NO862876L - Nye polypeptider med blodkoaguleringshemmende virkning, fremgangsmaate til deres fremstilling resp. utvinning, deres anvendelse og midler som inneholder disse. - Google Patents
Nye polypeptider med blodkoaguleringshemmende virkning, fremgangsmaate til deres fremstilling resp. utvinning, deres anvendelse og midler som inneholder disse.Info
- Publication number
- NO862876L NO862876L NO862876A NO862876A NO862876L NO 862876 L NO862876 L NO 862876L NO 862876 A NO862876 A NO 862876A NO 862876 A NO862876 A NO 862876A NO 862876 L NO862876 L NO 862876L
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- polypeptide
- produced
- ile
- peptide
- thr
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 53
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 39
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 30
- 239000008280 blood Substances 0.000 title description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 title description 2
- 230000001112 coagulating effect Effects 0.000 title 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 16
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 14
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 14
- -1 phenylthiocarbamoyl group Chemical group 0.000 claims description 12
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 10
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 claims description 10
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 claims description 9
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 claims description 9
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 claims description 9
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 9
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 8
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N urethane group Chemical group NC(=O)OCC JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 5
- 150000001371 alpha-amino acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 235000008206 alpha-amino acids Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 claims description 3
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 claims description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 3
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 claims description 3
- 241000237903 Hirudo Species 0.000 claims description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 claims description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 2
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 claims description 2
- 239000013003 healing agent Substances 0.000 claims 1
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 claims 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 14
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 14
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000545744 Hirudinea Species 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 5
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229940122388 Thrombin inhibitor Drugs 0.000 description 5
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 5
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000003868 thrombin inhibitor Substances 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910006069 SO3H Inorganic materials 0.000 description 4
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 4
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004019 antithrombin Substances 0.000 description 4
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 125000000020 sulfo group Chemical group O=S(=O)([*])O[H] 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000237902 Hirudo medicinalis Species 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MUTXDFGBERJZBX-UHFFFAOYSA-N acetic acid;4-methylmorpholine Chemical compound CC(O)=O.CN1CCOCC1 MUTXDFGBERJZBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 3
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 3
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 239000002585 base Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 3
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KBPLFHHGFOOTCA-UHFFFAOYSA-N 1-Octanol Chemical compound CCCCCCCCO KBPLFHHGFOOTCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WPANETAWYGDRLL-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzenecarboximidamide Chemical compound NC(=N)C1=CC=C(N)C=C1 WPANETAWYGDRLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 2
- CIOWSLJGLSUOME-BQBZGAKWSA-N Lys-Asp Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O CIOWSLJGLSUOME-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- PCLIMKBDDGJMGD-UHFFFAOYSA-N N-bromosuccinimide Chemical compound BrN1C(=O)CCC1=O PCLIMKBDDGJMGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N Silane Chemical group [SiH4] BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101000712605 Theromyzon tessulatum Theromin Proteins 0.000 description 2
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 2
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 2
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 2
- PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N benzamidine Chemical compound NC(=N)C1=CC=CC=C1 PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003130 blood coagulation factor inhibitor Substances 0.000 description 2
- 210000001601 blood-air barrier Anatomy 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- XXBDWLFCJWSEKW-UHFFFAOYSA-N dimethylbenzylamine Chemical compound CN(C)CC1=CC=CC=C1 XXBDWLFCJWSEKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 108010003700 lysyl aspartic acid Proteins 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- GBCKRQRXNXQQPW-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(C)CC=C GBCKRQRXNXQQPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YTJSFYQNRXLOIC-UHFFFAOYSA-N octadecylsilane Chemical group CCCCCCCCCCCCCCCCCC[SiH3] YTJSFYQNRXLOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKFJKGMPGYROCL-UHFFFAOYSA-N phenyl isothiocyanate Chemical compound S=C=NC1=CC=CC=C1 QKFJKGMPGYROCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000009424 thromboembolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- NWZSZGALRFJKBT-KNIFDHDWSA-N (2s)-2,6-diaminohexanoic acid;(2s)-2-hydroxybutanedioic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O.NCCCC[C@H](N)C(O)=O NWZSZGALRFJKBT-KNIFDHDWSA-N 0.000 description 1
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CFMZSMGAMPBRBE-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyisoindole-1,3-dione Chemical compound C1=CC=C2C(=O)N(O)C(=O)C2=C1 CFMZSMGAMPBRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AHEZEFWRBPPAGP-UHFFFAOYSA-N 3,3a-dihydro-2h-indene-1,4-dione Chemical compound O=C1CCC2C1=CC=CC2=O AHEZEFWRBPPAGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HIQIXEFWDLTDED-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxy-1-piperidin-4-ylpyrrolidin-2-one Chemical compound O=C1CC(O)CN1C1CCNCC1 HIQIXEFWDLTDED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VXIXUWQIVKSKSA-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxycoumarin Chemical class C1=CC=CC2=C1OC(=O)C=C2O VXIXUWQIVKSKSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NDZFORWVONADMI-UHFFFAOYSA-N 4-phenyl-5h-1,3-thiazol-2-one Chemical compound O=C1SCC(C=2C=CC=CC=2)=N1 NDZFORWVONADMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 241000243818 Annelida Species 0.000 description 1
- 102000004411 Antithrombin III Human genes 0.000 description 1
- 108090000935 Antithrombin III Proteins 0.000 description 1
- 102000009133 Arylsulfatases Human genes 0.000 description 1
- 241000244186 Ascaris Species 0.000 description 1
- 229910014033 C-OH Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241000869051 Chtonobdella Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910014570 C—OH Inorganic materials 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-M D-gluconate Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-M 0.000 description 1
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010014522 Embolism venous Diseases 0.000 description 1
- 239000001856 Ethyl cellulose Substances 0.000 description 1
- ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N Ethyl cellulose Chemical compound CCOCC1OC(OC)C(OCC)C(OCC)C1OC1C(O)C(O)C(OC)C(CO)O1 ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 241000735395 Haemadipsa Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical class ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 235000008331 Pinus X rigitaeda Nutrition 0.000 description 1
- 235000011613 Pinus brutia Nutrition 0.000 description 1
- 241000018646 Pinus brutia Species 0.000 description 1
- 102000003827 Plasma Kallikrein Human genes 0.000 description 1
- 108090000113 Plasma Kallikrein Proteins 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229960005348 antithrombin iii Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000000746 body region Anatomy 0.000 description 1
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000012928 buffer substance Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- MHDVGSVTJDSBDK-UHFFFAOYSA-N dibenzyl ether Chemical compound C=1C=CC=CC=1COCC1=CC=CC=C1 MHDVGSVTJDSBDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- 229920001249 ethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000019325 ethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol Natural products OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229940050410 gluconate Drugs 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- IKDUDTNKRLTJSI-UHFFFAOYSA-N hydrazine monohydrate Substances O.NN IKDUDTNKRLTJSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 238000005984 hydrogenation reaction Methods 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 150000002825 nitriles Chemical class 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Al]O[Al]=O TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000636 p-nitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1*)[N+]([O-])=O 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 230000007030 peptide scission Effects 0.000 description 1
- 150000002976 peresters Chemical class 0.000 description 1
- YPJUNDFVDDCYIH-UHFFFAOYSA-N perfluorobutyric acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F YPJUNDFVDDCYIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940117953 phenylisothiocyanate Drugs 0.000 description 1
- UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N phenylmethyl ester of formic acid Natural products O=COCC1=CC=CC=C1 UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001515 polyalkylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 229920005990 polystyrene resin Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- ULWHHBHJGPPBCO-UHFFFAOYSA-N propane-1,1-diol Chemical compound CCC(O)O ULWHHBHJGPPBCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 108060007951 sulfatase Proteins 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 208000004043 venous thromboembolism Diseases 0.000 description 1
- 230000004304 visual acuity Effects 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/141—Feedstock
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/26—Containing cys-cys disulfide bridge between nonadjacent cysteine residues
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Antikoagulenter tjener profylaksen og terapien av tromboemboliske prosesser>deres hovedanvendelsesområde ligger derved fremfor alt ved venøse tromboembolier. Antikoagulenter kreves videre ved fremstillingen av blodkonserver. Derivater av 4-hydroksykumarin elle 1,4-indandion, som eksempelvis anvendes for dette formål, har på tross av sterk optimering en rekke ulemper.
Det er derfor ønskelig, spesielt i humanmedisinen, å ha blodkoaguleringshemmere til disposisjon, som har en liten toksisitet og få bivirkninger og som ved deres metabolisme ikke danner noen belastning av den syke organisme.
Foruten de kroppsegne plasmatiske hemmstoffer som antitrombin III har også mange andre proteiner blodkoagulerings-hemmende virkning, som f.eks. Kunitz-inhibitoren, som utvinnes fra soyabønner. Dette hemmstoff blokkerer blodkoagu-leringskaskaden ved inhibering av den aktiverte faktor X,
men inhibitorens spesifitet er så liten at mange bivirkninger oppstår: Hemming av plasmakallikrein, av plasmin, av trypsin, således at de terapeutiske anvendelser er utelukket. Også andre virksomme stoffer, som Ascaris- eller Kazals-inhibitoren, kunne på grunn av manglende spesifitet ikke få noen betydning.
Hirudin, et fra Hirudo medicinalis utvunnet polypeptid,
viser derimot en spesifikk antitrombin-aktivitet.
Den omstendelige fremgangsmåte til dets isolering og rensing har hittil virket uheldig på dens praktiske anvendelse.
Det er nå funnet at det fra blodigler lar seg isolere høy-aktive polypeptider med formel I.
Oppfinnelsen vedrører derfor polypeptider med formel I
hvori m = 0 - 50,
h = 0 - 100, og
R betyr fenolisk hydrogen eller en fenolestergruppe, X betyr like eller forskjellige rester av naturlig
forekommende a-aminosyrer,
Z betyr like eller forskjellige rester av naturlig
forekommende a-aminosyrer og
A betyr Ile eller fravær av en aminosyre,
B betyr Ile eller Thr eller fravær av en aminosyre, C betyr Thr, Val, Ile, Leu eller Phe,
D betyr Glu eller fravær av en aminosyre,
E betyr Glu eller Pro,
F betyr Thr eller Ile,
G betyr Lys eller Lys-Asp,
H betyr Ala eller Leu, og
hvori 6 Cys-restene parvis er sammenknyttet over disulfid-broer,
samt deres fysiologisk tålbare salter.
De tre disulfid-broer befinner seg fortrinnsvis mellom Cys-restene i stillingene 7 og 15, 17 og 29 samt 23 og 40.
Naturlig forekommende a-aminosyrer er spesielt Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Arg, Lys, Hyl, Orn, Cit, Tyr, Phé>- Trp, His, Pro og Hyp.
R betyr fortrinnsvis hydrogen, SO^H eller ^ 0^ 2! spesielt foretrukket er hydrogen.
Som salter kommer det spesielt på tale alkali- og jordalkali-salter, salter med fysiologisk tålbare aminer samt salter med fysiologisk tålbare syrer, som HCL, H2SO4, maleinsyre eller eddiksyre.
Foretrukket er polypeptider med formel I, hvori C betyr Thr, videre slike hvor C betyr Thr og A betyr Ile. Spesielt egnede^peptider er slike med
- A = Ile, B = Thr, C = Thr, D = Glu, E = Glu, F = Thr,
G = Lys, H = Leu, J = Gin, m=0, n = 0, R = H eller S03H, -m=0, n = 0, R = H eller SO^H, A = Ile, B = direkte binding, C = Thr, D = Glu, E = Glu, F = Thr, G = Lys,
H = Leu, J = Gin,
-m=0, n = 0, R = H eller SO^H, A = Ile, B = direkte binding, C = Thr, D = Glu, E = Glu, F = Ile, G = Lys,
H = Leu, J = Gin,
-m=0, n = 0, R = H eller S03H, A = Ile, B = direkte binding, C = Thr, D = Glu, E = Pro, F = Thr, G = Lys,
H = Leu, J = Gin,
-m=0, n = 0, R = H eller S03H, A = Ile, B = direkte binding, C = Thr, D = Glu, E = Pro, F = Ile, G = Lys,
H = Leu, J = Gin,
- m = 0, n = 0, R = H eller S03H, A = direkte binding,
B = direkte binding, C = Thr, D = direkte binding, E =Glu, F = Thr, G = Lys, H = Leu, J = Gin, - A = Ile, B = direkte binding, C = Thr, D = direkte binding,
E = Glu, F = Ile, G = Lys-Asp, H = Ala, J = Lys, m = 0,
n = 0, R = S03H,
- A = Ile, B = direkte binding, C = Thr, D = direkte binding, E = Glu, F = Ile, G = Lys-Asp, H = Ala, J = Lys, m = 0,
n = 0, R = hydrogen.
Oppfinnelsen vedrører også de nye biologisk aktive peptidiske spaltprodukter, som fåes ved kjemisk eller enzymatisk spalting av disse polypeptider.
Oppfinnelsen vedrører videre en fremgangsmåte til utvinning av et renset polypeptid av ovennevnte formel, idet fremgangsmåten erkarakterisert vedat polypeptidet isoleres fra ormer av stammen Annelida ved hjelp av enkombiansjon av ekstraksjonsmetoder, fellingsmetoder, membranfiltrering og/eller kromatografiske fremgangsmåter, en eventuelt tilstedeværende fenolestergruppe R avspaltes hvis ønsket hydrolyttisk under dannelse av den fenoliske hydroksylgruppe og det dannede peptid overføres eventuelt i dets fysiologisk tålbare salter.
Polypeptidet utvinnes fortrinnsvis fra halskjertler av
ormer av klassen Hirudinea, spesielt av slike av orden Gnathobdellida. Foretrukket er slektene Hirudo, Gnathob-della, Haemadipsa og Philaemon. Speiselt foretrukket er Hirudo medicinalis. Ved siden av halskjertlene av blodiglen kan det også finne anvendelse dens forreste kropps-region eller hele blodiglen.
En fremgangsmåte til utvinning av et råekstrakt fra blodigler er omtalt i Enzymology, bind 5 "Hirudin as an Inhi-tor of Thrombin". En rensefremgangsmåte for Hirudin er kjent fra Bull. Soc. Chim. Biol. 45 (1963) 55.
Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen har det spesielt vist seg nyttig en kombinasjon av fellingsmetoder og av gel-permeasjons-kromatografi eller ultrafiltering, affinitetskromatografi og av høyoppløsende fordelingskromatografi på "Reverse-Phase"-material og kromatografi på kiselgel eller aluminiumoksyd. Alt etter råekstraktets beskaffenhet kan det imidlertid goså ansettes andre kromatografi-fremgangsmåter fordelaktig (eventuelt også i kombinasjon med ovennevnte fremgangsmåte), som f.eks. kation- eller- anion-ut-vekslingskromatografi, kromatografi på;_uspesifikke absor-benter, spesielt hydroksylapatitt.
For å få,et: f or kromatograf ien egnet råekstrakt kan man opp-arbeide blodiglene på den ved Bady et al. Methods"of Enzymology 45 /1976/ 669-678 omtalte måte. Man kan imidlertid også eksempelvis knuse hodedelen av blodiglen i frossen tilstand og ekstrahere ved hjelp av en vandig puffer-opp-løsning.(f.eks. fosfatpuffer). Det uoppløselige material adskilles f.eks. ved kort sentrifugering eller ved filtrering over gass og polypeptidet adskilles ved isoleres fra det således oppnådde ekstrakt. Det er fordelaktig å opp-varme dette ekstrakt hurtig til 70 til 90°C, fordi derved denatureres hovedmengden av de proteolytiske enzymer og utfelles, hvis adskillelse da f.eks. kan foregå ved sentrifugering. Man isolerer fra ekstraktet proteinfraksjonen som inneholder peptidet ifølge oppfinnelsen, f.eks. ved utfelling, således at man har ekstraktet i et vannbland-
bart organisk oppløsningsmiddel. F.eks. kan aceton anvendes i en flereganger mengde av ekstraktvolumet, fortrinnsvis ca..10 ganger mengden, idet utfellingen foretas i kulden, vanligvis ved 0 til -40°C, fortrinnsvis ved ca. -20°C.
En annen mulighet til å gjennomføre utfellingen er tilset-ningen av salter, som f.eks. ammoniumsulfat. Ved pH-styr-ing oppnår utfellingen en viss selektivitet. Peptidene ifølge oppfinnelsen som har isoelektriske punkter på 3,5-4, kan utfelles i pH-området mellom 3 og 5, fortrinnsvis ca. 4, ved tilsetning av ammoniumsulfat inntil en konsentrasjon på ca. 50%, idet et flertall av følgeproteiner derved:forblir i oppløsningen. Også denne utfelling gjennomføres under avkjøling ved ca. -5 til +15°C, fortrinnsvis mellom 0 og +4°C.
Fra dette råekstrakt kan proteiner med høyere molekylvekt adskilles f.eks. ved ultrafiltrering eller ved gélpermea-sjons-kromatografi. Ved større blandinger kan ultrafiltrer-ingen f.eks. foregå i to trinn: I første trinn arbeider man med en kapillarmembran med en utelukkelsesgrense på 50 000 Dalton og deretter i annet trinn med en flatmembran med en utelukkelsesgrense på 10 000 Dalton. Ved hjelp av kapillarmembran oppnår man en hurtig adskillelse av høyeremolekylært material, som ville hindre gjennomstrømningen gjennom den selektivt arbeidende flatmembran. Ved mindre mengder kan man også se bort fra første trinn av ultrafilteringen.
En rensing av råekstraktet kan også ved hjelp av ioneut-veksler-kromatografi, eksempelvis på "DEAE"-Sephadex, på
den av Markwardt, Walsmann, Hoppe-Seyler's Z. Physiol.
Chem. 348 /1967/ 1381-1386 omtalte måte.
Det således dannede material består av en blanding av trombininhibitorene ifølge oppfinnelsen og andre polypeptider. En foretrukket fremgangsmåte til utvinning av inhibitorene med formel I med R = H resp. SO^H består i at trombininhibitorene adskilles på grunn av egenskapene av kompleksdannelse med på bærer bundet trombin fra produkter som ikke danner kompleks med trombin. Fraksjonene som er blitt utvunnet på grunn av deres trombinaffinitet kan igjen oppløses med et andre høytoppløsende kromatografisk system i de enkelte komponenter. Således isoleres inhibitorene med formel I. For affinitetskromatografi har det vist seg spesielt egnet anvendelse av trombin-sefarose. Trombin-sefarose . ble fremstilt etter fremgangsmåten
av Brosstad (Thrombos Res. II, 119, 1977).
For adskillelsen fyllter man trombin-sefarose i en høyle
med en egnet puffer, som f.eks. 0,1 M N-metylmorfolinacetat-puffer pH 8,0 eller Tris/HCl 0,1 M pH 8,5. Etter søylens ekvilibrerihgvoppløses blandingen fra fellingen i samme puffer og påføres på søylen. Peptidene som ikke har trombinaffinitet fjernes ved spyling med pufferen. Deretter opp-løses komplekset trombin/trombin-inhibitor ved spyling av søylen med en puffer av 0,5 - 2 M benzamidin eller 4-amino-benzamidin i 0,1 M N-metylmorfolinacetat pH 8,0*De forskjellige aktive fraksjoner samles sammen og avsaltes ved vanlig gel-permeasjonskromatografi på Sephadex G 25 med 0,05 N-metylmorfolinacetat pH 8,0.
Adskillelsen av de forskjellige trombin-inhibitorer fra hverandre besørges ved høyoppløsende kromatografiske fremgangsmåter. Dertil har det spesielt vist seg egnet HPLC.
Ved den høye oppløsningsevne av HPLC-teknologien er det mulig å skille inhibitorene med formel I fra hverandre og fra mindre mengder av følgeprotein og å renf reinstille.
For den stasjonære fase har det vist seg fordelaktig derivatisert kiselgel med egnet kornstørrelse (f.eks.
mellom 3 og 20 um). For derivatisering av kiselgel egner seg ved siden av de utbredte oktadecylsilanrester også
et flertall andre silanrester eller deres balndinger,
som silanrester med lavere alkyl, fenylalkyl- eller araino-substituert alkyl, idet sistnevnte byr en viss kombina-
sjon av ioneutvekslings- og "Reverse-Phase"-kromatografi. Det kan eksempelvis anvendes skillesøyler fra 5 til 25 cm lengde og en diameter fra 3 til 10 mm. Som pufret eluer-ingsmiddel kommer det på tale alle sekundære elelr tertiære blandinger mellom vann, organiske oppløsningsmidler av egnet lipofili, som f.eks. lavere alkoholer, ketoner, nitriler, etere, syrer, aminer, glykoleter, amider og deres derivater. Som pufferstoff kan det anvendes organiske og uorganiske salter eller andre tilsetninger. Elueringen foregår fortrinnsvis ved en pH-verdi mellom 2 og 8.
Anvendelsen av flytende pufferstofer, som ammoniumacetat eller ammoniumhydrogenkarbonat, muliggjør utvinning av inhibitorene fra eluatet ved enkel frysetørking.
Avspaltingen av en sulfatmonoestergruppe R i stilling 64 kan foregå analogt til den i DE-A-33 42 139 omtalte måte surkatalysert eller enzymatisk ved hjelp av en arylsulfa-tase .
Polypeptidene ifølge oppfinnelsen med formel I er fargeløse, oppløselige i vann og i vandige puffere, viser seg homo-gene i polyakrylamid-elektroforese og har isolektriske punkter fra 3,5 til 4 (bestemt ved isoelektrisk fokuser-ing) . Bestemmer man aminosyre-sammensetningen etter metoden av Moore og Stein (Methods of Enzymology bind VI, 819 - 831, utgitt av Rolovick og Kaplan, Academic Press, New York, London, 1963), finner man de i tabell 1 angitte verdier. Oppfinnelsen vedrører videre en fremgangsmåte til fremstilling av et polypeptid av ovennevnte formel I, idet fremgangsmåten erkarakterisert vedat a) det fremstilles på i og for seg kjent måte ved hjelp av fastfasesyntese eller
b) til fremstilling av et polypeptid, hvori m■= 0,
I. Hirudin underkastes en dobbelt Edman-avbygning,
II. Det således dannede peptid omsettes med en aktivester av en aminosyre eller av et peptid med formel
hvori m, X og A, B, C har ovennevnte definisjon og U
betyr en syre- eller baselabil uretanbeskyttelsesgruppe, m. Fentyltiokarbamoyl-gruppen ved e-aminofunksjonen av Lys
avspaltes ved hjelp av hydrazin,
IV. og uretan-beskyttelsesgruppen U avspaltes ved hjelp
av en syre eller base, og
det ifølge a) eller b) dannede polypeptid overføres eventuelt i;det fysiologisk tålbare salt.
Ved fastfasesyntesen (sammenlign hertil Arhterton, Sheppard, Perspectives in Peptide Chemistry, Karger
Basel 1981, sidene 101-117) kan det vanligvis sees bort
fra en OH-beskyttelsesgruppe for Thr.
Syntesen av polypeptidet med formel I foregår.f.eks. trinnvis på hydroksymetylert polystyren-harpiks. Poly-styrenet er tverrkryssbundet med eksempelvis 1% divinyl-benzen. Det foreligger vanligvis i form av små kuler.
Aminosyrene anvendes N-terminalt beskyttet. Den første N-beskyttede aminosyre anbringes pr. esterdannelse på bæreren. Etter fjerning av aminobeskyttelsesgruppen tilknyttes den neste N-beskyttede aminosyre under anvend else av et koblingsreagens som dicykloheksylkarbodiimid. Avbeskyttelsen og tilføyelse av ytterligere aminosyrer fort-settes inntil det er oppnådd den ønskede sekvens.
Valget":.av beskyttelsesgrupper retter seg etter aminosyrene og koblingsmetodene.
Som aminobeskyttelsesgrupper kommer det f.eks. på tale de kjente uretaniske beskyttelsesgrupper som benzyloksykarbo-nyl(Z), p-metoksykarbobenzoksy, p-nitrokarbobenzoksy, t-butyloksykarbonyl(Boe), Fmoc og lignende.
Boc-gruppen foretrekkes, da den er avspaltbar under relativt milde betingelser (f.eks. med trifluoreddiksyre eller HC1 i organiske oppløsningsmidler).
Treonin kan blokkeres som benzyleter og e-aminofuksjonen
av lysin som Z-derivat. Disse to beskyttelsesgrupper er sterkt resistente mot avspaltningsreagensen for BOC-gruppen og kan fjernes hydrogenolyttisk med en hydrogen-eringskatalysator (Pd/aktivkull) eller fveks. med natrium i flytende ammoniakk.
Det beskyttede peptid kan f.eks. med hydrazin taes.fra harpiksen. Derved oppstår hydrazidet, som f.eks. med N-bromsuccinimid ifølge Int. J. Pept. Prot. Research 17
(1981) 6-11 kan overføres til den fri karboksylsyre.
Hvis nødvendig, må disulfidbroene lukkes oksydativt (sammenlign Konig, Geiger, Perspectives in Peptide Chemistry, Karger Basel, sidene 31 - 44).
Ved fremgangsmåtevariant b) underkaster man hirudin en dobbelt Edman-avbygning, idet man omsetter dette polypeptid i.en-egnet pufferoppløsning, som pyridin/vann eller dioksan/vann eventuelt under tilsetning av en base som dimetylbenzylamin (DMBA), dimetylallylamin (DMAA) eller trietylamin, fortrinnsvis ved ca. 50°C og en pH-verdi på 8 - 9 med et isotiocyanat, fortrinnsvis fenylisotio- tiocyanat. Etter fjerning av overskytende puffer og av overskytende fenylisotiocyanat avspaltes det N-terminale valin ved behandling med en syre (heptafluorsmørsyre eller trifluoreddiksyre) i 10 minutter ved 50°C som fenyltiazolinon. Man gjentar denne reaksjonsrekke til spaltning av annet valin ved N-terminusen.
Det på denne måte dannede Des-(Val)2~hirudin-derivat omsettes med en aktivester av en aminosyre eller et peptid av formel U-(X) -A-B-C-OH. Egnet er f.eks. p-nitrofenyl,-, cyanometyl-, N-hydroksyftalimid eller spesielt N-hydroksysuccinimdester. Egnede uretanbeskyttelsesgrupper U er slike, som er avspalt - bare surt eller alkalisk, som f.eks. Boe eller Msc. Hvis nødvendig, så kan også eventuelt tilstedeværende funksjoner i sidekjedene av B og C forbigående beskyttes ved egnede beskyttelsesgrupper.
De på denne måte dannede beskyttede fortrinn av polypeptidet med formel I (m=0) behandles til avspalting av fenyltio-karbamoyl-gruppen ved lysin i et egnet oppløsningsmiddel, som'en lavere alkohol eller dets blanding med vann med hydrazin-hydrat.
Man avspalter fra dette polypeptid nå dessuten de resterende eller de resterende beskyttelsesgrupper på egnet måte (Boe f.eks. med trifluoreddiksyre, Msc med en base) og får således polypeptidet ifølgeeppfinnelsen med formel I.
Polypeptidene ifølge oppfinnelsen er spesifikke støkio-metriske hemmere av trombinet. Den kvantitative måling av trombinhemmingen ved inhibitorene ifølge oppfinnelsen viste at komplekset trombin-inhibitor/trombin praktisk talt ikke dissosierer. Ved hjelp av denne målemetode kan under opparbeidelse og rensing aktiviteten og dermed renhetsgraden av polypeptidene ifølge oppfinnelsen be-stemmes. De således rensede polypeptider med ovennevnte formel I kan derved ha en trombinhemming på over 10 000
antitrombin units/mg og dermed overtreffe det vanlige hirudin. Derved er in vivo forbindelsene med formel I med fritt fenolisk hydrogen i stilling 64 vanligvis enda aktivt.
Oppfinnelsen vedrører derved også anvendelsen av polypeptider med formel I, hvori mn, n, R, X, Z, A, B, C, D,. E, F, G, J og H har ovennevnte betydning som blodkoaguleringshemmere til anvendelse ved terapi.- av tromboemboliske pro-sesser samt deres anvendelse som diagnostika og-reagenser.
Oppfinnelsen vedrører videre midler som inneholder et polypeptid med formel I eller dets peptidiske spaltprodukt i en farmasøytisk ufarlig bærer.
Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan administreres paren-teralt eller topisk i tilsvarende farmasøytiske tilbered-ninger .
Til subkutan eller intravenøs applikasjon bringes de
aktive forbindelser eller deres fysilogisk tålbare salter, hvis ønsket med de dertil vanlige stoffer som oppløsnings-formidlere, emulgatorer, isotonimidler, konserveringsstoffer eller ytterligere hjelpestoffer i oppløsning, suspensjon eller emulsjon. Som oppløsningsmiddel for de nye aktive forbindelser og de tilsvarende fysiologisk tålbare salter kommer det f.eks. på tale: vann, fysio-logiske koksaltoppløsninger eller alkoholer, f.eks.
etanol, propandiol eller glycerol, dertil også sukkeropp-løsninger som glukose- eller mannitoppløsninger eller også en blanding av de forskjellige nevnte oppløsninger. Ved subkutan anvendelse har forbindelsene med formel I
(R = fenolisk hydrogen) vanligvis fordelen med en mer langsom resorpsjon og dermed en retardert virkning.
De topiske bærestoffer kan være organiske eller uorganiske forbindelser. Typiske farmasøytiske benyttede bærestoffer er vandige oppløsninger, som f.eks. puffersystemer eller isotoniske blandinger av vann og vannblandbare oppløsnings- midler, som f.eks. alkoholer eller arylalkoholer, oljer, polyalkylenglykoler, etylcellulose, karboksymetylcellulose, polyvinylpyrrolidon eller isopropylmyristat. Egnede puffer-stoffer er f.eks. natriumborat, natriumfosfat, natriumacetat eller også glukonatpuffere. Den topiske anvendeIsesform kan også inneholde ikke toksiske hjelpestoffer somf.eks. emulgerende konserveringsstoffer, fuktemidler som f.eks. polyetylenglykoler og antibakterielle forbindelser.
<E>ksem<p>el_l
•Bestemmelse av inhibitor-konsentrasjonen ved trombin-titrering^ 10 til .100 yl av inhibitor-oppløsningen med et på forhånd bestemt proteininnhold blandes med 200 yl natriumhydrogen-karbonat-oppløsning (pH = 7,0, 0,5 M). Man adderer 0,1 ml fibrinogen-oppløsning (0,5 til 1%) eller fortynnet citrat-plasma, i regelmessige avstand, under omrøring, ved værel-sestemperatur, tilsettes en aliquot del (50-100 yl) av trombinoppløsningen (ca. 100 NIH-enheter pr. ml). Som omslagspunkt kan det ved halvkvantitative arbeider tjene koaguleringen av væsken innen den valgte tidsavstand eller for kvantitative bestemmelser, turbimetri-måling ved 54 6 nm.
Eksempel_2
Det anvendes frittlevende blodigler (ingen oppdréttsdyr)
av typen Hirudo medicinalis, som er blitt samlet i Tysk-land .
Ca. 150 - 200 g frosne blodiglefordeler homogeniseres i
en blander med 2 liter iskald 0,09%-ig vandig natrium-klorid-oppløsning og 10 ml oktanol i løpet av 3 minutter. Etter 30 minutters sentrifugering ved 0°C og 10 000 opm videreklares det overstående ved hjelp av filtrering over 2 lag gas og oppvarmes deretter under omrøring i løpet av 15 minutter til 80°C. Den dannede utfelling adskilles ved filtrering over 4 lag gas. Filtratet ned-
kjøles ved omrøring i et isbad hurtig til 4°C og has i 7,5 liter foravkjølt aceton (-20°C). Det oppstår igjen en fell-ing som frafiltreres etter 5 minutter på en glassfilternutsj og ettervaskes med 1 liter kald aceton (-20°C). Etter tørk-ing i vakuum oppstår 520 mg svaktgulaktig pulver med et proteininnhold på 62% (bestemt etter metoden av Lowry). Antitrombinaktiviteten utgjør ca. 400 enheter pr. mg.
Eksem<pe>l_3
520 mg pulver ifølge eksempel 2 oppløses i 75 mg vann, innstilles deretter med 5 N ammoniakk på pH 8,0 og omrøres 1 time ved 0-4°C. Den uoppløselige del fraslynges i løpet av 30 minutter med en begersentrifuge ved 5000 opm.
Etter innstilling av proteininnholdet ved vanntiltilsetning på 25 mg/ml (Lowry) blandes oppløsningen med 36 ml mettet ammoniumsulfat-oppløsning og omrøres 1 time ved 4°C. Den første utfelling adskilles hurtig ved sentrifugering
(5000 opm/30 minutter). Man oppløser dessuten ca. 26 g ammoniumsulfat hertil og innstiller pH-verdien med iseddik på pH 4. Etter 5 timers henstand sentrifugeres den sam-lede suspensjon og den dannede fuktige utfelling videre-forarbeides som følger.
Eksep_el_4
Den ifølge eksempel 3 dannede fuktige utfelling oppløses
i 200 ml 0,1 M ammoniumhydrogenkarbonat-oppløsning av pH
8 og ultrafiltreres i en 250 ml "Amicon"-celle med en 5PM 10-flatmembran (utelukkelsesgrense 10 000 Dalton). Derved inndampes oppløsningen til ca. 40 ml, idet mot avslutningen etterfylles to ganger 150 ml 0,1 M ammoniumhydrogenkarbonat-oppløsning av pH 8,0. Frysetørking av residuet gir ca.
350 mg material med et proteininnhold på 89%.
Eksemg<e>l_5
Man fyller en søyle (0,9 x 15 cm) med trombinsefarose i
0,1 m tris-puffer (HCl) pH 8. Stoffet fra eksempel 3 opp-løses i samme puffer og søylen besjikkes med denne prøve. Ved spyling av søylen med ekvilibreringspufferen fjernes inaktive følgestoffer. Deretter med en oppløsning av benzamidin (1,5 M tris-puffer pH 7) eller med 4-aminobenz-amidin (0,2 M tris-puffer pH 7) lar hirudinet seg fortrenge fra komplekset trombin-hirudin og elueres porsjonsvis.
Til prøving av antitrombinaktiviteten må først den kompeti-tive inhibitor skilles ved gelfiltrering "Sephadex" G 20 fra hirudin.
Vektutbytte, 5 5%,
Aktivitet 6000 til 12000 ATU/mg.
Eksemrj§l_6
20 mg inhibitor ifølge eksempel 3 oppløses i 200 yl vann av pH 2,16 (innstilt med trifluoreddiksyre + 5% acetonitril) og innsprøytes på en med oktadecylsilankiselgel (5 ym)
fylt stålsøyle ("Shandon" ODS). Søylen elueres med en gradient på maksimalt 2%/minutt mellom startpufferen (vann-pH = 2,16 + 5% acetonitril) og acetonitril. Fraksjonene samles enkeltvis. Etter tørking har inhibitorene ifølge oppfinnelsen med formel I (R = H resp. S03H) en spesifikk aktivitet som tilsvarer støkiometrien av 1:1-kompleks med trombin.
Eksemp_el_7
a) Det ifølge eksempel 4 dannede material ble på den ved Markwardt, Walsmann, Hoppe-Seyler<1>s Z. Physiol. Chem. 348 /19677 1381-1386 omtalte måte renset på "DEAE"-Sephadex A-25. b) 1,1 mg av den således dannede proteinfraksjon ble oppdelt ved hjelp av HPLC på en 25 cm x 4,6 mm "Bio-Rad" (Richmond, CA) Hi-poresøyle som var fylt med C-18 Reverse-fase, kiselgel med 5 y partikkelstørrelse og 330 Å porevidde. Som mobil fase ble det anvendt 10% acetonitril i vann med 0,1% trifluoreddiksyre (A)/10% vann i acetonitril med 0,1% trifluoreddiksyre (B) med en gradienthastighet A.B på 1%/minutt. Kromatografiens tidsmessig forløp ble overvåket ved deteksjon ved 216 nm (se fig. 1). De på fig. 1 skraverte fraksjoner 1-5 ble igjen rekromatografert, idet det benyttes det samme HPLC-system. c) Rekromatografie av fraksjon 1 (fig. 2) ga ca. 200 ug av et protein, hvis struktur ble bestemt ved sekvensanalyse. Det tilkommer 'følgende struktur: d) Rekromatografi av fraksjon 2 (fig. 3) ga ca. 300 yg av et protein, hvis struktur ble bestemt ved sekvensanalyse. Det tilkommer følgende struktur: e) Rekromatografi av fraksjon 3 (fig. 4) ga ca. 150 yg av et protein, hvis struktur ble bestemt ved sekvensanalyse. Det tilkommer følgende struktur: f) Rekromatografi av fraksjon 4 (fig. 5) ga ca. 80 yg av et protein, hvis struktur ble bestemt ved sekvensanalyse. Det tilkommer følgende struktur: g) Rekromatografi av fraksjon 5 (fig. 6) ga ca. 40 yg av et protein, hvis struktur dessuten ikke ble fastslått.
Eksemp_el_8
a) Man gikk ut fra et material, som var blitt utvunnet ifølge eksempel 5 ved opparbeidelse av i handel befinn-ende fyr og underkastet det en forrensing ifølge eksempel 7 a). b) 1 mg av den således dannede proteinfraksjon ble oppdelt som i eksempel 7 b) ved hjelp av HPLC. Den på fig. 7 skraverte fraksjon ble rekromatografert, idet bortsett fra en gradienthastighet A:B på 0,8%/minutter beting-elsene forblir like (fig. 8). Fig. 9 viser kromato-grammet av det således utvunnede analyserene protein, som tilkommer følgende ved sekvensanalyse fastslåtte struktur:
Aminosyrenes tre- og en-bokstavs-symboler.
Claims (10)
1. Fremgangsmåte til utvinning av renset polypeptid med formel
hvori m = 0-50,
n = 0-100 og
R betyr fenolisk hydrogen eller en fenolestergruppe, X betyr like eller forskjellige rester av naturlig
forekommende a-aminosyrer,
Z betyr like eller forskjellige rester av naturlig
forekommende a-aminosyrer, og A betyr Ile eller fravær av en aminosyre, B betyr Ile eller Thr eller fravær av en aminosyre, C betyr Thr, Val, Ile, Leu eller Phe,
D betyr Glu eller fravær av en aminosyre,
E betyr Glu eller Pro,
F betyr Thr eller Ile,
G betyr Lys eller Lys-Asp,
H betyr Ala eller Leu og
J betyr Gin eller Lys,
hvori 6 Cys-restene parvis er sammenknyttet over disul-
.:f idbroer,
samt deres fysiologisk tålbare salter, karakterisert ved at polypeptidet isoleres fra ormer av .orden Gnathobdellida, fortrinnsvis fra ormer av slekten Hirudo ved hjelp av en kombinasjon av ekstraheringsmetoder, utfellingsmetoder, membranfiltrering og/eller kromatografiske fremgangsmåter, en eventuelt tilstedeværende fenolestergruppe R avspaltes hvis ønsket hydrolyttisk under dannelse av den fenoliske hydroksylgruppe, peptidet spaltes eventuelt kjemisk eller enzymatisk og det dannede peptid overføres eventuelt til dets fysiologisk tålbare salter.
2. Fremgangsmåte til fremstilling av et polypeptid av den i krav 1 definerte formel I, karakterisert ved at
a) det fremstilles på i og for seg kjent måte ved hjelp' av fastfasesyntese eller
b) til fremstilling av et polypeptid, hvori n = 0,
I. underkastes hirudin en dobbelt Edman-avbygning,
II. det således dannede peptid omsettes med en aktivester av en aminosyre eller av et peptid med formel
hvori m, X, A, B og C har ovennevnte betydning, og U betyr en uretanbeskyttelsesgruppe, III.fenyltiokarbamoylgruppen ved e-aminofunksjonen av
Lys avspaltes ved hjelp av hydrazin,
IV. og uretanbeskyttelsesgruppen U avspaltes ved hjelp av en syre eller base,
det ifølge a) eller b) dannede polypeptid spaltes eventuelt kjemisk eller enzymatisk og overføres eventuelt i dets fysiologisk tålbare salter.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det fremstilles resp. utvinnes et polypeptid, hvori C betyr Thr..
4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at det fremstilles resp. utvinnes et polypeptid, hvori A betyr Ile.
5. Fremgangsmåte ifølge minst et av kravene 1-4, karakterisert ved at det fremstilles resp. utvinnes et polypeptid, hvori R betyr hydrogen,
S03 H eller P03 H2 .
6. Fremgangsmåte ifølge minst et av kravene 1-5, karakterisert ved at det fremstilles resp. utvinnes et polypeptid, hvori R betyr S03 H.
7. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1-5,
k a r a k t e r:, i sert ved at det fremstilles resp. utvinnes et polypeptid, hvori R betyr fenolisk hydrogen.
8. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1-7 til fremstilling av et biologisk aktiv peptidisk spaltprodukt av et polypeptid med formel I.
9. Anvendelse av et peptid fremstilt ifølge minst et
av kravene 1-8 som helbredelsesmiddel fortrinnsvis som antikoagulens.
10. Fremgangsmåte til fremstilling av et middel innehold-ende et peptid fremstilt ifølge minst et av kravene 1-8 og en farmasøytisk tålbar bærer, karakterisert ved at man bringer dette i en egnet administreringsform.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19853525428 DE3525428A1 (de) | 1985-07-17 | 1985-07-17 | Neue polypeptide mit blutgerinnungshemmender wirkung, verfahren zu deren herstellung bzw. gewinnung, deren verwendung und diese enthaltende mittel |
| DE19863601032 DE3601032A1 (de) | 1986-01-16 | 1986-01-16 | Neue polypeptide mit blutgerinnungshemmender wirkung, verfahren zu deren herstellung bzw. gewinnung, deren verwendung und diese enthaltende mittel |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO862876D0 NO862876D0 (no) | 1986-07-16 |
| NO862876L true NO862876L (no) | 1987-01-19 |
Family
ID=25834067
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO862876A NO862876L (no) | 1985-07-17 | 1986-07-16 | Nye polypeptider med blodkoaguleringshemmende virkning, fremgangsmaate til deres fremstilling resp. utvinning, deres anvendelse og midler som inneholder disse. |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4791100A (no) |
| EP (1) | EP0209061B1 (no) |
| JP (1) | JPH0764875B2 (no) |
| KR (1) | KR940000758B1 (no) |
| AU (1) | AU593820B2 (no) |
| CA (1) | CA1340102C (no) |
| DE (1) | DE3689525D1 (no) |
| DK (1) | DK173509B1 (no) |
| ES (1) | ES2000216A6 (no) |
| FI (1) | FI862950A7 (no) |
| GR (1) | GR861837B (no) |
| HU (1) | HUT41418A (no) |
| IE (1) | IE61569B1 (no) |
| IL (1) | IL79424A (no) |
| NO (1) | NO862876L (no) |
| PT (1) | PT82993B (no) |
Families Citing this family (56)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE64956T1 (de) * | 1984-06-14 | 1991-07-15 | Ciba Geigy Ag | Verfahren zur herstellung von thrombininhibitoren. |
| ES2055149T3 (es) * | 1985-04-11 | 1994-08-16 | Hoechst Ag | Derivado de hirudina. |
| DE3738541A1 (de) * | 1987-11-13 | 1989-05-24 | Hoechst Ag | Verfahren zur isolierung und reinigung von hirudin |
| FR2607517B2 (fr) * | 1986-12-01 | 1989-12-22 | Transgene Sa | Vecteurs d'expression de variants de l'hirudine dans les levures, procede et produit obtenu |
| US5236898A (en) * | 1987-05-21 | 1993-08-17 | Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. | Cyclic anticoagulant peptides |
| US5192745A (en) * | 1987-05-21 | 1993-03-09 | Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. | Cyclic anticoagulant peptides |
| US5256559A (en) * | 1988-03-04 | 1993-10-26 | Biogen, Inc. | Methods and compositions for inhibiting platelet aggregation |
| ATE115146T1 (de) * | 1988-05-27 | 1994-12-15 | Philadelphia Children Hospital | Amphiphile peptide und deren verwendung. |
| US5114921A (en) * | 1988-05-27 | 1992-05-19 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Amphiphilic peptides and use thereof |
| DE3819079A1 (de) * | 1988-06-04 | 1989-12-07 | Hoechst Ag | Hirudin-derivate mit verzoegerter wirkung |
| EP0347376B1 (en) * | 1988-06-11 | 1994-03-23 | Ciba-Geigy Ag | Novel polypeptides with an anticoagulant activity |
| US5268296A (en) * | 1988-06-11 | 1993-12-07 | Ciba-Geigy Corporation | DNA vector and recombinant host cell for production of hirullin P6 and P18 |
| IL86856A0 (en) * | 1988-06-24 | 1988-11-30 | Yissum Res Dev Co | Bovine xa factor and pharmaceutical compositions containing the same |
| IL87004A (en) * | 1988-07-06 | 1992-08-18 | Technion Res & Dev Foundation | Method and apparatus for bioaffinity separation |
| GB8817160D0 (en) * | 1988-07-19 | 1988-08-24 | Ciba Geigy Ag | Novel proteins |
| DE3835815A1 (de) * | 1988-10-21 | 1990-04-26 | Hoechst Ag | Neue isohirudine |
| GB8826428D0 (en) * | 1988-11-11 | 1988-12-14 | Biopharm Ltd | Antithrombin |
| US4861865A (en) * | 1989-01-23 | 1989-08-29 | Washington University | Novel antithrombin peptide |
| US5254535A (en) * | 1989-04-17 | 1993-10-19 | The Children's Hospital Of Pennsylvania | Composition and treatment with biologically active peptides and antibiotic |
| US5187155A (en) * | 1989-06-23 | 1993-02-16 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Anticoagulant peptides |
| US5192747A (en) * | 1989-10-03 | 1993-03-09 | Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. | Anticoagulant peptides |
| ZA907743B (en) * | 1989-10-03 | 1991-07-31 | Merrell Dow Pharma | Radiolabeled anticoagulant peptides |
| US5190919A (en) * | 1989-11-13 | 1993-03-02 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Antihemostatic factor vii peptides |
| DE3939801A1 (de) * | 1989-12-01 | 1991-06-06 | Basf Ag | Neue proteine und ihre herstellung |
| DE4001238A1 (de) * | 1990-01-18 | 1991-07-25 | Basf Ag | Verfahren zur anreicherung bzw. reinigung von biomolekuelen |
| US5459237A (en) * | 1990-02-08 | 1995-10-17 | Magainin Pharmaceuticals Inc. | Peptide compositions and uses therefor |
| US5792831A (en) * | 1990-02-08 | 1998-08-11 | Magainin Pharmaceuticals Inc. | Analogues of magainin peptides containing D-amino acids |
| EP0514464A4 (en) * | 1990-02-08 | 1993-04-28 | Magainin Sciences, Inc. | Biologically active amphiphilic peptides and method of inhibiting growth of target cells, virus or virally-infected cell |
| AU641215B2 (en) * | 1990-02-13 | 1993-09-16 | Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. | Stabilized sulfonate, sulfate, phosphonate and phosphate derivatives of hirudin |
| US5330973A (en) * | 1990-03-19 | 1994-07-19 | Merck & Co., Inc. | Lipopeptide derivatives |
| US5386009A (en) * | 1990-03-19 | 1995-01-31 | Merck & Co. Inc. | Lipopeptide derivatives |
| JPH05507273A (ja) * | 1990-05-14 | 1993-10-21 | マゲイニン サイエンセズ インコーポレーテッド | Ｄアミノ酸残基を有する生物活性ペプチドの組成物およびそれによる治療方法 |
| IL98506A (en) * | 1990-06-18 | 1996-09-12 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Cyclic peptide antibiotics processes for the preparation thereof and pharmaceutical compositions containing them |
| US5208220A (en) * | 1990-06-27 | 1993-05-04 | Magainin Pharmaceuticals, Inc. | Composition and treatment with biologically active peptides and antibiotics which inhibit DNA gyrase |
| JPH05507718A (ja) * | 1990-06-27 | 1993-11-04 | マゲイニン サイエンセズ インコーポレーテッド | 生物活性ペプチドおよびｄｎａギラーゼを阻害する抗生物質よりなる組成物と治療法 |
| US5428009A (en) * | 1990-07-16 | 1995-06-27 | Merck & Co., Inc. | Lipopeptide derivatives |
| CA2047527A1 (en) * | 1990-07-24 | 1992-01-25 | Christopher Dunwiddie | Method for administering a therapeutic anticoagulant |
| DE4031731A1 (de) * | 1990-10-06 | 1992-04-09 | Basf Ag | Protein aus hirudo medicinalis |
| US5369093A (en) * | 1991-03-15 | 1994-11-29 | Merck & Co., Inc. | Lipopeptide derivatives |
| US5837808A (en) * | 1991-08-20 | 1998-11-17 | Baxter International Inc. | Analogs of hirudin |
| US5385884A (en) * | 1991-08-27 | 1995-01-31 | Merck & Co. Inc. | Lipopeptide derivatives |
| AU2901692A (en) * | 1991-10-16 | 1993-05-21 | Children's Hospital Of Philadelphia, The | Composition and treatment with biologically active peptides and antibiotic |
| DE4140381A1 (de) * | 1991-12-07 | 1993-06-09 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt, De | Neue synthetische isohirudine mit verbesserter stabilitaet |
| DE69429858D1 (de) * | 1993-04-09 | 2002-03-21 | Bio Technology General Corp | Herstellung eines rekombinanten inhibitors des faktors xa des blutegels hirudo medicinalis |
| US5824641A (en) * | 1993-04-09 | 1998-10-20 | Bio-Technology General Corp | Method of treating of preventing influenza |
| GB9309509D0 (en) * | 1993-05-07 | 1993-06-23 | Merck Patent Gmbh | Thrombin inhibitors |
| DE4404168A1 (de) * | 1994-02-10 | 1995-08-17 | Hoechst Ag | Hirudinderivate und Verfahren zu deren Herstellung |
| DE19529997C1 (de) | 1995-08-16 | 1997-04-10 | Hoechst Ag | Verfahren zur Inaktivierung von Carboxypeptidase Y in hirudinhaltigen Kulturbrühen |
| DE19543737A1 (de) * | 1995-11-24 | 1997-05-28 | Hoechst Ag | Verfahren zur Ultrafiltration von Peptide oder Proteine enthaltender biologischer Matrices |
| DE19544233A1 (de) * | 1995-11-28 | 1997-06-05 | Hoechst Ag | Verfahren zur Nutzung des Hefe-ADH II-Promotorsystems zur biotechnologischen Produktion heterologer Proteine in hohen Ausbeuten |
| DE69625623T2 (de) | 1996-01-31 | 2003-11-06 | Sumitomo Bakelite Co. Ltd., Tokio/Tokyo | Verfahren zur Herstellung von in Epoxyharz eingekapselter Halbleitervorrichtung |
| AU4054900A (en) | 1999-04-02 | 2000-10-23 | Advanced Medicine East, Inc. | Desleucyl glycopeptide antibiotics and methods of making same |
| US6699836B2 (en) | 1999-04-02 | 2004-03-02 | The Trustees Of Princeton University | Vancomycin analogs |
| SG171340A1 (en) * | 2008-11-19 | 2011-07-28 | Avantor Performance Mat Inc | New chromatographic media based on phenoxy alkyl and alkoxy-or phenoxy-phenyl alkyl ligands |
| CN102373216B (zh) * | 2011-10-28 | 2013-06-05 | 元昊 | 一种含有医用水蛭素基因的重组真核汉逊酵母工程菌株的构建及重组水蛭素的生产工艺 |
| CN113956339B (zh) * | 2021-10-28 | 2023-02-24 | 中国药科大学 | 宽体金线蛭抗凝血因子XIa多肽及其应用 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3342139A1 (de) * | 1983-11-22 | 1985-05-30 | Ciba-Geigy Ag, Basel | Desulfatohirudine, verfahren zu ihrer herstellung und pharmazeutische mittel |
| WO1985004418A1 (fr) * | 1984-03-27 | 1985-10-10 | Transgene S.A. | Vecteurs d'expression de l'hirudine, cellules transformees et procede de preparation de l'hirudine |
| DE3438296A1 (de) * | 1984-04-18 | 1985-11-07 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Neue polypeptide mit blutgerinnungshemmender wirkung, verfahren zu deren herstellung bzw. gewinnung, deren verwendung und diese enthaltende mittel |
| DE3429430A1 (de) * | 1984-08-10 | 1986-02-20 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Gentechnologisches verfahren zur herstellung von hirudin und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens |
| DE3445532A1 (de) * | 1984-12-13 | 1986-06-19 | Plantorgan Werk Heinrich G.E. Christensen, KG, 2903 Bad Zwischenahn | Hirudin-pa, desulfatohirudine-pa, verfahren zur herstellung und pharmazeutische mittel, die diese wirkstoffe enthalten |
-
1986
- 1986-07-08 DE DE86109309T patent/DE3689525D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-07-08 EP EP86109309A patent/EP0209061B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-07-15 FI FI862950A patent/FI862950A7/fi not_active Application Discontinuation
- 1986-07-15 US US06/885,821 patent/US4791100A/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-07-15 HU HU862913A patent/HUT41418A/hu unknown
- 1986-07-15 IL IL79424A patent/IL79424A/xx not_active IP Right Cessation
- 1986-07-15 GR GR861837A patent/GR861837B/el unknown
- 1986-07-15 ES ES8600317A patent/ES2000216A6/es not_active Expired
- 1986-07-16 KR KR1019860005761A patent/KR940000758B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1986-07-16 PT PT82993A patent/PT82993B/pt not_active IP Right Cessation
- 1986-07-16 IE IE190286A patent/IE61569B1/en not_active IP Right Cessation
- 1986-07-16 NO NO862876A patent/NO862876L/no unknown
- 1986-07-16 AU AU60233/86A patent/AU593820B2/en not_active Expired
- 1986-07-16 JP JP61165699A patent/JPH0764875B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1986-07-16 DK DK198603384A patent/DK173509B1/da not_active IP Right Cessation
- 1986-07-16 CA CA000513871A patent/CA1340102C/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0209061B1 (de) | 1994-01-12 |
| EP0209061A2 (de) | 1987-01-21 |
| US4791100A (en) | 1988-12-13 |
| IE861902L (en) | 1987-01-17 |
| PT82993B (pt) | 1989-01-30 |
| KR940000758B1 (ko) | 1994-01-29 |
| CA1340102C (en) | 1998-10-27 |
| NO862876D0 (no) | 1986-07-16 |
| HUT41418A (en) | 1987-04-28 |
| IL79424A0 (en) | 1986-10-31 |
| AU6023386A (en) | 1987-01-22 |
| DK173509B1 (da) | 2001-01-15 |
| FI862950A7 (fi) | 1987-01-18 |
| ES2000216A6 (es) | 1988-01-16 |
| PT82993A (de) | 1986-08-01 |
| JPH0764875B2 (ja) | 1995-07-12 |
| GR861837B (en) | 1986-11-11 |
| DE3689525D1 (de) | 1994-02-24 |
| KR870001237A (ko) | 1987-03-12 |
| IE61569B1 (en) | 1994-11-16 |
| FI862950A0 (fi) | 1986-07-15 |
| DK338486A (da) | 1987-01-18 |
| JPS6222799A (ja) | 1987-01-30 |
| IL79424A (en) | 1992-02-16 |
| EP0209061A3 (en) | 1989-03-15 |
| DK338486D0 (da) | 1986-07-16 |
| AU593820B2 (en) | 1990-02-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO862876L (no) | Nye polypeptider med blodkoaguleringshemmende virkning, fremgangsmaate til deres fremstilling resp. utvinning, deres anvendelse og midler som inneholder disse. | |
| DK171824B1 (da) | Blodkoagulationsinhiberende hirudinderivater, fremgangsmåde til deres udvinding, deres anvendelse samt middel indeholdende dem | |
| CA1239606A (en) | Desulfatohirudins, the preparation thereof and pharmaceutical compositions containing them | |
| Charles et al. | The primary structure of porcine colipase II. I. The amino acid sequence | |
| FI102183B (fi) | Menetelmä uusien trombiini-inhibiittoreiden valmistamiseksi | |
| CA1299126C (en) | Hirudin-pa and its derivatives | |
| EP0147193B1 (en) | Peptide production and use thereof | |
| US4801613A (en) | Bradykinin antagonist peptides | |
| RU2050160C1 (ru) | Полипептид, полученный из ткани или секрета пиявок hirudinaria manillensis, специфически ингибирующий тромбин | |
| JPH0475240B2 (no) | ||
| BODANSZKY et al. | CHOLECYSTOKININ (PANCREOZYMIN) 6. Synthesis and Properties of the Nα‐Acetyl‐derivative of Cholecystokinin 27–33 | |
| PL111979B1 (en) | Process for preparing novel peptides | |
| JPH03255095A (ja) | カゼインペプチド | |
| US4784988A (en) | Peptides correlated to lysozyme | |
| EP0332688A1 (en) | Bradykinin antagonist peptides | |
| Suzuki et al. | Purification and characterization of a signal peptide, a product of protein secretion across the cytoplasmic membrane of Escherichia coli | |
| JPH05208999A (ja) | セリンプロテアーゼインヒビターおよびこれを含有する医薬組成物 | |
| JPH0680695A (ja) | ペプチド | |
| GB2242681A (en) | Hirudin fragments |