NO863842L - Makromolekylaert tumorcellevekstinhiberende antibiotikum. - Google Patents

Description

Denne oppfinnelse vedrører fremstilling av et nytt makromolekylært tumorcellevekst-inhiberende antibiotikum og aktino-myceten som fremstiller et slikt antibiotikum. Denne oppfinnelse vedrører også en farmasøytisk blanding som inneholder en virksom, ikke-toksisk, tumorcellevekst-inhiberende mengde av et slikt antibiotikum og en inert farmasøytisk akseptabel bærer eller fortynningsmiddel, og fremgangsmåten ved behandling av tumorceller som erømfintlig overfor et slikt antibiotikum ved å gi en virksom, ikke-toksisk tumorcellevekst-inhiberende mengde av et slikt antibiotikum til et vertsdyr som har slike tumorceller.

Fig. 1 er en kurve av fermenteringsprofilen for fermenteringen av ATCC .

Denne oppfinnelse vedrører fremstilling av en makromolekylær tumorcellevekst-inhiberende og cytotoksisk antibiotisk forbindelse, AAC-345, som har følgende egenskaper:

Denne oppfinnelse vedrører også en biologisk ren kultur av en aktinomycert mikroorganisme som har identifiseringsegenskapene til ATCC , og aktive mutanter og derivater derav.

Denne oppfinnelse vedrører også en farmasøytisk blanding som omfatter en virksom, ikke-toksisk tumorcellevekst-inhiberende mengde av AAC-345 og en inert farmasøytisk akseptabel bærer eller fortynningsmiddel.

Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte ved inhibering av vekst av dyretumorceller som erømfintlig for AAC-345, hvilken består i å gi en effektiv, ikke-toksisk tumorvekstcelle-inhiberende mengde av AAC-345 til et dyr som er påvirket av tumorcellene.

Det makromolekylære tumorcellevekst-inhiberende antibiotikum som fremstilles i denne oppfinnelse, AAC-345 kan fremstilles som et rått fermentat, anriket rått fermentat eller et renset produkt fra fermentatet av en ikke-identifisert aktinomycert (sannsynlig-vis en Actinomadura sp), som ble deponert 20. september 1985 hos American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, U.S.A. under tilgjengelighetsnummeret ATCC . Slik det her brukes betyr uttrykket "rått fermentat av ATCC " det klarede fermentat av ATCC såsom filtratet som er igjen etter filtrering eller sentrifugering av fermentatet ved vanlige teknikker. Slik uttrykket "anriket rått fermentat av ATCC " her brukes, betyr det klart filtrat som er tilbake etter ytterligere filtrering av det klarede rå fermentat av ATCC ved ultrasentrifugering eller diafiltrering eller annen fremgangsmåte som medfører kromatografisk separasjon. Se f.eks. eksempel 3 nedenunder. Brukt her betyr uttrykket "renset aktiv bestanddel av ATCC " substansen som er igjen etter rensning av det rå fermentat av ATCC til en renhet på minst 95% ved enhver passende metode, såsom metoden som er beskrevet i eksempel 3. Derivater av AAC-345 kan fremstilles ved kjente teknikker og alle aktive derivater av AAC-345 ligger innenfor omfanget av be-skrivelsen. Med uttrykket "aktivt derivat av AAC-345" menes slike derivater av AAC-345 som i det vesentlige beholder den tumorcellevekst-inhiberende aktiviteten til AAC-345. Slike derivater innbefatter, men er ikke begrenset til derivater fremstilt ved addisjon, delesjon eller substitusjon av noen av aminosyrene som omfattes av AAC-345, hvilke i det vesentlige beholder den tumorcellevekst-inhiberende aktiviteten til AAC-345, og derivatet som er komplekser av AAC-345 med andre forbindelser eller molekyler hvor kompleksene i det vesentlige beholder den tumorcellevekst inhiberende aktiviteten til AAC-345.

Mikroorganismen i denne oppfinnelse som i det følgende kalles ATCC , produserer ved dyrking under riktige betingelser et fermentat som i det følgende skal kalles fermentatet av ATCC . Med uttrykket "dyrket under riktige betingelser" menes slike betingelser som muliggjør vekst av ATCC og dens produksjon av fermentatet av ATCC . Illustrerende riktige betingelser innbefatter dyrking av ATCC i et vandig næringsmedium som inneholder assimilerbare kilder av karbon og nitrogen under aerobe dypkulturbetingelser ved en temperatur mellom 25° og 30°C, fortrinnsvis 28°C, med en pH mellom 7 og 8 i 10 til 100 timer, fortrinnsvis 50 til 80 timer, helst fra 70 til 77 timer. Enda heller er de riktige betingelser for dyrking av ATCC for å produsere fermentatet av ATCC i det vesentlige lik de betingelser som er beskrevet i eksempel 1. For en fagmann vil det være klart at de riktige betingelser for dyrking av ATCC kan optimaliseres for produksjonen av AAC-345.

I denne oppfinnelse anvendes en biologisk ren kultur av en aktinomycert mikroorganisme som har identifikasjonsegenskapene til ATCC , og aktive mutanter og derivater derav. Med "aktive mutanter og derivater" menes mutanter eller derivater av ATCC som beholder evnen til å produsere et fermentat som inneholder antibiotikumet fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse. Slike mutanter og derivater kan fremstilles ved kjente teknikker, f.eks. ved kjemisk mutagenese, rekombinant DNA-teknikker, bestråling og seleksjon.

Som angitt ovenfor har antibiotikumet i denne oppfinnelse, AAC-345, cytotoksisk aktivitet. Først ble den cytotoksiske aktiviteten til det rå fermentat av ATCC og den rensede aktive bestanddel av ATCC undersøkt in vitro ved å bruke B16 melanoma celler ifølge den følgende måleteknikk [se Mirabelli et al., J. Antibiotics, 38, 758-766 (1985)]: B16 melanoma (sterkt metastatisk underlinje, F10) brukes og holdes som monosjiktkulturer i Minimal Essential Media (Grand Island Biological Co., Grand Island, N.Y.) tilsatt 10% kalveserum, 1% kalveserum, 1% antibiotika i en 5% CO2-fuktet inkubator ved 37°C. Asynkrone cellepopulasjoner høstes og repletteres som 5000 celler/plate i sterile 60 mm petriskåler. Skålene inkuberes natten over for å la cellene feste seg til platen. Cellene behandles med det rå fermentat av ATCC eller den rensede aktive komponent av ATCC under sterile betingelser, får reagere i 1 eller 24 timer hvoretter mediet suges av. Platene vaskes en gang med 5 ml fosfatbufret saltvann (PBS) hvoretter mediet suges av. Platene inkuberes i 5 dager ved 37°C i en CO2-inkubator med nytt medium og serum. Levedyktigheten måles som en celles evne til å danne en koloni som er større enn 50 celler. Koloniene fikseres med 0,5% krystallfiolette 95% etanol. Platene tørkes og telles med en Biotran III Automatic Count Totalizer (New Brunswick Scientific Co., Edison, N.J.). Middel og standard avvik for trippelprøver bestemmes for hver forbindelseskonsentrasjon. Dataene analyseres ved å plotte log av overlevelsesfraksjon (antall kolonier i plater behandlet med forbindelsen/antall kolonier i kontroller) mot mediumfortynning eller forbindelses-konsentras jon . 50% Inhiberingskonsentrasjon (IC50) bestemmes fra denne plot.

AAC-345 i form av renset aktiv bestanddel fra ATCC , reduserte levedyktigheten til B16 celler med 50% i in vitro B16 melanoma målingen i en konsentrasjon på 0,56 pg/ml når cellene ble utsatt for den aktive komponent i en time. For en 24 timers eksponering var den 50%-ige cytotoksiske konsentrasjon ca.

0,01 ug/ml. Således er antibiotikumet fremstilt i foreliggende oppfinnelse et sterkt cytotoksisk middel for tumorceller.

Som ovenfor angitt har AAC-345, antibiotikumet fremstilt i denne oppfinnelse, tumorcellevekst-inhiberende aktivitet, som er blitt påvist i en rekke dyretumormodeller.

P388 lymfocytisk leukemi er for tiden den mest anvendte dyretumormodell for undersøkelse av antitumormidler og for detaljert bedømmelse av aktive forbindelser. Dette tumorsystem er utstrakt akseptert som et antitumormiddel undersøkelsesredskap fordi det er ømfintlig for praktisk talt alle de kliniske aktive anti-neoplastiske midler, kvantitative og reproduserbare, anvendelige for undersøkelser i stor skala, og forutsigbare for aktivitet i andre dyretumormodeller. Forbindelser som er sterkt aktive i den intraperitoniale (ip) P388 leukemimodell er generelt aktive også i andre tumormodeller. Anti-tumoraktiviteten til AAC-345 i form av rå fermentater fra ATCC og renset aktiv komponent av ATCC , ble demonstrert i P388 leukemi-musemodell ved anvendelse av den følgende forskrift [se Geran et al., Cancer Chemother. Rpts. (del III), 3, 1-103 (1972)]:

10<6>P388 leukemiceller inokolures i.p. i B6D2Fi mus.

24 Timer senere, hvis tumor inokolummet viser seg å være

fritt for bakteriekontaminasjon (som bestemmes ved 24 timers inkubering i tioglykolatmedium), deles dyrene statistisk i grupper på 6 og oppbevares i skoeskebur. Den rensede aktive bestanddel av ATCC ble oppløst i 0,9% NaCl-løsning (normalt saltvann) ved en tilsvarende konsentrasjon, slik at denønskede dose ble gitt i et volum på 0,5 ml. Råfermentatet fra ATCC ble gitt ufortynnet eller fortynnet med normalt saltvann. Slike saltløsninger ble lagret i ravgule flasker ved 4°C. Saltløsningen av den rensede aktive bestanddel av ATCC , saltløsning av råfermentatet av ATCC eller ufortynnet råfermentat fra ATCC

gis i.p. på dagene 1 til og med 5 (dvs. behandlingen begynnes 24 timer etter tumorinokulering). Hvert eksperiment inneholder 3 grupper på 6 dyr som ubehandlede kontroller og dyr behandlet med en positiv kontroll, cisplatin. Dyrene veies som en gruppe på dagene 1, 5 og 9, og gjennom-snittsvektforandring (^vekt) brukes som en gjenspeiling av toksisitet. Hvert eksperiment inneholder også en inokolum titrasjon — grupper på 8 mus inokulert i.p. med 10<5>til

IO<10>P388 leukemiceller. Titreringen brukes til å beregne celledrap oppnådd ved behandling med forbindelsene. Dyrene kontrolleres daglig med hensyn til dødelighet og eksperimen-tene avsluttes etter 45 dager. Sluttpunktet er median overlevelsestid (MST) og økning i levetid (ILS) som er prosentdelen av økningen i MST i forhold til ubehandlede kontroller. Ubehandlede kontroller inokulerte ip med IO<6>P388 leukemiceller overlever generelt med en median på 9 til 11 dager. En forbindelse ansees aktiv hvis den produserer

25 prosent ILS.

En sammenfatning av undersøkelsen av denne rensede aktive komponent av ATCC og råfermentatet fra ATCC i in vivo ip P388 modellen er vist i den følgende tabell A.

Basert på dataene som er oppført i tabell A, viste AAC-345 i form av råfermentatet av ATCC og den rensede aktive bestanddel av ATCC betydelig antitumoraktivitet i in vivo P388 leukemi tumormåling ved alle ikke-toksiske doser.

Likeledes ble AAC-345 i form av råfermentatet fra ATCC

og den rensede aktive komponent fra ATCC prøvet i en ytterligere in vivo tumormodell kjent som ADJ-PC6 Plasmacytoma ifølge den følgende måling [se Cleare et al., J. Biochimie, 60, 830-850 (1978) ] : Tumorceller føres med seriell sc passasje i BALB/c hunmus og samles så aseptisk den ca. 21 dag og opphakkes i Hank's balansert saltløsning. Cellene dispergeres deretter med homogenisator, og cellekonsentrasjonen justeres til 4xl0<6>levedyktig (trypan blått-ekskluderende) celler pr. ml ved hemocytometertellinger. Tilsammen 0,5 ml (2xl0<6>celler) implanteres sc på den høyre flanke av BALB c/hunmus i grupper på 8. Behandling gis i.p. dagene 1-10, og tumorene måles i perpendikulær diameter med et vernier caliper ca. 3 uker etter tumorimplantasjon (dagene 18-21). Generelt gjenspeiler > 75% inhibering av tumorcellevekst betydelig antitumorvirkning. Cisplatin, den positive kontrollforbin-delse, gir fullstendig tumorvekst-inhibering.

Resultatene av ADJ-PC6 Plasmacytomamålingen er sammenfattet i tabell B.

Basert på dataene i tabell B viste AAC-345 både i form av det rå fermentat fra ATCC og spesielt i form av den rensede aktive forbindelse fra ATCC fremragende anti-tumoirvirkning i ADJ-PC6 Plasmacytomaprøven ved alle ikke-toksiske doser som ga £ 75% inhibering av tumorvekst.

De farmasøytiske blandinger omfatter en effektiv, ikke-toksisk, tumorcellevekst-inhiberende mengde av det makromolekylære tumorcellevekst-inhiberende antibiotikum fremstilt ifølge oppfinnelsen, AAC-345, og en inert farmasøytisk akseptabel bærer eller fortynningsmiddel. Disse blandinger fremstilles i enhets-form egnet for parenteral administrering.

Blandinger for parenteral administrering inneholder sterile vandige eller ikke-vandige løsninger, suspensjoner eller emulsjo-ner. Blandingen kan foreligge i form av en løsning av den rensede aktive komponent av ATCC i et minimalt volum dimetylacetamid eller etanol, f.eks. 5 volum%, fyllt opp til volum med peanøttolje eller normal saltløsning. Polyetoksylert ricinusolje, f.eks. 2 til 5 volum%, kan også brukes for å løseliggjøre den aktive bestanddel. I tillegg kan blandingen foreligge i form av et slam med f.eks. hydroksypropylcellulose eller annet passende oppslemmingsmiddel. Som et emulgerings-middel kan f.eks. leteitin brukes. Blandingen kan også fremstilles i form av et sterilt fast stoff som kan oppløses i et sterilt injiserbart medium umiddelbart før bruk.

Det vil være klart at den aktuelle foretrukne dosering av det makromolekylære antibiotikum fremstilt ifølge oppfinnelsen som brukes i blandingene vil variere avhengig av den faktiske formulerte blanding, administreringsformen og spesielt punktet, verten og sykdommen som behandles. Innvendig administreringsvei bør velges for å sikre at en effektiv tumorcellevekst-inhiberende mengde av antibiotikumet kommer i kontakt med tumoren. Optimale doser for et gitt sett betingelser kan fastslås av en fagmann ved bruk av vanlige doseringsbestemmelsesmålinger i lys av de ovenfor nevnte eksperimentelle data. For parenteral administrering ligger dosen generelt fra ca. 1 til ca. 10 mg/m<2>kroppsflate pr. dag i 1-5 dager, gjentatt ca. hver 4de uke for fire behandlings-serier .

Fremgangsmåten for å forhindre vekst av dyretumorceller som ømfintlige overfor antibiotikumet fremstilt ifølge oppfinnelsen består i å gi et vertsdyr innvendig, som er påvirket av tumorcellene, en effektiv ikke-toksisk tumorcellevekst-inhiberende mengde av antibiotikumet fremstilt ifølge oppfinnelsen. Som ovenfor beskrevet vil den aktive bestanddel under behandlingen gis fortrinnsvis parenteralt i en mengde valgt fra ca. 10 mg til ca. 100 mg pr. m<2>legemsflate.

EKSEMPLER

De følgende eksempler illusterer bare en av flere fremgangs-måter for fremstilling av råfermentatet av ATCC og den rensede aktive komponent av ATCC som brukes i blandingen og behandlingsmetoden, og skal som sådanne ikke ansees som begrensende for oppfinnelsesomfanget.

De følgende forkortelser anvendes i eksemplene:

EKSEMPEL 1

FREMSTILLING AV FERMENTAT AT ATCC

Hele veksten av en skråagar av ATCC ble inokulert i 500 ml medium 13H i en 4-liters rystekolbe og ble så inkubert ved 28°C i 5 dager på en rysteanordning (New Brunswick Model G53) ved 250 OPM og 5,08 cm utslag. 5-Dagers inokulatet ble så overført til en 14-liters fermentor (New Brunswick Model 19) med 10 liter medium 13H. Fermenteringen ble utført ved 28°C, tilført 4 1 luft pr. minutt og rørt ved 400 OPM. Fermentatet ble høstet etter 77 timer basert på Biochemical Induction Assay (BIA) aktivitet som er beskrevet av H.F. Bartus et al., Antimicrob. Agents Chemother., 25, 622-625 (1984). Fig. 1 er en kurve av fermenteringsprofilen av fermentater fra ATCC og sammenligner veksten av ATCC over tid (innbefattet pH-måling) og aktivitet av fermentatet fra ATCC over tid, dvs. den høyeste fortynning ved hvilken fermentatet beholder aktiviteten i

BIA.

EKSEMPEL 2

FREMSTILLING AV RAFERMENTAT AV ATCC

Fermentatet av ATCC fremstilt som beskrevet i eksempel 1 ble sentrifugert ved 14000xG i 15 minutter og den resulterende klumpen ble kastet. Den gjenværende supernantant er råf ermentatet av ATCC .

EKSEMPEL 3

FREMSTILLING AV DEN RENSEDE AKTIVE FORBINDELSE FRA ATCC

Råfermentatet av ATCC fremstilt som beskrevet i eksempel 2 ble ført gjennom et ultrafiltreringsapparat (Amicon DC-2) utstyrt med to 30000 molekylvekts avskjæringspatro-ner, og ble konsentrert til ca. 200 ml. Retentatet ble så diafiltrert 4 ganger mot like volumer vann. Etter ferdig diafiltrering ble retentatet frosset for lagring før de gikk til det neste rensetrinn. Etter at det frosne retentat var opptint, ble det sentrifugert 30 minutter ved 8000xG for å fjerne all felling. Det resulterende klare retentat er det anrikede råfermentatet av ATCC . Det klare retentat (anriket råfermentat av ATCC ) ble satt på en "DEAE-Trisacryl M" ionebytterkolonne (LKB, 5 cm innvendig diameter (ID) x 15 cm lengde) forut ekvilibrert med 0,05 M tris-acetatbuffer (pH 8,3) ved 4°C i mørket. Kolonnen ble kjørt ved en strømningshastighet på 8 mm/min., og elueringen ble etterfulgt av UV-påvisning ved 220 nm ved 2 absorbansenhet full skala (AUFS). Kolonnen ble i rekkefølge eluert med 560 ml tris-acetatbuffer, 520 ml 50 mM NaCl i tris-acetatbuffer, 350 ml 100 mM NaCl i tris-acetatbuffer,

350 ml 150 mM NaCl i tris-acetatbuffer og til slutt 270 ml 200 mM NaCl i tris-acetatbuffer. Det bioaktive produkt ble påvist ved biologisk måling (som beskrevet i eksempel 4) og høytrykksvæske-kromatografi (HPLC) under 200 mM NaCl + tris-acetat elueringen. Den bioaktive fraksjonen ble avsaltet ved bruk av et ultrafiltreringsapparat (Amicon DC-2) utstyrt med to 10K MW-avskjærings-patroner ved diafiltrering av fraksjonen 15 ganger mot like volumer vann. Det avsaltede retentat ble så frysetørket til tørrhet. Det frysetørkede pulver (275 mg) ble så oppløst i 0,05 M kaliumfosfatbuffer ved pH 6,3 og injisert i 4 like porsjoner på en "Altex Spherogel" TSK-3000 SW-kolonne (21,5 mm x 60 cm lengde), og elueringen ble fulgt med UV-påvisning ved 220 nm ved 2 AUFS rr.ed en strømningshastighet på 5 ml/min. Den bioaktive fraksjonen ble så avsaltet ved dialyse mot vann (2x2L) i 48 timer ved bruk av en 10K MW-avskjæringsmembran. Det avsaltede retentat ble frysetørket til tørrhet for å oppnå ca. 45 mg rent (>95%) biologisk aktivt produkt. Produktets homogeni-tet (dvs. den rensede aktive komponent av ATCC ) ble målt med natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE), HPLC, aminoterminal aminosyreanalyse og isoelektrisk fokusering.

EKSEMPEL 4

KARAKTERISERING AV DEN RENSEDE AKTIVE KOMPONENT AV ATCC

Den nye makromolekylære tumorcellevekst-inhiberende og cytotoksiske antibiotikum i foreliggende oppfinnelse, AAC-345, har flere karakteristiske egenskaper. Slike egenskaper er de følgende:

a) Natur

Den rensede aktive komponent av ATCC er et hvitt amorft pulver. Denne egenskap ble bestemt ved visuell observa-sjon .

b) Løselighet

Antibiotikumet fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse er

løselig i vann. Denne egenskap ble bestemt ved å oppløse 1 mg av den rensede aktive komponent av ATCC i 1 ml vann.

c) Stabilitet

Antibiotikumet fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse er

ømfintlig for lys i vandig løsning, men er stabilt som et frysetørket pulver. Disse egenskaper ble målt ved ustabiliteten av aktive kolonnefraksjoner under renseprosessen av den aktive bestanddel av ATCC beskrevet i eksempel 2. Slik ustabi-litet ble vurdert ved en bioaktivitetsmåling mot B_;_ Subtilis, som ble utført ved å plassere kolonnefraksjoner (25 pl i 6,35 mm skål) på agarplater sådd med Subtilis (ATCC 6633) og inkubere ved 37°C natten over.

d) Molekylvekt

Antibiotikumet fremstilt i foreliggende oppfinnelse har en

molekylvekt på ca. 42000 dalton. Denne egenskap ble målt ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel-elektroforese (SDS - PAGE) ved bruk av Laemmli, 12,5% gel [se Laemmli, Nature, 177, 680

(1970)] .

e) Isoelektrisk punkt

Det isoelektriske punkt (pl) for antibiotikumet er 2,9.

Denne egenskap ble målt ved å anvende LKB 1818P instruksjonsarket for sterkt effektiv analyttisk elektrofokusering.

f) Karbohydratinnhold

Karbohydratinnholdet av antibiotikumet fremstilt ifølge

foreliggende oppfinnelse er 12%. Denne egenskap ble bestemt ved fenol/svovelsyremetoden beskrevet i Methods in Enzymology, III, 93, (1957), Colowick et al. (Ed.), Academic Press, N.Y.

g) Høytrykksvæskekromatografi ( HPLC)

Antibiotikumet fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse ble eluert fra en "Altex Spherogel" TSK-3000 SW kolonne (serienummer 4K793 med førerkolonne) (7,5 mm x 30 cm) med 0,05M kaliumfosfatbuffer (pH 6,3) ved bruk av et Beckman Model 345/165 HPLC instrument. Etter 11,5 minutter ved en strømningshastighet på 1 ml pr. minutt ble topper påvist ved 220 nm og 280 nm ved 0,1

AUFS .

h) Ekstings . jonskoef f is i ent

Antibiotikumet fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse har

en ekstingsjonskoeffisient (Ei cm 1% H2O) på 21,6 ved 220 nm (UVjiraax) og 3,0 ved 275 nm (UVjL m a x ) . Denne egenskap ble målt ved å oppløse 1 mg av den rensede aktive bestanddel av ATCC i 1 ml vann og utføre UV spektroskopi på et Beckman DU-7 spektro-fotometer med en celleveilengde på 1 cm.

i) Aminosyreanalyse

Antibiotikumet fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse har det følgende aminosyreinnhold:

Aminosyreanalysen ble bestemt ved å bruke "pico tag"- metoden beskrevet i Water's Associates Operator's Manual #86746 (mai 1984) og #88140 (juni 1984) .

j ) Partiell aminosyresekvens

Antibiotikumet fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse har den følgende partielle aminosyrekodesekvens (som begynner ved N-enden): asp-thr-val-thr-val. En slik partiell sekvens ble bestemt ved Edman nedbrytning som beskrevet i Operator's Manual of Model 470A Protein Sequencer (Applied Biosystems, Inc.).

EKSEMPEL 5

FARMASØYTISK BLANDING

Som en spesifikk utførelsesform av en blanding oppløses den rensede aktive komponent av ATCC fremstilt som beskrevet i eksempel 3, i steril vandig løsning og gis parenteralt i en dose på 10 mg/m<2>til et vertsdyr påvirket av tumorceller som er ømfintlige for AAC-345.

Claims (6)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av et makromolekylært tumorcellevekst-inhiberende antibiotikum, karakterisert ved at man dyrker ATCC 53270 eller en aktiv mutant eller derivat derav, i et vandig næringsmedium inneholdende assimilerbare kilder for karbon og nitrogen under aerobe dypkulturbetingelser inntil en utvinnbar mengde av antibiotikumet er produsert og isolerer dette antibiotikum fra fermentatet som oppstår ved slik dyrking.

2. Fremgangsmåte ved fremstilling av antibiotikum ifølge krav 1, karakterisert ved at AAC-345 fremstilles.

3. Fremgangsmåte ved fremstilling av et råfermentat av ATCC 53270, karakterisert ved at man dyrker ATCC 53270 eller en aktiv mutant eller derivat derav, i et vandig næringsmedium inneholdende assimilerbare kilder for karbon og nitrogen under aerobe dypkulturbetingelser, inntil en utvinnbar mengde AAC-345 er produsert og isolerer råproduktet fra fermenterings-produktet som dannes ved slik dyrking.

4. Fremgangsmåte ved fremstilling av et anriket råprodukt av ATCC 53270, karakterisert ved at man dyrker ATCC 53270 eller en aktiv mutant eller derivat derav i et vandig næringsmedium inneholdende assimilerbare kilder for karbon og nitrogen under aerobe dypkulturbetingelser inntil et utvinnbart utbytte av AAC-345 er produsert, og isolerer det anrikede råprodukt fra fer-menteringsproduktet som dannes ved slik dyrking.

5. Fremgangsmåte ved fremstilling av et makromolekylært tumorcellevekst-inhiberende antibiotikum, AAC-345, som har de følgende egenskaper:

karakterisert ved at man dyrker ATCC 53270 eller en aktiv mutant eller derivat derav i et vandig naeringsmedium inneholdende assimilerbare kilder for karbon og nitrogen under aerobe dypkulturbetingelser inntil en utvinnbar mengde av antibiotikumet er dannet, og isolerer antibiotikumet fra fermentatet som dannes ved slik dyrking.

6. Fremgangsmåte ved fremstilling av en biologisk ren kultur av en mikroorganisme som har identifikasjonsegenskapene til ATCC 53270 og aktive mutanter eller derivater derav.