NO853063L - Fremgangsmaate ved fremstilling av substituerte guanidinbenzosyrefenylestere. - Google Patents

Description

Oppfinnelsen angår nye, substituerte guanidinbenzo-syrefenylestere, deres anvendelse såvel som fremgangsmåter til fremstilling av dem og av farmasøytiske preparater inne-holdende disse i henhold til patentkravene.

Arylestere av 4-guanidinbenzosyrer er egnet for en vaginal befruktningshindring (US patent 4 4 23 069)•

De virker som inhibitor for det for en befruktning essen-sielle enzym akrosin, en innen akrosomet i spermatozoer lokalisert serin-proteinase. Akrosin er avgjørende viktig for den del av befruktningen ved hvilken spermatozoene trenger igjennom Zona pellucida (Oolemma) , de innerste tre skikt som omgir eggcellen.

Det har nu vist seg at de nye guanidinbenzosyreestere med den generelle formel I

hvor X er hydrogen, en cyanogruppe eller en alkoxygruppe med 1-4 carbonatomer, som f.eks. methoxy-, ethoxy- eller propoxygruppen, og Y er et hydrogenatom, en alkoxy- eller alkoxycarbonylgruppe med 1-4 carbonatomer, som f.eks. methoxy-, ethoxy-, propoxy- eller methoxycarbonyl-, ethoxy-carbonyl-, propoxycarbonylgruppen, eller en -C-NRR'-gruppe

0

hvor R og R<1>er et hydrogenatom eller en lavere mettet alkylgruppe med 1-4 carbonatomer som eksempelvis methyl-, ethyl-, propyl- eller i-propylgruppen, idet X og Y ikke samtidig skal være hydrogen, såvel som deres fysiologisk akseptable salter med uorganiske eller organiske syrer,

som f.eks. saltsyre, sitronsyre eller p-toluensulfonsyre, overraskende oppviser en betraktelig sterkere virksomhet overfor de kjente aryl-guanidinbenzoater såvel som

(human)-akrosininhibitor og også som antikonsepsjonsmidler

i dyreforsøk.

Farmakologiske iakttagelser

1. ) Akrosin (- human)- bestemmelse

Dette forsøk utgjør den egentlige primærsikting. Den gir et holdepunkt for den inhibitoriske effekt av en forbindelse på enzym (humanakrosin) selv, men tillater ennå ikke noen avgjørelse over den biologiske effektivitet (dvs. hemning av akrosin i det intakte spermium såvel som befruktningshindrende virksomhet) av de undersøkte forbindelser.

Det ved en sur ekstraksjon av humanspermier utvundne enzym akrosin inkuberes med forskjellige konsentrasjoner av den potensielle inhibitor, og den konsentrasjon bestemmes som fører til en 50%-ig hemning av akrosinaktivitet. Serum-proteinase-akrosinet spalter på fysiologisk vis fortrinnsvis arginin- og lysin-gruppene. Derfor anvendes for in vitro-undersøkelsen for aktivitetsbestemmelse av akrosin en benzoyl-arginin-ethylester som substrat.

De målte data (tabell 1) underbygger ikke bare en inhiberende virkning av forbindelsene ifølge oppfinnelsen (nr. 2 til 6) på enzymet akrosin, men underbygger også at deres effektivitet er større enn den tidligere kjente forbindelse nr. 1 som må anses som ledende forbindelse.

2. ) Gelatinolyse

Denne prøve er likeledes å anse som en bestanddel av primærundersøkelsen. For den ønskede befruktningshindrende virkning av en akrosininhibitor er det, foruten den egentlige akrosinhemning på det isolerte enzym, av essensiell betydning at en slik inhibitor er i stand til å trenge igjennom plasmaet og den ytre akrosomale membran av et intakt spermium, da akrosin er lokalisert i den indre akrosomale membran.

Som særlig egnet for undersøkelsen av denne spesielle problemstilling har gelatinolysemodellen ifølge P. Gaddum og R. Z. Blandau (Science 170: 749 - 751), modifisert ifølge W. B. Schill (Int. J. Andrology 4: 25 - 38) og efter egen utarbeidelse, vist seg. Ved denne metode anvendes det ikke belyste, fikserte og med methylenblått farvede film- plater for autoradiografi, hvis gelatinskikt blir oppløst ved den lytiske aktivitet av akrosin. Som følge derav danner det seg om spermiehodene godt synlige, hvite ringer (såkalt halogendannelse/lysisring). Ved en hemning av akrosin bortfaller dannelsen av disse ringer.

For å undersøke gjennomtrengbarheten av en påvist akrosininhibitor og dermed hemningen av akrosin i det intakte spermium blir humanspermier forinkubert med flere konsentrasjoner av inhibitoren.Derpå blir en aliquot anbragt på

de tilsvarende bearbeidede (se ovenfor) gelatinplater anbragt på objektglasset og inkubert i dyrkeskranken i fuktig atmos-fære. Derpå blir under fasekontrastmikroskopet graden av halogendannelse bestemt semikvantitativt.

De i tabell 2 angitte farmakologiske resultater av denne prøve underbygger

effektiviteten hhv. overlegenheten av anførte forbindelser over den tidligere kjente ledende forbindelse (nr. 1).

3.) In vitro- befruktning ( mus)

Denne prøve tillater en første kontroll av den befruktningshindrende effektivitet såvel som en kontroll av virkeprinsippet i og for seg: I en mediumdråpe ifølge Brinster, Whitten og Whittingham som inneholder inhibitoren, blir så de ved super-ovulering vundne oocytter overført. Derpå blir en aliquot av det ubehandlede musespermium pipettert. Konsentrasjonen av inhibitoren velges slik at ingen hemning av motiliteten foreligger. 24 timer senere blir antallet av de delte og ikke-delte oocytter og dermed befruktningshastigheten bestemt.

Det blir også prøvet om akrosininhibitoren som skal undersøkes, anvendt i et system i hvilket det umiddelbart kommer i kontakt med oocytter og sæd, kan hemme befruktning - uten at en hemning av motiliteten av sæden foreligger.

I tabell 3 er oppført den på grunnlag av denne prøve bestemte befruktningshemmende virkning av forbindelsene ifølge oppfinnelsen, eksempelvis av 2-cyano- hhv. 3-methoxycarbonyl-forbindelsen (nr. 2 hhv. 3) sammenlignet med den tidligere kjente, ledende forbindelse (nr. 1): verdiene viser en tydelig overlegenhet av de nye forbindelser.

4.) In vivo-befruktning (kaniner) etter kunstig insemin-asjon med preinkubert sæd

Denne prøve muliggjør angivelse av den befruktningshindrende effektivitet under in vivo-betingelser: Kaninsæd, som utvinnes ved hjelp av en kunstig vagina, preinkuberes med akrosininhibitoren som skal undersøkes. Derpå blir induksjon av en superovulasjon med PMS (pregnant mare serum) forbehandlede hunn-kaniner inseminert kunstig med forbehandlet sæd. Til utløsning av superovulasjon fåes til slutt HCG (human chorionic gonado-tropin). 36 timer senere avlives dyrene, eggledere og uteri taes ut og spyles for å få de tidlige embryoer, hhv. udelte oocytter, og på grunnlag av deres antall bestemmes befruktningshastigheten.

Også resultatene (se tabell 4) av dette in vivo-forsøk underbygger for forbindelsene ifølge oppfinnelsen anvendt i eksempel på forbindelsene nr. 2 og 3, i sammen-ligning med den ledende forbindelse (nr. 1) en overraskende høy økning av den befruktningshemmende virkning (befrukt-ningsgraden synker fra 51 til 4 hhv. 1%).

Bortsett fra det egentlige virkningsprinsipp blir den befruktningshindrende virkning av foreliggende forbindelser som skal patenteres, avgjort avhengig av den egnede formuler-ing .

For den praktiske anvendelse som legemiddel blir forbindelsene ifølge oppfinnelsen ved i og for seg kjente metoder i galenikken formulert til vaginal-befruktningshindrende midler.

Som anvendelsesform er geler, kremer, skum, små tapper eller oppløselige filmer, egnet. Foretrukket er anvendelsen av et "langsomt frigjørende" system for å få en vedvarende befruktningshindrende virkning over lengre tid (inntil 24 timer).

Som hensiktsmessige bærermaterialer som kan benyttes alene eller sammen med egnede oppløsningsmidler som vann og som må gi en lett fordeling av virkestoffet, men som selv ikke må være for flytende, kommer bl.a. polyethylenglycol-derivater som methylcellulose-forbindelser på tale.

Konsentrasjonen av virkestoffet ligger i området på 0,1 - 10,0 vekt%.

For anvendelse på mennesker utgjør doseenheten pr. anvendelse 1-10 mg.

Frems till ingen... av de ifølge oppfinnelsen anvendte guanidinbenzosyreestere med den generelle formel I skjer ifølge krav 8 etter i og for seg kjente metoder for for-estring av carboxylsyrer. Foretrukket er den ved 0°C - 30°C gjennomførte, ved dicyclohexylcarbodiimid-bevirkede og en sur, som f.eks. p-toluensulfonsyre, og en basisk, som f.eks. pyridin, katalysator påskyndet kondensasjon av fenoler med den generelle formel II

hvor X og Y er som angitt i krav 1, med et salt av 4-guani-dinbenzosyre (fortrinnsvis hydrokloridet) i et egnet inert, aprotisk, polart oppløsningsmiddel som eksempelvis dimethylformamid, dimethylacetamid, dimethylsulfoxyd, tetra-hydrofuran, diethylether, methylenklorid, acetonitril eller pyridin. Efter egnet opparbeidelse og rensning (som viktigste biprodukt må N,N'-dicyclohexylurea fjernes) ved konvensjonelle metoder som filtrering, ekstrahering med egnede oppløsningsmidler, såvel som fremfor alt kromato-grafiske skillemetoder blir den ønskede guanidinbenzosyre-ester med den generelle formel I, alt efter reaksjonsfør-ingen, erholdt som frie baser eller som uorganiske eller organiske salter, som f.eks. hydroklorid, citrat eller p-toluensulfonat. Ved for fagmannen kjente metoder og måter kan saltene overføres til de frie baser, hhv. kan de frie baser overføres til salter.

Eksempel 1

En blanding av 1,0 g (4,64 mmol) 4-guanidinbenzosyre-hydroklorid, 2,12 g (13,92 mmol) 3-hydroxybenzosyre-methyl-ester og 100 mg (0,58 mmol) vannfri p-toluensulfonsyre om-røres under argon ved 0°C i 4 ml pyridin i 15 timer. Efter tilsetning av 2,87 g (13,92 mmol) dicyclohexylcarbodiimid omrøres i ytterligere 3 dager ved værelsetemperatur, og derpå tilsettes 1 ml iseddik ved 0°C. Efter en røretid på 2 timer ved 0°C frafiltreres faststoff, filtratet tilsettes ca. 25 g is og syres med-5 N saltsyre til pH = 1. Efter underskiktning med 25 ml methylenklorid omrøres i nok 1 time under is-avkjøling og derpå inndampes ved 50°C. Den erholdte olje-krystall-blanding (9,93 g) kromatograferes på silicagel med methylenklorid/methanol/iseddik (80:20:0,1). Derpå omkrystalliseres fra kloroform, hvilket gir 270 mg 4-guanidin-benzosyre-(3-methoxycarbonylfenyl)-ester-hydroklorid med smeltepunkt 194 - 195°C.

Eksempel 2

Gjennomføring og anvendte mengder svarende til de i eksempel 1. Det blir imidlertid istedenfor 3-hydroxybenzo-syre-methylesteren anvendt 2,31 g (13,9 2 mmol) 3-hydroxy-benzosyre-ethylester. Den efter inndampning erholdte olje-krystallblanding (12,4 g) kromatograferes på silicagel med methylenklorid/methanol/iseddik (80:10:0,1), og den tilsvarende fraksjon (960 mg) omkrystalliseres fra aceton/ethanol. Man får 330 mg 4-guanidinbenzosyre-(3-ethoxycarbonylfenyl)-ester-hydroklorid med smeltepunkt 137°C.

Eksempel 3

Gjennomføring og anvendte mengder svarende til de i eksempel 1. Imidlertid blir det istedenfor 3-hydroxy-benzosyre-methylesteren anvendt 1,66 g (13,92 mmol) 2-hydroxybenzonitril. Den efter inndampning erholdte olje-krystallblanding (12,55 g) kromatograferes på silicagel med methylenklorid/methanol/iseddik (90:10:0,1), og den tilsvarende fraksjon omkrystalliseres fra 15 ml kloroform. Man får 960 mg 4-guanidinbenzosyre-(2-cyanfenyl)-ester-hydroklorid med smeltepunkt 178°C.

Eksempel 4

Gjennomføring og anvendte mengder svarer til dem i eksempel 1. Imidlertid anvendes istedenfor 3-hydroxybenzo-syre-methylester 2,15 g (13,92 mmol) 2,3-dimethoxyfenol. Den efter inndampning erholdte olje (4,46 g) kromatograferes på silicagel med methylenklorid/methanol/isedik (8:2:1), og den tilsvarende fraksjon på 750 mg digreres efter hverandre med 70 ml ethanol/methylenklorid (1:1) og 10 ml methylenklorid ved værelsetemperatur. Efter avsugning fåes 24 5 mg 4-guanidinbenzosyre-(2,3-dimethoxyfenyl)-ester-hydroklorid med smeltepunkt 197 - 201°C (spaltning).

Eksempel 5

Gjennomføring og anvendte mengder svarer til dem i eksempel 1. Imidlertid anvendes istedenfor 3-hydroxybenzo-syre-methylesteren 1,91 g (13,92 mmol) 3-hydroxybenzamid. Efter behandling med 5 N saltsyre og underskiktning med methylenklorid blir det utfelte faststoff (820 mg) avsuget og utkokt med 17 ml kloroform. Ved filtrering fåes 530 mg 4-guanidinbenzosyre-(3-carbamoylfenyl)-ester-hydroklorid med smeltepunkt 104 - 105°C.

Eksempel 6

Gjennomføring og anvendte mengder svarer til dem i eksempel 1. Imidlertid anvendes istedenfor 3-hydroxybenzo-syre-methylesteren 1,81 g (12,00 mmol) 3-hydroxy-N-methyl-benzamid. Efter behandling med 5 N saltsyre ekstraheres med methylenklorid. Vannfasen blir efter nøytralisasjon med natriumhydrogencarbonat inndampet, og det gjenblivende, faste residuum utrøres efter hverandre med 300 ml ethanol og 150 ml isopropanol.

De forenede filtrater inndampes, det oljeaktige residuum (2,40 g) kromatograferes på silicagel med methylenklorid/ethanol (1:1), og den tilsvarende fraksjon om krystalliseres fra 30 ml isopropanol. Man får 330 mg 4-guanidinbenzosyre-(3-methylcarbamoylfenyl)-ester-hydroklorid med smeltepunkt 194,5 - 195,6°C (spaltning).

Claims (10)

1. Guanidinbenzosyreestere med den generelle formel I

hvor X er et hydrogenatom, en cyanrest eller en alkoxygruppe med 1-4 carbonatomer, og Y er et hydrogenatom, en alkoxy- eller alkoxycarbonylgruppe med 1-4 carbonatomer eller en -C-NRR'-gruppe med R og R' i 0 betydningen et hydrogenatom eller en lavere, mettet alkylgruppe med 1-4 carbonatomer, idet X og Y ikke samtidig er hydrogen, såvel som deres fysiologisk akseptable salter med uorganiske eller organiske syrer.

2. 4-guanidinbenzosyre-(3-methoxycarbonylfenyl)-ester og dens hydroklorid.

3. 4-guanidinbenzosyre-(3-ethoxycarbonylfenyl)-ester og dens hydroklorid.

4. 4^guanidinbenzosyre-(2-cyanofenyl)-ester og dens hydroklorid.

5. 4-guanidinbenzosyre-(2,3-dimethoxyfenyl)-ester og dens hydroklorid.

6. 4-guanidinbenzosyre-(3-carbamoylfenyl)-ester og dens hydroklorid.

7. Guanidinbenzosyre-(3-methylcarbamoylfenyl)-ester og dens hydroklorid.

8. Fremgangsmåte ved fremstilling av forbindelser med den generelle formel I,karakterisert vedat man på i og for seg kjent vis kondenserer et salt av 4-guanidinbenzosyre med en fenol med den generelle formel II

hvor X og Y er som angitt i krav 1.

9. Legemiddel på basis av én eller flere forbindelser ifølge krav 1-7.

10. Anvendelse av én eller flere forbindelser ifølge krav 1-7 til fremstilling av legemidler.