NO851392L - Fremgangsmaate ved immunoanalytiske bestemmelser. - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører analysebestemmelser

som anvender immunokjemiske stoffer slik som antigene og antistoffer som reaktanter, som er spesielt rettet mot agglutinerings-immuno-bestemmelse som involverer lateksbærer-partikler.

Av de mange heterogene og homogene immunologiske analyse-metoder som var tilgjengelige, fortsetter agglutinerings-immunobestemmelse å være vidt anvendt i biologi og medisin til bestemmelse av små mengder av et antistoff eller antigen av interesse i en væske-testprøve. Agglutineringsreaksjonen involverer in vitro aggregering av mikroskopiske bærerpartikler. Denne aggregering blir formidlet ved den spesifikke reaksjon mellom antistoffer og antigene, hvorav en av dem blir immobilisert på overflaten av bærerpartiklene. I en utforming blir en væske som inneholder liganden av interesse tilsatt i en suspensjon av de sensitiviserte bærerpartiklene og tilsynekomsten av aggregering blir notert som indikativ for liganden.

En spesielt verdifull anvendelse av agglutinerings-bestemmelsene er i påvisning av en ligand eller analytt av interesse i humane kroppsvæsker slik som serum. Agglutineringsreaksjonen kan så bli brukt på flere forskjellige måter for å påvise et antigen eller antistoff (liganden av interesse) som følger: med en antigen immobilisert bærer-partikkel for påvisning av et spesifikt antistoff som ligand av interesse;

med en antistoff immobilisert bærer-partikkel for påvisning av spesifikt antigen eller hapten som ligand av interesse;

i en agglutineringsinhiberingsmetode som bruker antigen immobiliserte partikler: en fiksert mengde antistoff ble blandet med en fortynning av testprøven som inneholder liganden av interesse.

Denne reaksjonsblandingen blir så ført sammen med de antigen immobiliserte bærer-partiklene. Graden hvortil liganden av interesse (antigene) i testprøven inhiberer aggregeringen av bærer-partiklene som ellers ville ha forekommet, angir konsentrasjonen av ligand til stede i prøven;

i en agglutineringsinhiberingsmetode med antistoff immobiliserte partikler: en fiksert mengde av antigen ble blandet

med en fortynning av testprøven som inneholder liganden av interesse - et spesifikt antistoff - som inaktiverer en del av antigenet. Denne reaksjonsblanding blir så ført sammen med de antistoff-immobiliserte bærer-partikler. Graden hvortil liganden (antistoffet) til stede i testprøven inhiberer aggregeringen av bærer-partiklene, sammenlignet med det som ellers ville ha forekommet, angir konsentrasjon av antistoff til stede.

Det er imidlertidig blitt funnet at mange kroppsvæsker slik som serum ofte inneholder andre udefinerte stoffer, i tillegg til den spesielle ligand eller analytt av interesse, som forårsaker eller inhiberer agglutinering og således forårsaker interferenser og feil i bestemmelsen. Slike interferenser blir nominelt kalt ikke-spesifikke i og med at naturen av de(t) interfererende stoff (er) og mekanismen hvorved de interferer, er lite forstått og ikke noe spesielt forårsakende stoff eller sett av betingelser kan tilskrives disse effekter. Videre kan interferenser jsv disse typer ikke korrigeres ved sammenligning av analyseresultatene med en lignende analyse som bruker en prøve som ikke inneholder liganden eller analytt det er spørsmål om som blindprøve, fordi blindprøven ikke kan være virkelig representativ for det spesielle serum under forsøket, og ofte er interferensen så stor at ingen spesifikk reaksjon finner sted. Som resultat er det blitt brukt mye tid og krefter til å lete etter metoder for å eliminere ikke-spesifikke interferenser.

Vanlig kjente metoder til å redusere ikke-spesifikke interferenser i agglutineringsbestemmelser, inkluderer de følgende: massiv fortynning av testprøven opptil minst 20 ganger;

tilsetning av vaskemidler slik som beskrevet i US-patent

4 06 0 596; kraftig forbehandling av testprøven, inkludert varme-behandling i 30 minutter ved 56°C som beskrevet av Merz et al,

J. Clin. Micro., vol. 5, s. 596, 1977: enzymatisk behandling med protease-reaksjon som beskrevet av Collet-Cassart et al, Clin. Chem., vol. 27, s. 1205, 1981; behandling med reduserende/- oksyderende stoffer som beskrevet av Cambiaso et al, J. Immuno. Meth., vol. 28, s. 13, 197 9 og separering av komponenter ved å bruke jernutvekslingskromatografi som beskrevet i US-patent 4 270 923. Mens disse fremgangsmåter enkeltvis og som et hele er effektive, er de tidkrevende og de kan bringe med seg en uønsket virkning som er drastisk reduksjon av den potensielle følsomhet og nøyaktighet av immunobestemmelsen som et resultat av de nødvendige manipulasjoner. En annen tilnærming har vært tilsetning av spesifikke kjemiske stoffer for å redusere ikke-spesifikke interferenser i agglutinerings-reaksjoner slik som beskrevet i US-patent 4 362 531. De be-skrevede stoffer inkluderer imidlertid et vidt område av ulike og ubeslektede forbindelser som er effektive i varierende grader i forhold til hverandre. På grunn av dette fortsetter letingen etter tilsetningsstoffer til agglutineringsreaksjonsblandinger som reduserer eller eliminerer virkningene av ikke-spesifikke serum-interferenser i slike immunoanalytiske bestemmelser.

En forbedret lateksimmuno-analytisk metode er fremskaffet

til å bestemme nærværet av en ligand av interesse i en ikke-ekstrahert kroppsvæske. Forbedringen innbefatter følgende trinn: inkludert et kjemisk beleggstoff som består av minst én halogert substituert karboksylsyre eller et salt av syren i reaksjonsblandingen for å minke ikke-spesifikke interferenser av lateksimmunobestemmelsen. Tilsetningsstoffer reduserer ikke-spesif ikke interferenser i de enkelte serum-prøver, oppsamlete serum-prøver og andre kroppsvæsker til analyse, inkludert plasma, spytt, spinalvæske, urin og lignende. Tilsetning av slike tilsetningsstoffer tillater anvendelse av agglutinerings-immunobestemmelse til å bestemme kvantitative nivåer av endogene metabolitter og til å kontrollere spesifikke ligander av interesse slik som rusgifter, terapeutiske stoffer og spesifikke bindende proteiner i prøvene.

Den foreliggende oppfinnelse er en immunoanalytisk metode

som tilsetter et kjemisk tilsetningsstoff til immunokjemiske reaksjonsblandinger for å redusere eller eliminere virkningene av ikke-spesifikke serum-interferenser. Det kjemiske tilsetningsstoff innbefatter minst en halogen-substituert karboksylsyre eller dets salt og er fortrinnsvis et metallsalt av en trihalo-

eddiksyre slik som natriumtrikloreddiksyre. Tilsetnings-stoffene som er anvendbare i den foreliggende oppfinnelse, er definert ved formel I

og hvor R-^ er Cl, Br eller I og R2er H, Cl, Br eller I og R3er H, CH^, CH3CH2-/Cl, Br eller I eller et vannløselig

salt av syren av formel I slik som natriumsaltet. Tilsetning av forbindelsen av formel I, for eksempel natriumtrikloreddiksyre (heretter NaTCA) i agglutineringsreaksjonsblandinger reduserer eller fjerner fullstendig virkningene av ikke-spesifikke inhiberende stoffer og andre interferenser i serum og ikke-

serum kroppsvæske-testprøver. De foretrukne reagenser er kloreddiksyre, dikloreddiksyre, trikloreddiksyre, bromeddiksyre, dibromeddiksyre, tribromeddiksyre, jodeddiksyre eller blandinger av disse med NaTCA som er det mest foretrukne tilsetnings-

stoff. Virkningene av NaTCA på serumprøver er spesielt slik at økning av konsentrasjonen av tilsetningsstoffet i konsentra-sjoner som varierer fra 0,01 mol til 2,0 mol med serum-konsentrasjoner opptil omtrent 50 %, på en konsekvent måte ; reduserte virkningen av ikke-spesifikke interferenser. Denne virkning er konsekvent og reproduserbar selv med serum-konsentrater som øker graden av ikke-spesifikk interferens proporsjonalt. Således er en sammenføring av sammenlignbart store mengder av NaTCA med proporsjonalt større volumer av serum praktisk anvendbar og økonomisk for å påvise tilstedeværelsen av en ligand av interesse i prøven og for å eliminere de ikke-spesifikke inhibitorer og interferenser som normalt påtreffes i løpet av analyseprosedyren. I normal praksis er det blitt funnet at blandinger som inneholder 0,5 molar NaTCA og 5,0 % serum (volum/volum) er optimum, men en hvilken som helst kombiner-ing av tilsetningsstoffet med serum i de ovenfor angitte områdene er anvendbar og effektiv.

I denne oppfinnelse blir tilsetningsstoffet anvendt i en lateks agglutinerings-immunobestemmelse (heretter LIA) hvor en suspensjon av lateks-partikler som varierer fra 0,05-1,0 mikrometer i diameter binder kovalent eller absorberer sterkt en spesifikk bindingspartner (et antigen eller antistoff)

for liganden som skal bestemmes i serum-prøven. Det kjemiske tilsetningsstoff, fortrinnsvis NaTCA, er inkludert i reaksjonsblandingen, tilsetningen av det kjemiske tilsetningsstoff vil resultere i et økt nivå av spesifisitet i agglutineringen ved tiden for måling. Denøkte grad av agglutinering kan så bli bestemt visuelt eller bli målt ved å bruke vanlige fremgangsmåter slik som turbidimetri, nefelometri, konvensjonelle lys-spredningsteknikker, kvasielastiske spredningsmetoder eller angulær anisotrop spredningsbestemmelse.

Forskjellig fra tilsetningsstoffer kjent i de tidligere metoder, reduserer eller eliminerer NaTCA anvendt som tilsetningsstoff til agglutineringsblandinger alle virkningene av ikke-spesif ikke serum-interferenser. Anvendelsen av slike salter av halogen-substituerte karboksylsyrer som kjemiske tilsetningsstoffer i immunoanalytiske metoder gjør det mulig for brukeren å kontrollere ligander av interesse i serum eller plasma-prøver inkludert medikamenter, antibiotika og andre terapeutiske stoffer.

Det er imidlertid spesielt lagt merke til, at et metall-

salt av trifluoreddiksyre ikke er egnet som tilsetningsstoff for å redusere ikke-spesifikke interferenser. Det kjemiske tilsetningsstoff anvendt i denne oppfinnelse, kan faktisk være en blanding av to eller flere metallsalter av halogen-substituerte karboksylsyrer. For eksempel er en blanding av natrium-(eller kalium) trikloracetat og natrium-(eller kalium) tribrom-acetat effektivt som tilsetningsstoff. Det er foretrukket at pH av tilsetningsstoffét opprettholdes mellom 8,0 og 10,0

for maksimum dyrkning. Dette område kan bli justert til å

passe til alle optimums immunokjemiske mengder i det indivi-duelle testsystem.

Optimumskonsentrasjonen av tilsetningsstoffet avhenger av tallrike faktorer som inkluderer a) latekspartikkel-sammenset-ning, b) antistoffets natur og dets følsomhet for tilsetnings-

stoffet, c) antigenets eller naptenets natur og dets følsom-

het for tilsetningsstoffet og d) temperaturen - hvorav alle definerer systemet.

Optimumskonsentrasjonen av tilsetningsstoffet må bestemmes empirisk for hvert system. Muligens er det noen systemer som kan være fullstendig uforenlige med tilsetningsstoffet av grunner som ikke har noe å gjøre med interferens av serum.

Det er blitt vist at monosubstituerte og/eller disubstituerte halid-salter av kortkjedede karboksylsyre også er effektive som tilsetningsstoffer som minker ikke-spesifikke interferenser i serum-testprøver.

De følgende eksempler illustrerer den foreliggende oppfinnelse og har ikke til hensikt å begrense denne.

EKSEMPEL I

Følsomhet av agglutinering for anti- hCG antistoff når

serum, NaTCA eller begge er til stede Agglutineringsblandinger (0,4 ml, pH 8,0) som inneholdt

0,02 molar natrium-barbital, 0,15 molar natriumklorid, 0,1 % bovin-serum albumin, en 1/92 fortynning av lateks-partikler

(r)

dekket med hCG (Pregnosis lateks tilgjengelig fra Roche Diagnostics, Nutley, NJ), og serisk fortynnet anti-humant

korion gonadotropin (anti-hCG) antiserum (Miles-Yeda, 467-073) ble fremstilt. Blandinger som i tillegg inkluderte 0,44 molar NaTCA eller 5,0 % normalt serum (hCG fritt) eller begge ble

også fremstilt.

Agglutineringsblandingene ble opprettholdt ved 25°C og turbidimetriske målinger utført i et spektrofotometer. Av-lesninger av absorbansen ved 600 nm ble gjort umiddelbart etter sammenføring av alle komponenter og igjen etter en 30 minutters inkubering. Forandringen i absorbans i løpet av det intervallet for hver blanding ble regnet ut ved å trekke nulltids-avlesningen fra 3 0 minutters avlesningen. I tillegg ble passende blindprøver hvor antistoffet ikke var til stede, kjørt parallelt, og enhver nominell forandring i absorbans ble trukket fra, hvilket resultere i en AA verdi for hver blanding (tabell I).

Det fremgår av tabell I at i nærvær av serum og fravær av NaTCA forekommer agglutinering hverken i en signifikant ut-strekning eller i en grad som kan bli klart relatert til mengden av anti-hCG antiserum tilstede. Når imidlertid NaTCA er inkludert i serum-inneholdende blandinger, forekommer agglutinering, og graden av agglutinering er relatert til mengden av antistoff tilstede.

EKSEMPEL II

Følsomhet av agglutinering overfor hCG i nærvær av

serum, NaTCA eller begge

Inkuberingsblandinger (350 yl, pH 8,0) som inneholdt 1/7 000 fortynning av anti-hCG antiserum (1/3 500 fortynning i blandinger som inneholdt NaTCA), 0,02 M natriumbarbital, 0,15 M natriumklorid, 0,1 % bovin serum-albumin og varierende mengder av hCG ble fremstilt. Andre blandinger som i tillegg inkluderte 0,53 molar TCA, 5,7 % normalt mannlig serum (hCG fritt) eller begge ble også fremstilt. Etter en 15 minutters inkuberings- periode ble 50 yl av en fortynnet hCG-lateks (Roche) suspensjon tilsatt til hver blanding. (Slutt-fortynning av hCG-lateks var 1/100). Turbiditeten ble målt ved begynnelsen og slutten av et 30 minutters intervall, og AA ble regnet ut som beskrevet i eksempel I. (Se tabell II). Alle trinn ble utført ved 25°C.

Det fremgår av tabell II at i nærvær av serum og fravær av NaTCA forekommer agglutinering hverken i en signifikant ut-strekning eller i en grad som klart kan relateres til mengden av hCG tilstede. Når imidlertidig NaTCA er inkludert i serum-inneholdende blandinger, forekommer agglutinering, og graden av agglutinering er relatert til mengden av hCG tilstede.

Claims (5)

1. I en agglutineringsimmunobestemmelse for en analytt i væskeprøve som er ført sammen med et reagens som inkluderer sensitiviserte latekspartikler og bindingspartner som trengs, hvorved graden av agglutinering av partiklene er et mål for analytten i prøven, idet forbedringen innbefatter et trinn som består av tilsetning av et tilsetningsstoff til reaksjonsblandingen for å minke ikke-spesifikke interferenser av agglutinering av partiklene, hvor slike tilsetningsstoffer innbefatter minst en halogen-substituert karboksylsyre eller vannløselig salt av denne hvor syren har formel:

og hvor er Cl, Br eller I og Rj er H, Cl, Br eller I og R3 er H, CH^ , CH3 CH2 -, Cl, Br eller I.

2. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, karakterisert ved at tilsetningsstoffet er valgt fra gruppen som består av kloreddiksyre, dikloreddiksyre, trikloreddiksyre, bromeddiksyre, dibromeddiksyre, tribromeddiksyre, jodeddiksyre, et vannløselig salt av disse og blandinger av disse.

3. Fremgangsmåte i henhold til et hvilket som helst av krav 1 eller 2, karakterisert ved at tilsetningsstoffet er til stede i en konsentrasjon som varierer fra 0,01 til 2,0 molar.

4. Fremgangsmåte i henhold til et hvilket som helst av krav 1 eller 2, karakterisert ved at tilsetningsstoffet er til stede som et vannløselig salt.

5. Fremgangsmåte i henhold til et hvilket som helst av krav 1 eller 2, karakteriser, t ved at tilsetningsstoff-forbindelsen er en blanding av minst to av de nevnte tilsetningsstoffer .