NO852974L - Rekombinant faktor viii-r. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører generelt kloning^av strukturelle gener og bruken av slike gener i den syntese av ønskede proteinprodukter som er styrt ved hjelp av rekombinant DNA. Nærmere bestemt vedrører den et nytt

faktor VIII protein (Faktor VIII-R),syntesen derav styrt

ved hjelp av rekombinant DNA og bruken derav i behandlingen av koagulasjonsforstyrrelser, som for eksempel Von Willebrand's sykdom.

Teknikker basert på rekombinant DNA er generelt sett nå blitt meget ;kjent. Se Methods in Enzymology, (Academic Press) volumene 65 og 68 (1979); 100 og 101

(1983) og de litteraturhenvisninger som der er angitt

En omfattende teknisk omtale som omfatter det meste av de vanlig brukte metoder med rekombinant DNA, er å finne i Maniatis, et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982). Gener som koder for forskjellige poly-peptider kan klones ved å føye inn et DNA-frament som koder for polypeptidet i et rekombinant DNA overføringsmiddel,

for eksempel bakterie- eller virusvektorer, og transformere en egnet vert, vanligvis en cellelinje av Escherichia coli (E. coli), og isolere kloner som er føyd inn i de rekombinante vektorer. Slike kloner kan dyrkes og brukes til å fremstille det ønskede polypeptid i stor skala.

Flere forskjelige forskergrupper har isolert blandinger av mRNA fra eukaryote celler og anvender en serie på tre enzymatiske reaksjoner for å syntetisere dobbeltkjedede DNA-kopier av hele gener som er komplementære til denne mRNA-blanding. Ved den første reaksjon transkriberes mRNA til en énkjedet komplementær DNA (cDNA) ved hjelp av en RNA-styrt DNA-polymerase, også kalt revers-transkriptase.

Revers transkriptase syntetiserer DNA i 5' - 3'-retningen, gjør bruk av deoxyribonukleosid -5'-trifosfater som for-løper forbindelser og krever både et templat og en primer-kjede, hvor den sistnevnte må ha en fri 3<1->hyaroxyienae. Revers transkriptase-produkter, hva enten de er delvise eller fullstendige kopier av mRNA-templatet, har ofte korte, delvis dobbelt-kjedede "hårnåler" ("sløyfer") i sine 3'-ender. Ved den andre reaksjonen kan disse "hårnålssløyfer" utnyttes som primere for DNA-polymeraser. På forhånd dan-net DNA trengs både som et templat og som en primer ved virkningen av DNA-polymerase. DNA-polymerasen krever nærvær av en DNA-kjede med en fri 3<1->hydroxylgruppe, hvortil nye hydroxylrester tilføres for å utvide kjeden i retningen 5' - 3'. Produktene fra slike revers transkript.ase-- og DNA-polymerase-reaksjoner i rekkefølge har fortsatt en sløyfe i én ende. Sløyfens spiss eller "foldingspunkt" for den dobbeltkjedede DNA som på denne måte er blitt fremstilt,

er hovedsakelig et enkj edet segment. Ved den tredje reaksjon spaltes dette énkjedede segment med nucleasen Sl som er spesifikk for enkle kjeder slik at det frembringes et "blunt-end" duplex DNA-segment. Denne generelle fremgangsmåte er anvendbar på enhver mRNA-blanding, og er beskrevet av Buell, et al, J. Biol. Chem, 253:2483 (1978).

Den resulterende dobbeltkjedede cDNA (ds-cDNA) innføres i overføringsmidler for kloning ved hjelp av en eller flere kjente teknikker, avhengig i det minste delvis av det bestemte overføringsmiddel som brukes. Forskjellige innføringsmetoder er svært inngående omtalt i Methods In Enzymology, 68:16-18, og i de der angitte litteraturhenvisninger.

Disse overføringsmidler ved kloning tilfører vanligvis verten en antibiotisk resistens. Etter at DNA-segmentet er innført, brukes overføringsmiddelet for kloning til å transformere en egnet vert. Slike verter er vanligvis prokaryote eller eukaryote celler, på dette punkt inneholder bare noen få av de transformerte eller transfiserte verter den ønskede cDNA . Summen av alle transformerte eller transfiserte verter utgjør en gensamling. Den samlede ds-cDNA-samling frembragt ved hjelp av denne metode gir en representativ prøve på kode-informasjonen som er til stede i mRNA-blandingen brukt som utgangsmateriale.

Dersom en passende oligonucleotidsekvens er tilgjengelig, kan den brukes til å identifisere kloner av interesse på følgende måte. Individuelt transformerte eller transfiserte celler dyrkes som kolonier på filterpapir av nitrocellulose. Disse kolonier lyseres, den derved fri- gjorte DNA bindes kovalent til filterpapiret ved oppvarming og arket inkuberes med en merket oligonucleotidprobe. Probesekvensen er komplementær til det strukturelle gen av interesse. Proben hybridiseres med ds-cDNA som den er komplementær til, og denne identifiseres ved hjelp av autoradiografi. Klonene karakteriseres for å identifisere en klon som inneholder hele strukturinformasjonen for det ønskede protein. Nucleinsyresekvensen som koder for proteinet av interesse, isoleres og innføres på nytt i en ekspresjonsvektor. Ekspresjonsvektoren bringer det klonede gen under reguleringskontroll av et spesifikt prokaryot eller eukaryot-kontrollelement som gir virksom ekspresjon (transkripsjon og translasjon) av den klonede ds-cDNA i full lengde. Den generelle teknikk er således bare anvendbar på de proteiner hvor minst en del av aminosyre- eller DNA-sekvensen er kjent, og som det er tilgjengelig en oligonucleotidprobe for. Generelt vises det til Maniatis et al, supra.

I den senere tid er det utviklet metoder for å identifisere spesifikke kloner ved prøving av bakterielle kolonier med antistoffer som er spesifikke for det kodede protein av interesse. Denne fremgangsmåte kan bare brukes med "ekspresjonsvektor"-overføringsmidler for kloning etter-som det kreves oppbygning av produktproteinet. Det strukturelle gen innføres i vektoren ved siden av regulatorgen-sekvenser som induserer ekspresjon av proteinet. Cellene lyseres, enten ved hjelp av vektoren eller ved hjelp av kjemiske metoder, og proteinet påvises ved hjelp av det bestemte antistoff og et merkingssystem, f.eks. enzym-immunoprøving. Et eksempel på dette er systemet lambda gtll beskrevet av Young and Davis, Proe. Nat'l, Acad. Sei. USA, 80:1194-1198 (1983) og Young and Davis, Science, 22:778

(1983) .

Normalt blodplasma fra mennesker inneholder et

kompleks av to proteiner som refereres til som Faktor VIII-komplekset. En bestanddel i Faktor Vlll-komplekset influe-rer på blodplatenes festeegenskaper og betegnes Faktor VIII-R. En mangel på Faktor VIII-R er karakteristisk for Von Willebrand's sykdom, en autosomalt arvet sykdom.

Det foreligger lite informasjon i litteraturen om biokjemien til Faktor VIII-R. De fleste undersøkelser av Faktor VIII-R er blitt utført ved å bruke det intakte Faktor Vlll-kompleks. Nylig er Faktor VIII-R blitt sepa-rert fra Faktor Vlll-komplekset og de fleste andre plasma-proteiner, først og fremst ved hjelp av cryoutfelling, immunoabsorpsjon, ionebytterkromatografi og gelfiltrering. Generelt vises det tilHoyer, Blood, 58:1:13 (1981) og Zimmerman, et al. US patentskrift nr. 4 361 509, Zimmerman, et al, Prog. in-Hematol., 13:279 (1983) og de der angitte litteraturhenvisninger.

Faktor VIII-R har terapeutisk verdi på grunn av sin evne til å rette opp koagulasjonssvikten hos pasienter med Von Willebrands<1>s sykdom. Uheldigvis er de tilgjengelige metoder for å sikre Faktor VIII-R begrenset til fraksjonering av menneskeplasma, som beskrevet ovenfor. Fremstilling av Faktor VIII-R ved plasmafraksjonering gir bare begrensede mengder som varierer fra fremstilling til fremstilling, er kostbare og utsetter mottageren for risikoen for å erverve sykdommer som for eksempel hepatitt og AIDS.

Ved erkjennelse og overvinnelse av de ovenfor beskrevne problemer har foreliggende oppfinnelse gjort det mulig å tilveiebringe på en lett tilgjengelig måte store mengder av Faktor VIII-R Von Willebrand's faktor som er fri for risikoene for overføring av sykdom forbundet med preparater fra plasmafraksjonering. Dette er oppnådd med oligonucleotider som koder spesifikt for segmenter av proteinmolekylet til Faktor VIII-R, anvendelse av teknologi med rekombinant DNA for å fremstille overføringsmiddel for kloning som koder for Faktor VIII-R-protein, og screening/ isolerings-fremgangsmåter for utvinning av human Faktor VIII-R-protein som i det vesentlige er fri for andre proteiner av human opprinnelse.

Følgelig tilveiebringer foreliggende oppfinnelse human Faktor VIII-R som i det vesentlige er fri for andre proteiner av human opprinnelse. Faktor VIII-R-proteinet er kjennetegnet ved å være glycosylert. Faktor VIII-R fremstilles ved hjep av teknikker med rekombinantet DNA i vertceller eller andre selv-replikerende systemer og tilveiebringes i hovedsakelig ren form. Det tilveiebringes også fremgangsmåter og blandinger for fremstilling av den ovenfor beskrevne Faktor VIII-R såvel som terapeutiske preparater og anvendelser av Faktor VIII-R protein ved behandlingen av koagulasjonssykdommer hos mennesker og dyr.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre replikerbare ekspresjonsvektorer hvor det er innføyd en DNA-sekvens som koder for human ~F ak tote- VIII-R, og vertcellesystemer eller cellefrie, selvreplikerende systemer som er transformert eller transfisert med vektorene. Vertsystemet er vanligvis av prokaryote, f.eks. E.coli eller B.subtilis, eller eukaryote. celler.

Den humane Faktor VIII-R produseres ved en fremgangsmåte som omfatter (a) fremstilling av en replikerbar ekspresjonsvektor som er i stand til å uttrykke DNA-sekvensen som koder for humen Faktor VIII-R i en egnet vertcelle eller i et cellefritt replikerende system,

(b) transformering av vertsystemet til et rekombinant vertsystem, (c) oppbevaring av det rekombinante vertsystem under betingelser som gir ekspresjon av DNA-sekvensen som koder for Faktor VIII-R hvorved det fremstilles human Faktor VIII-R protein, og (d) utvinning av humant

Faktor VIII-R protein. Den replikerbare ekspresjonsvektor som koder for Faktor VIII-R lages fortrinnsvis ved å fremstille et dobbeltkjedet komplementær-DNA (ds-cDNA) preparat som er representativ for en blanding av budbringer-RNA som inneholder budbringer-RNA for Faktor VIII-R, og føye DNA fra ds-cDNA-blandingen inn i de replikerbare ekspresjonsvektorer. Den foretrukne måte å utvinne human Faktor VIII-R på omfatter å omsette proteinene som uttrykkes ved hjelp av det rekombinante vertsystem, med en reagenssammensetning som omfatter minst ett bindende protein som er spesifikt for Faktor VIII-R, iaktta en eventuell påvisbar respons og isolere den identifiserte Faktor VIII-R fra vertsystemet .

På tegningene er fig. 1 et flytskjema som viser de enzymatiske reaksjoner beskrevet i eksemplet.

Fig. 2 er et flytskjema som viser fremgangsmåtene som ble brukt ved fremstilling av den rekombinante vektor, inkorporering av den i en vert og screening av en samling for identifikasjon av den ønskede klon eller de ønskede kloner som ble brukt i eksemplet.

"Human Faktor VIII-R" betegner, slik det her er brukt, human Faktor VIII-R produsert ved hjelp av celle-eller cellefrie-dyrkningssystemer, i bioaktive former med evne til å delta i normal hemostase på samme måte som Faktor VIII-R som er naturlig forekommende i blodplasma hos mennesker.

I naturen kan det forekomme forskjellige alleler av Faktor VIII-R. Disse variasjoner kan være kjennetegnet ved forskjell eller forskjeller i den totale nucleotid-sekvens til de strukturelle gener som koder for proteiner med identisk biologisk funksjon. Dertil kan lokaliseringen og graden av glycosylering såvel som andre modifikasjoner som oppstår etter translasjonen, variere og vil i en viss grad være avhengig av arten av verten og beskaffenheten av miljøet som proteinet produseres i. Det er mulig å fremstille analoger av human Faktor VIII-R som har én eller flere aminosyresubstitusjoner, -utelatelser, aktive frag-menter, -addisjoner eller -ombyttinger. Disse kan omfatte analoger som er blitt tilveiebragt med ytterligere seter for blodplatebinding, samt for spesifisiteter som er forskjellige fra spesifisitetene til endogen eller naturlig forekommende human Faktor VIII-R. Subgenomfragmenter, deriblant de som uttrykker spesifikt ønskede biologiske egenskaper, kan også foreligge eller fremstilles. Alle slike allelvariasjoner, modifikasjoner og analoger som resulterer i derivater av human Faktor VIII-R og som bibe-holder de biologiske egenskaper til naturlig forekommende human Faktor VIII-R, er omfattet innenfor opppfinnelsens omfang.

"Ekspresjonsvektorer" refererer til vektorer som er i stand til å transkribere og translatere DNA-sekvenser

som de inneholder, hvor slike sekvenser er bundet til andre regulatorsekvenser som er i stand til å bevirke deres ekspresjon. Disse ekspresjonsvektorer må være replikerbare i vertorganismene eller -systemene enten som episomer, bakteriofager eller som en integrert del av den kromosomale DNA. En form for ekspresjonsvektor som er spesielt egnet for bruk ifølge oppfinnelsen, er bakterio-fagene, virus som vanligvis oppholder seg og replikerer i bakterier. Spesielt ønskelige fager for dette formål er fagene lambda gtlO .og. lambda gtll beskrevet av Young et al, supra. Lamba gtll er en generell rekombinant DNA ekspresjonsvektor som er i stand til å produsere polypep-tider bestemt av den innføyde DNA. Den rekombinante vektor kan formeres i sin vertcelle som et én-kopi genom-innskudd for å øke sin stabilitet. Denne vektor reagerer på induk-sjon med en hurtig økning i kopiantall og transkripsjon på et høyt nivå av den fremmed DNA. For å minimalisere ned-brytning syntetiseres fremmede eukaryote proteinpolypep-tider som en fusjon av den eukaryote rest fra dens strukturelle DNA-sekvens med all, bortsett fra en liten del, av den prokaryote protein B-galactosidase fra dens gen. Bruken av vertceller med feil i sporene for proteinned-brytning kan også øke levetiden til nye proteiner fremstilt fra de induserte lambda gtll-kloner. Korrekt ekspresjon av fremmed-DNA i lambda gtll-kloner vil avhenge av orien-teringen og avlesningsrammen for den innføyde DNA i forhold til B-galactosidasepromoteren. En annen form for ekspresjonsvektorer som er nyttig ved teknikker med rekombinant DNA, er "plasmidet", en ringformet, ikke-integrert ekstra-kromosomal dobbeltkjedet DNA-sløyfe. Oppfinnelsen omfatter enhver annen form for ekspresjonsvektor som tjener en tilsvarende funksjon og som er eller senere blir kjent innen teknikken.

Rekombinante vektorer og metoder som her er beskrevet, er egnet for bruk i vertceller fra en lang rekke prokaryote og eukaryote organismer. Vanligvis er selvsagt prokaryoter foretrukket for kloning av DNA-sekvenser og ved konstruksjon av vektorene som kan brukes ifølge oppfinnelsen. For eksempel er E.coli K12 stamme MM294 (ATCC nr. 31446) spesielt nyttig. Selvfølgelig kan andre mikrobestammer brukes. Vektorer som inneholder replikasjons- og kontrollsekvenser avledet fra arter som er forenlige med vertcellen eller -systemet, brukes i for-bindelse med disse verter. Vektorene har vanligvis et opprinnelsessted for replikasjon samt egenskaper som er i stand til å gi fenotyp.seleksjon i transformerte celler. E.coli kan transformeres ved å bruke pBR322, et plasmid avledet fra en E.coli jBolivar, et al, Gene, 2:95 (1977)). pBR322 inneholder gener for ampicillin- og tetracyklin-resistens, og tilveiebringer følgelig et middel for identi-fisering av transformerte celler. Ekspresjonsvektoren må også inneholde promoterer som kan brukes av vektoren for ekspresjon av dens egne proteiner. Vanlige prokaryote promoterer omfatter beta-laktamase (penicillinase-), laktose-, tryptofan- (trp-) og pR- og pL-promoteren til bakteriofag lambda. Kombinasjoner av disse promoterer har også vært brukt (f.eks. TAC, som er en fusjon av trp-promoteren med lactose-operatoren). Andre promoterer er også blitt oppdaget og utnyttet, og detaljer vedrørende deres nucleotidsekvenser har vært publisert, noe som har gjort det mulig for erfarne forskere å ligere dem funksjonelt med passende vektorer.

I tillegg til prokaryoter kan også eukaryote mikrober, som for eksempel gjærkulturer, brukes. Saccharomyces cerevisiae eller vanlig bakergjær, er den mest vanlig brukte blant eukaryote mikroorganismer selv om en rekke andre stammer i alminnelighet er tilgjengelige. Egnede promotersekvenser i gjærvektorer omfatter promote-rene for 3-fosfoglycerat-kinase eller andre glycolytiske enzymsystemer. Ved konstruksjon av egnede ekspresjonsvektorer ligeres også termineringssekvensene forbundet med disse gener inn i ekspresjonsvektoren 3' til sekvensen som ønskes uttrykt, for å gi polyadenylering av mRNA og termi-nering. Enhver vektor som inneholder en gjær-forenlig promoter, et opprinnelsessted for replikering og en hen-siktsmessig termineringssekvens, er egnet for ekspresjon av Faktor VIII-R.

I tillegg til mikrooragnismer kan også celle-kulturer avledet fra flercellede organismer brukes som verter. I prinsippet er en hvilken som helst slik celle-kultur brukbar, uansett om den er fra hvirveldyr eller fra ikke-hvirveldyr. Interessen har imidlertid vært størst for hvirveldyrceller, og formering av hvirveldyrceller i kultur (vevkultur) er blitt en rutinefremgangsmåte i de senere år. Eksempler på slike brukbare vertcellelinjer er VERO- og HeLa-celler, ovariecellelinjer fra kinesisk hamster (CHO), og W138--, BHK- , COS—7.- og MDCK-celle-lin jer. Ekspresjonsvektorer for slike celler omfatter vanligvis (om nødvendig) et opprinnelsessted for replikering, en promoter lokalisert foran genet som skal uttrykkes, sammen med eventuelt nød-vendige ribosombindende seter, tilknytningsseter for RNA, polyadenyleringssete og transkripsjonene terminator-sekvenser.

For bruk i pattedyrceller tilveiebringes kontrol-funksjonene på ekspresjonsvektorene ofte ved hjelp av virus-materiale. Vanlig brukte promoterer avledes for eksempel fra polyoma, adenovirus 2 og som oftest fra apevirus 40 (SV40). Videre er det også mulig, og ofte ønskelig, å benytte promoter- eller kontrollsekvensen som er naturlig forbundet med den ønskede gensekvens, forutsatt at slike kontrollsekvenser er forenlige med vertsystemet. For å øke transkripsjonshastigheten kan eukaryote "forsterker"-sekvenser også føyes til konstruksjonen. Sekvensene kan erholdes fra en lang rekke forskjellige dyreceller eller oncorna-virus som for eksempel sarcomaviruset fra mus.

Et startsted for replikering kan tilveiebringes enten ved at vektoren konstrueres på en slik måte at den omfatter et eksogent startsted, som f.eks. det som fås fra SV40 eller andre viruskilder, eller kan tilveiebringes ved hjelp av den kromosomale replikeringsmekanisme hos vertceller. Dersom vektoren er integrert i vertcellekromosomet, er dette ofte tilstrekkelig.

Vertceller kan fremstille Faktor VIII-R-human-proteiner som kan ha en lang rekke forskjellige kjemiske sammensetninger.Proteiner fremstilles med methionin som sin første aminosyre (tilstede i kraft av ATG startsignal-kodonet som er innføyd foran det strukturelle gen). Methio-ninet kan også avspaltes intra- eller ekstracellulært slik at proteinet får sin vanlige første aminosyre. Proteinet kan fremstilles enten sammen med sitt signal-polypeptid eller et konjugert protein som er forskjellig fra det vanlige signal-polypeptid, idet signal-polypeptidet eller konjugatet er spesifikt avspaltbart i et intra- eller ekstracellulært miljø. Endelig kan Faktor VIII-R fremstilles i fullstendig., form ved direkte ekspresjon uten nødvendigheten av å spalte bort noe fremmed polypeptid.

Med rekombinante vertceller refereres det til celler som er blitt transformert med vektorer som er fremstilt ved å bruke teknikker med rekombinant DNA. Faktor VIII-R fremstilles som en konsekvens av denne transformasjon.

Faktor VIII-R produsert ved hjelp av slike celler refereres til som "rekombinant Faktor VIII-R".

B. Rekombinant og screening- metodikk

Fremgangsmåtene nedenfor er bare noen av en lang rekke forskjellige veletablerte fremgangsmåter for fremstilling av bestemte reagenser som er nyttige ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Den generelle fremgangsmåte for å oppnå en blanding av budbringer-RNA (mRNA) er å fremstille et ekstrakt fra en vevprøve eller å dyrke celler som produserer det ønskede protein og ekstrahere mRNA ved hjelp av en fremgangsmåte som for eksempel den som er beskrevet av Chirgwin, et al, Biochemistry, 18:5294

(1979). MRNA anrikes med hensyn på materiale som inneholder poly(A) mRNA ved hjelp av kromatografi på oligo (dT)-cellulose eller poly (B)-sefarose, etterfulgt av eluering av den poly(A)-holdige mRNA-anrikede fraksjon.

Den ovenfor nevnte poly(A)-holdige mRNA-anrikede fraksjon brukes til å syntetisere en énkjedet komplementær DNA (ss-cDNA) ved å bruke revers-transkriptase. Som en følge av DNA-syntese dannes det en "hårnålsløyfe" i 3'-enden av DNA-molekylet som vil initiere syntese av den andre DNA-kjede. Under hensiktsmessige betingelser brukes denne "hårnålsløyfe" til å bevirke syntese av den andre kjede

i nærvær av DNA-polymerase og nucleotidtrifosfater.

Den resulterende dobbeltkjedede cDNA (ds-cDNA) føyes inn i ekspresjonsvektoren ved hjelp av en hvilken som helst av kjente teknikker. Generelle fremgangsmåter etc, finnes angitt i Maniatis, supra og Methods in Enzymology, vol, 65 og 68 (1980), 100 og 101 (1983). Vanligvis gjøres vektoren, rettkjedet ved hjelp av minst én restriksjonsendonuclease, noe som vil gi minst to butte ender eller kohesive ender. DNA-molekylet ligeres med eller knyttes til in.nføringsstedet i vektoren.

Dersom det brukes prokaryote celler eller celler som inneholder vesentlige celleveggkonstruksjoner, er den mest vanlige fremgangsmåte for transformasjon med ekspresjonsvektoren forbehandling med calsiumklorid som beskrevet av Cohen, F.N., et al, Proe. Nat'1. Acad. Sei. (USA), 69:2110 (1972). Dersom celler uten celleveggbarrierer brukes som vertceller, utføres transfeksjon ved hjelp av utfellingsfremgangsmåten ved calsiumfosfat beskrevet av Graham and Ver der Eb, Virology, 62: 546 (1978). Andre fremgangsmåter for innføring av DNA i celler, som for eksempel cellekjerneinjeksjon eller protoplastfusjon, har også vært brukt med hell. Organismene dyrkes deretter på selektive medier og det fremstilles proteiner som den rekombinante cDNA-samling koder for.

Kloner som inneholder en del av eller hele sekvensen for Faktor VIII-R, kan identifiseres. vecj a hybridisere den således dannede blanding av ds-cDNA med en kjemisk syntetisert oligonucleotidprobe. Oligonucleotidproben bestemmes ut fra den primære aminosyresekvens til Faktor VIII-R-proteinet. Sekvensen til olginucleotidene

som koder for en bestemt aminosyresekvens kan utledes på grunnlag av den degenererte beskaffenhet av den genetiske kode.

Kloner dyrkes på nitrocellulosefilteret og pre-pareres for hybridisering i henhold til Grunstein and Hogness, Proe. Nat. Acad. Sei., 72:3961 (1975). Filtrene omsettes med 32p-merkede oligonucleotider syn-

tetisert på grunnlag av aminosyresekvensen til Faktor VIII-R,

og vaskes deretter, tørkes og undersøkes ved hjelp av autoradiografi. Klonene som oppviste et sterkt hybridi-seringssignal velges ut for videre analyse. DNA kan så isoleres ved hjelp av fremgangsmåten beskrevet i Norgard, et al, J. Bacteriol., 138:270 (1979), spaltes med restriksjonsendonuclease Pstl og spaltingsfragmentene separeres ved elektroforese i horisontale 1,5 % agarosegeler som beskrevet i Maniatis, supra (1975). Vektorer som inneholder de lengste cDNA-innskuddene kan deretter sekvensbestemmes som beskrevet av Max-am and Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499 (1980). Kloner som svarer til den hele nucleotid-sekvens som koder for Faktor VIII-R, identifiseres.

Kloner som inneholder en del av eller hele genet for Faktor VIII-R, identifiseres også med spesifike antistoffer rettet mot en del av eller hele Faktor VIII-R-proteinet. Denne metode for identifikasjon krever at ds-cDNA føyes inn i en vektor som inneholder passende regu-lator-nucleinsyresekvenser ved siden av innføyningssetet. Disse regulatorsekvenser initierer transkripsjon og translasjon av disse ds-cDNA-molekyler som er innføyd i vektoren. De kloner som inneholder ds-cDNA-sekvenser for Faktor VIII-R i korrekte posisjoner i forhold til regulatorsekvensene, danner en del av eller hele Faktor VIII-R-proteinet. Denne Faktor VIII-R-aminosyresekvens påvises ved hjelp av passende spesifikke antistoffer. Et slikt kloningssystem er lambda gtll-systemet som først ble beskrevet av Young and Davis, supra.

Det brukes fortrinnsvis screening-teknikker for spesifikke bindingsprøver for å identifisere Faktor VIII-R-protein som er blitt bøyd opp av den transformerte vert. Spesifikk bindingsprøving er basert på den spesifikke reaksjon mellom en ligand, dvs. en bindbar analytt som skal . bestemmes, og en bindingspartner for denne. Når en av liganden og dens bindingspartner, slik som i tilfellet med Faktor VIII-R, er et antigen og den andre er et tilsvarende antistoff, er prøven kjent som immunprøving.

Flere forskjellige prøvingssystemer for binding er kjent innen teknikken og inndeles i kategorier etter beskaffenheten til den anvendte markør. Det påvirkede kjennetegn hos markøren kan være av en hvilken som helst målbar beskaffenhet. I de fleste tilfeller omfatter systemet homogene reagenser for spesifikk bindingsprøving som reagerer med liganden i prøven eller prøvens bindings-kapasitet på en immunokjemisk måte. I ett system er for eksempel markøren et enzym og enzymets evne til å virke på substratet påvirkes, enten på en positiv eller negativ måte, ved binding av markørkonjugatet med dets bindingspartner. Virkning - av enzymet på substratet gir et produkt som kan skjelnes ved noen egenskaper, vanligvis fluorescens eller lysabsorpsjon (farve).

Eksempel

A. Dyrkning av endothelialceller

Endothelialceller fra navlevene hos menneske

ble dyrket som beskrevet av Maciag, et al, J. Cell Biol. 91:420 (1981). De ble dyrket i Medium 199 som inneholder 20 % kalvefosterserum, vekstfaktor for endothelialcelle (100 yg/ml), penicillin G (10 u/ml), streptomycin (1 yg/ml) og fungizon (5 yg/ml). Cellene ble tilført næring hver andre til tredje dag inntil de fløt sammen. Ved sammenflyting ble cellene høstet ved avskraping i PBS.

B. Fremstilling av samlet RNA

Samlet RNA (budbringer, ribosomal og overføring) ble ekstrahert fra de endotheliale celler hovedsakelig slik som beskrevet av Chirgwin, supra, (1979). Cellene ble homogenisert i 15 volumdeler av en oppløsning som inneholdt 4 M guanidinthiocyanat, 25 mM natriumcitrat ved pH 7,0,

0,5 % N-laurylsarcosin, 0,1 M 2-merkaptoethanol og 0,2 % Antifoam A (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Homogenatet ble sentrifugert ved 6000 opm i en Sorvall GSA-sentrifuge i 15 minutter ved 10° C. Supernatantvæsken ble regulert til pH 5,0 ved tilsetning av eddiksyre og RNA utfelt ved hjelp av 0,75 volumdeler ethanol ved -20° C i 2 timer.

RNA ble samlet opp ved sentrifugering og oppløst i 7,5 M guanidinhydroklorid som inneholdt 25 mm natriumcitrat og 5 mm dithiothreitol. Etter to ytterligere utfellinger under anvendelse av 0,5 volumdeler ethanol, ble det reste- rende guanidinhydroklorid ekstrahert fra bunnfallet med absolutt ethanol. RNA ble oppløst i sterilt vann, uopp-løselig materiale fjernet ved sentrifugering og pellettene ble på nytt ekstrahert med vann. RNA ble justert til 0,2 M med kaliumacetat og ble utfelt ved tilsetning av 2,5 volumdeler ethanol ved -20<Q>C over natten.

C. Fremstilling av poly( A)- holdig RNA

Den samlede RNA-utfelling, fremstilt som beskrevet ovenfor, ble oppløst i 20 mm Hepes buffer ved pH 7,2 inneholdende .10 mm EDTA og 1 % SDA, oppvarmet ved 65° C i 10 minutter og deretter hurtig avkjølt til 25° C. RNA-oppløsningen ble deretter fortynnet med et like stort volum vann og NaCl ble tilsatt for å bringe sluttkonsentrasjonen til 300 mm NaCl. Prøver som inneholdt opp til 2400 & 260~ enheter RNA ble kromatografert på poly(U)-sefarose ved å bruke standard fremgangsmåter. Poly(A)-holdi<g>RNA ble eluert med 70 % formamid som inneholdt 1 mm Hepes-buffer (pH 7,2) og 2 mm EDTA. Eluatet ble regulert til 0,24 mm NaCl og RNA ble utfelt ved hjelp av 2,5 volumdeler ethanol ved -20° C.

D. Konstruksjon av cDNA- cloner i lambda gtll

Fremgangsmåten som ble fulgt for alle enzymatiske reaksjoner er generelt fremstilt skjematisk på fig. 1. mRNA (20 mikrogram) ble kopiert inn i ds-cDNA med revers-transkriptase og DNA-polymerase I nøyaktig slik som beskrevet av Buell, et al, supra, og Wikens, et al J.Biol. Chem., 253:2483 (1978). ds-cDNA ble avsaltet på Sephadex G-50 og de tunge volumfraksjoner ble ytterligere renset på en kolonne med Elutip-D (Schleicher & Schuell, Keene, NH), idet produsentens retningslinjer ble fulgt. ds-cDNA fikk butte ender ved inkubasjon med Sl nuclease, Norgard et al, supra. Reaksjonsblandingen besto av 0,2 M natriumacetat (pH 4,5), 0,4 M natriumklorid, 2,5 mm sinkacetat og 0,1 enhet Sl nuclease pr. ng ds-cDNA, idet det endelige reak-sjonsvolum var 100 mikroliter. ds-cDNA ble inkubert ved 37° C i 1 time, ekstrahert med fenol:kloroform og deretter avsaltet på en Sephadex G-50 kolonne som beskrevet ovenfor.

Den dobbelt-kjedede cDNA ble deretter behandlet med Eco RI methylase og DNA polymerase I (Klenow) ved å

bruke reaksjonsbetingelsene beskrevet i Maniatis,

Molecular Cloning, supra. cDNA ble på nytt avsatt på Sephadex G-50 som beskrevet ovenfor og deretter ligert til 0,5 mikrogram fosforylert Eco RI linker med T. DNA ligase (Maniatis, supra). Blandingen ble deretter spaltet med

Eco RI og fraksjonert på en 8 % acrylamidgel i tris-boratbuffer (Maniatis, supra). DNA med en størrelse større enn 1 kilobase ble eluert fra gelen og utvunnet ved binding på en kolonne med Elutip-D, eluert med 1 M NaCl og deretter oppsamlet ved ethanolutfelling.

Fremgangsmåtene som ble fulgt i resten av dette eksempel er generelt blitt oppstilt skjematisk på fig. 2. DNA-fragmentene ble deretter innføyd i Eco RI, spaltet og fosfatase-behandlet lambda gtll med T. DNA ligase hvorved man fikk en samling av ca. 8 hundre tusen rekombinante fager. Samlingen ble "forsterket" ved å fremstille plate-beholdningen ved 42° C med E.coli Y1088 /supE supF metB trpR hsdR~hsdM<+>tonA21 strA lacU169 proC::Tn5 (pMC9)J. Forsterkningsfremgangsmåter er beskrevet i Maniatis, supra. Viktige trekk ved denne stamme, som er beskrevet av Young

og Davis, omfatter supF (som kreves for undertrykking av fag-ambermutasjonen i S-genet), hsdR hsdM<+>(nødvendig for å forhindre restriksjon av fremmed-DNA før vertmodifikasjon), lacUl69 (en fjerning av lac-operonet reduserer vert-fag-rekombinasjon og er nødvendig for å skjelne mellom lambda gtll rekombinanter (vanligvis med liten eller ingen B-galactosidase-aktivitet) og ikke-rekombinanter (B-galactosidase-aktivitet) og pMC9 (et pBR322-plasmid som bærer lad for å undertrykke ekspresjon av fremmede gener som kan være skadelige for veksten av vertcelle og fag).

E. Identifikasjon av kloner som inneholder

Faktor VIII- R- sekvens

For å gjennomsøke samlingen etter kloner som produserer Faktor VIII-R-antigendeterminanter, ble lambda gtll rekombinant-fag platet ut på en plate .med E. Coli Y1090 /lacUl69 proA<*>lon araDl39 strA supF £trpC22: : Tnl0_7 (pMC9)J og inkubert ved 42° C i 2,5 timer. Denne vert manglet ion-proteasen, noe som reduserte nedbrytningen av uttrykt fremmed protein. Et nitrocellulosefilter som på forhånd var blitt mettet med 10 mm isopropyl-thio-B-d-galaktopyra-nosid (IPTG), et induksjonsmiddel for lacZ-transkripsjon,

og tørket, ble lagt over platene. Platene ble deretter fjernet til 37° C i 1,5 timer. Ekspresjonen av innskudd av fremmed-DNA i lambda gtll var under vanlig kontroll med lacZ-transkripsjon og, ble som sådan, også indusert. Filterets posisjon Ble markert med en nål, filteret fjernet, vasket i TBS-buffer (20 mm tris, pH 7,5 og 500 mm NaCl), og deretter inkubert i TBS pluss 3 % gelatin i 60 minutter ved værelsetemperatur.

Filteret ble så inkubert ved værelsestemperatur over natten i en 1:100 fortynning av monoklonal-antistoff, Zimmerman, PNA, 79:1648 (1982), rettet mot Faktor VIII-R i en buffer bestående av 1 % gelatin i TBS. Filteret ble deretter vasket to ganger i 10 minutter hver i TBS-buffer etterfulgt av tilsetning av 20 ml av en 1:2000 fortynning av pepperrot-peroxydase (HRP) koblet geit-anti-mus-IgG (Kirkeguard&Perry, Gaithersburg, MD), etterfulgt av inkubering i 1 time ved værelsetemperatur, og vasket to ganger i 10 minutter hver i TBS. Filtrene ble deretter inkubert ved værelsetemperatur i HRP-fargefremkallings-oppløsning som beskrevet i den litteratur som fulgte leve-ransen fra Kirkeguard & Perry.

En agarplugg med 4 mm i diameter på stedet for hvert av fargefremkallingssignalene ble fjernet fra platene og inkubert i 10 mm tris HC1, pH 7,5, og 10 mm MgS04

i minst 1 time. Fager i denne oppløsning ble platet ut

3

pa nytt i 90 mm plater ved en tetthet på ca. 10 plaque-dannende enheter (PFU) og platene på nytt gjennomsøkt som beskrevet ovenfor. Denne fremgangsmåte med ny utpla-ting og screening ble gjentatt inntil alle plaques på platene gir et signal. Disse plaques identifiserte rekombinante kloner som produserer human Faktor VIII-R.

Dette eksempel beskriver følgelig eksperimentelle fremgangsmåter som gir human Faktor VIII-R som i det vesent-

lige er fri for andre proteiner av human opprinnelse,

fra et humant vevekstrakt som inneholder RNA som koder for Faktor VIII-R-protein, i en heterogen blanding med RNA for en bred samling av andre human-proteiner eller -polypep-tider.

Claims (20)

1. Replikerbar eksprosjonsvektor, karakterisert ved at den i en celle eller i et cellefritt selv-replikerende rekombinantsystem er i stand til å uttrykke allel-varisjoner av human Faktor VIII-R, samt modifikasjoner og analoger derav, som i det vesentlige er fri for andre proteiner av human opprinnelse.

2. - Celle-eller,-cellefritt selv-replikerende rekombinantsystem, karakterisert ved at det er transformert med vektoren ifølge krav 1.

3. Rekombinant system ifølge krav 2, karakterisert ved at det er erholdt ved å transformere en mikroorganisme av arten E.coli eller B. subtilis.

4. Rekombinant system, karakterisert ved at det erholdes ved å inkorporere en celle med naturlig endogen produksjon av Faktor VIII-R, med ekspresjonsvektoren ifølge krav 1.

5. Fremgangsmåte for fremstilling av human Faktor VIII-R, karakterisert ved at : a) det fremstilles en replikerbar ekspresjonsvektor som er i stand til å uttrykke DNA-sekvensen som koder for human Faktor VIII-R i et egnet selv-replikerende rekombinant-vertsystem, b) vertsystemet transformeres til et rekombinant- vert sy stem. c) det rekombinante vertsystem holdes under betingelser som tillater ekspresjon av DNA-sekvensen som koder for Faktor VIII-R slik at human Faktor VIII-R fremstilles, og d) human Faktor VIII-R utvinnes.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at fremstillingen av den replikerbare ekspresjonsvektor omfatter trinnene med å fremstille en ds-cDNA fra en samling av budbringer-RNA inneholdende budbringer-RNA som koder for Faktor VIII-R, og føyer DNA'en fra denne ds-cDNA inn i replikerbare ekspresjonsvektorer.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at det som ekspresjonsvektor anvendes en bakteriofag.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at det som bakteriofag anvendes lambda gtlO eller lambda gtll.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at utvinningen av human Faktor VIII-R består i å omsette proteinene uttrykt ved hjelp av det rekombinante vertsystem med en reagensblanding som omfatter minst ett bindende protein som er spesifikt for Faktor VIII-R, iaktta en påvisbar respons og isolere den påviste Faktor VIII-R fra vertsystemet.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at det som spefikt bindende protein anvendes et primært antistoff.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at det som antistoff anvendes et polyklonalt antistoff.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at det som antistoff anvendes et monoklonalt antistoff.

13. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 9 -.12, karakterisert ved at antistoffet er forbundet med et stoff som gir en påvisbar respons.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at reagensblandingen omfatter et primært antistoff som er spesifikt for human Faktor VIII-R og et sekundært antistoff som er spesifikt for det primære antistoff.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at det primære og det sekundære antistoff begge er polyklonale.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at det sekundære antistoff er forbundet med et stoff som gir en påvisbar respons.

17. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 13 eller 16, karakterisert ved at stoffet som gir en påvisbar respons består av en isotop- eller ikke-isotop-markør.

18. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 13 og 16, karakterisert ved at stoffet består av et enzym, et substrat og et reagens som reagerer spesifikt på reaksjonen mellom enzymet og dets substrat, og gir en påvisbar respons.

19... Fremgangsmåte ifølge krav 18, karakterisert ved at enzymet er en peroxydase, substratet er et peroxyd og reagenset er et redox-kromogen.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at utvinningen av human Faktor VIII-R omfatter inkubasjon av det rekombinante vertsystem som inneholder ds-cDNA-blandingen med en merket oli-gonucleotid-probe som gir sekvensbestemmelse for minst en del av Faktor VIII-R-proteinet slik at proben hybridiserer med ds-cDNA som koder for Faktor VIII-R, og isolasjon og dyrking av den således identifiserte replikerbare ekspresjonsvektor som inneholder ds-cDNA for Faktor VIII-R.