NO854122L - Fremgangsm¨te for fremstilling av et nytt lymfokin. - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelsen vedrører et nytt lymfokin

som er fremstilt av humane T-celler eller humane T-celler hybridom.

"Lymfokin" er et fellesnavn for oppløselige forbindelser uten antistoff-funksjon som frigjøres av lymfocytter

som er aktivert av et antigen eller et mitogen og har forskjellige biologiske virkefelt. I snevrere forstand, representerer lymfokinene faktor-grupper som er fremstilt av aktiverte T-celler og virker som et primært medium med hensyn til celle-immunitet. Man har når nylig tatt i betraktning at lymfokinene videre representerer en annen faktor-gruppe som vedrører intercellulære reaksjoner i immunsystemet. Den første gruppen inkluderer makrofag vandring inhiberende faktor (MIF), makrofag aktiverende faktor (MAF) og lymfotoksin (LT), mens den siste gruppen inkluderer undertrykkelses-faktor for antistoffproduksjon, hjelpefaktor og T-celle-vekstfaktor (IL-2).

Lymfokinene oppnås fra supernatanten av en celle-kultur av normale lymfocytter i en meget begrenset mengde og med meget begrenset renhet, slik at mange lymfokiners funksjon ennå ikke er fullstendig kjent. Men mange har forsøkt å oppdage T-tumor-stammer som har evnen til å fremstille lymfokiner og tilveiebringe T-celle-hybridomer, da noen lymfokiner kan være klinisk tilgjengelige når de fremstilles i stor mengde. Som et resultat har man funnet en T-tumor-stamme (Jurkat-FHCRC) som har evnen til å danne IL-2. Videre har man fremstilt monoklonal anti-IL-2-.antistoff og anvendt dette ved vekst av T-celler. Videre har man fastslått hvilken rolle IL-2 spiller ved fremkalling av differensieringen av allo-killer T-celler og mRNA og

cDNA har blitt isolert og identifisert. Disse arbeidene

er blitt etablert i oversstemmelse med studier på interferon. Man venter at et lymfokin som oppnås i en stor mengde og i ren tilstand ved hjelp av teknisk genetikk som beskrevet over ikke bare vil bli tilgjengelig innen det kliniske området, men tjene som et meget viktig redskap i forståelsen av sammenhengen mellom dets struktur og

funskjon, funskjonsforløpet og dets rolle in vivo.

Man vet at naturlige killer-celler har en nedbrytende effekt på visse celler som er angrepet av kreft, og mye oppmerksomhet er gitt lymfokinene og deres påvirkning av ovennevnte celler. F.eks., har man vist at IL-2 og interferon bevirker en økning i aktiviteten av naturlige killer-celler. Man har foreslått at de naturlige killer-cellene kan danne noen faktorer som har en toksis virkning på cellene som er angrepet av kreft, og dermed utøver den ovennevnte antikreftvirkende effekt. Man har videre foreslått at de ovennevnte faktorene kan være en viss type lymfotoksin. På den annen side, ansees en faktor som frigjøres når human lymfocytter kommer i kontakt med cancer-celler og styrker lymfocyttenes cytotoksisitet, å være lymfotoksin. Videre har man vist at lymfotoksin vil øke cancer-cellenes sensitivitet overfor naturlige killer-celler. Dette viser at lymfotoksin kan spille en viktig rolle både direkte og indirekte som et lymfokin som påvirker aktiviteten til naturlige killer-celler.

For videre å illustrere det man har funnet for naturlige killer-celler og lymfotoksin, vises til følgende referanser 1) til 8):

1) Herberman, R.B., Djeu, J.K., Kay, H.D., Ortaldo,

J.R., Riccardi, C. , Bonnard, G.G. Holden, H.T., Fagnani,

R., Santoni, A. og Puccetti, P., Immunol. Rev., 44, 43

(1979) . 2) Vose, B.M. Riccardi, C, Bonnard, G.D. og Herberman, R.B., J. Immunol., 130, 768 (1983).

3) Domzig, W., Stadier, B.M. og Herberman, R.B.,

J. Immunol., 130, 1970 (1983).

4) Wright, S.C., Weitzeu, M.L., Kahle, R. Granger,

G.A. og Bonavida, B., J. Immunol., 130, 2479 (1083).

5) Kedar, E., Ikejiri, B.L., Sredni, B. Bonavida,

B. og Herberman, R.B., Cell. Immuno., 69, 305 (1982).

6) Weitzen, M.L. Yamamoto, R.S. og Granger, G.A., Cell Immuno., 77, 30 (1983). 7) Peter, H.H., Eife, R.F. og Kaldeu, J.R., J. Immunol., 116, 342 (1976); og

8) Ransom, J.H. og Evans, C.H., Int. J. Cancer, 29,

451 (1982).

Under disse omstendighetne, har man forsøkt ulike undersøkelser med hensyn til den antakelsen at der kan være et lymfokin som kan aktivere naturlige killer-celler. Man har tidligere etablert flere celle-linjer som vedrører lymfokin-produserende human-T-celle-hybridom, og vist nærværet av lymfokiner slik som MIF og MAF (jfr. referansene 9) til 11) som er anført senere). Samtidig har man også prøvd å fremstille human T-celle-hybridom som har evnen til å danne en naturlig killer-celle-aktiverende faktor ved hjelp av en spesiell behandling som er forskjellig fra dem som er anvendt tidligere. Man har funnet at human-T-celle-hybridomer som er avledet fra humane T-celler behandlet med albuskjell-hemocyanin ("keyhole limpet") vil danne en naturlig killer-celle-aktiverende faktor.

Det er følgelig et formål med den foreliagende oppfinnelse

å fremskaffe en ny naturlig killer-celle-aktiverende faktor. For å oppnå dette, viser den foreliggende oppfinnelse et lymfokin som er fremstilt ved hjelp av human T-celle-hybridom som stammer fra humane T-celler behandlet med albuskjell-hemocyanin og har følgende fysisk-kjemiske egenskaper: (a) det har en molekylvekt på omtrent 15.000 og 30.000,

( b ) det er kjemisk ustabilt i surt miljø,

( c) det utøver en aktiverende virkning på naturlige killer-celler,

( dV det viser ingen interleukin 2 aktivitet, og (e) det viser ingen interferon-aktivitet.

De følgende referansene 9) til 11) vedrørende lymfokin-dannende human T-celle-hybridom tilveiebragt ved hjelp av emetin-aktinomycin D-metoden er anført som referanse ved den foreliggende oppfinnelsen.

9) Kobayashi, Y., Asada, M., Higuchi, M. og Osawa,

T., J. Immunol., 128, 2714 (1982).

10) Asada, M., Higuchi, M. Kobayashi, Y. og Osawa,

T., Cell. Immunol., 77, 150 (1983) og

11) Higuchi, M., Asada, M., Kobayashi, Y. og Osawa,

T., Cell. Immunol., 78, 257 (1983).

De humane T-cellene som anvendes om utgangsmaterialer i overensstemmelse med oppfinnelsen er lett tilgjengelige for en fagkyndig på området.

De human T-cellene som anvendes i den foreliggende oppfinnelsen er lymfocytter fra humant perifert blod eller dem som er isolert fra human milt eller tymus. Skjønt lymfocytter fra perifert blod vanligvis benyttes, kan man bare anvende dem som er mononukleære celler, likeledes velges dem som har evnen til å danne rosetter (dvs. rosett-s": dannende celler ) og dem som kleber seg til plast (dvs. klebende celler).

Den foreliggende oppfinnelsen erkarakterisert vedat humane T-celler behandles med albuskjell-hemocyanin. Albuskjell-hemocyanin "keyhole limpet hemocyanin",

(KLH) som er et av mytogenene, er kommersielt tilgjengelig fra Calbiochem-Behring Co., CA. Behandlingen av humane

T-celler med KLH omfatter sensibilisering av en blanding

av de rosett-dannende cellene og de klebende cellene som beskrevet over, ved at cellene er i kontakt med KLH i et passende medium. Etter sensibiliseringen, kan disse cellene fortsette å vokse i et medium som inneholder IL-2.

Det humane T-celle-hybridom som vedrører den foreliggende oppfinnelse, kan fremstilles ved å fusjonere humane T-celler behandlet med KLH ved hjelp av en passende metode, slik som HAT fra separeringsmetoden eller emetin-aktinomycin-D-metoden, og utskilling av de oppnådde fusjonerte cellene

i overensstemmelse med funksjonen av aktivering av naturlige killer-celler. Den ovennevnte emetin-aktinomycin-D-metoden ble utført som følger:

De humane T-cellene som var behandlet med KLH blandes med

en human akutt leukemi-celle-stamme slik som CEM i et forhold 1:1 til 10:1. Polyetylen-glykol 4000 tilsettes deretter for å fusjonere cellene etterfulgt av fraseparering. Kloning kan utføres ved hjelp av en grense-fortynnings-metode. Som det vil bli beskrevet i de følgende eksemplene, har man oppnådd en stamme ved navn KC8-1 som det humane T-celle-hybridom i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelsen. Videre kloning av dette KC8-1 i overensstemmelse med funksjonen av aktivering av naturlige killer-celler, har resultert i to stammer med navn KC8-1-9 og KC8-1-10. Disse stammene (KC8-1, KC8-1-9 og KC8-1-10) er blitt deponert ved the Fermentation Research Insitutue.

Lymfokiner i den foreliggende oppfinnelse, som er tilstede

i supernatanten fra en celle-kultur har det humane T-celle-hybridom i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse, kan renses ved at supernatanten oppkonsentreres til en metningsgrad på 90% ved hjelp av ammoniumsulfat, eluering av konsentratet gjennom en blå Sepharose-kolonne (markedsført av Pharmacia AB) med PBS og oppsamling av fraksjonene som er i stand til å aktivere naturlige

killer-celler.

Molekylvekten til det rensede lymfokinet ble bestemt til omtrent 15.000 og 30.000 ved at lymfokinet elueres gjennom en TSK G3000-SW-kolonne med PBS etterfulgt av gel-filtrering. Det har vist seg at lymfokinet utviser en aktiverende virkning på naturlige killer-celler når det bestemmes ved hjelp av en fremgangsmåte som vil bli beskrevet under. I den foreliggende oppfinnelse har man kalt lymfokinet naturlig killer-celle-aktiverende faktor (IJKAF) . Man har videre funnet at aktiviteten faller merkbart når lymfokinene i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse, får oppholde seg ved en pH-verdi lik 2 i et døgn, noe som viser at lymfokinet i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse er kjemisk ustabil i surt miljø.

Man har videre funnet at lymfokinene i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse hverken utviser IL-2 aktivitet eller interferon aktivitet hvori begge bestemmes ved hjelp av fremgangsmåter som vil beskrevet senere.

Lymfokinet i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse synes å angripe naturlige killer-celler. Det betyr at lymfokinet i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse ikke kan utvise noen aktiviserende virkning på naturlige killer-celler ved en fremgangsmåte for bestemmelse av ovennevnte virkning som vil bli beskrevet under, hvor plast ikke-klebende PBS behandles med antiLeu-11 monoklonale antistoffer og kanin-komplement for derved på forhånd å fjerne naturlige killer-celler Leu-11 overflate-antigen. Dette viser at lymfokinet i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse krever naturlige celler som et mål. Leu-11 overflate-antigenet fra naturlige killer-celler er beskrevet i de følgende referanser:

12) Phillips, J.H. og Babcock, G.F., Immunol. Letters,

6, 143 (1983). 13) Lanier, L.L., Le, A.M. , Phillips, J.H., Warner, K.K. og Babcock, G.F., J. Immunol., 131, 1789 (1983). 14) Phillips, J.H., Le, A.M. og Lanier, L.L., J. Exp. Med., 159, 993 (1984).

Fremgangsmåte for bestemmelse av aktiverende virkning på naturlige killer-celler.

Lymfocytter fra humant perifert blod som er ikke-klebende til plast (betegnet som plast ikke-klebende PBL) tilsettes et RPMI-1640 medium inneholdende 10% bovint fetalt serum. Supernatanten fra humant T-celle-hybridom tilsettes. Den oppnådde blandingen justeres til et totalt volum på

100 pl for anvendelse som en prøve. Tettheten av plast ikke-klebende PBL justeres til 5 x 10~* celler/ml. Etter inkubering i 20 timer, ble en oppløsning på 100 ul av K562 celler (10 5 /ml) merket med<51>Cr tilsatt cellekulturen og blandingen inkuberes i ytterligere 4 timer. Deretter tas 100 ul av kultur-blandingen ut for å bestemme fritt "'"Cr-. Et kontroll-forsøk ble utført for seg på følgende måte :

100 ul av et RPMI-1640 medium inneholdende 10% bovint fetalt serum inkuberes i 20 timer og 100 ul av en 5 51 oppløsning av K562 celler (10 /ml) merket med Cr tilsettes. Blandingen inkuberes så ytterligere 4 timer, deretter ble 100 ul av blandingen tatt ut for bestemmelse av fritt Cr.

Den naturlige killer-celle-aktiviteten (heretter omtalt som NK-aktivitet) bestemmes ved at hver av de bestemte verdiene settes inn i følgende ligning:

hvori b er mengden av fritt ^"'"Cr (cpm) bestemt i kreft-

5 1 prøven, a er mengden fritt Cr (cpm) bestemt i kontroll-prøven og c er totalt mengde ^Cr tilstede i 100 pl av 5 51 oppløsningen av K562 celler (10 /ml) merket med Cr.

Hver verdi er et gjennomsnitt av tre serier.

Fremgangsmåten som beskrevet over velges med unntak av at ingen human T-celler-hybridom tilsettes for å bestemme NK-aktiviteten. Hver verdi er et gjennomsnitt av tre serier. NK-aktiviteten i det tilfelle der supernatanten fra en kultur av human T-celle-hybridom tilsettes omtales som S, mens det tilfelle der ingen supernatant fra en kultur av human T-celle-hybridom tilsettes omtales som R. Den naturlige killer-celle-aktiverende faktor aktivitet (heretter referert til som NKAF aktivitet) i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelsen er bestemt som følger:

I den foreliggende oppfinnelsen, viser en NKAF-aktivitet ikke er verdi som er bestemt i overensstemmelse med den ovennevnte ligning, men et forhold av NK-aktiviteter (dvs. R og S) dersom ikke annet er vist.

Fremgangsmåte for bestemmelse av IL-2-aktivitet.

Denne aktiviteten bestemmes som evnen en celle-kultur av human T-celle-hybridom har til å opprettholde veksten av muse IL-2-avhengige celler slik som Lc7. Det betyr at 5 x IO<3>Lc7-celler settes til 50 ul av et RPMI-1640-medium inneholdende 10% bovint futalt serum, og 50 ul av en fortløpende fortynnet celle-kultur av human T-celle-hybridom tilsettes. Blandingen inkuberes i 20 timer og bestråles med 0,5 pCi H-tymidin (spesifikk aktivitet på 0,5 Ci/mM, markedsført av Amersham. England) for dermed å bestemme opptatt radioaktivitet ved hjelp av en væske seintiliasjons-teller.

Man utfører fremgangsmåten som beskrevet over, med unntak av at det ikke tilsettes supernatant av celle-kultur av human T-celle-hybridom, for dermed å kunne bestemme radioaktiviteten. I den foreliggende oppfinnelse, representerer IL-2-aktiviteten et forhold mellom disse to aktivitetene som er bestemt i det ovennevnte.

Fremgangsmåte for bestemmelse av interferon-aktivitet.

Denne aktiviteten bestemmes som en antiviral aktivitet mot stomatitis virus. Det betyr at den uttrykkes som en nedgang i antall plakk som er dannet på humane amniotoksiske celler ved hjelp av ovennevnte virus. Fremgangsmåten for bestemmelsen derav er beskrevet i detalj i de følgende referansene 15) og 16).

15) Hooks, J.J., Hayes, B.F., Petrich-Hooks, B., Dieh., L.F., Gerrard, T.L. og Fcuuci, A.S., Blood, 59, 198

(1982).

16) Hooks, J.J., Moutsopoulos, M. , Geis, S., Stahl,

N.I., Decker J.L., Notkins, A.L., Immune interferon in the circulation of patients with autoimmune diseases,

N. Engl., J. Med., 301, 5 (1979).

Beskrivelse av tegningene:

Figur 1 er en grafisk fremstilling som viser forholdet mellom fraksjonen No. i gel-filtrering og den naturlige killer-celle-aktiverende faktor-aktivitet (% økning)

(se eksempel 1 - (h)).

Figur 2 er en grafisk fremstilling som viser radioaktiviteten og den naturlige killer-celle-aktiviteten i fraksjoner som er eluert med ulike elueringsmidler (se eksempel 1 - (h)).

For videre å illustrere den foreliggende oppfinnelsen,

vises til de følgende eksempler.

Eksempel 1

(a) Fremstilling av humane T-celler

Humant perifert blod ble samlet fra en donor YK og lagt lagvis på en Ficoll-Urografin-oppløsning og mononukleære celler ble samlet derfra ved hjelp av konsentrasjons-gradient sentrifugering med referanse til følgende litteratur: 17) Kawaguchi, T., Matsumoto, I. og Osawa, T., J. Biol., Chem., 249, 2786 (1974).

Saue-erytrocytter som var behandlet med 2-aminoetyl-isotiouronium-hydrobromid (AET) ble tilsatt til de mononukleære cellene for å danne rosetter, for deretter å isolere de rosett-dannende cellene med referanse i følgende litteratur:

18) Pellegrino, M.A., Ferrone, S., Dierich, M.P.

og Reisfeld, R.A., Clin. Immunol. Immunophatol., 3. 324

(1975).

De ovennevnte mononukleære cellene ble dyrket på petri-skåler av plast (3003; markedsført av Falcon Plastics, Bacton Dickinson Co., Cockenysvile, MD).i en time. Cellene som satt fast til overflaten av plastikkskålen ble samlet og behandlet ved å tilsette mitomycin C (50 ug/ml) i 30 min. for dermed å fremstille plast-klebende celler.

(b) KLII-behandling.

6 5 10 /ml av de rosett-dannende cellene og 10 /ml av de plast-klebende cellene, hvori begge ble oppnådd i (a), ble tilsatt til en RPNI-1640 medium inneholdende 10% bovint fetalt serum, 2 mM glutamin og 5 x 10 M 2-merkaptoetanol og dyrket i nærvær av 100 ug/ml albuskjell-hemocyanin

(KLH) i 10 dager. Levende celler ble igjen samlet ved hjelp av konsentrasjons-gradient-sentrifugering med anvendelse av en Ficoll-Urografin-oppløsning og tilsatt til et RPMI-1640 medium inneholdende 10% bovint fetalt serum med de plast-klebende cellene. Deretter ble disse cellene dyrket på nytt i ovennevnte medium i nærvær av 100 pg/ml KLH og 5% IL-2, mens mediet ble skiftet ut med friskt

RPMI-1640 medium inneholdende 10% bovint fetalt serum og

5% IL-2 ved et interval på 5 dager.

(c) Fremstilling av CEM behandlet med emetin-aktinomycin

D.

CEM ble suspendert i et RPMI-1640 medium til man oppnådde

en tetthet på 2 x 10^ celler/ml og behandlet ved tilsetning

_5

av 5 x 10 M emetin-hydroklorid og 0,25 jig/ml aktinomycin D ved 37°C i nærvær av 5% CC^i 2 timer. Etter at behandlingen var ferdig, ble cellene vasket med PBS i 4 timer og et NEM-medium ble tilsatt.

(d) Fusjon

Etter en dyrking av cellene i 30 dager, ble cellene som beskrevet i (b) fusjonert med CEM behandlet med emetin-aktinomycin D. Deretter ble de dyrkede cellene fra (b) vasket grundig for å fjerne KLE, sentrifugert og oppløst i et MEM-medium (pH 7,2) inneholdende 25 mM HEPES. CEM som var behandlet med emetin-aktinomycin D som vist i (c) ble blandet dermed i et forhold på 10 : 1. Blandingen ble sentrifugert for å få dannet pellets hvortil det ble tilsatt 0,5 ml av et MEM-medium inneholdende 46% etylen-glykol, 15% dimetyl-sulfoksyd og 5 ug/ml poly-L-arginin (molekylvekt 60.000) som var forvarmet til 37°C. Blandingen fikk stå ved sakte omrøring ved 37°C i 45 sek. og deretter fortynnet gradvis med et MEM-medium inneholdende 25 mM

HEPES inntil et volum på 10 ml. Blandingen ble

sentrifugert for å oppnå pellets som sakte ble oppløst i et vanlig medium inntil det ble oppnådd en tetthet på 5 6 5 x 10 celler/ml. Til 6,0 x 10 av disse cellene, ble det tilsatt 1,2 x 10^ CEM celler behandlet med 25 ug/ml mitomycin C ved 37°C i 30 min. som næringsgivende celler. Porsjoner på 0,2 ml av denne blandingen ble overført til

en plate med 96 brønner. 100 ul av mediet i hver brønn ble daglig erstattet med nytt i en uke etter fusjonen. Etter noen dager døde CEM-cellene som var behandlet med emetin-aktinomycin C og dem som var bébehandlet med mitomycin C,

mens de fusjonerte cellene i tre brønner blant 20 viste utmerket vekst to uker etter fusjoneringen.

(e) Kloning

Kloningen ble utført ved hjelp av en grense-fortynnings-metode. Det betyr at en utvalgt KC8-stamme ble tilsatt en plate med 96 brønner til man oppnådde en tetthet på

0,5 celler/brønn. Samtidig ble 2 x 10 5/ml CEM-celler behandlet med 50 ug/ml mitomycin C i 30 min. tilsatt som næringsgivende celler. 10 til 14 dager etter tilsetningen, ble det observert vekst av klonen. Denne stammen er blitt kalt KC8-1 og deponert i Fermentation Research Institute. (f) Bestemmelse av overflate-egenskaper hos hybridom.

Overflate-egenskaper hos KC8-1 ble bestemt ved hjelp av en to-trinns bindings-test med anvendelse av OKT 3, 4, 8 og 11 (markedsført av Ortho Pharmaceutical Co., Raritan, NJ).

Man fant at eksprimeringen av OKT 8 og 11 var høyere når de ble sammenlignet med CEM 11 (p<<>0,01 i Students t-test). To-trinns bindings-testen er beskrevet i detalj i referansene 9) som vist over.

(g) Rensing av lymfokin.

KC8-1 ble dyrket ved en celle-tetthet på 10^ celler/ml

i 20 timer. Supernatanten av celle-kulturen ble tatt ut og mettet med ammonium-sulfat til en metningsgrad på 90%. Det dannede precipitatet ble samlet og eluert med PBS gjennom en blå Sepharose-kolonne (5,0 ml, markedsført av Pharmacia, Sverige). Deretter ble eluatet dialysert mot PBS for å oppnå renset lymfokin.

(h) Fysisk-kjemisk bestemmelse.

Det rensede lymfokin som ble oppnådd i (g) ble ført gjennom en TSK G3000-SW-kolonne med anvendelse av PBS ved en strømnings-hastighet på 0,25 ml/min. Den naturlige killer-celle-aktiviteten for hver fraksjon ble bestemt. Figur 1 viser resultatet hvor ordinaten betegner en NKAF-aktiviteten beregnet i overensstemmelse med ligningen som er vist i fremgangsmåte for bestemmelse av naturlig killer-celle-aktiverings-faktor-aktivitet som beskrevet over og hvori pilene viser elueringsstedene av standard proteiner med kjent molekylvekt, dvs. den venstre pilen viser elueringsstedet av ovalbumin (44K) mens den høyre pilen viser elueringsstedet av ribonuklease (14K). Figur 1 antyder at molekylvektene av lymfokinet i den foreliggende oppfinnelse er 15K og 30K.

Den naturlige killer-celle-aktiviteten av renset lymfokin oppnådd i (g) ble bestemt umiddelbart etter rensingen og etter henstand ved pH 2 i et døgn. De således bestemte NK-aktivitetene var 33,2<±>7,2% og 6,1 - 5,7%, mens NK-aktiviteten bestemt i fravær av renset lymfokin var 13,1 i 4,2%. Dette resultatet viser at lymfokinet i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse er ustabilt i surt miljø.

I likhet med fremgangsmåten beskrevet i (g) , ble supernatanten fra en celle-kultur av KC8-1 oppsamlet og ammonium-sulfat ble tilsatt inntil man oppnådde en metningsgrad på 90%. Det dannede precipitatet ble oppsamlet og eluert trinnvis gjennom en blå Sepharose-kolonne med 7,5 ml PBS (elueringsmiddel A), 10 ml PBS (elueringsmiddel B), 10 ml av en 10 mM fosfat-buffer-oppløsning (pH 7,0) inneholdende 1,0 ml natrium-klorid (elueringsmiddel C) og en 10 mM fosfat-buffer-oppløsning (pH 7,0) inneholdende 50% etylen-glykol (elueringsmiddel D). Den naturlige killer-celle-aktiviten og radioaktiviteten av hver fraksjon ble bestemt ved hjelp av fremgangsmåtene som beskrevet i fremgangsmåte for bestemmelse av naturlig killer-celle-aktiverings-f aktor-aktivitet og i fremgangsmåten for bestemmelse av IL-2-aktivitet med unntak av at supernatanten fra celle-kulturen av human T-celle-hybridom ble erstattet av hver fraksjon som var eluert med hvert elueringsmiddel. Figur 2 viser resultatet hvori den øvre del av ordinaten betegner radioaktiviteten, mens den nedre del betegner den naturlige killer-celle-aktiviteten; og A, B, C og D i abscissen hver og en betegner en fraksjon eluert med det tilsvarende elueringsmiddel, mens E betegner en kontroll der det ikke er tilsatt noen fraksjon. Figur 2 viser at lymfokinet i den foreliggende oppfinnelse utviser en naturlig killer-celle-aktiverings-faktor-aktivitet og ingen IL-2-aktivitet.

Interferon-aktiviteten av det rensede lymfokinet som ble oppnådd (g) er ikke mer enn 1 IU/ml og kan ignoreres. Derfor har lymfokinet i den foreliggende oppfinnelse ikke utvist noen interferon-aktivitet.

Eksempel 2

Det humane T-celle-hybridom KC8-1 som ble oppnådd i eksempel 1, ble klonet ved hjelp av den samme grense-fortynnings-metoden som beskrevet i eksempel 1 - (e) til å gi syv stammer, hvoriblant KC8-1-9 og KC8-1-10 har deponert i Fermentation Research Institute. NKAF-aktivitetene fra supernatantene av celle-kulturene av disse to stammene ble bestemt. NK-aktiviteten av den første var 9,5<±>1,7%, mens aktiviteten av den siste var 9,0 - 1,3%, sammenlignet med aktiviteten i fravær av supernatant (dvs. 6,8<±>0,3%). Dette betyr at begge utviser NKAF-aktiviteter.

For å bekrefte at målet for lymfokinet i den foreliggende oppfinnelse er naturlige killer-celler, ble følgende forsøk utført.

Forsøks-eksempel.

Prøve

De følgende plast ikke-klebende PBL (A) til (C) ble klargjort som prøver: (A) plast ikke-klebende PBL; (B) plast ikke-klebende PBL behandlet med antiLeu-llb monoklonalt antistoff (1 pl/10 celler) og kanin-komplement (markedsført av Cedarlane, Ontario, Canada) og innstilt til samme celle-tetthet som i (A); og

(C) plast ikke-klebende PBL behandlet med kanin-komplement (se ovenfor) og innstilt til samme

celle-tetthet som i (B).

Fremgangsmåte

Fremgangsmåtene som er beskrevet i det ovennevnte for bestemmelse av naturlig killer-celle-aktiverings-faktor-aktivitet ble fulgt med unntak av at plast ikke-klebende PBL ble erstattet av prøve (A), (B) eller (C) og at supernatanten fra celle-kulturen av human T-celle-hybridom ble erstattet med fraksjonen som var eluert med elueringsmiddel A som vist i eksempel 1 - (h) for dermed å bestemme de naturlige killer-celle-aktivitetene S og R. Slutt-konsentrasjonen av lymfokinene i den foreliggende oppfinnelsen ble innstilt til 20%.

Resultater

Tabell 1 viser resultatet.

Som vist i tabell 1 - (B), er den naturlige killer-celle-aktiviteten senket ved å fjerne naturlige killer-celler inneholdende Leu-11 overflate-antigen. Det er dermed innlysende at lymfokinet i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse har de naturlige killer-cellene som et mål.

Claims (4)

1. En fremgangsmåte for fremstilling av et lymfokin, karakterisert ved at man dyrker humane killer-celler i nærvær av albuskjell ("keyhole limpet") hemocyanin for oppnåelse av human T-celle-hybridom, og separering av lymfokinet med følgende fysisk-kjemiske egenskaper: (å) lymfokinet har en molekylvekt på omtrent 15.000 og 30.000, (" b) lymfokinet er kjemisk ustabilt i surt miljø, (c) lymfokinet utøver en aktiverende virkning på naturlige killer-celler, (id) lymfokinet viser ingen interleukin-2-aktivitet, og (e) lymfokinet viser ingen interferon-aktivitet.

2. En fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det som humane T-celler anvender celler som skriver seg fra humant perifert blod.

3. En fremgangsmåte som angitt i kravene 1-2, karakterisert ved at det som humant T-celle-hybridom anvendes KC8-1.

4. En fremgangsmåte som angitt i kravene 1-2, karakterisert ved at det som humant T-celle-hybridom anvendes KC8-1-9 og KC8-1-10.