NO861580L - Fremgangsmaate for fremstilling av celleadhesjonsinhibitorer. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår forbedringer ved-rørende fremstilling av celleadhesjonsinhibitorer, de således erholdte antiadhesiner og legemidler og næringsmidler inneholdende disse.

Det er nå ålment erkjent at en meget stor del av mikroorganismer og spesielt patogene mikroorganismer har den egenskap at de kan festes til overflaten av det omgivende medium (enhver type av fast substans, human, animal, plante-celler) . Infektiøse mikroorganismer adherer til målcellene i kraft av organiserte molekylære strukturer i form av cap-sider, ytre membraner og/eller pili, fimbriae, flagella eller lignende, som generelt angis som adhesiner.

I et utall tilfeller er et absolutt krav for infek-sjonsmekanismen en foregående adhesjon av mikroorganismen til det omgivende medium eller direkte til ett av de enkelte ganger spesifikke membranreseptorer, idet dette er en betin-gelse for hver bakteriell kolonisering. Arten av disse mikrobielle strukturer eller adhesiner, og den av reseptorene som er ansvarlig for adhesjonsfenomenet, er fremdeles ikke fullstendig belyst, et stort antall studier publisert av forskjellige forfattere har funnet ut at dette fenomen med økende hell (se spesielt arbeidet av G. Chabanon i "Revue de 1'Inst. Pasteur de Lyon", 1984, t. 18, s. 85 - 105; G.W. Jones i "Microbial Interactions" Series B, Vol. 3, s. 141 - 176

(1977); og A. Gunnarsson et al. i "Infection and Immunity",

Juli 1984, s. 41 - 46, etc). Resultatet av disse studier

er at adhesiner virker ved hjelp av enkelte ganger spesifikke interaksjoner som er etablert mellom enkelte av deres seter eller enkelte av deres strukturelle enheter og kjemiske grup-per tilstedeværende i naboomgivelsene av den ytre membran av målcellen eller strukturen og/eller på dets overflate.

Blant forskjellige midler som for tiden anvendes

for å bekjempe infektiøse midler anvendes i særdeleshet føl-gende to:

- vaksinasjon (preventiv virkning),

- antibioterapi (legende virkning).

I noen tid (cf. Sharon et al. i "Adhesion and Microorganism Pathogenicity" Ciba Foundation Symposium 80, s. 119 - 135; D.C. OLD i J.gen. Microbiol. 1972, 71, s. 149 - 157; og G.W. JONES er imidlertid en metode for å bekjempe infeksjon blitt anbefalt som består i inhibering av adhesjons-egenskaper av mikroorganismer. Denne inhibering ved konkur-rering innbefatter enkle sukkere av veldefinert struktur, slik som monosaccharider. De erholdte resultater, selv om disse er oppmuntrende, har ikke gitt en tilfredsstillende løsning på problemet.

I en grundig studie av fenomenet med bakteriell adhesjon, spesielt på dyr, har søkeren satt seg det mål å forbedre metoden for inhibering ved konkurrering og utvikle nye terapeutiske midler, antiadhesiner, som er i stand til å forhindre adhesjonen av patogene bakterier, idet man har satt seg det mål å tilveiebringe en fremgangsmåte for fremstilling av antiadhesiner hvis virkning både er legende og forhind-rende: - legende når det infeksiøse middel allerede er nær eller i kontakt med målstrukturer eller cellen, idet det forårsaker dette å løsgjøres, - preventiv når risikoen for infeksjon er høy og administrering av antiadhesinene vil forhindre det patogene middel fra å nå målet.

Søkeren har funnet at de kjemiske interaksjoner involvert i fenomenet ved celleadhesjon passer inn i utallige modeller. Enkelte er spesifikke og basert på et fenomen med molekylær gjenkjennelse mellom et makromolekyl, som generelt er protein (lecitin eller lignende) og en membranreseptor; andre er ikke-spesifikke og medfører fenomener innbefattende ladning av hydrofob, elektrostatisk eller ionisk type eller hydrogenbindinger. Generelt er det sistnevnte fenomen ikke tilstrekkelig til å sikre en varig adhesjon, men de bidrar ofte til en stabilisering av de spesifikke interaksjoner.

I det sistnevnte tilfelle er de molekylære enheter som er aktive i reseptorene generelt av carbohydrat-karakter.

Målet med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en fremgangsmåte for fremstilling av substanser som kan betraktes ut fra et kjemisk synspunkt som strukturer som imiterer receptorene involvert i gjenkjennelsesfenomenet.

Foreliggende oppfinnelse angår således en fremgangsmåte for fremstilling av inhibitorer av celleadhesjon,

eller antiadhesiner, hvori glycoproteiner og/eller glycopeptider, lipidstrukturer og/eller glycolipider inneholdt i eller som stammer fra forskjellige væskeformige eller faste organiske substrater enzymatisk og/eller kjemisk lyseres,

og hvor strukturene som er resistente overfor lyset, som er delvis eller fullstendig av osidisk karakter og hvis molekylvekt alltid er større enn 1000, oppsamles og steriliseres.

De således erholdte antiadhesiner, som kan podes

på forskjellige bærere om ønsket, motvirker adhesjonen av flere mikroorganismer og utgjør et foretrukket legemiddel for bekjempelse eller forhindring av infeksjon.

I en fordelaktig utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen behandles glycoproteiner og/eller glycolipider uten å ekstraheres fra det organiske substrat.

I en annen fordelaktig utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, hydrolyseres glycoproteinene og/eller glycopeptidene og/eller glycolipidene etter at de er blitt ekstrahert fra det biologiske medium hvori de forelå.

I en metode for utførelse av denne utførelsesform ekstraheres glycoproteinene med: a) behandling i et organisk medium med ethanol i nærvær av Na caprylat, etterfulgt av

b) varmebehandling (60 - 70° C) og separering av

de utf elte glycoproteiner, og sluttelig c) proteolyse etterfulgt om hensiktsmessig, med hydrazinolyse.

Ved en annen metode for utførelse av denne utføre-lsesform ekstraheres glycolipidene ved virkningen av en blanding av løsningsmidler, og underkastes deretter hydrolyse.

Løsningsmidlene anvendt for å ekstrahere glucn-lipinene kan bestå av den binære blanding kloroform/ethanol eller den ternære blanding kloroform/ethanol/aceton.

Ifølge oppfinnelsen utføres hydrolysen som følger:

1) Når det gjelder glycoproteiner, ved hjelp av

et protease, og fortrinnsvis ved hjelp av termolysin i nærvær

av calsiumioner ved pH på mellom 5 og 7 og ved en temperatur under eller lik 80° C, etterfulgt av hydrazinolyse eller en analog kjemisk behandling som gjør det mulig å frigjøre antiadhesinbestanddelen; 2) når det gjelder glycolipider, ved mild alkalisk hydrolyse etterfulgt av acetolysis eller en analog behandling for å isolere oligosaccharidstrukturen.

I en fordelaktig utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen innbefatter prosedyren rensing av oligosaccharidartene, og i særdeleshet, etter den enzymatis-ke hydrolyse, inaktivering av enzymet eller nøytralisering når det gjelder kjemisk lyse, hvoretter molekylærfiltrering gjør det mulig å oppsamle artene med en molekylvekt større enn 1000, hvoretter det foretas en sterilisering på en fil-termembran etter klaring av filtratet.

I en særlig fordelaktig utførelsesform konsentreres løsningen av antiadhesiner før sterilisering. Denne konsen-treringsprosess kan utføres ved hjelp av konvensjonelle midler slik som ultrafiltrering, utfelling, molekylekslusjons-kromatografi, ionebytterharpikser eller affinitetskromato-grafi.

Foreliggende oppfinnelse angår også adhesiner erholdt ved hjelp av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, hvilke antiadhesiner delvis eller fullstendig er av oligosaccharid-karakter, omfattende minst tre enkle eller substituerte oser, hvor én av osene nødvendigvis må være galactose eller glucose, og hvor molekylvekten av antiadhesinet alltid er større enn 1000.

Disse molekyler utgjør glimrende adhesjonsinhibi-torerfog de kan administreres i et utall av farmasøytiske former og kan også blandes med næringsmidler. Disse molekyler kan ha meget variert konfigurasjon. I deres strukturer har de kjerne, eller et skjelett, og perifere, terminale og/eller antennære sekvenser. De utviser i det minste enkle eller substituerte gal eller gle. Fig. 1-3 viser enkelte av disse strukturer ved hjelp av ikke-begrensende eksempler. Således viser fig. 1 en glycanstruktur av oligomannosid-typen av animalsk opprinnelse,

- fig. 2 viser en glycanstruktur av oligomannosid-type av

vegetabilsk opprinnelse,

- fig. 3 og 4 viser den typiske struktur av glycaner inneholdende repeterende eller ikke-repeterende, substituerte eller usutstituerte N-acetyllactoseaminenheter, og - fig. 5-7 viser noen få eksempler på indre sekvenser av kjernen podet på bæreren: et glycopeptid av animalsk opprinnelse på protein eller peptidbærere (fig. 5)

et glycopeptid av vegetabilsk opprinnelse på protein eller peptidbærere (fig. 6), og

et antiadhesin podet på væskeformige bærere (fig. 7).

Følgende forkortelser anvendes i figurene:

I realiteten er alle organiske substrater egnet for fremstilling av antiadhesinene ifølge oppfinnelsen.

Således har søkeren anvendt:

av biologiske væsker: blodplasma,fosterblodplasma-erythrocyter, urin, lymfevæske, cerebrespinalvæske, amniotisk væske, synovial væske;

av sekreter av forskjellige humane og animalske arter: melk, colostrum, gastrisk mucin, saliva, mucus; plantesekreter;

fra kilder av procaryoter og eucaryoter, dvs. helcelle-ekstrakter av normale celler eller celler overført ved infeksjon: vira, fager, bakterier, fungi, gjær, alger, moser, lav, bregner, celler fra høyere dyr, celler fra høyere planter;

av forskjlelige ekstrakter: celleekstrakter fra embryo, kjertler og vev, hjerne og nervevev, øyne, thymus, thyroid, pancreas, lunger, nyrer, lever, milt, tarmer, ben, muskler og placenta.

Oppfinnelsen forklares nærmere ved hjelp av den etterfølgende ytterligere beskrivelse, som henviser til eksempler for fremstilling av produktene ifølge oppfinnelsen, og også farmakologiske og kliniske forsøksrapporter som ved-rører aktiviteten av legemidlene ifølge oppfinnelsen.

De etterfølgende preparative eksempler såvel som testene for demonstrering av den inhiberende aktivitet av antiadhesinene, er gitt av illustrative grunner uten på noen måte å begrense oppfinnelsen.

PREPARATIVE EKSEMPLER

A. Andtiadhesiner fra blodplasma av forskjellige arter Eksempel 1

Blod oppsamlet med tilsatt antikoagulant ble sen-trifugert og separart i to faser: Plasma og cruor (suspen-sjon av erythrocyter). Plasmaet ble hydrolysert med et varmestabilt bakterielt protease, slik som thermolysin, som er i form av et lyofilisat inneholdende 25 % Na og Ca acetat bubbersalter (cf. Fransk patent 83 21033),

Etter inaktivering av enzymet ved varmebehandling (ved 75° C eller høyere) eller ved kjemisk utfelling, ble antiadhesinene med molekylvekt større enn 1000 oppsamlet og deretter klaret, ble befridd for lipider på en filterpresse ved hjelp av filterhjelpestoff, og ble sterilisert på en 0,22 y memb.ansikt. Antiadhesinene er eller kan erholdes ved bestemte kjemiske behandlinger, ved hydrasinolyse og/ eller ved hjelp av spesifike endoglycosidaser. Utbyttet av antiadhesin er ca. 5 % i forhold til proteinutgangsmaterialet.

Eksempel 2

Plastmaet ble behandlet med ethanol (8 %) og natriumcaprylat (4 x 10 3 M). Etter varmebehandling i 15 minutter ved 68° C ble de utfelte glycoproteiner separert fra albuminet ved filtrering på en filterpresse i nærvær av filterhjelpestoffer.

Den vaskede "kake" av glycoproteiner utgjør sub-stratet for proteolyse. Utbyttet av antiadhesiner er ca. 10 %.

Eksempel 3

Antiadhesinene erholdt ved hydrolyse i henhold

til Eksempel 1 og 2 ble konsentrert ved fysiokjemiske metoder: Ultrafiltrering, selektiv utfelling, molekylær ekstrusjonskromatografi, ionebyttekromatografi, affinitets-kromatografi. Denne sistnevnte teknikk ble anvendt for å separere de spesifikke individuelle arter.

B. Antiadhesiner fra erythrocytmembraner fra forskjellige arter

Eksempel 4

De røde celler erholdt ved sentrifugering av blod oppsamlet med tilsatt antikoagulant ble vasket og cellemem-branene ble bearbeidet ved en modifisert versjon av fremgangsmåten beskrevet av A. Faure, J. Debrieun og M. Caron (Red. Cell. Ghosts: a tool for purification of lectins in lectins, 1983, vol. 3, s. 661 - 665, publ. Walter de Gruyter, Berlin). Utbyttet av lyofiliserte membraner var ca. 4 g pr. liter blod.

Eksempel 5

Erythrocytmembranene erholdt i henhold til Eksempel 4 ble underkastet en proteolyttisk behandling lik den som er beskrevet i Eksempel 1, hvilket muliggjorde erholdelse av antiadhesinene båret av strukturer av protein-type.

Eksempel 6

Erythrocytmembranene erholdt i henhold til Eksempel 4 ble underkastet en prosess for ekstraksjon av glycolipidfraksjonene. Lipidfraksjonene ble erholdt ved innvirkning av en 2:1 blanding av kloroform og methanol og en andre ekstraksjon med en 1:9 blanding av de samme løs-ningsmidler eller med 2:1:30 ternær blanding av kloroform, ethanol og aceton. De erholdte ekstrakter ble underkastet en mild alkalisk hydrolyse, etterfulgt av en ytterligere oppdeling og fraksjonering ved kromatografi på silicagel. Elueringen ble utført med blandinger av methanol (x vol) og kloroform (y vol) slik at x/y økte fra 1:9 til 20:1.

Etter kjemisk hydrolyse eller en acetolys-behandling, muliggjorde kromatografiske metoder i henhold til en modifisert prosess beskrevet av A. Gunnarsson et al., i "Infection and Immunity", juli 1984, s. 41 - 46 å

isolere de individuelle oligosaccharidstrukturer med en molekylvekt alltid større enn 1000. Utbyttet var ca. 1 %. Alle erholdte fraksjoner inneholdt i det minste enkle eller substituerte gal og gle.

C. Antiadhesiner avledet fra biologiske væsker forskjellig fra blod

Eksempel 7

Etter konsentrering gjennomgikk utgangsmaterialene en proteolytisk behandling i henhold til Eksempel 1 eller en glycolipidekstraksjonsprosess i henhold til Eksempel 6. Utbyttet var av størrelsesorden 0,5 - 1 %.

D. Antiadhesiner erholdt fra pattedyrsekreter av forskjlelige animalske og/ eller humane arter

Eksempel 8

Colostrum eller melken gjennomgikk en protelytisk behandling og rensing i henhold til Eksempel 1 og/eller en behandling for ekstraksjon av lipidstrukturene i henhold til Eksempel 6.

E. Antiadhesiner erholdt fra mucus fra animalske arter, eksemplifisert ved intestinal mucus

Eksempel 9

Mucus fra duodenum, jejunum og ileum ble oppsamlet ved skrapning. Det suspenderte biologiske materiale ble befridd for forurensninger og cellebestanddeler ved sentrifugering ved 20 000 g. Etter dialyse utgjør løsningen av mucosale glucoproteiner, etter filtrering under sterile betingelser, subtratet for proteolysen i henhold til Eksempel 1.

F. Antiadhesiner avledet fra intestinale glycopeptider og glycolipider

Eksempel 10

Villi og epitel-cellene ble oppsamlet ved skrapning av duodenum, jejunum og ileum av det avlivede dyr og ble vasket ved sentrifugering. Etter homogenisering i en Potter homogenisator, eller delvis hydrolyse med trypsin

(15 minutter ved 37° C), ble lipidene ekstrahert med en

kloroform/methanol/vannblanding (4:8:3 v/v). Dette ga to fraksjoner: Lipider og glycolipider og lipid-frie celler.

Glycolipidekstraktene ble behandlet ved fremgangsmåten ifølge Eksempel 6. De lipid-fri epitele celler ble hydrolysert ved metoden beskrevet i Eksempel 1.

G. Antiadhesiner avledet fra plantesekreter

Eksempel 11

Sekretene suspendert i en vandig eller organisk buffret løsning, avhengig av det bestemte tilfelle, gjennom-aikk en proteolytisk behandling og rensing i henhold til Eksempel 1 og 3 og/eller en behandling i henhold til Eksempel 6.

H. Antiadhesiner avledet fra virus

Eksempel 12

Virus erholdt fra infiserte fluida eller celler ble renset ved densitetsgradient-ultrasentrifugering.

Glycoproteinene som bærer oligosaccharidstrukturene ble ekstrahert med butanol, etter behandling med membran-detergenter, ved en metode utledet fra metoden ifølge L.A. Hunt (Glycosidase analysis of large acidic-type glycopeptides from viral and cellular membrane glycoproteins, Biochem, J., 1983, 209, 659 - 667).

Antiadhesinene ble erholdt ved ensymatisk oppslut-ning og ble renset i henhold til Eksempel 1 og 3.

I. Antiadhesiner avledet fra fager

Eksempel 13

Fagene ble isolert fra forskjellig væskeformig gjødsel, gårdsgjødsel etc. ved metoden ifølge Smith and Huggins, 1982 (Successful treatment of experimental E. coli infections in mice using phage: its general superiority ever antibiotics, J. of General Bacteriology, 128, 307 - 318). Oligosaccharidene ble erholdt ved proteolysen ifølge eksempel 1.

J. Antiadhesiner erholdt fra bakterier

Eksempel 14

Bakteriene ble generelt dyrket ved 37° C i 24

timer på et medium egnet for utvikling av disse (eksempler er E. coli K88 på trypticase-soyamedium, E. coli K99 på

Minca's medium, lactobacilli på Rogosas medium etc.).

De bakterielle ekstrakter ble erholdt ved ultra-sonisk oppbrytning, hvoretter de ble konsentrert og underkastet hydrolyse i henhold til Eksempel 1 og 3 eller ekstraksjon av lipidstrukturene i henhold til Eksempel 6.

K. Antiadhesjiner fra fungi, gjær

Eksempel 15

Organismene ble isolert ved sentrifugering fra industrielle ekstrakter eller dyrkningsmedia anvendt for å mangfoldiggjøre disse. Ekstraktene ble underkastet proteolyse i henhold til Eksempel 1, 2, 3 eller 6.

1. Antiadhesiner avledet fra alger, moser, lav, bregner Eksempel 16

Plantene ble malt, glycoproteinene ble oppløst i en buffret løsning og underkastet hydrolyse i henhold til Eksempel 1, og antiadhesinene ble renset i henhold til Eksempel 3 eller 6.

M. Antiadhesiner ekstrahert fra høyere planter

Eksempel 17

Plantene, tilgjengelige i tørr eller våt, fullstendig malt tilstand og som er i stand til å fraksjoneres i to komponenter, dvs. protein og lipidkomponenter, ble underkastet de fremgangsmåter som er beskrevet i Eksempel 1, 3 eller 6, etter oppløsning eller suspendering om nødvendig.

N. Antiadhesiner isolert fra vev eller organer

Eksempel 18

Glycolipidene og glycopeptidene ble erholdt ved maling av hele organer slik som hjerne, nyre, lever, lunger etc. Glycolipidene ble ekstrahert i henhold til Eksempel 6. Glycopeptidene ble erholdt ved hydrolyse i henhold til Eksempel 1 eller 2. Disse kan separeres fra glycosamino-glycanene ved utfelling av sistnevnte med cetylpyridinium-klorid, og behandles deretter i henhold til Eksempel 3.

0. Antiadhesiner isolert fra egg

Eksempel 19

Egg-glycoproteinene (slik som ovomucoid, avidin, ovalbumin) oppsamlet etter selektiv utfelling av lysozymet og kromatografiske separasjoner, ble underkastet proteolyse i henhold til Eksempel 1, og antiadhesinene ble konsentrert og renset i henhold til Eksempel 3.

Demonstrasjon av den inhiberende aktivitet overfor bakteriell adhesjon

Følgende ble utført for å demonstrere aktiviteten av antiadhesinene ifølge oppfinnelsen: - in vitro forsøk på mål som de studerte mikroorganismer fester seg på, - in vivo forsøk på dyr bevisst infisert med patogene mikroorganismer,

- kliniske forsøk.

Den følgende prosedyre ble tilpasset for in vitro forsøkene: 1. Methodologi av aktivitetstesten på produktet som inhiberer adhesjon av mikroorganismen til målcellene

Adhesjon ble utført ved å bringe mikroorganismen

i kontakt med de fri eller immobiliserte mål ved hjelp av inhibering. Med parametrene for konsentrasjon, pH, ione-styrke, ionekarakter, temperatur og testvarighet definert, ble adhesjonsinhiberingstesten utført enten ved preinkubering av antiadhesinene ifølge oppfinnelsen med mikroorganismene, eller ved innføring av antiadhesinene i mediet inneholdende det mikrobielle middel og målstrukturen, fri eller immobilisert på en bærer.

Adhesjonen og antiadhesjonen ble observert og/eller kvantifisert: - visuelt mulig, avhengig av det angjeldende system, - ved optisk mikroskopi, enten ved direkte avles-ning etter (eller uten) beising, eller ved fasekontrast,

- ved spéktrofotometri,

- ved måling av radioaktiviteten eller fluorescens av mikroorganismene festet til målet.

Den sistnevnte metode gir en bedre kvantifisering av fenomenet.

2. Beskrivelse av en generell adhesjons- og anti-adhesjonstest basert på måling av radioaktiviteten av mikroorganismer bundet til målceller

Prinsipp

De undersøkte mikroorganismer ble dyrket og radio-aktivt merket ved innarbeidelse av forløpere inn i deres bestanddelmateriale.

Sluttkonsentrasjonen av mikroorganismen ble justert i henhold til testbetingelsene. Målestrukturene, dvs. cellene og/eller deres mucus, ble preparert ved de forskjellige teknikker som er beskrevet i litteraturen for erholdelse av celler. Det etterstrebede kvalitetskriterium er den studerte mikroorganismes adhesjonsevne.

Test

Testcellene og/eller deres mucus ble immobilisert på en egnet bærer som muliggjorde at radioaktive mikroorganismer kunne bringes i kontakt med disse, i nærvær eller fravær av antiadhesinene. Etter suksessiv vasking ble det biologiske materiale (målceller pluss adherende radioaktive bakterier) fjernet fra bæreren ved hjelp av en egnet behandling, og radioaktiviteten i mediet ble tellet ved væskescintillasjon.

I hvert forsøk uttrykker kontrollverdien 100 % adhesjon. Testen gjør det mulig å kvantifisere den biologiske aktivitet av antiadhesinene i forhold til deres enhets-masse.

3. Anvendelse av denne generelle test når det gjelder adhesjonen av E. coli K99 til målceller og/ eller deres mucus

E. coli K99 ble dyrket på et egnet medium inneholdende glucose og vitaminer, for eksempel Minca's medium (Guinée P.A.M., Jansen W.H., Agterberg CM., 1976), til hvilket en radioaktiv kjemisk forbindelse (aminosyre, pyrin eller pyrimidin nucleosid, natriumacetat etc.) var tilsatt, som er en forløper som er i stand til å inkorporeres i mikroorganismens bestanddelsmateriale.

Etter 18 timers dyrkning, ved 37° C hvis syntese av K99 pili skal finne sted, eller ved 18° C hvis den ikke skal finne sted, ble bakteriene oppsamlet, vasket og suspendert i en konvensjonell bufferløsning ved pH 7,2 (HEPES-Hanks, saltvannfosfatbuffer etc.).

Bakterieantallet ble funnet ved måling av den optiske densitet (OD) mellom 420 og 662 nm (OD er en lineær funksjon av antall kolonier, OD = f(C)), og konsentrasjonen ble justert til 10 8 - 10 9 bakterie/ml. Kontroller ble ut-ført med hensyn til nærvær av K99 pili ved seroagglutinasjon med anti-K99 antistoffer og med hensyn til levedyktigheten av bakteriecellene ved fortynning av en alikot og dyrkning på et egnet medium. - Fremstilling av målceller og/eller mucus og immobiliseringsteknikker (i henhold til CD. Laux et al., 1984) .

Mucus ble fremstilt ved skraping av tynntarmen av det avlivede dyr (mus, unge kaniner, smågris, lam, kalver etc.) og ble oppsamlet i en buffret løsning med pH 7,2. Sentrifugering ved 28 000 g i 15 minutter muliggjorde fullstendig fjerning av cellebestanddeler og materialer. Pro-teinkonsentrasjonen av hvert preparat ble sjekket og justert til minst 3,5 mg/ml.

Cellene ble fremstilt ved skraping av tynntarmen av dyret (mus med alder mellom 5 og 8 uker, én ukes gamle kaniner, smågris, lam, kalv under 5 dager) og ble oppsamlet i en bufferløsning som ble anvendt for konservering av cellene. Sentrifugering ved 1000 g fjernet vevbestanddeler,

og filtrering og sentrifugering ved 2000 g fjernet forurens-ningene. Cellene av tarm villi ble isolert ved trypsinering (0,1 % trypsin) eller dilacerering (Potter homogenisator nr. 18) og konsentrasjonen ble justert til mellom 10 6 - 10<8>celler/ml.

Cellen eller mucus-preparetet (0,25 ml) ble inn-ført i brønnene av~?vdyrkningsplater, ble inkubert over natten ved 4° C og ble vasket to ganger med en bufferløsning ved pH 7,2 fer å fjerne de ubundne proteiner eller celler.

Cellene av dyrearter (etablerte cellelinjer eller primærkulturer) ble dyrket i et celledyrkningsmedium i nærvær av 10 % kalvefosterserum, penicillin og streptomycin. De ble inkubert i 24 - 48 timer ved 37° C i en kontrollert atmos-fære, under dannelse av en sammenløpende monocellulært lag i brønnene av dyrkningsplatene. Ved bruk ble cellene vasket for å fjerne ethvert spor av virkningsmedium.

- Adhesjon og inhibering av adhesjon

Bakteriene (0,25 ml, dvs. minimum 50 000 dpm inkor-porert) og 50 yl buffer ble innført i brønnene og inkubert ved 37° C med de immobiliserte celler og/eller mucus.

Etter vasking med adherende bakterier løsgjort ved"virkningen av 0,5 ml 0,5 % SDS eller en hvilken som helst annen detergent eller gelatineringsmiddel, i 2 timer ved 37° C.

De tatte prøver (0,25 ml) ble deretter analysert ved måling av radioaktiviteten ved væskescintillasjon.

Ved testen for inhibering av adhesjon, ble legemidlet ifølge oppfinenlsen innført i det ovenfor beskrevne medium i 50 yl av bufferen som ledsaget bakteriene.

Angivelse av resultatene

Resultatene ble uttrykt som mengden av radioakti-vitet gjenvunnet fra brønnene under de ovenfor definerte betingelser og i forhold til kontrollverdiene, med hvilke 100 % adhesjon var bestemt.

En standard kurve for de erholdte resultater er vist på fig. 8a og 8b ved hjelp av eksempler som imidlertid ikke medfører noen begrensning. Inhiberingen er en lineær funksjon av logaritmen av legemiddelkonsentrasjonen. Enkle sukkere med en molekylvekt i størrelsesordenen 200, eller oligosaccharider med en molekylvekt i størrelsesordenen 400, dvs. med en molekylvekt på mindre enn 1000, har bare en svak inhiberende virkning, om noen over hodet.

4. Test for inhibering av mannose- resistens hemagglutinasjon

Dette er en annen modell for å studere adhesjonen av mikroorganismer til en målcelle,

a) Prinsipp

Bakteriene (10 7 - 10 9 bakterie/ml), i en konsentrasjon lik 10 hemagglutinasjonsenheter (én enhet svarer til den høyeste fortynning av bakteriesuspensjonen som er i stand til å agglutinere de rød celler av den valgte art i nærvær av mannose), ble suspendert i 25 pl buffret isotonisk løsning (pH 6,8 - 7,2) og ble inkubert i nærvær av 50 yl legemidler ifølge oppfinnelsen, eller fravær av dette, i 10 minutter ved 4 C eller ved romtemperatur. Erythrocytene,

i en konsentrasjon på 3 % (v/v) ble deretter tilsatt i et volum på 25 yl til det inkuberte medium. Resultatene ble avlest (visuelt eller ved mikroskop, turbiditetsmeter eller spektrofotometer) efter en kontakttid på 30 minutter,

b) Anvendelse på colibacilli

De anvendte systemer er beskrevet i Tabell 1.

c) Anvendelse på E. coli K9 9

Den inhiberende kapasitet til legemidlet, nemlig

den reciproke verdi av den minimale konsentrasjon som er i stand til å inhibere agglutinasjonen av rød saueceller ved E. coli K99, er proporsjonal med mengden av substansene ifølge oppfinnelsen (se fig. 9). 5. Test for adhesjon og aktivitet av anti- adhesinene utført på celler eller villi ved mikroskopisk observasjon Anvendelse på adhesjonen av E. coli K99 til kalve erythrocyter.

Villi eller celler erholdt ved den ovenfor beskrevne teknikk ble anvendt enten umiddelbart eller etter frysing ved -20° C i Hanks-medium eller et medium som er egnet for konservering av celler. I det tilfelle hvor fryste prepa-rater anvendes, fjernes additivene ved suksessiv vasking.

Bakteriene (10 7 - 10 11/ml) ble bragt i kontakt med cellepreparatet (IO<7>celle/ml) i 40 minutter ved 20° C eller 37° C, avhengig av systemet, i et pH-område på 5,5 - 8,5, i nærvær eller fravær av legemiddel ifølge oppfinnelsen.

Adhesjonen er positiv når mere enn 15 bakterier festes til celleoverflaten. Inhiberingen uttrykkes ved formelen:

Med 2 x IO<5>celler (200 yl) bragt i kotnakt med

2 x 10 bakterier (200 yl) i 40 minutter ved 37° C i nærvær av 0,25 mg av produkt ifølge oppfinnelsen, var den observerte inhibering 60 - 65 % i forhold til kontrollverdien.

Følgende prosedyre ble tilpasset in vivo-forsøkene: 1) Eksperimentell inokulering av unge mus med E.

coli K99

GruppeEr av mus fra samme rase (SWISS, OFl, CD etc.) som var yngre enn 48 timer, ble infisert oralt med

4 5 5 x 10 eller 10 E. coli K99. Forandringen i populasjon ble fulgt i 3 dager (D) etter en enkel oral administrering av legemidlet ifølge oppfinnelsen, 30 minutter etter infeksjon, eller uten behandling. Når det gjelder en LD^q„ infeksjon i 3 dager etter 4 5 inokulering (5 x 10 - 10 E. coli K99/individ) er beskyttel-sen av populasjonen vist i Tabell II: 2) Eksperimentell inokulering av nyfødte kalver med E. coli K99 Diaré ble reproduset ved den teknikk som er utledet fra hva som er beskrevet av H.W. Smith and S.S. Hall (1967). Kalvene som var yngre enn 8 timer gamle og frie for råmelk, ble infiset oralt med en lethal dose av 10 0 E. coli K99. Den ubehandlede kontrollgruppe døde i løpet av mindre enn 48 timer etter dehydrering. Testkalvene ble behandlet ved oral administrering av antiadhesinene ifølge oppfinnelsen.

Flere behandlingsmetoder viste seg å være effektive, etter administrering i 2 timer etter inokulering, eller så snart diaréen hadde startet. Alle de behandlede dyr ble restituert.

Den kliniske forbedring var hurtig og bedringen ble observert i løpet av mindre enn 48 timer. Effektiviteten av produktet viste seg ved en tilbakevending til det normale av de biokjemiske parametre slik som serum eller ekskresjons-ionogrammet, pH på feces og stansingen av vanntapet. Behandlede kalver holdt under observasjon i 90 dager viste ingen ytterligere gastroenteritisforstyrrelser og fortsatte å vokse normalt.

Antiadhesinaktiviteten ble vist ved å studere floraen som adherer til tarmveggen.

Bakteriemengder i duodenum, jejunum og ileum ble utført etter skraping av tarmveggen på kontrolldyr og behandlede dyr. For å gjøre dette og for å muliggjøre at den patogene flora kunne skilles fra enhver adherende coli-bakteriell intestinal flora som kan være tilstede, utviser inoculumet et antibioresistenskarakteristika. Resistensen overfor nalidixinsyre (Na£r) utgjør således markøren for E. coli K99-stammen.

I de behandlede kalver avtar den adherende E. coli K99 Na£r patogene flora med minst to logaritmiske enheter

i forhold til floraen i ubehandlede kontrollkalver. De erholdte resultater er vist i Tabell III.

3) Kliniske forsøk

Ifølge oppfinnelsen vil feltforsøk gjøre det mulig å fastslå en etiologisk diagnose av infektiøs diaré av colibacillar, viral eller parasittisk opprinnelse ved hjelp av en systematisk sjekk utført på avføring oppsamlet før terapi.

Effektiviteten av legemidlet ble sammenlignet med diagnosen. Kalver yngre enn 5 dager, som led av diaré og som var angrepet av positive K99 colibasiller, og de eldre kalver, ble leget i en høy prosent med antiadhesinene, som angitt ved resulttene i Tabell IV og V, erholdt i to forsøk og på 219 kalver.

Effektiviteten er større hvis antiadhesinene administreres tidlig og såsnart som de første symptoner på enterogastritis-forstyrrelsene kommer til syne. Det skal bemerkes at morsforing ikke ble stoppet.

Antiadhesinene er effektive med en curativ kapasitet under normale bruksbetingelser. 1 til 2 dagers administrering av legemidlet (1 til 10 x 60 mg) var den nødvendige periode for oppnåelse av effektiv behandling av diaré av colibacillær, viral eller parasitisk opprinnelse.

4) Uskadelighet av legemidlet

I laboratoriet ble ingen mortalitet observert som et resultatinntak av legemidlet ifølge oppfinnelsen, enten av unge mus eller av kalver som mottok 120 mg pr. dag i 90 dager. Veksten av dyrene ble ikke påvirket. Ingen bi-virkninger ble observert etter forsøket. Dette legemiddel av biologisk opprinnelse som tilhører kategorien av anti-adhesiner, er fullstendig uskadelig når det administreres enten oralt eller intraperitonealt.

Forsøket ble utført på 219 kalver som led av diaré. De eneste dyr som ble observert som leget, var de som mottok antiadhesinene beskrevet ifølge oppfinnelsen, med unntak av en hvilken som helst annen behandling eller komplementær behandling som ble betraktet å være nødvendig av veterinæren eller oppdretteren.

Dosering ved behandlingen: Antiadhesinene ble administrert som forlangt av oppdretteren, ofte etter at han hadde observert uthalt diaré, hvilket forklarer den langvarige administrering når det gjelder enkelte dyr.

Claims (10)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av celleadhesjonsinhibitorer, eller anti-adhesiner, karakterisert ved at glycoproteiner og/eller glycopeptider, lipidstrukturer og/eller glycolipider inneholdt i eller stammende fra forskjellige væskeformige eller faste organiske substrater illustreres enzymatisk og/eller kjemisk, og at strukturene som er resistente overfor lyse, som er delvis eller fullstendig av osidisk karakter og hvis molekylvekt alltid er større enn 1000, oppsamles og steriliseres.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at glycoproteinene og/eller glycolipidene behandles uten å ekstraheres fra det organiske substrat.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at glycoproteinene og/eller glycolipidene lyseres etter at de er blitt ekstrahert fra det biologiske medium hvori de var tilstede.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1 og 2, karakterisert ved at plasmaglycoproteinene ekstraheres ved: a) behandling i et organisk medium med ethanol i nærvær av natriumcaprylat etterfulgt av b) varmebehandling (60 - 70° C) og separering av utfelte glycoproteiner, og c) virkningen av proteolyse og ytterligere kjemisk behandling som gjør det mulig å oppnå antiadhesinstrukturen med en molekylvekt større enn 1000.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1 og 3, karakterisert ved at glycolipidene ekstraheres ved virkningen av en blanding av organiske løsningsmidler, og underkastes deretter kjemisk lyse som gjør det mulig å oppnå antiadhesinene.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at lysen utføres:

1) når det gjelder glycoproteiner, ved hjelp av et protease og fortrinnsvis ved hjelp av termolysin i nærvær av kalsiumioner ved en pH mellom 5 og 7 og ved en temperatur under eller lik 80° C, etterfulgt av hydrazinolyse eller en analog kjemisk behandling som gjør det mulig å frigi antiadhesinbestanddelen;

2) når det gjelder glycolipider, ved mild alkalisk hydrolyse etterfulgt av acetolyse eller en analog behandling som gjør det mulig å frigjøre antiadhesinbestanddelen.

7. Fremgangsmåte ifølge hvilke som helst av kravene 1-6, karakterisert ved at antiadhesinene renses ved en hvilken som helst metode for separering og konsentreres og steriliseres.

8. Antiadhesin erholdt ifølge hvilken som helst av kravene 1-7, som er av oligosaccharidtype med en molekylvekt større enn 1000 og omfatter minst tre enkle eller substituerte oser, hvor én av osene nødvendigvis må være galactose eller glucose.

9. Antiadhesin ifølge krav 8, karakterisert ved at den er podet på et protein eller en lipid bærer.

10. Næringsmiddel og f6radditiv inneholdende antiadhesinene ifølge krav 8 og/eller 9.