NO854823L - Ren chymopapain b: industriell prosess og terapeutisk preparat. - Google Patents
Ren chymopapain b: industriell prosess og terapeutisk preparat.Info
- Publication number
- NO854823L NO854823L NO854823A NO854823A NO854823L NO 854823 L NO854823 L NO 854823L NO 854823 A NO854823 A NO 854823A NO 854823 A NO854823 A NO 854823A NO 854823 L NO854823 L NO 854823L
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- chymopapain
- approx
- enzyme
- buffer
- issued
- Prior art date
Links
- 108090001069 Chymopapain Proteins 0.000 title claims description 222
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 39
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 title claims description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 5
- 229960002976 chymopapain Drugs 0.000 claims description 114
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 73
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 50
- DEOKFPFLXFNAON-UHFFFAOYSA-N N-α-Benzoyl-DL-arginine 4-nitroanilide hydrochloride Chemical group Cl.C=1C=C([N+]([O-])=O)C=CC=1NC(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C1=CC=CC=C1 DEOKFPFLXFNAON-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 43
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 42
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 35
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 28
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 22
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 claims description 19
- 241000219173 Carica Species 0.000 claims description 18
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 claims description 18
- 235000009467 Carica papaya Nutrition 0.000 claims description 17
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 17
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 15
- 229920000126 latex Polymers 0.000 claims description 15
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 15
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 15
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 14
- 239000004816 latex Substances 0.000 claims description 14
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 claims description 13
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 12
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 claims description 12
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 11
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims description 11
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims description 10
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 10
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 claims description 9
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 8
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 claims description 7
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 6
- 239000003774 sulfhydryl reagent Substances 0.000 claims description 6
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 claims description 5
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 claims description 5
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 4
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 3
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 claims description 3
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 claims description 3
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 claims description 2
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- ISWQCIVKKSOKNN-UHFFFAOYSA-L Tiron Chemical compound [Na+].[Na+].OC1=CC(S([O-])(=O)=O)=CC(S([O-])(=O)=O)=C1O ISWQCIVKKSOKNN-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 10
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 claims 8
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims 2
- RALRVIPTUXSBPO-UHFFFAOYSA-N 4-[4-chloro-3-(trifluoromethyl)phenyl]piperidin-4-ol Chemical compound C=1C=C(Cl)C(C(F)(F)F)=CC=1C1(O)CCNCC1 RALRVIPTUXSBPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims 1
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 claims 1
- XXAXVMUWHZHZMJ-UHFFFAOYSA-N Chymopapain Chemical compound OC1=CC(S(O)(=O)=O)=CC(S(O)(=O)=O)=C1O XXAXVMUWHZHZMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 115
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 54
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 53
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 53
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 28
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 28
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 25
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 25
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 25
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 23
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 18
- 239000000047 product Substances 0.000 description 18
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 17
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 16
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 10
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 10
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 description 10
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 10
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 9
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 9
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 description 8
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 8
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 8
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 7
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 7
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 6
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 6
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 6
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 6
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 5
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 5
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 5
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 5
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 5
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 5
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 5
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 5
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 4
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 4
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 4
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 4
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 3
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 3
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 3
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 3
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 3
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 3
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 240000006432 Carica papaya Species 0.000 description 2
- QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N Disodium Chemical class [Na][Na] QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 2
- 206010050296 Intervertebral disc protrusion Diseases 0.000 description 2
- 241000239218 Limulus Species 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 2
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 2
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 description 2
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 2
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 150000004662 dithiols Chemical class 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 108010072542 endotoxin binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- LJPYJRMMPVFEKR-UHFFFAOYSA-N prop-2-ynylurea Chemical compound NC(=O)NCC#C LJPYJRMMPVFEKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 2
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 2
- 210000001032 spinal nerve Anatomy 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- NCQJBPXXRXOIJD-UHFFFAOYSA-N 3-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]-3-naphthalen-2-ylpropanoic acid Chemical compound C1=CC=CC2=CC(C(CC(O)=O)NC(=O)OC(C)(C)C)=CC=C21 NCQJBPXXRXOIJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 4-nitroaniline Chemical compound NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- GAWIXWVDTYZWAW-UHFFFAOYSA-N C[CH]O Chemical group C[CH]O GAWIXWVDTYZWAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000219172 Caricaceae Species 0.000 description 1
- YTPLMLYBLZKORZ-UHFFFAOYSA-N Divinylene sulfide Natural products C=1C=CSC=1 YTPLMLYBLZKORZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000003618 Intervertebral Disc Displacement Diseases 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- RSYYQCDERUOEFI-JTQLQIEISA-N N-benzoyl-L-arginine Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)C1=CC=CC=C1 RSYYQCDERUOEFI-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 206010039509 Scab Diseases 0.000 description 1
- 208000008765 Sciatica Diseases 0.000 description 1
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 1
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical compound [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101710097834 Thiol protease Proteins 0.000 description 1
- GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N Titan oxide Chemical compound O=[Ti]=O GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 208000024780 Urticaria Diseases 0.000 description 1
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003916 acid precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 230000002052 anaphylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036783 anaphylactic response Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000022 bacteriostatic agent Substances 0.000 description 1
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 1
- 238000005452 bending Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 238000001804 debridement Methods 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005108 dry cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- YQDHCCVUYCIGSW-LBPRGKRZSA-N ethyl (2s)-2-benzamido-5-(diaminomethylideneamino)pentanoate Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(=O)OCC)NC(=O)C1=CC=CC=C1 YQDHCCVUYCIGSW-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000000968 fibrocartilage Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Natural products SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000007803 itching Effects 0.000 description 1
- 238000002684 laminectomy Methods 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 210000000276 neural tube Anatomy 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 210000001696 pelvic girdle Anatomy 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005375 photometry Methods 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 230000036316 preload Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 1
- 230000001698 pyrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000011514 reflex Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000001226 reprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 231100000046 skin rash Toxicity 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- SRRKNRDXURUMPP-UHFFFAOYSA-N sodium disulfide Chemical compound [Na+].[Na+].[S-][S-] SRRKNRDXURUMPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L sodium disulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)S([O-])(=O)=O HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000010262 sodium metabisulphite Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000010414 supernatant solution Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000002277 temperature effect Effects 0.000 description 1
- OGIDPMRJRNCKJF-UHFFFAOYSA-N titanium oxide Inorganic materials [Ti]=O OGIDPMRJRNCKJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/63—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
- G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
- G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
- G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
- G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
- G01N2333/96466—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Botany (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for isolering av store mengder chymopapain B og chymopapain C fra enten papayalateks eller chymopapain-råpreparater. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen gir homogene polulasjoner av chymopapain B og chymopapain C, frie for kryss-kontaminering og frie for andre proteiner. Denne fremgangsmåten gir i industriell/kommersiell målestokk store mengder chymopapain B og store mengder chymopapain C med lave nivåer av pyrogener. Fremgangsmåten er hurtig, enkel og egnet for utførelse i industriell målestokk uten større tilpasninger eller komplikasjoner.
Foreliggende oppfinnelse innbefatter også terapeutiske preparater som består vesentlig av chymopapain B uten forurensning av chymopapain C. En ny fremgangsmåte for måling av aktiviteten til chymopapainene er også tilveiebragt.
Chymopapain angår generelt en gruppe proteolytiske sul fhyd ryi enzym er som man nå har erkjent er forskjellig fra papain og utgjør hovedkompo-nenten i rå papayalateks avledet fra Carica papaya, Caricaceae. Chymopapain ble først delviskarakteriserti 1941 av Jansen og Balls. Se: J. Biol. Chem. 137:459 (1941); US patent 2.313.875 (1943). Chymopapain har blitt ansett for å bestå av fire komponenter, hvorav to, chymopapain A og chymopapain B, har molekylvekter på ca. 35.000 og har blitt isolert i laboratoriet og studert. Se: The Merck Index, 10. utgave (1983), Entry No. 2244, side 322.
Proteolytiske enzymer avledet fra papayaplanten har lenge vært benyttet
i industrien. Se generelt: US patent 1.826.467, gitt til Harteneck 6. oktober 1931 (avkoking av råsilke og koagulat-gummilateks); US patent 1.967.679, gitt til Muench et al. 24. juli 1934 (fjerning av hår fra huder);
US patent 2.095.300, gitt til Wallerstein 12. oktober 1937 (avkoking av silke); US patent 2.219.209, gitt til Neuf eld 22. oktober 1940 (mørning av kjøtt); US patent 2.464.200, gitt til Hall 15. mars 1949 (mørning av kjøtt); US patent 3.235.468, gitt Hogan 15. februar 1966 (mørning av kjøtt); US patent 3.296.094, gitt til Cayle 3. januar 1967 (mørning av kjøtt); US patent 3.466.706, gitt til Beuk 27. mai 1969 (mørning av kjøtt); US patent 3.709.790, gitt til Beuk 9. jan. 1973 (mørning av kjøtt); US patent 3.776.693, gitt til Smith et al. 4. desember 1973 (tørrensing); US patent 4.024.285, gitt til Beuk et al. 17. mai 1977 (mørning av kjøtt); og US patent 4.118.515, gitt til Rømmele et al. 3. oktober 1978 (hindring av kald-turbiditet i øl).
Samtidig med slike industrielle anvendelser har betydelige anstrengelser vært foretatt for å aktivere og stabilisere disse enzymene. Se generelt: US patent 1.826.467, gitt til Harteneck 6. oktober 1931; US Patent 1.967.679, gitt til Muench et al. 24. juli 1934; US patent 2.095.300, gitt til Wallerstein 12. oktober 1937; US patent 2.130.137, gitt til Klotz 13. september 1938; US patent 2.257.218, gitt til Balls 30. september 1941; US patent 2.676.138, gitt til Hinkel 20. april 1954; US patent 3.019.171, gitt til Block et al. 30. januar 1962; US patent 3.284.316, gitt til Cayle 8. november 1966; US patent 3.539.451, gitt til Heinicke 10. november 1970; US patent 3.709.790, gitt til Beuk et al. 9. januar 1973; US patent 4.011.169, gitt til Diehl et al. 8. mars 1977; US patent 4.024.285, gitt til Beuk et al. 17. mai 1977; og US patent 4.118.515, gitt til Rommele et al.
3. oktober 1978.
Nylig har medisinske anvendelser for de proteolytiske enzymene avledet fra papaya også blitt undersøkt. Se f.eks. US patent 3.019.171, gitt til Block et al. 30. januar 1962 (fysiologisk debridement av brannskorpe, blod og puss); US patent 3.072.532, gitt til Innerfield 8. januar 1963 (kjemoterapi); US patent 3.320.131, gitt til Smith 16. mai 1967 (behandling av brokkdannelse av intevertebralskiver); US patent 3.558.433, gitt til Stern 26. januar 1971 og overdratt til Baxter Laboratories, Inc.
(behandling av brokkdannede intevertebralskiver og akselerasjon av den postkryokirurgiske helingsprosess); og US patent 4.374.926, gitt til Stern 22. februar 1983 og overdratt til Smith Laboratories, Inc. (behandling av abnormale, skadede eller brokkdannede skiver).
Medisinske anvendelser av de proteolytiske enzymene avledet fra papayaplanten har blitt forsinket av toksisitet- og antigenisitetsproblemer. Uheldige fysiologiske effekter ble observert når slike enzymer ble injisert i levende kveg for å bevirke ante-morten mørning av kjøtt. Se generelt: US patent 3.235.468, gitt til Hogan 15. februar 1966; US patent 3.446.706, gitt til Beuk 27. mai 1969; og US patent 3.707.790, gitt til Beuk 9. juni 1973. US patent 3.923.599, gitt til Hess et al. 2. desember 1975, rappor terte en fremgangsmåte for fremstilling av planteenzympreparater, f.eks. papain, med lavt bakterieinnhold. US patent 4.024.285, gitt til Beuk 17. mai 1977, rapporterte en metode for behandling av papain av matvarekvalitet eller råpapain, hvorved intravaskulær ante-morten injeksjon angiveligvis ikke resulterte i uheldige fysiologiske reaksjoner. Nevnte US patent 4.024.285 angir også at det i både råpapain og papain av matvarekvalitet er til stede flere proteolytiske enzymer andre enn rent papain, og at chymopapainproteaser kan utgjøre opptil 90% av de totale proteasene i kommersielle pulvere av papain av matvarekvalitet og råpapain. US patent4.374.926, gitt til Stern 22. februar 1983, beskriver en fremgangsmåte for fremstilling av det som angis å være en forbedret chymopapain med lavere toksisitetsrisiko og lavere sensitive r ingstilbøyelighet ved intravenøs og intradermal injeksjon i laboratoriedyr.
Problemer som skyldes toksisitet og antigenisitet hos chymopapain-preparater, har hittil gjort sitt til å forpurre utviklingen av chemo-nukleolitiske terapier som representerer et stort potensial med henblikk på å lindre de kliniske manifestasjoner som resulterer fra brokkdannelse av intervertebralskiver generelt og av lumbal-intevertebralskiver spesielt. Den voksne ryggsøylen består av en rekke av 24 ben som danner den fleksible, sentrale aksen i sjelettet. Ryggsøylen omslutter ryggmargen, understøtter hodet, holder ribbene lateralt, og er nedentil festet til bekkenringen. De ben som utgjør ryggsøylen, betegnes rygghvirvler. Hver rygghvirvel er vesentlig en hul sylinder av ben med flate øvre og undre overflater. Ryggmargen og -nervene løper gjennom sentralhulrommet. De flate overflatene på tilstøtende rygghvirvler er sammenbundet ved hjelp av intevertebral-bruskskiver. Skivene er noe bøyelige, og tillater bøying av ryggsøylen. Hver skive har ringer av solid fiberbrusk, betegnet annulus fibrosus, langs den ytre og indre omkrets. Disse ringer omgir og holder tilbake et mykt, sammenpressbart senter, betegnet nukleos pulposus, som virker som et støtabsorberende element. Nukleus pulposus er spesielt godt utviklet i intevertebralskivene mellom de fem store lumbalhvirvler, beliggende i den nedre del av ryggen, som understøtter vekten av den øvre torso. Disse nedre intevertebralskivene utsettes for store krefter, og er de som mest sannsynlig utsettes for brokkdannelse: skade eller svekkelse av annulus fibrosus, og omgivende ligamenter gjør at nukleus pulposus presses inn i nervekanalen og støter mot nerver som leder fra ryggsøylen til bena og nedre torso. Kliniske manifestasjoner av smerte i den nedre del av ryggen, sciatica, og paralyse kan bli resulta-tet.
Chemonukleolyse er et lovende alternativ til kirurgiske metoder, f.eks. laminektomi og diskektomi, for reparasjon av de lumbalskive-brokk-dannelser som ikke reagerer på konservativ terapi. En kanyle innføres forsiktig og anbringes i den brokkdannede nucleus pulposus, og en liten mengde proteolytisk enzym injiseres deri for å oppløse nucleus pulposus og utløse trykket på spinalnervene. Chymopapain er det valgte proteolytiske enzym for chemonukleolysis fordi det selektivt hydrolyserer chon-dromucoproteinstrukturen til nucleus pulposus, men angriper ikke vesentlig den kollagene annulus fibrosus. Den generelle chemonucleolyse-teknikken har vært kjent over to desenner, se f.eks. US patent 3.320.131, gitt til Smith 16. mai 1967 og overdratt til Baxter Laboratories, Inc. Det lovende ved denne "kjemiske kirurgi" har blitt hindret bl.a. av den markerte toksisiteten og antigenisiteten til chymopapainpreparatene som hittil har vært tilgjengelige. Milde til sterke anafylaktoide reaksjoner har blitt observert etter injeksjon av endog relativt raffinerte chymopapain-preparater i omkring 1% av alle pasienter, og disse reaksjoner er livs-truende dersom de ikke behandles raskt og riktig. En allergisk reaksjon kan oppstå umiddelbart eller opptil 1 time etter injeksjon og kan vare i fra munitter til flere timer. Dessuten kan reaksjoner slik som utslett, urticaria eller kløe oppstå så sent som 2 uker etter chemonukleolyse med de tidligere kjente chymopapainpreparatene. P.g.a. faren for anafylakse blir chemonukleolyse i dag kontraindikert hos pasienter som tidligere har blitt injisert med en eller annen form for chymopapain.
Chymopapainpreparatene i den tidligere teknikk ble isolert ved ekstraksjonsmetoder som typisk representerte forbedring av tidligere metoder med isolering av proteolytiske enzymer fra papaiaplanter generelt. Slike tidligere metoder innebar vanligvis forskjellige utsaltingstrinn for å utfelle forurensninger og for selektivt å utvinne papain-fraksjoner som viste enzymatisk aktivitet. Se generelt følgende US patenter: Nr. 1.959.750, gitt til Wada 22. mai 1934 (acetonutfelling) ;nr. 2.219.209, gitt til Neufeld 22. oktober 1944; nr. 2.492.580, gitt til Kauffman et al 27. desember 1949; nr. 2.669.559, gitt til Reid 15. februar 1954 (utsalting med ioneutvekslingsharpikser); nr. 2.950.227, gitt til Gibian 23. august 1960 (tiocyanat-utfelling); nr. 2.958.632, gitt til Schwartz et al. 1. november 1960 (sulfatsalt-utf elling); nr. 3.011.952, gitt til Lesuk 5. desember 1961 (sekvensmessig utfelling med laverealkanol); nr. 3.141.832, nr. 3.248.300, nr. 3.248.301, nr. 3.274.072 og nr. 3.274.073, alle gitt til Burdick henholdsvis 21. juli 1964, 26. april 1966, 26. april 1966, 20. september 1966 og 20. september 1966 (aceton- eller amonium-sulfat-utfelling); nr. 3.210.257, gitt til Cayle 5. oktober 1965 (syre-, ammoniumsulfat- og oppløsningsmiddel-utfellinger); og nr. 3.694.315, gitt til Boudart 26. september 1972.
Slike utsaltingstrinn har generelt blitt supplert av forskjellige kromatografiske separeringsmetoder. Se: US patent 3.104.206, gitt til Messing 17. september 1963 (rapporterer gelfiltrering av papain og dekstran-kolonne; US patent 3.983.001, gitt til Coupek et al. 28. september 1976 (rapporterer isolering av papain på en kolonne av hydroksyetylmet-aktylatgel med kovalent bundet p-aminofenylkvikksølvacetat); US patent 4.020.268, gitt til Nishikawa et al. 26. april 1977 (rapporterer isolering av papain på kolonner av affinitetsadsorpsjonsmiddel); f.eks. karboksymetylcellulose, eller kryssbundede dekstraner; og US patent 4.318.990, gitt til Thompson & al. 9. mars 1982 (rapporterer separering av papain på kolonne av titanoksydpartikler).
Flere andre isolasjonsmetoder er kjent og kombinerer enten satsvis med kromatografiske teknikker, eller angir behovet for oppnåelse av en viss optimalisering av forskjellige isoleringsparametere.
US patent 3.011.952, gitt til Lesuk 5. desember 1961, rapporterer en fremgangsmåte for rensing av papain ved dispergering av råenzymene i vann, tilsetning av en mengde av vannblandbar laverealkanol til det begynnende utfellingspunktet for de proteolytiske enzymene, for derved å holde tilbake den normale proteolytiske aktivitet i oppløsningsmiddelfasen mens størstedelen av forurensningene som er uoppløselige i den lavere alkanolen utfelles. Det angis at for å utfelle den maksimale proteolytiske aktiviteten til det rensede enzymet, så var det fordelaktig først å bestemme den optimale konsentrasjonen av laverealkanol som skulle benyttes. F.eks., til aliquot-porsjoner av en dispersjon av 100 g rå papain i 120 ml vann ved 24^C, ble det tilsatt varierende mengder1 metanol for oppnåelse av varierende oppløsningsmiddelkonsentrasjoner til området 60-90% (v/v) i oppløsningsmiddelfasen. Etter likevektsinnstilling i 1 time ved 24°C ble de respektive utfellinger isolert, og den proteolytiske aktiviteten til de utfelte enzymene ble bestemt kvantitativt for hver av dem.
US patent 3.752.741, gitt til Courtois 14. august 1973, rapporterer en fremgangsmåte for ekstraksjon av proteaser som er aktive i alkalisk medium, fra fermenteringsbuljonger ved hjelp av en ikke-ionisk amberlitt-harpiks. I vanlig praksis ble 100-500 ml av harpiksen pr. liter fermenteringsbuljong som skulle behandles, angivelig tilsatt en eller flere ganger. Generelt ble harpiksen hensatt i kontakt med fermenteringsbuljongen i 2-15 timer for å sikre adsorpsjon av proteasene på harpiksen. Harpiksen ble deretter isolert fra hele fermenteringsbuljongen ved f.eks. enkel sikting. Den isolerte harpiksen ble angiveligvis mest fordelaktig i en kolonne og proteasene deretter eluert. Proteasene ble derved angiveligvis utvunnet fra fermenteringsbuljongen ved utbytter på 70-90%.
US patent 3.947.324, gitt til Lakshminaraya 30. mars 1976, rapporterer en metode for isolering av peroksydaseenzym fra plantevev, hvilket innebar behandling av et vandig ekstrakt av nevnte plantevev med sinkioner. Etter en slik behandling ble den klare enzymoppløsningen selektivt adsorbert ved tilsetning av hydratisert karboksymetylcellulose (Sephadex C50), som angis å adsorbere ca. 70% av den totale tilgjengelige peroksydase-aktiviteten, og resten ble resirkulert til neste sats. Karboksymetylcellulosen ble deretter separert ved filtrering, og den resulterende kaken ble vasket og eluert.
US patent 4.246.351, gitt til Miyake et al. 20. jan. 1981, rapporterer et kopolymer-adsorpsjonsmiddel som angis å adsorbere proteiner generelt og bl.a. papain. Adsorpsjon av et protein rapporteres generelt som anbringelse av adsorpsjonsmiddelet i kontakt med en oppløsning eller en dispersjon av proteinet, enten ved tilsetning av adsorpsjonsmiddelet til proteinoppløsninger (satsprosess) eller ved å føre proteinoppløsninger gjennom en kolonne pakket med adsorpsjonsmiddelet (kontinuerlig prosess). Det rapporteres at fordi jo større mengden av adsorpsjonsmiddelet er, jo større er mengden av adsorbert protein, og desto hurtigere er adsorpsjonshastigheten, så bør mengden av adsorpsjonsmiddel som skal benyttes, bestemmes avhengig av den mengde av protein som skal adsorberes, og den ønskede adsorpsjonstid: "Før praktisk adsorpsjonsoperasjon er det nødvendig å fastsette optimale betingelser. Dette vil oppnås ved kvantitativt å bestemme adsorpsjonskapasiteten til adsorpsjonsmiddelet over tid. Adsorpsjonsmiddelets proteinadsorberende kapasitet ble bestemt ved følgende metoder. Først, i det tilfelle adsorpsjonen ble utført ved en satsprosess, ble konsentrasjonen av proteinet i den behandlede oppløsning eller dispersjon bestemt. Mengden av protein adsorbert av adsorpsjonsmiddelet ble beregnet fra forskjellen mellom konsentrasjonen av proteinet i den opprinnelige oppløsning eller dispersjon og den i den behandlede oppløsning eller dispersjon. For det annet, i det tilfelle adsorpsjonen ble utført ved en kontinuerlig prosess, ble, etter adsorpsjonen, proteinoppløsningen eller dispersjonen som var til stede blant kornene av adsorpsjonsmiddelet, vasket ut ved bruk av det samme oppløsningsmiddelet som det i protein-oppløsningen eller -dispersjonen. Volumet av oppløsnings-middelet som skulle benyttes for vasking, var fem ganger adsorpsjonsmiddelets tilsynelatende volum. Mengden av proteinet i den behandlede oppløsning eller dispersjon inkludert vaskemateriale, ble bestemt. Forskjellen mellom mengden av protein i den opprinnelige oppløsning eller dispersjon og den i den behandlede oppløsning eller dispersjon, er mengden av protein adsorbert av adsorpsjonsmiddelet. Adsorpsjonsmiddelets proteinadsorberende kapasitet beregnes i mg adsorbert protein pr. gram tørt adsorpsjonsmiddel." (Oversettelse) (se spalte 14, linje 44, til spalte 15, linje 2).
Alle utførelseseksemplene i US patent 4.246.351 innebærer adsorpsjon av bestemte mengder av en ren proteintype ved hjelp av det generelle protein-adsorpsjonsmiddel; intet lærer overvåking av adsorpsjonen av spesifikt enzym fra komplekse blandinger inneholdende andre proteiner i tillegg til spesifikt enzym.
US pateter 4.388.406 og 4.390.628, gitt til Johansen 14. og 28. juni 1983, respektivt, rapporterer en metode for utvinning av Cu, Zn-superoksyd-dismutase i industriell målestokk. I forbindelse med eksempel 1 rapporteres det at mikrogranulær karboksymetylcellulose som hadde blitt, likevektsinnstilt med buffer, ble tilsatt til et konsentrert gjær-råekstrakt, og blandingen ble omrørt i 1 time. Karboksymetylcellulosen ble deretter oppsamlet på en kolonne med en diameter på 30 cm, vasket med bufferen og deretter overført til en kolonne med en diameter på 10 cm for eluering.
Følgende patenter beskriver forskjellige isoleringsmetoder for chymopapain: US patent 2.313.875, gitt til Jansen et al. 16. mars 1943, rapporterer fremstilling av et nytt proteolytisk enzym, betegnet chymopapain, fra papaialateks. Forurensninger ble fjernet fra en oppløsning av utørket lateks ved syreutfelling ved pH 2, fulgt av saltutfelling ved halvmetning med natriumklorid. Nesten rent chymopapain-protein ble deretter angiveligvis utfelt ved å heve konsentrasjonen for saltet til full metning ved pH 2. Nevnte protein var angivelig mottgelig for ytterligere rensing ved gjenutfelling og omkrystallisering.
US patent 3.235.468, gitt til Hogan 15.ebruar 1966, rapporterer isolering av meget høyrensede materialer, f.eks. ren chymopapain, fra råpapain. Det er imidlertid ingen beskrivelse om det som rapporteres for å være et involvert separeringssystem.
US patent 3.558.433, gitt til Stern 26. januar 1971 og overdratt til Baxter Laboratories, Inc., rapporterer en fremgangsmåte for rensing av chymopapain ved kromatografi av et vandig ekstrakt av rå chymopapain eller papayalateks med karboksymetylsubstituert, kryssbundet dekstran-kopolymer, fortrinnsvis Sephadex CM-50, likevektinnstilt med vandig bufferoppløsning fulgt av eluering med vandig bufferoppløsning med omtrent samme pH-verdi som, men større ionestyrke enn, bufferen benyttet for likevektsinnstilling av den kromatografiske kolonne. Nevnte rå chymopapain er deri definert som chymopapain separert fra papaya ved saltfraksjonering, og/eller oppløsningsmiddelfraksjonering, og/eller pH-justering og/eller lignende metoder. Stern angir at kolonneformen for den karboksymetylsubstituerte, kryssbundede dekstran-kopolymeren er vesentlig, og at en satsteknikk ikke resulterer i tilfredsstillende separering. Dessuten angir US patent 3.558.433 at sjiktvolumet bør være slik at vesentlig alt protein som skal tilføres, vil bli bibeholdt på kolonnen, med tilstrekkelig fri karboksymetylsubstituert, kryssbundet dekstran-kopolymer værende tilbake for å bevirke god separering av komponenter under passasje gjennom kolonnen. Således, for å gjøre vesentlig fullstendig bruk av gelfiltrering- og ioneutvekslingsegenskapene til kopolymeren, lærer Stern at chymopapainen bør anbringes på kolonnen ved langt under metningskonsentrasjonen for kopolymeren. I det eneste utførelseseksempe-let ble 4 g rå chymopapain i vandig oppløsning tilsatt direkte til toppen av kolonnen, og kolonnen ble eluert ved 25°C med 400 ml elueringsmiddel ved en strømningshastighet på ca. 20 ml pr. time. Chymopapainet I og II ble angivelig desorbert ved ca. 50% og 80% saltmetninger, respektivt. 4 g rå chymopapain, som nevnes å utgjøre et typisk behandlings-resultat, ga angivelig 2,250 g chymopapain I og 0,430 g chymopapain II. Stern rapporterer at vesentlig rene chymopapainer I og II ble isolert; likevel indikerer hans elektroforetiske resultater at det var kryss-kontaminering. Etter angivelse av at forskjellige proteiner danner forskjellige soner under elektroforese, rapporterer Stern dannelsen av enkeltproteinsoner etter elektroforese på celluloseacetat. Dessuten plotter elueringsprofilen som er presentert på fig. 1 i US patent 3.558.433, hver fraksjon ved bare totalt proteininnhold.
US patent 3.627.640, gitt til Blumberg et al. 14. desember 1971, rapporterer en fremgangsmåte for rensing og avfarging av et relativt urent enzymmateriale ved dannelse av et kovalent bundet polymer-enzym-produkt. Nevnte fremgangsmåte hvori enzymet er chymopapain, er definert i patentets krav 9.
US patenter 4.212.945 og 4.212.946, gitt til Nonaka et al.15. juli 1980, rapporterer en fremgangsmåte for utvinning av protease, f.eks. chymopapain, fra reaksjonsproduktet av en peptidsyntese i nærvær av protease.
US patent 4.374.926, gitt til Stern 22. februar 1983 og overdratt til Smith Laboratories, Inc., rapporterer en fremgangsmåte for fremstilling av det som betegnes forbedret chymopapain. Nevnte fremgangsmåte erstatter hovedsakelig en karboksymetylagarosegel med karboksymetyldekstrangelen rapportert i Sterns US patent 3.558.433. Rå chymopapain ( ca. 29 g) i vandig oppløsning ble tilsatt til en kolonne . av karboksymetylagarosegel - harpiks og eluert med ca. 4,6 1 elueringsmiddel i ca. 40 timer. Eluerings-profiler er gitt på fig. 1 i US patent 4.374.926 med hensyn til både det totale proteininnhold og enzymatisk aktivitet. Det rapporterte utbytte, beregnet på proteininnhold, av chymopapain I er omtrent fem ganger det til chymopapain II. Dessuten er den enzymatiske aktivitetskurven klart forskjøvet fra kurven for totalt proteininnhold; enzymologene erkjenner at en slik forskyvning indikerer tilstedeværelsen av urenheter. De opp-samlede elueringsmiddelfraksjonene inneholdende chymopapain I og II ble kombinert, dialysert og lyofilisert. Det rapporteres at ved rensing av chymopapain til to aktive komponenter ble det oppnådd et ensartet produkt med lavere toksisitet.
Forskjellige chymopapainpreparater er beskrevet i den tidligere teknikk; se generelt kravene i følgende US patenter: nr. 1.967.679, gitt til Muench et al. 24. juli 1934 (aktivert papainpreparat); nr. 2.676.138, gitt til Hink el 20. april 1954 (papainpreparat); nr. 3.019.171, gitt til Bloch et al. 30. januar 1962, (aktivert papainpreparat); nr. 3.284.316, gitt til Cayle 8. november 1966 (lagringsstabilt papainderivat); og nr. 4.011.169, gitt til Diehl et al. 8. mars 1977 (peptid-peptidohydrolyseholdige preparater). To chymopapainpreparater blir i dag markedsført, nasjonalt og internasjonalt, for bruk i kjemonukleolyseterapi. "Discase", et produkt fra Baxter-Travenol Laboratories, Inc., beskrives i nevnte selskaps produktbilag av juli 1982 som et sterilt preparat av det proteolytiske enzym chymopapain, avledet fra papayalateks; det er angivelig vesentlig fritt for papain som bestemt ved elektroforese. "Chymodiactin", et produkt fra Smith Laboratories, Inc., beskrives i dette selskaps produktprofil av januar 1983 som et raffinert proteolytisk enzym oppnådd fra rålateks fra Carica papaya-treet, inneholdende to enzymatisk aktive proteinkomponenter.
Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for isolering av store mengder av chymopapain B og chymopapain C fra enten papayalateks eller rå chymopapainpreparater. Homogene populasjoner av chymopapain B og chymopapain C kan nå utvinnes separat i kommersielle mengder uten k ry ss - kontamine ring.
Foreliggende oppfinnelse angår også terapeutiske preparater som består vesentlig av ren chymopapain B uten noen forurensning av andre proteaser, f.eks. chymopapain C, eller andre proteiner. Slike terapeutiske preparater ifølge foreliggende oppfinnelse er særlig nyttige for kjemonukleolyse av brokkdannet invertebralskivevev, og deres eksepsjonelle renhet er en forbedring som i betydelig grad reduserer risikoen for sterke anafylaktoide og andre allergiske reaksjoner. Oppfinnelsen tilveie-bringer også en ny metode for bestemmelse, med vesentlig reproduserbarhet, av aktiviteten til chymopapain B og chymopapain C.
Det er nå oppdaget at det er minst seks proteaser i papayalateks: papain, chymopapain A, chymopapain B1-B3, og chymopapain C. Rensingsproses-sen ifølge foreliggende oppfinnelse resulterer i isoleringen av chymopapain B og chymopapain C i homogene former. Det er nå oppdaget at chymopapain B eksisterer i tre underformer, som man betegner chymopapainer B1-B3, og at de tre underformene av chymopapain B (B1-B3) skyldes forskjellige oksydasjonstilstander av SH-gruppene på denne ditiol— proteasen.
Foreliggende oppfinnelse er rettet mot utviklingen av en fremgangsmåte for isolering i stor målestokk av chymopapain B og chymopapain C som separate homogene enzymer. Den mest foretrukne fremgangsmåten for isolering av rene fraksjoner av chymopapain B og chymopapain C vil nå bli beskrevet i detalj med utgangspunkt i råmaterialet papayalateks. Det skal også påpekes at dersom delvis renset chymopapain anvendes som utgangsmateriale, så kan trinnene 1-10 i følgende fremgangsmåte sløyfes, og fremstillingsmetoden kan begynne med den høyt selektive sats-adsorpsjonsprosess i trinn 11 og 12.
Med mindre annet er angitt, utføres alle trinnene ved omkring 4°C for å minimalisere eventuell mikrobiell forurensning og for å bevare enzymaktivitet. Pyrogenfritt destillert vann anvendes i alle sammenheng.
Trinn 1: Vei 2 kg av papayalateks i en 6 liters beholder. Tilsett 3,2 1 destillert vann. Omrør denne blanding ved romtempe-ratur (22-25°C) i 1 time.
Trinn 2: Sentrifuger blandingen hurtig (9000 x g i 30 min). Kasser pelleten som inneholder papain. Ta vare på supernatanten til det neste trinnet.
Trinn 3: Bring supernatantoppløsningen til 45% ammoniumsulfat ved tilsetning av små mengder (5-10 g) av gangen. Omrør den resulterende oppslemming i 30 min.
Trinn 4: Sentrifuger ved 9000 x g i 30 min. Kasser pelleten. Ta
vare på supernatanten til det neste trinnet.
Trinn 5: Tilsett langsomt IN saltsyre (fremstilt ved tilsetning av 85
ml konsentrert saltsyre til 915 ml destillert vann) inntil pH-verdien er bragt til 2,0 hvorved en uklar oppløsning resulterer.
Trinn 6: Sentrifuger oppløsningen ovenfor ved 9000 x g i 30 min.
Kasser pelleten. Ta vare på supernatanten til det neste trinnet.
Trinn 7: Bring supernatanten til 75% ammoniumsulfat ved tilsetning av små mengder (5-10 g) av gangen. Omrør den resulterende oppslemming i 1 time.
Trinn 8: Sentrifuger oppslemmingen i 30 min ved 9000 x g.
Dekanter supernatanten og kasser. Ta vare på pelleten, som inneholder chymopapain B og chymopapain C, til det neste trinnet.
Trinn 9: Oppløs pelleten fra trinn 8 i et minimum volum (100-200
ml) av 0,2M natriumacetatbuffer (pH 5,0).
Trinn 10: Overfør den resulterende oppløsning til dialyserør (for-vasket med destillert vann) og dialyser mot 0,2M natriumacetatbuffer (pH 5,5). Flere endringer (3-5)av bufferoppløs-ninger bør benyttes. Det resulterende retentat er delvis renset, men inneholder fremdeles flere forurensende proteiner. Denne råchymopapain renses som følger.
Trinn 11: Vei 100 g karboksymetyl-Sephadex i et 4 liters begerglass.
Tilsett 3,0 liter av 0,2M natriumacetat-buffer (pH 5,0) og omrør. Hensett denne blanding natten over ved 4°C. Den svellede karboksymetyl-Sephadex (ca. 3 liter) er ferdig for det neste trinnet.
Trinn 12: Tilsett retentatet fra trinn 190 til den svellede karboksymetyl-Sephadex fra trinn 11 og foreta kortvarig omrøring med en glassrørestav. La karboksymetyl-Sephadexen sedimentere. Analyser en aliquot (50 ul) av supernatanten med henblikk på chymopapainaktivitet ved bruk av standardanalysen som er beskrevet ytterligere nedenfor. Tilsett ytterligere karboksymetyl-Sephadex, og gjenta prosessen inntil chymopapainene er selektivt bundet til matrisen og mindre enn 5% av den opprinnelige aktivitet er tilbake i oppløsningen.
Trinn 13: Pakk den chymopapain-bundede karboksymetyl-Sephadexen i en egnet kolonne. Vask kolonnen med 0,2 M natriumacetat inntil absorbansen (280 nm) for utløpet når baislinje-nivå.
Trinn 14: Eluer enzymene fra kolonnen med en lineær gradient av natriumacetat fra 0,2 til 1,0 M (pH 5,0). Overvåk fraksjonene med henblikk på proteininnhold og enzymatisk aktivitet. En typisk elueringsprofil er angitt på fig. 1. Den store proteintoppen som viser seg i de tidlige fraksjonene, mangler chymopapainaktivitet mens de to senere eluerings-fraksjonene inneholdende aktivitet representerer chymopapain B chymopapain C.
Trinn 15: Utfør syre-polyakrylamid-gelelektroforese på representative fraksjoner av elueringsmiddelet. Bestem fraksjonene inneholdende ren chymopapain B og fraksjonene inneholdende ren chymopapain C. En typisk elektroforetisk profil er vist på fig. 2.
Trinn 16: Oppsamle fraksjonene inneholdende ren chymopapain B og reduser volumet enten ved lyofilisering veller ultraf iltre - ring. Foreta separat oppsamling av og konsentrer fraksjoner som inneholder ren chymopapain C.
Trinn 17: Enten dialyser den konsentrerte chymopapain C-oppløsning fra det foregående trinn mot destillert vann med minst tre endringer med vann, eller før den konsentrerte enzym - oppløsning gjennom en Sephadex G-25 gelfiltreringskolonne for å eliminere salter. En typisk elueringsprofil for Sephadex G-25 gelfiltrering er vist på fig. 3. Foreta separat avsalting av den konsentrerte chymopapain C på lignende måte.
Trinn 18: Lyofiliser den resulterende saltfrie oppløsning for oppnåelse av den fnuggaktige, krystallinske chymopapain B. Foreta separat lyofilisering av den avsaltede chymopapain C.
Mens denne fremgangsmåte er beskrevet på bakgrunn av et innledende utgangsmateriale på 2 kg papayalateks, skal det forstås at den kan ytterligere opptrappes, f.eks. 10-ganger, uten for stor forsinkelse eller forandringer i prosedyre. En rensing i industriell målestokk har f.eks. blitt foretatt ved bruk av 60 g rå chymopapain som utgangsmateriale i trinn 12.
Mens foreliggende beskrivelse har blitt beskrevet på bakgrunn av den foretrukne fremgangsmåte for utsalting av forurensninger ved 45% ammoniumsulfat og ved pH 2,0, fulgt av utsalting av rå chymopapain ved 75% ammoniumsulfat, skal det forstås at rå chymopapain fremstilt ved andre metoder med fordel kan benyttes, og uten overdreven eksperimen-tering i den nye, selektive satsvise adsorpsjonsprosess i trinn 12. Se eksempel 2, hvor en kommersiell kilde for delvis renset chymopapain renses ved hjelp av ovennevnte trinn 11-18. Likeledes er det inneforstått at tilfredsstillende eluering kan oppnås ved bruk av lineære gradienter fra 0,2 til 1,0 M (pH 5,0) av salter andre enn det foretrukne natriumacetat.
Et kritisk element i foreliggende fremgangsmåte er det høyselektive sats-adsorpsjonstrinnet (det tidligere nevnte trinn 12). En oppløsning av rå chymopapain blandes med porsjon av kationutvekslingsharpiks, fortrinnsvis en karboksymetylsubstituert, kryssbundet dekstran-kopolymer, for spesifikt å adsorbere chymopapain-enzymene på harpiksen, hvorved forurensninger etterlates i oppløsning. Supernatanten analyseres deretter for å bestemme den resterende chymopapainaktiviteten i oppløsning. Ytterligere kationutvekslerharpiks tilsettes for spesifikt å adsorbere ytterligere chymopapain-enzymer fra oppløsning, og supernatanten analyseres deretter på nytt. Denne titrering av oppløsningen med kationutvekslerharpiks fortsettes inntil en bestemt resterende aktivitet av chymopapain er tilbake i oppløsning - inntil chymopapain-enzymene nesten har mettet de tilgjengelige bindingssetene på kationutvekslerharpiksen.
Det er funnet fordelaktig å tilsette harpiksen langsomt inntil den resterende aktivitet i supernatanten er mindre enn ca. 10% og fortrinnsvis fra ca. 5 til ca. 2%, av den innledende totale aktivitet i oppløsningen av rå chymopapain. Optimalt bør minst ca. 2% av den innledende chymopapain-aktivitet forbli i oppløsningen. Den tidligere nevnte kationutvekslerharpiksen er fortrinnsvis en karboksymetylsubstituert, kryssbundet dekstran-kopolymer. Karboksymetyl-Sephadex (Pharmacia) type C-50 er spesielt foretrukket, men type C-25 er også akseptabel. Det er inneforstått at karboksymetyl-agarosegeler også vil være akseptable.
Den nye selektive satsvise adsorpsjonsprosessen i forbindelse med det konvensjonelle kolonnekromatografitrinnet har blitt funnet å gi flere fordeler i forhold til enkle kolonnekromatografiske metoder alene, hvori alle forurensningene må passere fullstendig gjennom kolonnen. Den selektive adsorpsjonsprosessen ifølge foreliggende oppfinnelse unngår vesentlig føring av forurensende materialer gjennom kolonnen. De forurensende materialene passerer aldri gjennom kolonnen fordi de blir aldri adsorbert på kationutvekslerharpiksen. Chymopapain-enzymene adsorberes spesifikt og selektivt på den valgte harpiksen, og det ovennevnte titreringstrinn sikrer at utilstrekkelig harpiks tilsettes til systemet til at forurensningene også adsorberes. Titreringen av harpiksen i den urene enzymoppløsning stoppes nær * harpiksens metningspunkt for enzymene, men før metningspunktet overskrides,- ved hvilket punkt forurensningene ville adsoreres på det da tilgjengelige overskudd av bindingsseter. Således kan utvinning av det ønskede produkt maksimeres med minimal forurensning.
Andre fordeler med denne forbelastning innbefatter mye hurtigere behandlingstider og mye større opptrappingspotensial for industrielle ekstrasjoner, isoleringer og rensinger. I den ovennevnte utørelse blir bare tilstrekkelig karboksymetyl-dekstran tilsatt for nesten fullstendig å binde chymopapain-enzymene. Dette resulterer i maksimering av effektiviteten til ioneutvekslingen og, fordi forurensningene ikke behøver å bli møysom-melig pumpet gjennom den etterfølgende dannede kolonnen, er det mulig med en mye hurtigere behandling. Det skal forstås at behandlingstid er en faktor som påvirker pyrogeninnholdet i det endelige produktet, og at denne parameter blir spesielt viktig hvor, som her, tilsetningen av bakteriostatiske midler ville inaktivere enzymet. Tabell 1 oppsummerer representative prøver av chymopapain B ifølge oppfinnelsen med henblikk på endotoksin-nivåer.
Limulus amoebocyttlysat (LAL) test (Associates of Cape Cod, Inc. Woods Wole, Massachusetts).
Fordi den satsvise titreringsprosess ifølge oppfinnelsen eliminerer behovet for å føre forurensende materialer gjennom kolonnen forut for eluering, kan produksjonsmålestokken lett forøkes. Chymopapain-enzymer kan nå utvinnes separat og på hurtig måte i kommersielle mengder, og den homogene renhet hos de resulterende enzymer er betydelig bedre enn den som oppnås ved hjelp av en hvilken som helst eksisterende kommersiell metode.
En vesentlig komponent i den ovennevnte rensemetode er anvendelse av en standardisert enzymatisk aktivitetsanalyse som er nødvendig for å bevirke optimal belastning (trinn 12) og utvinning (trinn 14) av chymopapain B og chymopapain C.
Det var nødvendig å tilveiebringe en standardisert reproduserbar enzymanalyse for chymopapain B. Fremgangsmåten som tradisjonelt benyttes ved bruk av kasein som et substrat, var utilfredsstillende av flere grunner. For det første er kasein et heterogent substrat som omfatter en blanding av peptider; videre gir hver hydrolytiske spalting et nytt, forskjellig substrat med forskjellig affinitet og katalytiske parametere. Således oppstår ikke-lineær kinetikk hvilket resulterer i mangel på reproduserbare hastigheter og ikke-linearitet. For det annet er analysemetoden med kasein triviell og tidskrevende og tillater derfor ikke kontinuerlig overvåkning av reaksjonen. For det tredje tillater ikke denne metode uttrykking av enzymaktivitet i standardenheter, f.eks. mikromol produkt dannet pr. minutt. En alternativ metode benytter det syntetiske substrat DL-benzoylarginin-p-nitroanilid (BAPNA). Dette substratet er homogent og gir en enkeltbindingstype for hydrolyse. Dette substratet tillater også en mer hensiktsmessig og hurtigere analyse fordi reaksjonen kan overvåkes fotometrisk. Tidligere analyser som benytter BAPNA, ble imidlertid ikke utført under substrat-metningsbetingelser, dvs. ved kinetikk av orden null. Under ikke-metningsbetingelser resulterer små endringer i substratkonsentrasjon i store endringer i reaksjonshastigheten, og således mangler en ikke-standardisert BAPNA-analyse reproduserbarhet. Tidligere BAPNA-analyser har dessuten benyttet den antikvariske nomenklatur med ktal eller pktal i stedet for å uttrykke aktivitet i internasjonale enzymenheter (mikromol pr. min.) Se f.eks. US patent 4.374.926.
Således, for å optimalisere den selektive, satsvise belastning av chymopapain B på karboksymetyl-dekstrangelen og forbedre og overvåke dens eluering fra den etterfølgende dannede kolonne, var det nødvendig å etablere en standardanalyse for chymopapain B ved bruk av BAPNA ved substrat-metningsbetingelser under optimale betingelser for enzymaktivitet. Fagfolk på området enzymologi vil forstå at før en slik standardisert analysemetode kunne tilveiebringes, måtte følgende parametere undersøkes og etableres: den molare ekstinksjonskoeffisient for de hydrolytiske produktene i BAPNA under optimale analysebetingelser, enzymets optimale pH-verdi, de optimale betingelsene for enzymaktivering og substrat-metningskurven.
Nevnte ekstinksjonskoeffisient ble fastslått som følger: Når chymopapain hydrolyserer BAPNA, absorberer produktet p-nitrofenol lys i det synlige området. Det er nødvendig å fastsette den molare ekstinksjonskoeffisien-ten for dette produktet under analysebetingelsene. BAPNA ble fullstendig hydrolysert med chymopapain B og det synlige absorbansspekteret bestemt ved bruk av et Gilford modell 2.600 spektrofotometer. Fig. 4 viser absorbansspektra for både BAPNA og hydrolyseproduktene av BAPNA. 410 nm ble valgt som bølgelengden for denne analysen, fordi ved denne bølgelengde absorberer ikke BAPNA. En bølgelengde på 410 nm ble benyttet for alle fremtidige studier. En 0,10M BAPNA standardoppløsning ble fremstilt ved oppløsning av 130,47 mg BAPNA (Sigma Chemical Co., produkt nr. B-4875, molekylvekt 434,9) i 3,0 ml dimetylsulfoksyd (DMSO). Denne oppløsning ble fortynnet i DMSO for oppnåelse av forrådsoppløsnin-ger på 10 mM og 1 mM. Det er nødvendig å oppløse BAPNA i DMSO fordi det oppløses ikke lett i vann. Aliquoter av 1 mM oppløsningen ble overført til kuverter inneholdende analysebuffer (0,1 mM natriumcitrat, 0,5 mM EDTA, 3,6 mg/ml cystein, pH 6,4), og den spektrofotometriske null-basislinjen ble etablert ved 410 nm. Substratet ble deretter hydrolysert enzymatisk ved bruk av en aliquot (30 1) av enten trypsin eller chymopapain. Reaksjonen ble kontinuerlig overvåket inntil alt substrat var hydrolysert, og ingen ytterligere økning i absorbans ble registrert. Fullførelsen av reaksjonen ble bekreftet ved ytterligere aliquoter av enten enzym eller substrat. Resultatene som er gitt i tabell 2, fastslår en gjennomsnittlig mM ekstrinksjonskoeffisient for de hydrolytiske produktene av BAPNA ved 410 nm lik 4,86 mM-<1>cm-<1>. ,
pH-optimum for chymopapain B ble fastslått som følger: Chymopapain B aktivitet ble bestemt som en funksjon av pH ved anvendelse av 5 mM BAPNA. Alle inkubasjoner var i den ovenfor beskrevne 0,1 M natriumcitrat-analysebuffer. Fig. 5 viser resultatene fra disse studier. Alle studier i fortsettelsen benyttet pH 6,4 som den optimale pH-verdi for analysen.
Optimalee nzymanalysebetingelser: Aktivator-cysterin inkluderes for å sikre at de vesentlige SH-gruppene i enzymet forblir reduserte. EDTA tilsettes for å hindre inaktivering av tunge metaller; citrat-buffer hjelper også i dette henseende p.g.a. dens chelateringsegenskaper. Alle analysene foretas ved 37°C siden dette er nærmest kroppstemperaturen hos menne-sker, hvorved enzymet skal benyttes for kjemonukleolyse. Selv om enzymet kan analyseres ved forskjellige temperaturer, ville korreksjon for den betydelige temperatureffekt på enzymhastighet ellers være nødvendig.
Substratmetning ble fastslått som følger: Ren chymopapain B ble benyttet for å fastsette en metningskurve. En konstant mengde enzym ble analysert, i ovennevnte analysebuffer som en funksjon av BAPNA-konsentfasjonen. De resulterende data som indikerer effekten av BAPNA-konsentrasjonen på chymopapain B-aktivitet, er rapportert i tabell 3 og gitt som en metningskurve på fig. 6.
Fig. 7 presenterer disse data i en dobbelt resiprok Lineweaver-Burk plotting, hvorfra følgende er beregnet:
Correlasjon = 0,99956
Intersept = 77,948
Helling = 179,38
Km = 2,3 mM
Km-verdien på 2,3 mM indikerer at ved denne konsentrasjon for BAPNA vil reaksjonshastigheten være 1/2 maksimalt. Ideelt ville en substratkonsentrasjon på 10 x Km bli benyttet for å sikre kinetikk av orden null. BAPNA er imidlertid ikke oppløselig i vandig buffer ved pH 6,4 ved denne konsentrasjonen. Som det beste kompromiss bør en konsentrasjon på 5 mM bli benyttet for å analysere enzymet. Dette representerer den høyeste konsentrasjon hvorved substratet fremdeles er oppløselig. Ved 5 mM nærmer dessuten reaksjonshastigheten seg ved maks. slik at små variasjoner i BAPNA-konsentrasjonen bare forårsaker små endringer i den målte hastighet.
Når først de ovennevnte optimale betingelser var fastslått, ble den standardiserte, reproduserbare enzymanalysen for chymopapain B tilveiebragt. Følgende oppløsninger benyttes: Analysebuffer, BAPNA-forråds-oppløsning, og chymopapain B-oppløsning. Analysebufferen er 0,1 M Na-citrat, 3,6 mg/ml cystein, 0,5 mM EDTA, pH 6,4. Oppløs 29,41 g natriumcitrat (Na3C6H507-2H20; molekylvekt = 294,10; Fisher Scientific Co.) i 1 1 destillert vann. Tilsett 3,6 g cystein og 168,1 mg EDTA, dinatriumsalt (molekylvekt = 336,2; Sigma Chemical Co., produktnr. ED255), og omrør inntil oppløsning. Juster pH til 6,4 med 0,1 M sitronsyre, fremstilt ved oppløsning av 19,2 g sitronsyre (molekylvekt = 292,13; MCB Manufacturing Chemists) pr. liter. BAPNA-forrådsoppløsningen er 100 mM BAPNA i DMSO. Oppløs 130,47 mg BAPNA (molekylvekt = 434,9; Sigma Chemical Co., produkt nr. B-4875) i 3,0 ml DMSO ved 37 °C. Enzymoppløsningen fremstilles ved oppløsning av 8 mg chymopapain B i 1,0 ml destillert vann.
Standard analysemetoden er som følger: For standard analysemetoden er nivået for BAPNA 5 mM. Det registrerende spektrofotometeret er satt ved 410 nm (synlig lyskilde); temperaturen er satt ved 37°C; 940 pl 0,1 M Na-citrat, (pH 6,4), 3,6 mg/ml cystein, og 0,5 mM EDTA, og 50 ul 100 mM BAPNA i DMSO tilsettes til en 1,0 ml kuvette (1 cm veilengde). Innholdet i kuvetten blandes, og kuvetten innføres i spektrofotometeret (ved 37°C). All BAPNA, hvis ikke allerede i oppløsning, vil gå i oppløs-ning når 37°C nås. Registreringsanordningen skrus på, en null-basislinje etableres for å bekrefte at det ikke er noen ikke-enzymatisk hydrolyse av BAPNA. 10 jjI chymopapain B-enzymoppløsning tilsettes deretter til kuvetten, innholdet blandes, og den enzymatiske aktivitet overvåkes og registreres ved 410 nm.
En internasjonal enzymenhet (IEU) av chymopapain B er den mengde enzym som produserer et mikromol p-nitroanilin pr.min. fra en 5 mM oppløsning av BAPNA-substrat ved 37°C og pH 6,4.
Et signifikant trekk av avgjørende betydning i den standardiserte analysen, og åpenbare variasjoner derav, er bruken av kontinuerlig overvåkning. Problemer med inaktivitet, ustabilitet og reproduserbarhet i tidligere enzymanalyser for chymopapain, har blitt erkjent. Se f.eks. US patent 2,676.138. Foreliggende oppfinnelse gir en løsning på disse problemer ved tilveiebringelse av en analysemetode hvorved økningen i absorbans fra produktene av enzym-substrat-reaksjonen kontinuerlig overvåkes. En slik overvåkning unngår f.eks problemet med variabilitets-hastigheter hvorved forskjellige prøver av chymopapain gjenvinner aktivitet når de først er utsatt på nytt for en sulfhydrylreagens før reaksjon med enzymsubstratet.
Mens den standard analysemetoden som beskrevet ovenfor, er den foretrukne utførelse av foreliggende oppfinnelse, vil det forstås at analysemetoden kan modifiseres på en rekke forskjellige måter i overens-stemmelse med prinsippene på det tekniske området. Som illustrasjon er bruken av EDTA eller et sammenlignbart chelateringsmiddel ikke strengt tatt nødvendig fordi metallioner ikke vanligvis er forurensninger i analysebufferen eller blandinger derav. Tilsetningen av et chelatering som EDTA, vil imidlertid minske effekten av metallioner, hvis slike er til stede.
Andre sulfhydrylreagenser kan benyttes istedenfor, eller i kombinasjon med, cystein. Inkludert blant slike sulfhydrylreagenser er ditiotreitol, p-merkaptoetanol og glutation. Vanlig benyttede buffere, f.eks. fosfat eller acetatbuffere, kan benyttes istedenfor Na-citrat, og bufferkonsentrasjo-ner varierende fra ca. 0,25 M til ca. 0,025 M kan anvendes.
En rekke forskjellige substrater for chymopapain B eller chymopapain C kan være nyttige som homogene ikke-proteinholdige fotometriske substrater for den fotometriske måling av enzymatisk aktivitet. Foruten BAPNA, innbefatter slike substrater, men er ikke begrenset til, N-cx-benzoyl-L-argininetylester (BAEE); N-a-benzoyl-L-argininmetylester; N-oc-benzoyl-D,L-arginin- p -naf tylamid; N-a -benzoyl-D,L-arginin-para-nitroamid. Selve BAPNA har blitt rapportert av andre som nyttig ved måling av chymopapain. Se f.eks. US patent 4.439.423.
Mens konsentrasjonen av BAPNA eller et annet substrat fortrinnsvis er ca. 5 mM, og i alle tilfeller vesentlig under 10 x Km, vil det forstås at konsentrasjoner lavere eller høyere enn ca. 5 mM i prinsippet er nyttige ved utførelse av foreliggende standardiserte analysemetode forutsatt at man fortsetter å oppnå tilstrekkelig reproduserbarhet. Det er oppdaget at reproduserbarheten til foreliggende standardiserte analyse er større enn den ville ha vært forventet å være for analyser foretatt ved ca. 2 x Km, eller 5 mM i tilfellet for BAPNA.
Den ovenfor beskrevne standard analysemetode for chymopapain kan også anvendes for måling av C-formen for chymopapain, også kjent som chymopapain C. Se f.eks. fig. 1. Disse to former for chymopapain har tidligere blitt betegnet med andre nomenklaturer.
Ifølge de generelle prinsippene for enzymanalyser kan de ovenfor beskrevne standard analysemetoder for chymopapain B også modifiseres ved endring av temperatur, volum, trykk og konsentrasjon for reaktanter. Det er inneforstått at variasjoner f av disse parametere samt andre omfattes av foreliggende oppfinnelse.
Det skal i det følgende vises til medfølgende illustrasjoner, hvor:
Fig. 1 er en grafisk fremstilling som plotter både totalt proteininnhold i enheter for absorbans ved 280 nM (<*>—<*>) og enzymatisk aktivitet i internasjonale enzymenheter pr. ml (□—□) mot molarkonsentrasjon og fraksjonstall for elueringsmiddel, som beskrevet i eksempel 4: fig. 2 er gelplaten som resulterte fra elektroforetisk analyse på syre-polyakrylamidgel av hver 10. fraksjon av elueringsmiddel, som beskrevet i eksempel 2;
fig. 3 er en grafisk fremstilling som viser et typisk elueringsprofil etter avsalting (se trinn 17 i den ovenfor angitte beskrivelse), hvor både enzymatisk aktivitet i internasjonale enzymenheter pr. ml —Q) og saltkonsentrasjonen som en funksjon av konduktivitet (<*>—<*>) er plottet mot elue ringsmiddel - f raks jonstall;
fig. 4 er en grafisk fremstilling hvor absorbans er plottet mot bølge-lengde, hvilken viser absorbansspekteret for både BAPNA og hydrolyseproduktene av BAPNA som beskrevet i det ovenstående;
fig. 5 er en grafisk fremstilling hvor enzymatisk aktivitet i 1000 av internasjonale enzymenheter er plottet mot pH-verdi, hvilket fastsetter pH-optimum for chymopapain B, som beskrevet ovenfor;
fig. 6 er en grafisk fremstilling hvor enzymatisk aktivitet i tusen av internasjonale enzymenheter er plottet mot BAPNA-konsentrasjon (i mM) som rapportert i tabell 3;
fig. 7 er en dobbelt resiprok Lineweaver-Burk-plotting av dataene i tabell 3; og
fig. 8 er en gelplate som resulterte fra elektroforetisk analyse på syre-polyakrylamidgel av fire chymopapain-preparater: Discase® (helt til venstre), Chemolase® (midten til venstre), Chymodiactin® (midten til høyre), og den rensede chymopapain B ifølge oppfinnelsen (helt til høyre), som beskrevet i eksempel 6.
For at fagmannen på området mer fullstendig skal forstå foreliggende oppfinnelse, angis følgende eksempler. Disse eksempler er kun gitt for illustrasjonsformål, og de skal ikke anses for å uttrykke begrensninger med mindre dette er angitt i de medfølgende krav.
Eksempel 1
En typisk beregning av den enzymatiske aktiviteten for chymopapain B, bestemt ved den standardiserte enzymanalysen ifølge oppfinnelsen og uttrykt i internasjonale enzymenheter (heri betegnet "enheter") pr. mg, ble foretatt som følger. 8 mg Chemolase<®>(Pharmotex, Inc., lot nr. 01153-38) ble oppløst i 1,0 ml destillert vann, 10 liter av denne enzymoppløsning ble analysert.
En bufferoppløsning (0,1 M natriumcitrat, 3,6 mg/ml cystein, 0,5 mM EDTA, pH 6,4) ble fremstilt som tidligere beskrevet. 940 pl av nevnte bufferoppløsning ble benyttet i denne analysen. En BAPNA-forrådsoppløs-ning (100 mM BAPNA i DMSO ble fremstilt som beskrevet tidligere. 50 pl av nevnte BAPNA-f or rådsopp løsning ble benyttet i denne analysen.
Standard analysemetoden ble fulgt som beskrevet ovenfor. 1,0 ml kuvette inneholdende de tidligere nevnte aliquoter av buffer- og BAPNA-oppløs-ninger ble likevektsinnstilt ved 37°C i et spektrofotometer, og en null-basislinje ved 410 nm ble fastsatt. Deretter ble tidligere nevnte aliquot av enzymoppløsning tilsatt, omrørt og endringen i aborbans ved 410nm ved 37°C ble overvåket. Nevnte observerte endring i absorbans (A) var 0,044/min.
Den relevante formel er:
A = cbc
hvor
A absorbans = 0,044/min.
c = ekstinksjonskoeffisient = 4,86 mM~<l>cm~<l>b = veilengde = 1 cm
c = konsentrasjon
Omordning av formelen:
Siden sluttvolumet i kuvetten er 1 ml og enhet =<i>^-y (0 , 009053 5 ^~--t- )<1 ml) = 0 , 009 05 35 = 9^535 x 10~<3>enheter. ml min min
Siden 10 pl av chemolase benyttes for analysen, får man (\f X0.01 ml) = 0,08 mg chemolase benyttet for analysen. Derfor, 9,0535 x 10^ enheter/0,08 mg = 0,113 enheter)/mg veiet chemolase.
Eksempel 2
Renseprosessen ifølge foreliggende oppfinnelse illustreres ved følgende produksjonsutførelse som benyttet en delvis renset chymopapain som utgangsmateriale. 100 g karboksymetyl-dekstran (CM-Sephadex)-kuler ble suspendert i 3 liter 0,2 M natriumacetatbuffer, pH 5,0, og hensatt natten over ved 4°C. Neste morgen var den svellede CM-Sephadex ferdig for bruk. 30 g delvis renset chymopapain (Sigma, lot nr. 13F-8155) ble oppløst i 1,5 liter 0,2 M natriumacetatbuffer, pH 5,5, i et 2 liters begerglass under anvendelse av en magnetisk rørestav. En aliquot av den resulterende urene enzymoppløsning ble analysert med henblikk på aktivitet under anvendelse av fremgangsmåten beskrevet i eksempel 1, og den totale enzymatiske aktivitet for de 1500 ml ble beregnet til å være 5.245 internasjonale enzymenheter, eller 3,497 enheter/ml.
Ca. 1,5 1 av de sedimenterte CM-Sephadex-kulene og 750 ml av den urene enzymoppløsning, ble sammenblandet og omrørt med en glasstav. Kulene fikk sedimentere, og supernatanten ble analysert med henblikk på enzymatisk aktivitet. Ingen aktivitet ble observert.
Ytterligere 250 ml uren enzymoppløsning ble tilsatt og omrørt. Etter at CM-Sephadex-kulene hadde sedimentert, ble en aliquot av supernatanten analysert, og en svak enzymatisk aktivitet ble observert.
Ca. 650 ml ytterligre CM-Sephadex og de gjenværende 500 ml av den urene enzymoppløsningen ble tilsatt og omrørt. Supernatanten ble igjen analysert, og denne gangen ble en svak enzymatisk aktivitet - mindre enn 5% av den beregnede totale aktivitet - observert.
Den resulterende chymopapain-bundede CM-Sephadex ble pakket i en 5 x 100 cm kolonne ogVasket natten over med 0,2 M natriumacetatbuffer, pH 5,0, ved en strømningshastighet på 1,5 ml/min. 4 liters volumer av 0,2 M og 1 M natriumacetatoppløsninger, pH 5,0, ble påført på kolonnen for oppnåelse av en lineær ionestyrke-gradient av elueringsmiddel fra 0,2 co 1,0 M, ved pH 5,0. Nevnte gradient tok omkring 4 dager gjennom kolonnen. 2,5 ml fraksjoner i rekkefølge av elueringsmiddel ble oppsamlet idet de kom ut av kolonnen.
Hver 10. fraksjon ble analysert med henblikk på chymopapain-aktivitet og også underkastet elektroforetisk analyse på syre-polyakrylamidgel. Gelplaten fra de således testede fraksjonene i dette forsøk er reprodusert på fig. 2. Bemerk at chymopapain B opptar det øvre båndet, og at chymopapain C opptar det nedre båndet som bare viser seg i de fraksjoner som eluerte ved høye molarkonsentrasjoner.
Fraksjonene som bare inneholdt chymopapain B, og spesielt de represen-tert ved fraksjoner 150-220 på fig. 8, ble oppsamlet og lyofilisert til et mindre volum. Dette konsentrerte kombinerte materiale ble deretter dialysert mot destillert vann med 4 vannskiftinger. Det resulterende retentat ble deretter lyofilisert for oppnåelse av den fnuggaktige, krystallinske chymopapain B.
Pyrogeninnhold ble analysert ved bruk av Limulus amoebocytelysat (LAL)-testen (Associates of Cape Cod, Inc., postboks 244, Woods Hole, Massachusetts 02543). Resultatene viste tilstedeværelsen av bare tre pyrogene endotoksinenheter (5 mg av denne krystallinske chymopapain
B).
Eksempel 3
7,4 g renset chymopapain B, fremstilt ved flere utførelser av den ovenfor beskrevne prosess, ble bestemt til å ha en spesifikk aktivitet på 0,15 enheter/mg. Disse 7,4 g renset chymopapain B eller 1.110 internasjonale enzymenheter, ble sendt til Connaught Laboratories, Inc. som lot nr.
0308-307, for sammenblanding-, med konvensjonelle eksipienser for dannelse av et Chemolase®-preparat for^bruk i kjemonukleolyseterapi.
Chemolase® er et sterilt, lyofilisert, proteolytisk enzympulver for injeksjon mellom skiver. Chemolase® inneholder 6 internasjonale enzymenheter Chymopapain B, 3,5 mg L-cysteinhydrokloridmonohydrat og 0,37 mg dinatriumedetat; med 1 mg natriumdisulfid tilsatt ved sammenblanding. Nevnte terapeutiske preparat består vesentlig av chymopapain Buten blanding med chymopapain C eller andre forurensende proteiner.
Eksempel 4
Fig. 1 representerer en elueringsprofil som er representativ for de totale utvinninger bevirket ved foreliggende fremgangsmåte. Enzymatisk aktivitet (internsjonale enzymenheter/ml) og totalt proteininnhold (absorbans ved 280 nm), er plottet på abscissen, molar saltkonsentrasjon på diagonalen og fraksjonsnummer på ordinaten. Bemerk at den store proteintoppen som først viste seg, manglet protease-aktivitet, mens de to fraksjonene som deretter eluerte fra kolonnen, viste slik aktivitet. Chymopapain B, den andre fraksjonen, kom ut av kolonnen ved en omtrentlig saltkonsentrasjon fra ca. 0,65 til ca. 0,75 M (fraksjoner 165-220 her). Chymopapain C eluerte som en tredje fraksjon ved en saltkonsentrasjon fra ca. 0,80 til 0,90 M (fraksjoner 230-280 her).
Eksempel 5
De fysiokjemiske egenskapene til den rene chymopapain B isolert ved den representative metoden i eksempel 2 ble undersøkt. Nevnte homogene chymopapain B viste tre nær beslektede bånd på polyakrylamidgel-elektroforese. Disse tre båndene ble funnet å representere tre underformer av chymopapain B, som man betegnet B1-B3, som skyldes forskjellige oksydasjonstilstander av SH-gruppene på denne ditiol-protease. Chymopapainer BJ-B3er omdannbare til hverandre ved oksydasjon eller reduksjon. F.eks., fig. 8 viser en elektroforetisk gel av ren chymopapain B i både delvis redusert (midten til venstre, med cystein) og oksydert
(ytterst til høyre, uten cystein) tilstand. Disse bånd flyter ofte sammen til en enkelt sone, som generelt refereres til i den tidligere teknikk som chymopapain B (eller chymopapain I).
Fra SDS-polyakrylamidgeler viser det seg at molekylvekten for chymopapain B ifølge foreliggende oppfinnelse er 34-35 K. Det beste anslag i foreliggende sammenheng er 35.200 dalton. Dette enzym er en monomer.
Det isoelektriske punktet til chymopapain B ifølge oppfinnelsen er meget basisk. Elektroforetisk og isoelektrisk rettede studier indikerer at chymopapain B (BJ-B3) har en tilsynelatende pl = 10,3-10,5.
N-terminal-analyse av chymopapain B ifølge oppfinnelsen viste primært tyrosin. Dette er i overenstemmelse med funn i litteraturen, som også indikerer at chymopapain A har en N-terminal glutaminsyre og chymopapain C en N-terminal leucin.
Aminosyresammensetningene for to representative prøver av chymopapain B ifølge oppfinnelsen ble bestemt ved hjelp av konvensjonelle teknikker. Resultatene er vist i tabell 4.
Chymopapain B fremstilt ved foreliggende fremgangsmåte kan klart skjelnes fra chymopapain C (også betegnet chymopapain II) som elimine-res ved foreliggende fremgangsmåte, og som ikke forurenser foreliggende terapeutiske preparat. Preliminære undersøkelser av chymopapain C isolert ved foreliggende fremgangsmåte indikerer at dette monotiol-enzymet synes å være monomert og har den omtrentlige størrelsen til de andre tiol-proteasene fra papaya. Denne chymopapain C er mer basisk enn chymopapain B og har en tilsynelatende pl-verdi omkring 10,8. Denne chymopapain C utviser positiv BAPNA hydrolytisk aktivitet og har på en spesifikk aktivitetsbasis en høyere BAPNA "turnover" enn chymopapain B.
Eksempel 6
Fire chymopapain-preparater ble analysert ved gelelektroforese under sure betingelser ved følgende metode: J. V. Maizel, Methods in Virology, vol. 5, kapittel 5, side 179-246 (1971).
Resultatene er angitt på fig. 8. Helt til venstre er Discase® (Baxter-Travenol Laboratories, lot nr. AV15F5M). Til venstre for midten er Chemolase® (lot nr. 021031-86), som er representativ for renset chymopapain B fremstilt ved en mer detaljert metode enn metoden i eksempel 2, og her sammenblandet med L-cysteinhydrokloridmonohydrat og dinatriumedat, med tilsatt natriumdisulfitt. Til høyre for midten er chymodiactin® (Smith Laboratories, lot nr. BM201). Helt til høyre er en representativ prøve på chymopapain B renset ved fremgangsmåten i eksempel 2.
Det skal bemerkes at både Discase og Chymodiactin er blandinger av chymopapainer B (øvre bånd) og C (nedre bånd), mens preparatet ifølge foreliggende oppfinnelse (helt til høyre) inneholder chymopapain B uten noe forurensende chymopapain C.
Eksempel 7
Toksisiteten og antigenisiteten for to forskjellige chymopapainpreparater ble sammenlignet i en undersøkelse med dobbelt blindprøve. Et Chemolase®-preparat som her hadde blitt fremstilt ved preparering av den rensede chymopapain B ifølge oppfinnelsen som beskrevet i eksempel 3, ble sammenlignet med Chymodiactin® (Smith Laboratories), som inneholdt både chymopapainer B og C. En kontrollundersøkelse med dobbelt blind- referanse uten placebo; ble utført ved Yale University under FDA-beskyttelse (IND 21087). innbefattende chemonukleolyse med menneske-pasienter. Hverken de involverte leger eller pasientene kjente til hvilke av de to ovennevnte chymopapain-preparater som ble benyttet.
Av 43 injeksjoner hittil har en uheldig reaksjon som muligens kunne være en allergisk reaksjonstype, blitt rapportert, og som forekom etter injeksjon av Chymodiactin®-forbindelsen. I dette spesielle tilfellet rapporterte legen at et hudutslett på hele kroppen oppsto 24-48 timer etter injeksjon av et preparat som senere ble bestemt til å være Chymodiactin®-forbindelsen. Journalene viser at den rammede pasient hadde hatt tidligere episoder med denne type reaksjon. Selv om legen ikke er overbevist om at dette faktisk var en legemiddelreaksjon, har lignende sykdomsreaksjoner av serumtypen etter chymopapain-injeksjon tidligere blitt rapportert i den medisinske litteratur, og denne kliniske observasjon ble rapportert til FDA. Disse preliminære resultater tyder på at det nye terapeutiske preparat ifølge oppfinnelsen, som består vesentlig av chymopapain B uten sammenblanding med chymopapain C, kan redusere risikoen for uheldige allergiske reaksjoner vis a vis injeksjon med preparater som inneholder flere chymopapain-enzymer. Denne antydning følger det generelle prinsipp at for å minimalisere risikoen for enhver type allergisk reaksjon, er det tilrådelig å inkorporere færrest antall forskjellige typer av proteiner i inokulumet.
Mens oppfinnelsen har blitt beskrevet i forbindelse med spesielle utførel-ser derav, vil det forstås at den kan ytterligere modifiseres, og at foreliggende søknad skal dekke enhver variasjon, bruk eller tilpasning av oppfinnelsen som generelt følger oppfinnelsens prinsipper og innbefatter slike avvik fra det som her er beskrevet som omfattes av den relevante teknikk som oppfinnelsen tilhører, og som kan benyttes på de tidligere angitte vesentlige trekk, innen oppfinnelsens ide og rammen for de med-følgende krav.
Claims (26)
1. Fremgangsmåte for rensing av chymopapain-protease fra en kompleks ioppløsning,karakterisert vedat man . (a) blander nevnte komplekse oppløsning med inkrementer av kationutvekslerharpiks for selektivt å adsorbere noe, men . ikke all protease på harpiksen inntil det punkt er nådd hvorved protease-aktivitet i supernatanten har minsket til et bestemt minimalt nivå; og (b) eluerer proteasen fra harpiksen.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at den komplekse oppløsning er en vandig oppløsning av rå-chymopapain.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 2,karakterisertved at rå-chymopapainen er isolert fra papayalateks ved at man (a) danner en vandig dispersjon inneholdende papayalateks, (b) sentrifugerer nevnte dispersjon for oppnåelse av en supernatant og et bunnfall, (c) bringer supernatanten fra trinn (b) til 45% ammoniumsulfat for dannelse av en resulterende supernatant og et bunnfall, (d) surgjør den resulterende supernatant fra trinn (c) til ca. pH 2,0 for dannelse av en resulterende oppløsning og et bunnfall, (e) bringer den resulterende oppløsning fra trinn (d) til 75% ammoniumsulfat for å utfelle rå-chymopapain; og (f) utvinner den utfelte rå-chymopapain.
4. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at kationutvekslerharpiksen er et karboksymetylderivat av et polymert karbohydrat slik som karboksymetyldekstran, karboksymetyl-agarose o.l.
5. Fremgangsmåte ifølge krav 4,karakterisertved at kationutvekslerharpiksen er en CM-Sephadex.
6. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at den bestemte minimale proteaseaktivitet er mindre enn ca.
5%, men større enn ca. 2% av den totale protease-aktiviteten som innledningsvis er til stede i den komplekse oppløsning.
7. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at elueringen utføres ved kolonnekromatografi.
8. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at elueringen utføres med en lineær ionestyrke-gradient av elueringsmiddel.
9. Fremgangsmåte ifølge krav 8,karakterisertved at elueringen utøres med en lineær gradient av natriumacetat fra 0,2 til 1,0 M (pH5,0).
10. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at chymopapain B utvinnes separat fra chymopapain C.
11. Preparat,karakterisert vedat det i det vesentlige består av ren chymopapain B fremstilt ved fremgangsmåten ifølge krav 1.
12. Preparat,karakterisert vedat det i det vesentlige består av ren chymopapain C fremstilt ved fremgangsmåten ifølge krav 1.
13. Terapeutisk preparat,karakterisert vedat det vesentlig består av chymopapain B uten chymopapain C.
14. Terapeutisk preparat ifølge krav 13,karakterisert vedat det er blandet med egnede farmasøytiske eksipienser.
15. Terapeutisk preparat ifølge krav 14,karakterisertved at det er blandet med cystein og dinatriumedetat.
16. Terapeutisk preparat ifølge krav 15,karakterisertved at det er blandet med natriumdisulfat.
17. Enzymanalyse for chymopapain,karakterisertved følgende trinn: (a) tilveiebringelse av en egnet mengde buffer inneholdende (1) en sulfhydrylreagens og (2) et homogent fotometrisk substrat, (b) anbringelse av nevnte buffer i kontakt med tilstrekkelig chymopapain for å gi anledning for forekomst av detekterbare fotometriske endringer, og (c) kontinuerlig overvåking av nevnte fotometriske endringer etter hvert som de forekommer.
18. Enzymanalyse ifølge krav 17,karakterisertved at nevnte chymopapain er chymopapain B.
19. Enzymanalyse ifølge krav 18,karakterisertved at substratet er BAPNA.
20. Enzymanalyse ifølge krav 18,karakterisertved at bufferen er Na-citrat med en molaritet fra ca. 0,025 M til ca.
0,25 M.
21. Enzymanalyse ifølge krav 20,karakterisertved at Na-citratbufferen har en molaritet på ca. 0,1 M.
22. Enzymanalyse ifølge krav 18,karakterisertved at bufferen inneholder et chelateringsmiddel.
23. Enzymanalyse ifølge krav 18,karakterisertved at sulfhydrylreagensen er cystein, p-merkaptoetanol og glutation.
24. Enzymanalyse ifølge krav 23,karakterisertved at sulfhydrylreagensen er cystein.
25. Enzymanalyse ifølge krav 19,karakterisertved at de fotometriske endringene overvåkes ved ca. 410 nm.
26. Enzymanalyse for chymopapain B,karakterisertved følgende trinn: (a) tilveiebringelse av en egnet mengde på ca. 0,1 M Na-citrat-buffer ved ca. pH 6,4, inneholdende ca. 3,6 mg/mlcystein og ca. 0,5 mM EDTA og ca. 5 mM BAPNA, idet bufferen likevektsinnstilles ved 37°C, (b) anbringelse av bufferen i kontakt med tilstrekkelig chymopapain B til å tillate detekterbare økninger i absorbans ved ca. 410 nm, og (c) kontinuerlig overvåking av nevnte økninger i absorbans ved 410 nm etter hvert som de forekommer.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US59635684A | 1984-04-03 | 1984-04-03 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO854823L true NO854823L (no) | 1986-01-24 |
Family
ID=24386988
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO854823A NO854823L (no) | 1984-04-03 | 1985-11-29 | Ren chymopapain b: industriell prosess og terapeutisk preparat. |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0175786A1 (no) |
| JP (1) | JPS61502444A (no) |
| AU (1) | AU4217885A (no) |
| ES (2) | ES8604303A1 (no) |
| FI (1) | FI854765A7 (no) |
| GB (1) | GB2156821A (no) |
| NO (1) | NO854823L (no) |
| WO (1) | WO1985004417A1 (no) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2193720B (en) * | 1986-08-15 | 1990-09-19 | Agricultural & Food Res | Payaya proteinase b separation and uses |
| GB8909836D0 (en) * | 1989-04-28 | 1989-06-14 | Boots Co Plc | Therapeutic agent |
| CN114054301B (zh) * | 2021-12-27 | 2022-06-24 | 南通世睿电力科技有限公司 | 一种电力设备堵漏用丙烯酸胶黏剂低温条件下施工工艺 |
| WO2025057166A1 (en) | 2023-09-14 | 2025-03-20 | Herbarius Ltd | Composition and method for removing plaque from an artery |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3412150A (en) * | 1965-01-15 | 1968-11-19 | Navy Usa | Nalpha-benzoyl arginine p-nitroanilide hydrochloride |
| US3558433A (en) * | 1967-11-07 | 1971-01-26 | Baxter Laboratories Inc | Process for purification of chymopapain |
| US3623955A (en) * | 1968-08-14 | 1971-11-30 | Monsanto Co | Purification and recovery of alkaline protease using cationic-exchange resin |
| FR2093139A5 (no) * | 1970-06-03 | 1972-01-28 | Roussel Uclaf | |
| YU40433B (en) * | 1975-02-20 | 1986-02-28 | Lek Tovarna Farmacevtskih | Process for obtaining pure, proteolytically active anzymes |
| US4086139A (en) * | 1976-04-09 | 1978-04-25 | Gb Fermentation Industries Inc. | Differential inactivation of amylase in amylase-protease mixtures |
| US4390628A (en) * | 1979-05-17 | 1983-06-28 | De Forenede Bryggerier A/S | Process for isolating Cu, Zn-superoxide dismutase from aqueous solutions containing said enzyme together with accompanying proteins |
| EP0065395B1 (en) * | 1981-05-13 | 1988-08-24 | BOOTS-FLINT, INC. (a Delaware corp.) | Improved chymopapain and method for its production and use |
-
1984
- 1984-07-03 GB GB08416926A patent/GB2156821A/en not_active Withdrawn
- 1984-08-09 ES ES535035A patent/ES8604303A1/es not_active Expired
-
1985
- 1985-04-02 JP JP60501768A patent/JPS61502444A/ja active Pending
- 1985-04-02 FI FI854765A patent/FI854765A7/fi not_active Application Discontinuation
- 1985-04-02 AU AU42178/85A patent/AU4217885A/en not_active Abandoned
- 1985-04-02 EP EP85902217A patent/EP0175786A1/en not_active Withdrawn
- 1985-04-02 WO PCT/US1985/000559 patent/WO1985004417A1/en not_active Ceased
- 1985-08-23 ES ES546394A patent/ES8700319A1/es not_active Expired
- 1985-11-29 NO NO854823A patent/NO854823L/no unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU4217885A (en) | 1985-11-01 |
| FI854765A0 (fi) | 1985-12-02 |
| GB2156821A (en) | 1985-10-16 |
| WO1985004417A1 (en) | 1985-10-10 |
| ES535035A0 (es) | 1986-01-16 |
| ES8604303A1 (es) | 1986-01-16 |
| JPS61502444A (ja) | 1986-10-30 |
| EP0175786A1 (en) | 1986-04-02 |
| FI854765L (fi) | 1985-12-02 |
| FI854765A7 (fi) | 1985-12-02 |
| ES546394A0 (es) | 1986-10-01 |
| ES8700319A1 (es) | 1986-10-01 |
| GB8416926D0 (en) | 1984-08-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5332503A (en) | Process for purifying collagenase | |
| Soni et al. | Extraction, purification and characterization of phycocyanin from Oscillatoria quadripunctulata—Isolated from the rocky shores of Bet-Dwarka, Gujarat, India | |
| US6471500B1 (en) | Process for producing erythropoietin containing no animal proteins | |
| Nagai | Vertebrate collagenase: further characterization and the significance of its latent form in vivo | |
| NO863424L (no) | Fremgangsmaate for rensing av et interferon. | |
| HU197357B (en) | Process for cleaning and reactivating precipitated heterologous proteins | |
| Takamori et al. | Skin sulfhydryl oxidase purification and some properties | |
| Yamaya et al. | Characteristics of nitrate reductase-inactivating proteins obtained from corn roots and rice cell cultures | |
| EP2145896A2 (en) | Recovery of a heat shock protein | |
| NO854823L (no) | Ren chymopapain b: industriell prosess og terapeutisk preparat. | |
| EP0446582A1 (en) | Method for producing of recombinant human cysteineless gamma-interferon free of methionine at n-terminal | |
| OSMUNDSVAG et al. | Cellulases from Sporocytophaga myxococcoides: Purification and properties | |
| Tilgmann et al. | Purification and partial sequence analysis of the soluble catechol-O-methyltransferase from human placenta: comparison to the rat liver enzyme | |
| Bollen et al. | A conditionally lethal mutation of Escherichia coli affecting the gene coding for ribosomal protein S2 (rpsB) | |
| CA1173389A (en) | Isolation of microbial protein with reduced nucleic acid content | |
| WO2022089340A1 (zh) | 一种利用基因工程水稻表达人糜蛋白酶原和制备重组人糜蛋白酶的方法 | |
| SELTZER et al. | Purification and characterization of esculentamin, a proteinaceous alpha‐amylase inhibitor from the taro root, Colocasia esculenta | |
| Petell et al. | [80] Isolation of several abundant muscle enzymes | |
| Karam et al. | A rapid method for the purification of fatty acid synthetase from the yeast Saccharomyces cerevisiae | |
| CN110563833A (zh) | 一种人血白蛋白标准物质原料的制备方法及其产品和应用 | |
| US3793149A (en) | Cell-bound keratinolytic enzymes or trichophyton mentagrophytes and process therefor | |
| CN1948471B (zh) | 一种羧肽酶b的制备方法及其组合物 | |
| JP3108767B1 (ja) | ｃｈｉｂ２型キチナーゼの製造法 | |
| Braun et al. | [6] Cytochrome-c reductase/processing peptidase complex from potato mitochondria | |
| SU533631A1 (ru) | Способ извлечени белковых веществ из растворов |