NO861139L - Stabilt gamma-interferonpreparat. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører stabile lyofili-

serte -y-interferonpreparater som etter rekondisjonering med

vann forblir klare og biolgisk aktive i minst 24 timer ved væreIsetemperatur.

Uttrykket "-y-interferon" (GIF) henviser til naturlig forekommende interferon eller til rekombinant interferon som oppviser lignende biologiske egenskaper som humant immun-interferon. I beskrivelsen av foreliggende oppfinnelse er uttrykket7-interferon-A eller GIF-A brukt for å betegne f-interferon med 146 aminosyrer som begynner med cystein-tyrosin-cystein og slutter med glutamin. I tillegg er en rekke avkortede -y-interf eronprodukter kjent, idet de enkelte avkortede produkter betegnes tilsvarende nedenunder ved hjelp

av en stor bokstav etter uttrykket7-interferon, f.eks. GIF-

D, som mangler cystein-tyrosin-cystein-fragmentet som er

fjernet og således bare har 143 aminosyrer, og GIF-B, hvor GIF-A er avkortet i carboxylsyreenden til et fragment som inneholder 131 aminosyrer. Alle er ment for bruk i foreliggende oppfinnelse, selv om en foretrukket form av GIF for bruk i denne oppfinnelse er GIF-A.

■y-interferon er blitt rapportert å være et antiproli-ferasjonsmiddel, og å forsterke de antivirale og antiproli-ferative virkninger av a- og (3-interferoner (dvs. leukocytt-

og fibroblastinterferoner) . Det har vært foreslått at Y-interferon også kan være et immunregulerende middel.

En kjent fremgangsmåte for fremstilling av doseringsformer av interferon omfatter lyofilisering av interferonet i blanding med andre bestanddeler for rekondisjonering med vann på brukstidspunktet. Ettersom -jr-interferonet i litteraturen er kjent å være syrelabilt (i motsetning til a- og p-interferoner, som er stabile ved sur pH), har det tradisjonelt vært håndtert ved nøytral eller svakt alkalisk pH. F.eks. beskriver GB patentsøknad nr. 2119313A lyofiliserte preparater som inneholder 7-23 ug/ml GIF pr. ml rekondisjonert oppløsning med pH 7,5. På grunn av den øyeblikkelige dannelse av et synlig bunnfall er imidlertid slike nøytrale eller svakt alkaliske oppløsninger ubrukbare som injiserbare preparater ved høyere konsentrasjoner av -jf-interferon (dvs. >0,2 mg/ml). Slike bunn fall er uønsket av flere grunner, f.eks. på grunn av muligheten for at de forårsaker trombose hos pasienten, sannsynlig-heten for tap av GIF-styrke og muligheten for gjentetting av sprøytenålen.

Oppfinnelsen tilveiebringer derfor et biolgisk stabilt, lyofilisert7-interferonpreparat som omfatter7-interferon og en forenlig buffer, hvor bufferen holder pH i en oppløsning som er rekondisjonert med vann til en konsentrasjon fra 0,001, fortrinnsvis 0,05, til 10 mg Y-interferon pr. ml innenfor området 4,0 - 6,0, fortrinnsvis 4,5 - 5,0.

Slike preparater utgjør overraskende biologiske og kjemisk stabile lyofiliserte pulvere som, etter rekondisjonering med vann, gir klare oppløsninger.

Ettersom GIF fortrinnsvis administreres parenteralt,

er preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse primært ment for bruk ved injiserbare anvendelser, dvs. intramuskulære, intravenøse og subkutane injeksjoner. Slike preparater vil imidlertid være passende for andre administrasjonsmåter for GIF hvor en GIF-oppløsning i en annen passende doseringsform er nødvendig (f.eks. nese-sprayer og topiske doseringsformer, slik som oppløsninger for bruk på øynene).

Syrelabiliteten til GIF er godt dokumentert. F.eks. rapporterer J. Vilcek et al, Journal of Immunological Methods, 69 (1984), s. 61-60, ustabiliteten av GIF ved lav pH; de ut-vant hoveddelen av GIF fra en kolonne eluert ved pH 3,5, men bare når fraksjonene ble samlet opp direkte i nøytralt bufret medium.

Ved lav pH er oppløsninger av GIF med eller uten sure proteinoppløseliggjørende midler, slik som humant serumalbumin, opprinnelig klare i motsetning til nøytrale eller svakt alkaliske oppløsninger hvor oppløsningen er turbid. Ved sur pH dannes det eventuelt et bunnfall, men tilstedeværelsen av et oppløseliggjøringsmiddel nedsetter dannelsen av bunnfall betraktelig.

De lyofiliserte pulvere ifølge denne oppfinnelse forblir stabile ved pH 4,5 etter langvarig lagring (f.eks. 1 år) under nedkjøling. Rekondisjonerte oppløsninger forblir klare, dvs. fri for bunnfall og/eller uklarhet, og er biologisk stabile i minst 24 timer ved værelsetemperatur eller under nedkjøling. Ettersom pulveret rekondisjoneres like før bruk,

er 24 timer mer enn tilstrekkelig tid for at oppløsningen skal forbli klar for injeksjon. Videre forblir rekondisjonerte oppløsninger klare og biologisk stabile etter lagring i fryser i minst 2 uker.

I sammenheng med denne oppfinnelse betyr uttrykket "biologisk stabil" at den biologiske virkning av interferon-preparatet, slik den måles i standardmetoden ved inhibering av den cytopatiske virkning (CPE) til et virus, i det vesentlige bibeholdes etter lagring som beskrevet ovenfor. Andre mindre kvantitative biologiske funksjoner, slik som anti-proliferativ og immunregulerende virkning, oppviser alle lignende stabilitet.

En betydelig fordel ved foreliggende oppfinnelse er

at GIF er mer oppløselig ved lavere pH, og det er derfor mulig å bruke høyere konsentrasjoner enn de som tidligere er beskrevet for nøytrale eller alkaliske preparater av GIF. Ved nøytral pH gir en oppløsning med mer enn 0,2 mg GIF/ml

et bunnfall, mens GIF i preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse kan være tilstede i opp til 10 mg/ml av klar rekondisjonert oppløsning.

En annen fordel ved foreliggende oppfinnelse er at

den sure pH til preparatet gjør det mulig å blande a- og /eller P-interferon, som begge er syrestabile sure proteiner, med

•y-interf eron i det samme preparat.

Nok en annen fordel er evnen til i det vesentlige å redusere eller eliminere den høye saltkonsentrasjonen (f.eks. natriumklorid) som ofte settes til GIF-oppløsninger som en stabilisator. Lyofilisering av en GIF-oppløsning med lavt saltinnhold gir et betydelig bedre lyofilisert pulver ved fremstillingen av doseringsformer ifølge oppfinnelsen enn saltholdige oppløsninger. Slike preparater med lavt saltinnhold danner dessuten isotone oppløsninger egnet for intra-muskulær injeksjon når de er rekondisjonert med vann.

I de lyofiliserte preparater ifølge foreliggende oppfinnelse er buffermidler tilstede slik at pH i den rekondisjonerte oppløsning vil være 4,0 - 6,0, fortrinnsvis 4,5 - 5,0. Et foretrukket buffersystem er sitronsyre og dibasisk natriumfosfat, men andre organiske syrebuffere som f.eks. ravsyre eller vinsyre og/eller uorganiske syrebuffere som f.eks. borsyre eller én eller flere natriumfosfater, kan brukes.

Preparatet omfatter fortrinnsvis et oppløseliggjørings-middel, f.eks. humant serumalbumin (HSA), gelatin eller kasein. HSA kan være tilstede i en mengde opp til 30 mg/ml rekondisjonert oppløsning, idet 1 mg/ml er foretrukket.

Antioxydanter kan, dersom slike er tilstede, f.eks.

være sulfhydryl-spesifikke reduksjonsmidler som f.eks. gluta-thion, thiodiglycolsyre, dithiothreitol og 2-mercapto-

ethanol, eller en blanding av ascorbinsyre og cystein eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav. En foretrukket antioxydant er en blanding av ascorbinsyre og monohydratet av cysteinhydroklorid. For GIF-analoger som mangler oxyderbare cysteiner (f.eks. GIF-D) trengs det ingen antioxydant. Antioxydanten er fortrinnsvis tilstede i området 0,1-5 mg/ml rekondisjonert oppløsning.

For å danne et godtagbart lyofilisert stykke, og for

å optimalisere ny oppløseliggjøring, kan ett eller flere svellingsmidler slik som nøytrale aminosyrer (f.eks. glycin, alanin), monosaccharider (f.eks. glucose), disaccharider

(f.eks. lactose) og flerbasiske sukkeralkoholer (f.eks. mannitol) innlemmes i et område fra 0 til 100 mg/ml rekondisjonert oppløsning, idet 10 - 30 mg/ml er foretrukket. Et foretrukket svellingsmiddel er glycin.

Andre hjelpestoffer kan være tilsatt til preparatet etter skjønn av fagfolk innen teknikken, f.eks. gelaterings-midler slik som dinatriumedetat i et konsentrasjonsområde fra 0 til 0,5 mg/ml rekondisjonert oppløsning.

De ovenfor beskrevne oppløseliggjøring-, antioxydant-og svellingsmidler er kun foretrukkede additiver for GIF-preparatene ifølge oppfinnelsen. Bruken av noen eller alle midlene alene eller i blanding er ikke påkrevet for å oppnå fordelene med oppfinnelsen.

Hjelpemidler for rekondisjonering av det lyofiliserte pulver ifølge oppfinnelsen omfatter f.eks. vann, isotonisk vann og oppløsninger som omfatter dextrose, glucose, propylen-glycol og/eller polyethylenglycol. Når den rekondisjonerte oppløsning ikke er ment for injeksjon (f.eks. oppløsninger for tonisk eller oral bruk), kan det anvendes andre farmasøytisk akseptable hjelpemidler som f.eks. ethanol. Et foretrukket hjelpemiddel for rekondisjonering av det lyofiliserte pulver ifølge oppfinnelsen er vann.

Et annet aspekt ved foreliggende oppfinnelse er stabili-teten til sure bulkoppløsninger av GIF ved nedfrysing og opptining. Uttrykket "bulkoppløsning" henviser til vandige opp-løsninger som omfatter 1-15, fortrinnsvis 1 - 10 mg GIF/ml,

og 0 - 5 mg/ml av en antioxydant som f.eks. cystein, oppløs-ninger som ikke er blitt fremstilt ut fra lyofilisert GIF.

Når nøytrale bulkoppløsninger som kan inneholde et maksimum

på 1 mg GIF/ml nedfryses og tines, oppstår det rikelig utfelling. Vi har imidlertid overraskende funnet at ved pH 4,5 - 5,5, fortrinnsvis pH 5, gir en 8 mg/ml bulkoppløsning av GIF ikke utfelling etter opptining, selv etter langvarig lagring, når den lagres ved eller under frysepunktet for oppløsningen

(f.eks. -10°C eller lavere, idet -20°C er en vanlig temperatur

for testing av stabilitet).

Buffermidler for bulkoppløsning er de samme som de

som er beskrevet ovenfor for det lyofiliserte preparat.

En slik bulkoppløsning (pH 5) kan f.eks. ha følgende sammensetning:

Det er flere fordeler ved bruken av nedfryste sure bulkoppløsninger for lagring av GIF. F.eks. tillater den høyere konsentrasjon av GIF som er mulig ved sur pH, at mindre volumer av oppløsning lagres, hvorved det spares plass; og lagring av nedfyst materiale er foretrukket fremfor lagring av væsker ettersom f.eks. sjansen for mikrobiell vekst reduseres. Dessuten er en vanlig metode for lagring av GIF

for transport i nøytral 50% glyceroloppløsning ikke fullstendig tilfredsstillende ettersom glyceroloppløsningen vil fryse ved temperaturen som brukes for lagring under transport. Det at man er i stand til å fryse ned en sur bulk-GIF-oppløsning forenkler senere håndtering ved eliminering av behovet for tid-krevende, kostbare dialyser for å fjerne glycerolen og for å oppkonsentrere oppløsningen før bruk. Likeledes muliggjør bruken av sure bulkoppløsninger elimineringen av høye konsentrasjoner av salt som f.eks. natriumklorid, som har vært brukt for å stabilisere GIF-oppløsninger, og forenkler igjen bearbeiding før bruk i preparater.

Eksemplet nedenunder illustrerer fremstillingen av sterile pulvere for fremstilling av en injiserbar oppløsning av T-interferon:

Bestanddelene ble blandet og lyofilisert under an-vendelse av standardteknikker.

K GIF tilviebringes som en bulkoppløsning i det vesentlige som beskrevet ovenfor, særlig som eksemplifisert ovenfor. Sluttkonsentrasjonen av cysten • HC1 var derfor 1,0 mg/ampulle i hvert preparat.

Claims (13)

1. Biologisk stabilt, lyofilisert7 -interferonpreparat, karakterisert ved at det omfatter 7-interferon og en forenlig buffer, hvor bufferen holder pH i en oppløsning som er rekondisjonert med vann til en konsentrasjon fra 0,01, fortrinnsvis 0,05, til 10 mg -y-interferon pr. ml, innenfor området 4,0 - 6,0.

2. Preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at preparatet i tillegg innenholder et oppløseliggjøringsmiddel, fortrinnsvis humant serumalbumin, i en mengde opp til 30 mg pr. ml rekondisjonert oppløsning.

3. Preparat ifølge krav 1 eller krav 2, karakterisert ved at oppløsningen i tillegg inneholder en antioxydant valgt blant sulfhydryl-spesifikke treduksjonsmidler og en blanding av ascorbinsyre og cystein eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, fortrinnsvis en blanding av ascorbinsyre og cystein.

4. Preparat ifølge et av kravene 1-3, karakterisert ved at preparatet inneholder 0 - 100 mg/ml rekondisjonert oppløsning av ett eller flere svellingsmidler valgt blant nøytrale aminosyrer, monosaccharider, disaccharider og flerbasiske sukkeralkoholer, fortrinnsvis glycin.

5. Preparat ifølge et av kravene 1-4, karakterisert ved at preparatet i tillegg inneholder et gelateringsmiddel, fortrinnsvis dinatriumedetat.

6. Preparat ifølge et av kravene 1-5, karakterisert ved at bufferen omfatter sitronsyre og dibasisk natriumfosfat og fortrinnsvis opprettholder en pH på 4,5 - 5,0 i den rekondisjonerte oppløsning.

7. Preparat ifølge et av kravene 1-6, karakterisert ved at -y-interf eronet er tilstede i området 0,1 - 2 mg/ml rekondisjonert oppløsning, fortrinnsvis 1 mg/ml, og er især -y-interf eron-A.

8. Preparat ifølge et av kravene 1-7, karakterisert ved at det videre inneholder a- eller [3-interferon.

9. Preparat, karakterisert ved at det omfatter: 0,05 - 10 mg -y-interferon/ml rekondisjonert oppløs-ning , et buffersystem som er sammensatt av sitronsyre og dibasisk natriumfosfat slik at det opprettholder et pH-område på 4,0 - 6,0, fortrinnsvis 4,5, 0 - 30 mg humant serumalbumin/ml rekondisjonert opp-løsning, fortrinnsvis 1 mg/ml, 0,1 - 5 mg ascorbinsyre, fortrinnsvis 2 mg, og 0,1 - 5 mg, fortrinnsvis 1 mg, cystein/ml rekondisjonert oppløsning, 0 - 100 mg glycin/ml rekondisjonert oppløsning, fortrinnsvis 20 mg, og 0 - 0,5 mg dinatriumedetat/ml rekondisjonert opp-løsning, fortrinnsvis 0,1 mg.

10. Rekondisjonert preparat ifølge et av kravene 1-9, karakterisert ved at det er egnet for injeksjon.

11. Fremgangsmåte for lagring av GIF, karakterisert ved at den omfatter lagring ved eller under frysepunktet for en oppløsning som er sammensatt av 1 - 10 mg -y-interf eron og 0 - 5 mg antioxydant/ml oppløsning og en forenlig buffer som vil holde pH i oppløs-ningen innenfor området pH 4,5 - 5,5, fortrinnsvis på ca.

5,0.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at bufferen omfatter sitron syre og dibasisk natriumfosfat, pH i oppløsningen er fortrinnsvis 5,0 og antioxydanten er fortrinnsvis cystein.

13. Oppløsning ifølge krav 11 eller 12, karakterisert ved at den er lagret ved eller under frysepunktet.