NO873679L

NO873679L - Fremgangsmaate for fremstilling av faktor viii:c-type proteiner.

Info

Publication number: NO873679L
Application number: NO873679A
Authority: NO
Inventors: Randal J Kaufman; Robert S Adamson
Original assignee: Genetics Inst
Priority date: 1986-01-03
Filing date: 1987-09-02
Publication date: 1987-11-02
Also published as: EP0253870A1; FI873796L; WO1987004187A1; EP0253870B1; JP2525022B2; DE3785102T2; FI873796A0; NO873679D0; FI873796A7; DK457587A; JPS63502318A; DE3785102D1; EP0253870A4; DK457587D0; ATE87663T1

Description

Faktor VIH-komplekset har to distinkte biologiske funksjoner: koagulerende virkning og en rolle i primærhemosta-tien. Analysen av faktor VIII mangel sykdommer, klassisk hemofili og von Willebrand' s sykdom, har bidratt til forstå-elsen av at Faktor VIII er et kompleks av to komponenter. Faktor VIII:c-prokoaguleringsproteinet (antihemofilifaktor) og det Faktor Vlll-relaterte antigen (von Willebrandt-faktoren, WF) er under separat genetisk kontroll, har distinkte biokjemiske og immunologiske egenskaper og har unike og vesentlige fysiologiske funksjoner.

Faktor VIII:c-molekylet er et viktig regulatorisk protein I blodkoaguleringskaskaden. Etter aktivering av trombin aksellererer det hastigheten av Faktor X-aktiveringen via Faktor IXa, noe som eventuelt fører til dannelsen av fibrin-koagulering. Mangel på Faktor VIII:c (klassisk hemofili) er en X-bundet kromosomal mangel som har vært en hovedkilde for hemoragisk morbiditet og mortalitet hos påvirket hannkjønn. Behandlingen består vanligvis i hyppige transfusjoner med blodprodukter. Det sistnevnte har resultert i en høy frekvens av infektiøse komplikasjoner (slik osm forskjelllilge former av hepatitt og ervervet immunomangler) i den hemofile populasj on.

VWF-molekylet er et adhesivt glykoprotein som spiller en sentral rolle i blodplateagglutinering. Det tjener som bærer for Faktor VIII:c i plasma og letter plate- karvegginterak-sjoner. Diskrete områder av VWF som binder til platereseptor-setene på glykoprotein lb og på glykoprotein Ilb-IIIa-komplekset, såvel som binding til seter på kollagen, er funnet. VWF består av multiple, muligens identiske, subenhe-ter, hver på 230.000 dalton. VWF syntetiseres i endoteliale celler og megakaryocyter. I plasma foreligger det som høymolekylvektmultimerer på 5 x IO<5>til IO<7>dalton. Von Willebrand-faktoren inneholder 5-6$ komplekst karbohydrat, noe som synes viktig når det gjelder molekylenes evne til å binde plater. En varietet av abnormaliteter i VWF-aktiviteten kan resultere 1 Von Willebrand's sykdom. Mangelen er generelt arvede i autosomal dominant type, og kan påvirke så mange som ett av 2000 individer. Milde former av sykdommen blir ofte ikke diagnostisert, mens alvorlig påvirkede pasienter hyppig kan ha behov for blodproduktunderstøttelse med de derav følgende risiki.

I den senere tid har isolering av gener for både Faktor VIII:c og Von Willebrand-faktoren gjort mulig produksjonen av rekombinant Faktor VIII:c- og VWF-preparater som er i det vesentlige frie for forurensende viruser (Toole et al. 1984, Wood et al. 1984, Lynch et al. Cell 41:49-56 1985, Ginsberg et al. Science 228:1401-1406, 1985). Fremstillingen av Faktor VIII:c og analoger derav, via rekombinant DNA-teknologi er oppnådd ved å benytte pattedyrceller som resipient for DNA-kodende Faktor VIII:c (eller analoger derav), inneholdt i egnede eksprimeringsvektorer. Primærhensynet for syntesen av et rekombinant Faktor VIII:c Inkluderer

i) utbytte av rekombinant FVIII:c som kan oppnås fra dyrkingsmediet;

li) stabiliteten for det rekombinante FVIII:c som fremstilles på denne måte;

Ili) effektiviteten og omkostningene ved rensing av FVIII:c;

og

iv) de totale omkostninger ved fremstilling av renset

rekombinant FVIII:c.

For å oppnå de beste resultater er det dyrket FVIII:c-produserende celler i medier Inneholdende pattedyrserum, f.eks. konvensjonelle preparater av fetalbovinserum, i mengder på ca. 10 volum-# i forhold til det totale medium-volum (for enkelthets skyld vil alle serumkonsentrasjoner heretter uttrykkes som volum-# av det totale medium. ) Det er funnet at i fravær av slike serumsupplementer vil både utbyttet og stabiliteten av de rekombinante FVIII:c lide vesentlig. Imidlertid har omkostningene for serumsupplementer og de ytterligere vanskeligheter ved rensingen forhindret bruk av serum og den generelle bruk av rekombinant FVIII:c, det hele er gjort mindre kommersielt attraktivt som et alternativ til naturlig FVIII:c som er renset fra plasma.

Etter utstrakte eksperimentelle modifikasjoner av medier for FVIII:c-produserende celler er det overraskende funnet en metode for å oppnå høyere utbytter av stabile FVIII:c-type-proteiner (som beskrevet nedenfor) ved bruk av medier Inneholdende reduserte mengder serum (f.eks. semiraffinerte medier) eller i det vesentlige serumfrie medier (raffinerte medier). Det er funnet at vertsceller som produserer FVIII:c-type-proteiner gir gjenvinnbare, stabile FVIII:c-type-proteiner i semiraffinerte og reraffinerte medier I utbytter som minst er sammenlignbare med de som oppnås i nærvær av 10$ serum hvis semiraffinerte eller raffinerte medier inneholder en vesentlig mengde av et hydrofobt stoff slik som VWF eller visse fosforlipider. Det er videre funnet at FVIII:c-type-proteiner som fremstilles I semi-raffinerte eller raffinerte medier mangler slike supplementer som karakteristisk viser drastisk ustabilitet og som kun, hvis overhode, kan gjenvin-nes i lave utbytter.

Det man vet idag antyder enten av VWF kan ha en stqabiliser-ende virkning in vivo på Faktor VIII:c i plasma, eller at WF kan ellisitere in vivo-frigjøringen fra lagringsdepoter eller stimulere in vivo-syntese og/eller sekresjon av Faktor VIII:c (Weiss, H.J. et al., 1977, J. Clin. Invest. 60: 390-404). Det er også antydet at trombinaktivert Faktor VIII (avledet fra naturlig, human FVIII) er stabilisert av fosfolipider, sannsynligvis med henblikk på trombin-mediert nedbrytning, se Andersson and Brown, 1981, Biochem, J. 200:161-167. Såvidt man vet er det imidlertid intet forslag i den kjente teknikk når det gjelder muligheten eller mulighetene for VWF eller fosfolipid til en in vitro-produksjon av Faktor VIII:c-type-proteiner (der f.eks. trombin i det veseentlige er fravær-ende) eller noe forslag til mediumsupplementer som omfatter VWF og/eller fosfolipider i det vesentlige frie for kompleks- blandinger av komponenter som er tilstede i pattedyrserum i henhold til oppfinnelsen.

Foreliggende oppfinnelse angår en forbedret fremgangsmåte for fremstilling av Faktor VII:c-type proteiner. Faktor VIII:c-type proteiner, slik dette uttrykket benyttes her, betyr proteiner som viser Faktor VIII:c-type prokoaguleringsaktivi-tet. Faktor VIII:c-type-proteiner innenfor oppfinnelsens ramme kodes av DNA-sekvenser som er istand til å hybridisere til DNA-kodende Faktor VIII:c. I tillegg til naturlige pattedyr, f.eks. human Faktor VIII:c, inkluderer Faktor VIII:c-type-proteiner f.eks. proteiner som inneholder utelatelse av en eller flere aminosyrer mellom 90 kD- og 69 kD-spaltingssetene med henblikk på nativ Faktor VIII:c som beskrevet i større detalj i PCT/US86/00774, av 23. oktober 1986. Faktor VIII:c-type-proteiner inkluderer også Faktor VIII:c analoger som inneholder aminosyreutelatelser mellom 50/40 spaltingssete og 69 kD spaltingssete, som kan fremstilles ved metoder i henhold til det som er beskrevet i PCT/- US86/00774. Faktor VIII:c-type-proteinene inkluderer videre analoger (med eller uten utelatelse som nevnt ovenfor) der en eller flere av spaltingssetene som spenner over argeninrest-ene i posisjonene 226, 336, 562, 740, 776, 1313, 1648 eller 1721 er gjort motstandsdyktige mot proteolytisk spalting, f.eks. ved erstatning av en eller flere aminosyrer med forskjellige aminosyrer ved konvensjonell seterettet mutage-neser av cDNA som skal eksprimeres. Faktor VIII:c-type-proteinene inkluderer således naturlig Faktkor VIII:c, "rekombinant" Faktor VIII:c og analoger derav med prokoagule-rende aktivitet, og ikke-rekombinant Faktor VIII:c eller analoger derav som er fremstilt ved cellelinjer avledet fra celler som produserer proteinet.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen anvender således pattedyrceller som inneholder DNA som koder et Faktor VIII:c-type-protein, og som er istand til å eksprimere proteinet. I henhold til oppfinnelsen blir cellene dyrket i medier inneholdende en effektiv mengde av en stabiliserende substans for et Faktor VIII:c-type protein. Slike substanser omfatter: i) pattedyr von Willebrand Faktor (VWF), ii) et stabiliserende fosfolipid eller en fosfolipidblanding; og lii) blandinger av VWF og ett eller flere fosfolipider. Foretrukne effektive mengder av VWF ligger fra ca. 0,1 til 10 jjg VWF/ml medium, idet 1-3 pg/ml er spesielt foretrukket. En lett tilgjengelig kilde for egnede fosfolipider omfatter kommersielt tilgjengelige tørrmelkpreparater slik som tørrskummet melk og lavfettskummet melk. Slike tørkede melkepreparater kan tilsettes til mediene i mengder som ligger fra ca. 0,01 til 10 vekt-#, beregnet på tørrmelk i forhold til mediet. For optimal virkning på Faktor VIII-produksjonen med minimal toksisk effekt på cellene, er idag ca. 1-3$ tørrmelk foretrukket. Tørrmelkpreparatene kan konvensjonelt steriliseres ved først å fremstille en 10#-ig vandig suspensjon av melk og deretter å autoklavere den. En annen lett tilgjengelig kilde for egnede fosfolipider er kommersielt tilgjengelig soyabøn-nelecitin, som kan tilsettes til mediet i henhold til oppfinnelsen, fortrinnsvis i liposomform.

"Fosfolipid" slik det her benyttes betyr en ester av en fosforholdig syre inneholdende ett eller to molekyler fettsyre, en alkohol og en nitrogenholdig base. Eksempler på slike fosfolipider er cefalin, fosfatidylserin, fosfatidyl-kolinblandinger, fosfatidylinositol, fosfatidyletanolamin, soyabønnelecitin og blandinger derav, idet soyabønnelecitin er spesielt foretrukket. Selvfølgelig kan variasjoner være mulige. I dag er de foretrukne mengder av fosfolipid eller fosfolipidblandinger ca. 1-1000 jjg fosfolipid eller fosfoli-pidblandlng pr. ml dyrkningsmedium idet mengder over 100 pg/ml er mere foretrukket og konsentrasjoner mellom ca. 200 og 300 jjg/ml er spesielt foretrukket. I tillegg til dette er det idag foretrukket å tilsette fosforlipidblandingen til kulturmediet i form av liposomer, fortrinnsvis med en diameter på opptil ca. 500 nm. Fortrinnsvis er liposomene unilaminære selv om multilamellære også kan benyttes. Aller

helst er diameteren til llposomene mindre enn ca. 100 nm. I tillegg til dette kan liposomer som fremstilles ved konvensjonelle metoder fra fosfolipidene som benyttes, enten i blanding med eller inneholdende Faktor VIII:c-protein, som en bærer for administrering av proteinet til pasientene. Der tørrmelk benyttes som fosfolipidkilde, kan tørrmelken tilsettes direkte (heller enn i form av liposomer) til de forskjellige media.

VWF kan oppnås fra pattedyr, f.eks. mennesker, kveg, svin osv. i form av serum ved konvensjonelle metoder eller fra cellelinjer avledet fra VWF-produserende celler slik som endotelialceller. Alternativt kan "rekombinant" VWF, dvs. VWF avledet fra genetisk konstruerte celler, benyttes. I en utførelsesform blir VWF-produserende celler slik som celler som er konstruert for fremstilling av VWF, dyrket i mediet for å kondisjonere dem til VWF enten før eller samtidig med dyrking av cellene som produserer et Faaktor VIII:c-type-protein. Alternativt kan det rekombinante VWF produseres separat og tilsettes som et eksogent supplement til de media som benyttes for dyrking av cellene som produserer Faktor VIII:c-type-proteinet. I en annen utførelsesform blir de celler som produserer Faktor VIII:c-type-proteinet hensikts-messig konstruert, dvs. effektivt transformert med en VWF transkripsjonsenhet slik at VWF og Faktor VIII:c-type-proteinet koeksprimeres av de samme celler. En ytterligere utførelsesform av oppfinnelsen inneholder de medier som benyttes for dyrking av celler som produserer Faktor VIII:c-type-proteinet både VWF på grunn av en av de ovenfor nevnte prosesser og stabiliserende ett eller flere fosfolipider. I dette tilfelle kan det være ønskelig å benytte reduserte mengder av hver komponent i forhold til de mengder de ville vært benyttet i alene. Ved å benytte egnede supplerte raffinerte medier I forbindelse med oppfinnelsen, fremstilles det raffinerte medier med høye nivåer av gjenvinnbare stabile Faktor VIII:c-type-aktivitetsprodukter som så kan viderebear-beides og renses uten nødvendigheten av separering av serumkomponenter. Dyrkningsmediene som benyttes ifølge oppfinnelsen kan i tillegg inneholde pattedyravledet serum, f.eks. fetalbovinserum, fortrinnsvis i mengder mindre enn ca. 10%, fortrinnsvis mindre enn 5, og helst mellom 0 og 1%, selv om det i det alt vesentlige serumfrie medium spesielt er foretrukket. Andre konvensjonelle pattedyrcelledyrknings-mediumssupplementer kan også tilsettes.

Oppfinnelsen skal illustreres i de følgende eksempler som viser typiske prosedyrer for blant annet å overvinne serumav-hengigheten ved fremstilling av gjenvinnbare aktive Faktor VIII:c-type-proteiner ved bruk av fosfolipider og VWF som mediumsupplement. Eksemplene er illustrerende og skal ikke begrense oppfinnelsen.

EKSEMPEL I

Opprettelse av CHO ("Chinese Hamster Ovary") cellelinjer som eksprimerer human Faktor VIII:c.

Faktor VIII:c eksprimeringsplasmidet som benyttes i dette eksempel, var RxPy VIII-I som inneholder i urretning polyoma-virusforsterkeren, den første ledersekvens av adenovirus tripartitledersekvensen, en Faktor VIII:c transkripsjonsenhet fulgt av en DHFR-gen og SV40 polyadenyleringssignalet, og et gen som koder tetracyklinresistens. Dette plasmid blir innført i dihydrofolatreduktase (DHFR) defisient COH-celler via kotransformering med et DHFR ekspremeringsplasmid og etterfølgende seleksjon for celler som vokser I fravær av tilsatte nukleotider. En spesielt oppsamlet mengde av transformanter designert fig 1 ble deretter dyrket i økende konsentrasjoner av metotreksat, MTX, for å forsterke DHFR- og Faktor Vlll-genene. Den resulterende cellelinje eksprimerte høye nivåer av Faktor Vlll-aktivitet som bestemt enten ved evnen ved å koagulere Faktor VIII-defisientplasma [Clotech (APPT) analyse] eller ved evnen til å generere Faktor Xa I nærvær av Faktor IXa, fosfolipid, kalsium, og Faktor X (Kabl kontestanalyse). Evnen for disse CHO-celler for å produsere Faktor VIII:c er vist i tabell I. Faktor VIII aktiviteten øket 10.000 ganger med økende nivåer av MTX resistens som korrelerte med Faktor VIII-gen-kopitallet. Andre eksprimer-ingssektorer kan også benyttes i stedet for RxPy VIII-I så lengde de kan dirigere eksprimering av Faktor VIII:c eller analoger derav. Slike vektorer inkluderer f.eks. pCVSVL2-VIII (ATCC nr. 3913, se Europeisk Søknad 85202121.1) og pDGR-2 (ATCC nr. 53100, se PCT/US86/00774-utkuttingsanalog). Andre Faktor VIII:c eksprimeringsvektorer kan fremstilles ved bruk av konvensjonell eksprimeringsvektorer og teknikker som f.eks. inneholder Sall-fragmemntet fra pCVSVL2-VIII eller pSP64-VIII (ATCC nr. 39812). Sall-fragmentet fra en av disse vektorer inneholder en DNA-sekvens som koder full-lengde Faktor VIII:c.

Plasmidene pAdD26SVpA(3) (Kaufman and Sharp, 1982, Mol. Cell. Biol.) og plasmid pRXPy VIII-I ble nedbrutt med Cia 1 og det resulterende lineæriserte DNA ble ligert in vitro og kopresi-pitert med CaP04og benyttet for å transfektere CH0 DHFR defisiente DUKX-BII-celler. Celler som effektivt eksprimerte DHFR skulle forventes å inneholde forbedrerelementet fra pRXPyVIII-I forbundet med DHFR-genet fra pAdD26SVpA(3). Resultatene har vært konsistente med denne hypotese. Derpå følgende seleksjon for øket DHFR eksprimering ved propagering av cellene i økede konsentrasjoner av MTX, resulterer i celler som har forsterket Faktor Vlll-genet og DHFR-gen. På hvert nivå av MTX-seleksjon ble prøver på kondisjonert media (omtrent 10^ celler/ml i alfamedia supplementert med 10% fetal bovinserum) tatt for Faktor VIII:c-aktivitetsanalyse bestemt ved Kabi koatest-metoden, modifisert for å oppnå sensitivitet bedre enn 0,05 mU/ml.

Sammenlignbare resultater ble også oppnådd ved ett-trinns-aktivert partialtromboplastintid (APTT) koaguleringsprøven ved bruk av Faktor VIII:c-defisientplasma. Alle prøver viste trombinaktivitet på 30-50 ganger. For trombinaktiviseringen ble prøvene forbehandlet 1-10 min. med 0,2 enheter/ml trombin ved romtemperatur.

EKSEMPEL II: Serumavhengighet av Faktor VIII:c-syntese: CHO-celler (Lig 1 2 A subklon B10 i 0,1 pm MTX ved 80$ konfluens) som er skyllet og matet med medium inneholdende 10% FCS eller raffinert medium (serumfritt, inneholdende 5 mg/ml BSA, insulin, transferrin, selenium, hydrokortison og putrescin) akkumulerer Faktor Vlll-aktivitet. Graden av opptreden i definerte medier er grovt regnet 4 ganger lavere enn 1 serumholdige media. Denne 4-gangers forskjell blir større når cellene propageres i fravær av serum. Dette skyldes ineffektiv spyling av cellene. Graden av Faktor VIII:c-opptreden øker sterkt lineært opptil 24 timer, noe som antyder at Faktor VIII er stabilt i disse media. Dette resultat tilsvarer resultater som oppnås med COS-celler ved lavere nivåer av Vlll-eksprimering (ca. 10 mU/ml/dag).

Cefalin, en blanding av fosfolipider, kan motvirke I det minste en del av serummangelen. CHO-celler (lig. 2 A sammen-slått i 20 pM MTX) ble separat dyrket med og uten serum og spylt etter 4 timer. De to CHO-kulturer ble så splittet igjen og en del av serum<+>og av serum" CHO-cellene ble supplert med 5jjM cefalin i ytterligere 2 timer. Den andre andel av serum"*"- og serum" CHO-cellene ble ikke supplert med cefalin. Mediene ble analysert ved 6 timer og 25 timer og resultatene er vist nedenfor:

Disse resultater antyder at cefalin alene kan øke VIII-aktiviteten i fravær av serum men at virkningen er kortvarig (dvs. observert etter timer men forsvunnet etter 25 timer). I et forsøk ble konsentrasjonen av cefalin øket, og det var Ingen ytterligere økning av VIII-aktiviteten. Dette indikerer at en komponent i cefalin ikke var gradsbestemmende.

En del av cefalineffekten kan elislteres av en enklere blanding av fosfolipider eller ved enkle fosfolipider. Celler (Lig. 1 2 A 0,02-masse i 20jjm MTX) ble matet med 10% fetal kalveserum eller serumfritt medium i 24 timer og deretter enten cefalin (5pm) eller en blanding (1:4) av fosfatidylserin og fosfatidylkolin (PCPS) ble tilsatt til serumfrle kulturer. Resultater fra medier analysert etter 2 timer var:

Dette resultat viser at fosfolipider alene kan øke VIII-aktivlteten i kondisjonert media.

Analyser av trombintilgjengeligheten av VIII eksprimert I CHO-celler som dyrkes under forskjellige betingelser, antyder at nærværet av serum reduserer graden av trombinaktivering. CHO-celler (Lig 1 2 A-masse i 20>jm MTX) ble skyllet og matet med media inneholdende 10$ fetal kalveserum eller raffinert medium (5 mg/ml BSA, transferrin, selenium, insulin, hydrokortison, putrescin). 24 timer senere "ble enten cefalin eller 10% FCS tilsatt, og 2 timer senere ble prøver tatt for analyse og måling av trombintilgjengeligheten:

Disse resultater antyder at nærværet av serum øker den aktivitet som dannes sammenlignet med serumfritt medium, men reduserer trombindaktiverbarheten. I motsetning til dette, kan cefalinet kompensere for serumeffekten eller øke aktiviteten av VIII som fremstilles men reduserer ikke trombinakti-verbarheten. I serumfritt medium produserer således med tilsetning av cefalin 2 timer før høsting, CHO-celler VIII i en mengde av en enhet pr. ml og dette materiale viser en 34 ganger større trombinaktivering. Dette forsøk viser også at 10% FCS tilsatt til serumfritt medium 2 timer før analysen også kan øke mengden Vlll-aktiviteten. Denne evne ble ikke redusert ved å koke serum 10 minutter før tilsetningen. Således er serumfaktoren som kreves for Vlll-aktivitet varmestabil. Derav kan man slutte at serumfaktkoren som kreves for økning av VIII kan inneholde to komponente: et fosfolipid og en annen, varmestabil faktor som kan være nødvendig for å stabilisere fosfolipidet.

For å bestemme hvorvidt 10% serum var begrensende for en Faktor VIII:c-eksprimering i de meget forsterkede CHO- cellelinjer, overvåket man virkningen av økende mengder av serum på evnen til å elisitere faktor VIII:c-aktivitet i cellelinje 10A1. 10A1 er en klon som er aavledet fra seleksjon av Lig 1-massen for dyrking i 1 mm MTX. Dette forsøk viste virkningen av Faktor Vlll-aktivitet ved tilsetning av økende mengder av fetalbovinserum til lOAl-celler i 24 timer. 50% serum ga tre ganger mere aktivitet i det 24 timers kondisjonerte medium sammenlignet med 10$ serum. Andre resultater har antydet at mengden aktiv Faktor VIII antigen tilsvarende økes når cellene propageres i 5056 serum. Andre cellelinjer som eksprimerer noe lavere nivåer av Faktor VIII:c viser mindre drastiske økninger i Faktor VIII:c-aktiviteten ved vekst i høyere konsentrasjoner av serum. Således synes det å være et visst begrensende krav for Faktor Vlll-eksprimering i høyereproduserende celler slik som de som ville være ønskelige for kommersiell skalafremstllling av Faktor VIII.

Eksempel III

Serumavhengighet av rFaktor VIII:c- svntese i suspensjonskul-turer av CHO.

Den følgende tabell illustrerer avhengigheten av rekombinant Faktor VIII:c (rFVIII) aktivitet på serumnivåene i kultur. En relativt lav rFVIII-produsent, klon 1E6, ble dyrket i suspensjonskultur i 3 til 4 dager i medium inneholdende forskjellige konsentrasjoner av fetalbovlnserum, FBS.

Den samme serumavhengighet er observert med andre rFVIII-utskillende CHO-cellelinjer. Disse resultater reflekterer ikke den genetiske stabilitet fordi de opprinnelige ekspri-meringsnivåer kan forbindes ved tilsetning av serum.

Det er funnet at tilsetning av fosfolipid til dyrkningsmediet kan erstatte serumkravene, imidlertid er relativt høye konsentrasjoner av fosfolipid nødvendig (i størrelsesorden 10-20 ganger høyere enn tidligere benyttet med sereumholdige media). Når det gjelder avhengigheten av gjenvinning av FVIII-aktivitet på fosfolipidkonsentrasjonen er det funnet at suppleringen av raffinerte media, DM, med 240>jg soyabønne-lecitin, SL/ml medium etter 24 timer ga omtrent 2 ganger så mye FVIII-aktivitet som det som ble oppnådd 1 DM inneholdende 160 pg SL/ml og fem ganger så mye FVIII-aktivitet som det som ble oppnådd i DM inneholdende 80pg SL/ml. Ikke desto mindre ga DM inneholdende 80jjg SL/ml målbart mere FVIII-aktivitet enn DNM inneholdende 1% FBS (halvraffinert medium) mens det halvraffinerte medium ga signifikant mere FVIII-aktivitet enn DM alene. Signifikant er nivået av rFVIII, generert i løpet av en 24 timers periode i raffinert medium i nærvær av 240 Mg SL/ml medium minst så høy so m det som genereres i DM supplementert med 1056 FBS. En økning av konsentrasjonen av SL over 240 jjg/ml resulterte ikke i noen ytterligere økning i rVIII-aktiviteten i dette forsøk. Illustrerende resultater av et forsøk er vist nedenfor:

Disse data viser økningen av rFVIII:c-aktiviteten som o ppnås ved relativt høye konsentrasjoner, f.eks. 240 pg/ml) soyabøn-nelecitinfosfolipid i fravær av fetalbovinserum. CHO-cellene

(1E6 i 0,1 pmol iMTX) ble suspendert ved en konsentrasjon av 3 x 10^ celler/ml 1 raffinert medium inneholdende 5 g/l bovinserumalbumin, enten i fravær eller i nærvær av fosfolipid eller i medium inneholdende 10% FBS i 24 timer ved 37"C. Ved avslutning av inkuberingen ble prøver av cellefritt kondisjonert medium analysert med henblikk på rFVIII:C-aaktivitet ved kromogenanalyse.

Det er funnet at tilsetning av fosfolipid i mengder på opptil 320 pg/ml mediu7m ikke gir noenb markert endring i celleveksten hverken i raffinert eller i semiraffinert medium. I et sett forsøk ble det funnet at maksimal rFVIII-aktivitet ble oppnådd i kulturen der 320 pg fosfoliplder/ml medium ble tilsatt. I halvraffInert medium ble maksimale nivåer oppnådd etter 72 timer der 240pg/ml soyabønnelecitin ble tilsatt. Disse og andre data illustrerer at soyabønnelecitin som tilsettes trinnvis til kulturer på dagene 0, 1, 2 og 3 tillot produksjon av rFVIII. De optimale konsentrasjoner var ca. 240jjg/ml i disse og andre forsøk, uansett fremstillingsmeto-den for fosfolipidet.

Cellulærproduktivitetene i to forskjellige CHO-cellelinjer fra forsøk tilsvarende det ovenfor angitte er vist nedenfor. Således er produktivitetene av rFVIII fra rCHO-celler i det minste ekvivalent i raffinert medium supplert med fosfolipid som i serumholdig medium. Imidlertid, og som vist ved de ovenfor angitte data, er hovedmassen av rFVIII som fremstilles 1 raffinert medium mindre enn i serumholdig medium. Dette skyldes det faktum at cellene vokser hurtigere og til større celledensiteter 1 serumholdige medier i stedet for å være mere produktive. Ved supplering av raffinert medium med små mengder serum, f.eks. 156, forbedres celleveksten. Etter en kort tilpasningsperlode vil således cellene vokse så og sl like godt i halvraf finert medium som i 1056 FBS-supplert medium.

Det er funnet at rCHO-cellelinjer, f.eks. søkerens H9.05, vokser til tilsvarende celledensiteteer og er minst like produktive når det gjelder Faktor VIII i fosfolipldsupplert halvraf f inert medium som i 1056 FBS-supplert medium. Videre har man også undersøkt den fysikalske art av soyabønneleci-tInpreparatene. En størrelsesprofi 1 av et typisk fosfollpid-preparat der soyabønnelecitin suspenderes i saltoppløsning og føres tre ganger gjennom en Manton-Gaulin-homogenisør deretter filtreres gjennom et 0,2pm-filter , ble oppnådd. Den gjennomsnittlige midlere størrelse av liposomene var ca. lOOnm når det gjladt diameteren, noe som antyder at hovedandelen av liposomene som oppnås ved denne prosess er små unilaminære vesikler, såkalte SUVer. Det følgende forsøk Indikerer at størrelsen av soyabønnelIcitinliposomene kan spille en vesentlig rolle ved effektiviteten av fosfolipidet, dvs. evnen til dette SL til å forårsake en økning av FVIII-ekpremeringen.

Et soyabønnelecitinpreparat ble konstituert i saltoppløsning men ikke homogenisert. Preparatet Inneholdt signifikant mindre SUV enn et vanlig (dvs. med homogenisering) preparat (kun 4456 av liposomene var under lOOnm mot 74 i et vanlig preparat). Det inneholdt også en signifikant populasjon av multilamellære vesikler, MVer, som hadde en diameter på ca. lOOnm, dvs. 30-4056 av de totale liposomer var MVer, som er tilstede kun i små mengder, vanligvis mindre enn 556 i vanlige preparater. Effektiviteten av denne prøve ble redusert til ca. 6056 av en normalprøve, noe som indikerer at størrelsen av liposomene kan spille en vesentlig rolle når det gjelder fosfolipidenes effektivitet.

Eksempel IV

Porcin VWF kan bevirke elisitering av Faktor VIII:c-aktivitet fra CHO-celler som er propagert i fravær av serum.

Lig 1 (20 pm MTX) celler ble skyllet og matet til raffinert medium (alfamedlum inneholdende insulin, transferrin, selenium, hydrokortison og putreskin, glutamin og penicillin og streptomycin) tilsatt tilbake med økende konsentrasjoner av svineserumalbumin med tilsvarende konsentrasjoner av ovalbumin tabell II. Begge proteiner kan bevirke elicltering av Faktor VI11: c-ekprimering. Når imidlertid partielt renset VWF mates tilbake til medium inneholdende 5 g/l bovinserum-albumln, øket -faktor VIII:c-aktiviteten 4'fire ganger og mer enn de nivåer som oppnås ved propagering av celler 1 1056 fetalbovinserum. Dette viser drastisk evnen til VWF til å elicitere Faktor VIII:c-aktivitet i fravær av serum. Dette resultat dupliseres med forskjellige preparater av porcin VWF og også med renset human VWF.

For å vise at evnen til elicitering av Faktor VIII:c skyldtes VWF ble følgende forsøk gjennomført. Celler som eksprimerte Faktokr VIII:c ble inkubert i nærvær av media inneholdende serum avledet fra human VWFdeficientplasma. Faktor VIII:c-aktiviteten i CHO Lig 1-cellene inkubert i VWF deficientserum vbar 2556 nivå sammenlignet med normalhumanserum. Når por sin VWF-preparatet ble tilsatt tilbake til det VWF deficiente serum, øket Faktor Vlll-aktiviteten til verdiene for 1056 fetalbovinserum. Virkningen kunne eliciteres med helt ned til 2,5 pg/ml VWF, se tabell HA. I et annet forsøk og når VWF- konsentrasjonen "ble øket til 0,25 jig/ml , var aktiviteten kun 50$ av den til 1056 f etalbovinserum.

CHO-cellel inj e 1E6 som er tilpasset over en 2-3 måneders periode til å vokse i fravær av serum, i raffinert medium, ble benyttet i det følgende forsøk for å vise at eksogen VWF kunne øke nivået av RVIII-eksprimering i definert medium i fravær av sogar restmengder av bovin VWF. De data som gies nedenfor viser at supplering av definert medium med omtrent lpg/ml porcin VWF tillater eksprimering av rFVIII ekvivalent det nivå som oppnås i 1056 bovinserum supplert medium. Fordi disse celler er dyrket i mer enn tre måneder i fravær av FBS var ingen spor av bovin VWF tilstede. Således var den observerte økning 1 rFVIII:c-nivåene sannsynligvis grunnet eksogent VWF.

Disse data illustrerer økningen av rFVIII-aktiviteten på grunn av eksogent, partielt renset VWF (porsin) i fravær av fetalbovinserum. CHO-celler (1E6 i 0,1 Mm MTX) ble suspendert ved en konsentrasjon av 3 x IO<5>celler/ml i raffinert medium inneholdende 5 g/l bovinserumalbumin, enten i fravær eller nærvær av partielt renset porcin VWF (ved ca. 100 jjg/ml ) eller medium Inneholdende 1056 FBS 1 24 t ved 37° C. Etter slutten av inkuberingen ble prøver på cellefritt kondisjonert medium analysert med henblikk på rFVIII:c-aktivitet ved kromagenanalyse. For å undersøke virkningen av tilsatt VWF på mengden Faktor VIII:c i kondisjonerte medier ble celler merket med en 1 times puls på 35 - S metionin og sporet opp enten i mediein-neholdende 1056 fetalbovinserum, 1056 VWF deficient humanserum eller 1056 VWF deficient humanserum med tilbaketilsatt porcin VWF. Resultatene viste at ved tilsetning av VWF til VWF-fattig serum var mere Faktor VIII:c (både de tunge 200kDa- og til dette 76kDa-kjeder) tilstede i mediene. Ingen endring i den intracellulære syntese av Faktor VIII:c blre observert. VWF tilsetning til 1056 f etalbovinserum resulterte ikke i noen endring i nivået av Faktor VIII:c i de kondisjonerte media. Disse forsøk indikerer at VWF er nødvendig for sekresjon og/eller stabilitet av Faktor VIII:c.

EKSEMPEL V

Eksprimering av human VWF i COS-celler.

Kloning av et partielt segment av human VWF cDNA er tidligere angitt (Ginsberg, et al., 1985, Science). Etter denne rapport er fullengde VWF cDNA satt sammen og sekvensen bestemt. Kloningen, sekvensen og eksprimeringen av VWF er beskrevet i PCT/US86/00760.

Foreliggende søkere har innskutt fullengde cDNA-klonen i eksprimeringsvektoren pMT2 for å produsere pMT2-VWF (ATCC nr. 67122). pMT2-VWF inneholder adenovirusassosiert(VA)gener, SV40 opprinnelsen av replikeringen inkludert den transkrip-sjonene forsterker, adenovirus hovedsenpromoter inkludert adenovirus tripartittleder og et 5' spaltesete, et 3' spaltesete avledet fra et immunoglobulingen, VWF-koderegio-nen, et ikke-kodende DHFR-innskudd, det SV40 tidlig polya-denylerinssete og BR322 sekvensene som er nødvendig for propagering i E. coli. Detaljer fra denne vektor som er et derivat av pQ2 er beskrevet i Kufman, Proe. Nati. Acad. Sei., USA 82:689-693 (1985=. pMT2-VWF DNA ble så fremstilt for COS-celletransfeksjon ved konvensjonelle metokder. 60 timer etter DEAE dektranmediat transfeksjon av COS-cellene, ble disse merket med 35-S metionin og medium og celle-ekstrakter ble Immunpresipitert med et kaninantihumanpolyklonalt antistoff (Calbiochem) og presipitatene analysert ved SDS-reduserende gelelektroforese. Resultatene viser at en signifikant mengde VWF syntetiseres i de transfekteret COS-celler, idet hovedandelen utskilles. I kondisjonerte media er det et ca. 260kDa-protein og et 220kDa-protein som minner om den totalt prosesserte form av VWF. Ca. 50% av det syntetiserte VWF prosseseres til 200kDa-formen. Ved analyse for multimerdan-nelse ved ikke-reduserende gelelektroforese, ble det funnet at dette VWF var assosiert i multimerer men ikke med ekstremt høye molekylvekter som de man finner I plasma. Multimerene lå opptil 1 million dalton som et grovt anslag. Analyse av VWF-antigenet i COS-cellekondisjonerte medier antydet nærværet av human-VWF i en mengde av 0,35 pg/ml. Andre analyser har indikert at dette VWF eksprimert i COSD-celler spesifikt binder både plater og kollagen.

EKSEMPEL VI

Rekombinant VWF kan elicitere eksprimering av human Faktor VIII:c.

VWF-eksprimeringsplasmidet pMT2-VWF ble transfektert på COS-celler ved DEAE-dekstranmediert transfeksjon og 36 timers posttransfeksjon forandret mediet seg til serumfritt (DMEM-manglende serum). 72 timer senere ble de COS-cellekondlsjo-nerte medier høstet og tilført til CHO Lig 1-celler (20 pm MTX-resistent) som tidligere var skyllet med serumfritt medium ved 10^ celler/ml. 24 timer senere ble mediene tatt fra CHO-cellene og analysert med henblikk på Faktor VIII-aktlvltet. Resultatene er vist nedenfor og er sammenliignet med Faktor VIII:c-aktiviteter fra CHO-celler, propagert i 10% fetalbovinserum og i serumfritt medium I 24 timer.

Eksempel VII: Innføring, eksprimering og forsterkning av VWF-gener i CHO-celler som eksprimerer Faktor VIII:c: For eksprimering av VWF i CHO-celler ble en andre eksprlmer-ingsvektor pMT2AFDA-VWF (ATCC nr. 67172) benyttet med en celleksjonsprotokoll for celler som overeksprimerer enzym-adenosindeaminasen for å forsterke plasmidsekvensene (Kaufman et al., 1986, Proe. Nati. Acad.Sci. 83:3136; US-SN 619.801). En Faktor VIII:c-eksprimerende cellelinje som var klonet fra Lig 12a (fra eksempel I) i 1 mm MTX og kalt 10A1, ble benyttet som resipient for overføring av pMT2ADA-VWF. pMT2ADA-VWF ble Innført i lOAl-celler med protoplastfusjon som tidligere beskrevet (Sandri-Goldin et aklk., 1981, Mol. Cell. Biol. 1:743). E. coli DH5-celler som huset pMT2ADA-VWF (DH5 ble benyttet for å minimalisere homolog rekomblnerIng og utelatelse av VWF-sekvensene) ble dyrket 1 50 ml L-buljong inneholdende 50 pg/ml ampicillin til en A^qq verdi på 0,6. Kloramfenlkol ble tilsatt til 250 pg/ml og kulturen inkubert ved 37°C i ytterligere 16 timer for å forsterke plasmidkopl-tallet. En suspensjon av protoplaster ble fremstilt som beskrevet (Sandri-Goldin et al., 1981), tilsatt til 10A1-celler 1 en mengde av ca. 1-2 x IO<4>protoplaster/celle, og centrifugert på celler ved 2000 omdr./min. i 8 minutter i en IEC modell K centrifuge. Etter sentrifugering ble supernatanten fjernet ved beluftning, og 2 ml polyetylenglykoloppløs-ning (50 g PEG 1450 i 50 ml Dulbecco's modifisert medium) ble tilsatt til hver plate. Cellene ble sentrifugert igjen ved 2000 omdr./min. i 90 sek. og polyetylenglykoloppløsninger fjernet og platene skyllet tre ganger i alfamedium inneholdende 10$ v/v fetalkalveserum. Cellene ble så bragt på plate i vevkulturplater i medium inneholdende 100 Mg/ml kanamycin, 10 pg/ml hver av penicillin og streptomycin samt 20 pm MTX. To dager senere ble cellene tryptinisert og subdyrket 1:15 til ADA selektivt medium med 10% dialysert fetal kalveserum. 0,1 pm deoksykoformycin, 10 pg/ml penicillin og streptomycin, og i nærvær og fravær av 20 pm MTX. ADA selektivt medium, AAU inneholdt 1,1 mm adenosin, 10 pg(/ml alanosin volum uridin. Deretter ble det vist at fjerning av MTX-seleksjonen på dette trinn resulterte i en reduksjon av Faktor VIII:c eksprimeringen. Deretter ble MTX etterlatt i det ADA selektive medium.

Det var mulig å forsterke VWF-genet ved seleksjon for vekst i økende konsentrasjoner av 2'-deoksykoformycin, dCF, i nærvær av cytotoksisk konsentrasjoner av adenocin. En sammenslåeing av transformanter (6 kolonier) ble fremstilt fra 10Al-celler, valgt for ADA i nærvær av 20 pm MTX. ADA-seleksjonsmidlet ble endret ved sekvensielt å øke konsentrasjonen av 2'deoksykoformycin (trinn på 0,1 pm, 1,0 pm og 2,0 pm) i nærvær av 20 pm MTX. Ved hvert trinn ble produksjonen av VWF og av Faktor VIII:c målt etter 24 timer i nærvær av 10% FCS eller i raffinert medium. Resultatene er oppsummert nedenfor:

Disse resultater vbiser at VWF-eksprimeringen øket med økende ADA-seleksjon. I tillegg var eksprImeringen av Faktor VIII:c Ikke avhengig av nærværet av serum slik man observerer ved linje 10A13-a i 2 pm dCF og 1000 Vpm MTX som eksprimerer 1,4 penheter/celle/dag av Faktor VIII:c i raffinerte media.

EKSEMPEL VIII: Fusjon av CHO-celler som eksprimerer Faktor VIII:c og CHO-celler som eksprimerer VWF.

VWF-gen ble innført i CHO DHFR-defisiente celler (DUKX-B11, Chasln and Urlaub, 1980, Proe. Nati. Acad. Sei. 77:44216). To tilnærmelser er gjort for å oppnå celler som eksprimerer enten MTX-reslstens eller dCF-resistens forbundet med VWF-ekspr imer ing . Deretter kan hver av cellelinjene benyttes for sammensying til andre celler som eksprimerer Faktor VIII:c med evnen til seleksjon for enten MTX- eller dCF-resistens.

MTX- forsterkning 1 CHO DHFR- defisientceller

pMT2VWF-plasmid og pAdD26SVpa(3) ble blandet 10:1 og transfektert ved CaP04kopresiplterIng inn 1 CHO DUKX-Bll-celler som beskrevet av Kaufmann and Sharp (1982, J. Mol. Biol. 150:601). Cellene ble selektert for DHFR-posltlvfenotype ved dyrkning i fravær av nuklocider og kolonier slått sammen og selektert for øket MTX-resistens. Resultatene indikerte at VWF-eksprimeringen økes med økende MTX-resistens, og dette er angitt i tabellen nedenfor:

dCF seleksjon for VWF i CHO DHFR defisiente celler

pMT2ADA-VWF-plasmid ble innført i CHO DUKX-B11 som beskrevet i eksempel VIII og celler selektert for vekst i ADA selektivt alfa-medioum med 4 pm xyl-AO, 0,03 pm dCF, 10 pg/ml hypoksan-tln, 10 pg/ml tymidin, og lOpg/ml penicillin og streptomycin. En klon PM5F ble avledet som eksprimerte 3-5 pg VWF/celle/- dag. Denne klon ble deretter benyttet for fusjon til Faktor VII:c-cellelinjer og som en resipient for Innføringen av Faktor VIII:c-gener.

Fusjon av Faktor VIII:c- og VWF- eksprimerende cellelinjer Faktor VIII:c-eksprimeringsplasmidet pLA2 er beskrevet av Toole et al., 1986, Proe. nati. Acad.; International Applica-tion nr. PCT/US86/00774. Dette plasmid er innført i DUKX-B11 CHO-cellene ved protoplastfusjon med seleksjon for DHFR fra 3-regionen av Faktor VIII-DHFR-transkriptet (se PCT/US86/00774). En cellelinje ble avledet ved seleksjokn for MTX-resistens til 1,0 pm MTX og er kalt LA3-5. Denne cellelinje eksprimerer en utarmet form av Faktor VIII:c ved 3-5 p-enheter/celle/dag ( i 10% fetalkalveserum). Denne modifiserte faktor VIII;c binder også til og krever VWQF for effektiv syntese. LA3-5 ble fusert til PM5F og hybrider ble selektert som eksprimerte både MTX-resistent- og dCF-resistens fenoty-per .

For fusjon ble PM5F behadnlet med dietyleepyrokarbonat (0,0356 i 30 minutter på is) for å drepe PM5F. Disse celler ble så fusert ved polyetylenglykolindusert cellefusjon til LA3-5: DEPC-behandlet pMSF-celler ble sentrifugert på en LA 3-5 (1,5 x 10<6->celler) ved 2000 omdr. pr. min i 8 minutter i en IEC modell K-sentrifuge. Etter sentrifugering ble supernatanten fjernet og 2 ml 5056 PEG-oppløsning ble tilsatt. PEG ble satt hen i 45 sekunder og cellene ble vasket grundig med serumfritt medium. Cellene ble etterlatt bragt på plate med medium inneholdende serum inneholdende 48 timer og ble så subdyrket inn i selektivt medium inneholdende 4 pm xyl-A, 0,03 pMdCF, i nærvær av 10 pg/ml hver av: tymidin, hypoksantinin, streptomycin og penicillin. Imidlertid var det ikke nødvendig å inkludere tymidin og hypoksantin. En sammenslåing av hybrider ble oppnådd og denne eksprimerte 0,73 pg/celle/dag VWF og 0,2-2,0 enhetere/ml/dag Faktor VIII:c. Det hele ble deretter dyrket 1 fravær av tymidin og hypoksantin i nærvær av 0,5 pm MTX. Disse celler ble klonet inn i alfamedium med 4 pm xyl-A, 0,03 pm dCF, og 0,5 pm MTX for å oppnå følgende kloner: Disse resultater viser evnen til VWF- og Faktor VIII:c ko-eksprimerende cellelinjer til å fremstille høye nivåer av Faktor VIII-c i raffinerte medier.

Eksempel IX

Innføring av Faktor VIII:c-gener i celler som eksprimerer

VWF.

En Faktor VIII:c-utelatelsesmutant av 907 aminosyrer er konstruert ved heterodupleksmutagenese (PCT/US86/00774) som direkte føyer sammen 90 kDa-spaltingsete (ved rest 740= til 76 kDa-spaltingssete (ved 1647). Det resulterende plasmid p90-76R har den Faktor VIII:c-koden region 5' på den polycis-troniske transkripsjonsenhet i pMT2. Protoplaster av E. coil HB101 som huser dette plasmid hie fremstilt og føyet til VWF-eksprimeringscellelinjen PM5F som beskrevet i eksempel VIII.

48 timer etter gjenvinning fra protoplastsammenføyningen ble cellene subdyrket i DHFR-seleksjonsmedium (alfamedium som mangler nukleosider med 10% dialysert fetal kalveserum, 4pm xyl-A og 0,03 pm dCF. Etter to uker ble transf ormantene isolert og analysert med henblikk på Faktor VIII:c-eksprimering. Ca. 20% av transformanten som hadde vokst, eksprimerte både ved VWF og Faktor VIII:c. Resulater for en transformant er antydet nedenfor:

Disse resultater viser evnen til å selektere for DHFR-fenotypen i PM5F-cellelinjen og å koeksprimere Faktor VIII:c og VWF for å allevlere serumavhengighet for Faktor VIII:c eksprimering.

Patentkrav

1.

Fremgangsmåte for fremstilling av et Faktor VIII:c-type protein som omfatter dyrking av pattedyrceller istand til eksprimering av Faktor VIII:c-type protein,karakterisert vedat den omfatter å dyrke cellene i et cellekulturmedium som inneholder mindre enn ca. 10% pattedyrserum (på volumbasis) og inneholder en blannding valgt blant: a) pattedyr von Willebrand Faktor, VWF;

b) et fosfolipid eller en fosfolipidblanding; og

c) en blanding av (a) og (b).

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert

ved at blandingen er VWF og at mediet Inneholder Ikke mer enn ca. 1 volum-$ pattedyrserum. 3.

Fremgangsmåte ifølge krav 2,karakterisertved at mediet er i det vesentlig serumfritt. 4 .

Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved det som VWF benyttes VWF avledet fra pattedyrserum. 5 .

Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at det som VWF benyttes rekombinant pattedyr VWF. 6.

Fremgangsmåte ifølge krav 4,karakterisertved at det benyttes et medium som inneholder den rekombinante VWF ved at det er kondisjonert ved genetiske konstruerte celler som produserer dette VWF. 7.

Fremgangsmåte ifølge krav 6,karakterisertved at de genetisk konstruerte celler som produserer VWF koeksprimerer Faktor VIII:c. 8.

Fremgangsmåte ifølge krav 6,karakterisertved at den rekombinante VWF produseres separat fra Faktor VIII:c og tilsettes til mediet hvori de Faktor VIII:c-produserende celler dyrkes. 9.

Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at man velger fosfolipidet eller fosfolipidblandingen fra gruppen omfattende cefalin, fosfatidylserin; fosfatidylkolin, fosfatidylinositol, fosfatidyletanolamin, soyabønne-lecitin eller blandinger derav. 10.

Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at man som fosfolipid benytter soyabønnelecitin. 11.

Fremgangsmåte ifølge krav 10,karakterisertved at SL er tilstede i en mengde mellom ca. 1 og 1000 pg SL/ml medium. 12.

Fremgangsmåte ifølge krav 10,karakterisertved at SL er tilstede i en mengde mellom ca. 100 og 300 pg SL/ml medium. 13.

Fremgangsmåte ifølge krav 10,karakterisertved at man benytter et medium som inneholder mindre enn ca. 5 volum-# serum. 14 .

Fremgangsmåte ifølge krav 13,karakterisertved at mediet inneholder mer enn ca. 1 volum-# serum. 15 .

Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at fosfolipidet eller fosfolipidblandingen foreligger i form av tørrmelk i en mengde fra ca. 0,01 til ca. 10 vekt-%, beregnet på mediets volum. 16.

Fremgangsmåte ifølge krav 15,karakterisertved at mengden tørrmelk er fra ca. 1 til ca. 3 vekt-#, beregnet på mediets volum.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et Faktor VIII:c-type-protein som omfatter dyrking av pattedyrceller istand til å eksprimere Faktor VIII:c-type-protein, karakterisert ved at den omfatter å dyrke cellene i et celledyrkingsmedium som inneholder et preparat valgt hlant: a) eksogen von Willehrand Faktor (VWF); b) et fosfolipid eller en fosfolipldblanding; og c) en blanding av (a) og (b).

2 . Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som preparat benyttes eksogent VWF og at det som medium benyttes et som ikke inneholder mer enn ca. 1 volum-# pattedyrserum.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som medium benyttes et som inneholder eksogent VWF oppnådd ved dyrking deri av genetisk konstruerte pattedyrceller som koproduserer VWF og Faktor VIII:c-type-proteinet .

4 . Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som eksogent VWF benyttes rekombinant VWF som er produsert separat fra Faktor VIII:c-type-proteinet.

5 . Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som preparat benyttes eksogent VWF i en mengde fra ca. 0,1 til ca. 10 pg/ml medium.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at fosfolipidet eller fosfolipidblåndingen velges blant cefalin, fosfatidylserin, fosfatidylkolin, fosfatidylinositol, fosfatidylehanolamin, soyabønnelecitin og blandinger derav.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at det som fosfolipid anvendes soyabønnelecitin, SL, i en mengde fra ca. 1 til 1000 pg/ml medium.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at man anvender SL i en mengde fra ca. 100 til ca.

300 pg/ml medium.

9. Fremgangsmåte ifølge k rav 1, karakterisert ved at man anvender fosfolipidet eller fosfolipidblandingen i form av tørrmelk i en mengde fra ca. 0,01 til ca. 10 vekt-#, beregnet på mediets volum.

10. Genetisk konstruert pattedyrcelle eller cellelinje, karakterisert ved at den inneholder: i) DNA-kodene og istand til å eksprimere et Faktor VIII:c-type-protein, og ii) en VWF transskripsjonsenhet, slik at VWF og Faktor VIII:c-type-proteinet eksprimeres av de samme celler.