NO880010L

NO880010L - Analytisk metode for detektering og maaling av spesifikke nuklein syresekvenser.

Info

Publication number: NO880010L
Application number: NO880010A
Authority: NO
Inventors: Ranald Macdonald Sutherland; Peter Bromley; Bernard Gentile
Original assignee: Intracel Corp
Priority date: 1986-05-05
Filing date: 1988-01-04
Publication date: 1988-02-10
Also published as: NO880010D0

Description

Den foreliggende oppfinnelsen vedrører en metode for bestemmelse av nukleinsyrer som inneholder en spesiell basesekvens. Bestemmelse av slike nukleinsyrer, i DNA eller RNA som er tilstede i biologiske prøver, er meget viktige ved biomedi-sinske og genetiske studier.

Det er for tiden en klinisk nødvendighet å detektere spesifikke nukleotidsekvenser i biologiske prøver, f.eks. kropps-væsker, vevsprøver slik som chorionic villus prøver, og vattpinner. Resultatene fra slike analyser kan bli brukt til å identifisere og/eller detektere forstyrrelser som spenner fra genetiske abnormaliteter og kreftmistanker, til infektu-øse sykdommer med bakteriell, viral og sopp-opprinnelse. Slik det står nå, er ikke metodene som blir brukt for en slik nukleotid deteksjon lett å anvende i et rutinemiljø, og kan ikke bli utført uten spesialiserte ansatte og laboratorie-fasiliteter. Dette kommer av at kompleksiteten av fremgangs-måtene, nødvendigheten av farlige materialer (f.eks. radio-isotoper) og de langvarige inkubasjonstidene som er nødvend-ige for å oppnå et resultat.

Den ønskede nukleinsyresekvensen blir konvensjonelt detektert ved inkubasjon med den komplementære nukleotiden som på forhånd er merket for deteksjon etter reaksjonen. Denne komplementære sekvensen (eller probe) kan lett bli syntetisert ved hjelp av kjent teknologi innefor fagområdet.

Makten som nukleinsyreprobe-teknologien har kommer av spesifisiteten av deteksjonsprosedyren som både kommer av unikheten til nukleinsyresekvensene og muligheten for stringente hybridiseringsbetingelser som tillater diskrimina-sjon mellom perfekt og ikke perfekt sekvensparring. Det er mulig å diskriminere mellom to sekvenser som er tilstede i DNA som er forskjellige bare med hensyn på et enkelt nukleotid i sekvensen ved bruk av prober med egnede størrelser og spesifikke hybridisasjonsbetingelser. Dette tillater deteksjonen av tilstedeværelse av enkle punktmutasjoner i testsekvensen, og der hvor slike mutasjoner kan bli korrelert med sykdom, slik som spesifikke kreftformer og andre, vil disse prosedyrene være benyttbare ved diagnoser av slike sykdommer. For det andre, har utviklingen av automatiserte syntesesystemer av spesifikke oligonukleotidsekvenser lettet konstruksjonen av prober på basesekvenser som er avledet fra de omfattende og raskt voksende nukleinsyredatabaser som for tiden er tilgjengelige.

Deteksjon av spesifikke DNA-sekvenser er for eksempel en prosedyre som består av tre trinn (P. SZABO et al., Trends in Biochemical Sciences (1982), s. 425-427). Først skjer en hybridisasjonskobling mellom prøven, som vanligvis er festet til et fast substrat, og en probe-DNA. For det andre, blir den u-spesifikt bundne probe-DNA vasket bort og, for det tredje blir det spesifikt bundne DNA bestemt. Tidligere er probe-DNA blitt radioaktivt merket ved inkorporering av<32>P som et indre merke i sukker-fosfat "rygg-rad", eller ved bruk av<l25>i som et ytre merke inkorporert inn i den aromatiske strukturen til basene. På denne måten har autoradiografi eller isotop-tellingsteknikker har deteksjonssystemene oppnådd en veldig høy sensitivitet, på størrelse på et genom per celle (Hasse E.T. et al. (1982), Virology 119: 339-410). Isotopmerking for kvantitering av bindingsgrad er en velkjent teknikk innenfor immunoanalyser. Men, på grunn av risikoen som er involvert ved arbeid med radioaktive forbindelser, er det gjort store anstrengelser i løpet av de siste ti årene for å unngå bruk av isotoper i immunoanalyser og, istedet, bruke enzymer, fluorescent eller kjemiluminescent merker. På grunn av de store erfaringene som er blitt oppnådd innen immunoanalyser, er man begynt å lete etter ikke-isotope merker for nukleinsyrer. Men, på grunn av de vanskelige forhold ved hybridiseringstester, er det ikke mulig å bruke enzymmerker siden de ville blitt denaturert under de hybridi-seringsbetingelsene som brukes i dag.

Derfor, er det forsøkt flere metoder for å unngå de nåværende uønskede forholdene ved radioisotope merker og nukleinsyreprober og også de lange reaksjonstidene og spesialiserte utstyret som er nødvendig for å visualisere<32>P-merket DNA. Davidson og co-arbeidere har kovalent bundet biotin til RNA via cytokrom c eller polyaminbroer. Etter hybridasjon med prøven, blir proben bestemt ved reaksjon med avidin immobilisert på metakrylat sfærer. Dermed, med sfærene som merker, kan hybridisasjonssetene bli detektert ved elektronmikroskopi (J.E. Manning et al., Chromosoma 53 (1975), 107-117; A.Soja et al., Nucleic Asid Research 5 (1978), 385-401). Denne fremgangsmåten er med hell blitt brukt ved kromosom kart-leggingsfremgangsmåter. For å prøve å lage et system med en mere generell anvendelighet, Langer et al (Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 78 (1981), 6633-6637) syntetiserte en rekke nukleotidanaloger som inneholdt biotin kovalent bundet til pyrimidin eller purinringen. Biotin-merkede derivater av uridin trifosfat (UTP) og dUTP ble fremstilt ved bruk av komplekse serier av kjemiske reaksjoner. Disse analogene ble inkorporert inn i DNA ved in vitro reaksjon med en rekke DNA polymeraser. Det modifiserte DNA-molekylet (probe) ble deretter brukt til å binde enten avidin eller anti-biotin antistoffer. Her ble både avidin og antistoff signaldannere kolorimetrisk konstatert ved bruk av peroksidase-kromogen systemer. Selv om det er med hell blitt demonstrert, har denne fremgangsmåten flere negative sider: For det første innbefatter det teknisk vanskelige fremstillinger av relativt ustabile nukleosid-trifosfat-bioton analoger. For det andre er den enzymatiske inkorporering av slike analoger inn i DNA vanskelige å kontrollere, ueffektivt og resulterer generelt i maksimalt en til to biotionmolekyler per probe-DNA-molekyl. Affiniteten som biotionantistoffene har for biotin (opp til 10<8>til 10<10>) er også mye mindre enn affiniteten for avidin. En videre utvikling av en slik bruk av nukleotidanaloger ble demonstrert av Vincent et al., (Nucleic Acid Research (1982) 10, 6787-6796) som, konstruerte etter en lignende fremgangsmåte som Langer et al. utførte en dinitro-fenol (DNP) nukleotidanalog. Denne analogen ble med hell Inkorporert inn i DNA'et med et hensiktsmessig forhold på en til to molekyler DNP per probemolekyl. Deteksjon av proben ble utført ved reaksjon med et anti-DNP antistoff, etterfulgt av deteksjon av spesifikt bundet antistoff med reaksjon med et anti-spesies antistoff-peroksidasekonjugat. Men, det ble oppdaget at systemet ikke var tilstrekkelig sensitivt når man sammenlignet med isotope teknikker. En hovedårsak var at en del av antigen (DNP) molekylene ble bundet innenfor hybridiseringskomplekset, og på denne måten ikke var tilgjengelig for reaksjon med antistoff.

Nylig er det blitt utviklet forbedrede teknikker for detekte-ring av DNA basert på bruk av fluorescenssignaldannere og binding av probe-DNA til substrater. FR-A-2.480.943 (WANG et al.; ABBOTT Laboratories) vedlegger en ny klasse fargestoffer som fluorescerer sterkt når de kommer i kontakt med nukleid-syrer, spesielt dobbelt-trådet DNA. Uten målnukleinsyrene, finnes det ingen fluorescens i vandige løsninger og relativt lite fluorescens med enkelttrådet polynukleotider (mRNA). Målinger blir utført på løsninger ved bruk av et fluorescens-mikroskop. Konsentrasjoner på 1-100 nM DNA kan blant annet bli målt ved bruk av vandig 3-'y-dimetylaminopropyl-2-p-dimetylaminostyrylbenzotiazodium-jodid (2 mg/ml). Fluorescensen er lineært proporsjonal til mengden av DNA i prøven.

Dokumentet EP-A-57.553 (BIRNBOIM; Atomic Energy of Canada) lærer bort bruken av fluorescent farger som reagerer med dupleks DNA og gir fluorescens, mens ikke noe fluorescens fremkommer med enkelttrådet DNA. Denne teknikken gjør det mulig å måle grad av DNA-denaturering på grunn av varme, pH, kjemikalier, strålinger eller andre denatureringsbetingelser. Egnede farger er etidiumbromid; 4',6-diamino-2-fenylindol-dihydroklorid; mitramicin, Hoechst 33258 og andre. Fluorescens blir målt på hovedmengden av løsningen.

US-A-4,423,153 (D.F. RANNEY et al) vedrører en spesifikk DNA-fluorokrom fremfører dannelsen som medfører fluorescensøkning som står i direkte proporsjon til det totale dobbelt-trådete DNA som er tilstede i en prøve. Fluorescens-forsterkeren som er å foretrekke er mitramicin som binder seg spesifikt til dupleks DNA. Fluorescens blir målt i hele løsningen med et fluorimeter. Flere hensiktsmessige kommersielle fluorimeter blir spesifikt nevnt.

Dokument US-A-4,257,774 (RICHARDSON et al; Meloy lab.) fremlegger direkte binding av fluorescent interkalatorer til DNA, f.eks. ethidiumsalter, daunomycin, mepakrin og akridin orange i tillegg til 4' ,6-diamidino-2-fenylindol for å kvantitere DNA. Fluorescens polarisasjon blir brukt i tester for bestemmelse av ikke-fluorescent DNA bindere som vanligvis konkurrerer med bindingen til nevnte farger, som dermed medfører en korresponderende nedgang i fluorescens.

I tillegg er det fremlagt prober immobilisert på støtter. Dokument EP-A-131830 (DATTAGUPTA et al; Molecular Diagnostics) fremlegger merking av nukleinsyrer for deteksjon i hybridisasjon for bestemmelse av DNA som inneholder spesifikke base-par sekvenser. Hvor den merkede nukleinsyren inneholder minst en enkeltkjedet basesekvens som er vesentlig komplementær til eller homolog med sekvensen som skal bli detektert. Proben kan immobiliseres på en fast fase slik som nitrocellulose, modifisert nylon og fluorhydrokarboner i form av filtere eller ark. For merking, er enzymer eller biotion-avidinsystemer fremlagt. Likeledes fremlegger EP-A-130,523 (DATTAGUPTA et al; Molecular Diagnostics) immobilisasjon av nukleinsyreprober på faste substrater. Substrater med reaktive grupperinger slik som karboksyl, amino og hydroksy, f.eks. bommul, papir, karboksymetylcellulose, o.s.v. er egnede.

Nukleinsyrer blir bundet til substratene ved bruk av fotokjemisk reaktive nukleinsyre-bindende ligander, f.eks. interkalatorer som furokoumarin, angelicin, psoralen og aminofenantridiumhalider eller ikke-interkalatorer slik som neotropsin, distamicin, Hoechts 33258 og bis-benzlmidazol. Kobling av ligander og substrater blir utført ved bruk av brodannende forbindelser slik som CNBr, dialdehyder og di-glysidyl-etere.

Deteksjon av substrat immobiliserte fluorescent-dannere ble også undersøkt. EP-A-70687 (M.J. HELLER; AMOCO CORP.) omhandler reaktant immobilisering i DNA-hybridasjon. En immobilisert enkelt-trådet polynukleotid bli hybridisert med en lys-emitterende merket elementær polynukleotid reagens. Etter separasjon av det ikke-hybridiserte reagens fra den immobiliserte prøven, blir lyssignalet eksitert og lysrespon-sen detektert. Immobilisasjonsfasene innbefatter glassper-ler, polyakrylamid, agarose, Sephadex, cellulose osv. Lyssignalene kan være kjemiluminiscent, bioluminiscent, fosforescent eller fluorescent. For deteksjon, kan kommersielt tilgjengelige detektorer bli brukt, f.eks. fotomulti-plikatorrør.

EP-A-117.777 (THANH THUONG NGUYEN et al, CNRS) fremlegger også spesiallagede oligonukleotider som er kovalent festet til en interkalatorgruppe slik som akridin, furokoumarin og ellipticin derivater som kan bli brukt som nukleinsyresekvenser oppdagelsessystemer. Målinger basert på hele løsninger eller gelfluorescens er beskrevet.

Til tross for presentasjonene som nevnt ovenfor, var det ønskelig med videre fremskritt, spesielt med hensyn til raskere og mere sensitive tester og unngåelse av mange av de kunnskapskrevenede manipulasjonene som er assosiert med teknikkene nå for tiden.

Dette ble oppnådd ifølge metoden i denne oppfinnelsen som vesentlig benytter seg av en optisk bølgeleder som probe-immobilisasjonsfase, hvor fluorescentmarkørene som blir brukt til å merke polynukleotid probe hybridisasjonsproduktene reagerer med bølgeenergien som går i nevnte bølgeleder og gir et fluorescent signal som blir detektert og målt som et utløp av nevnte bølgeleder. Denne metoden er i store trekk summert i vedlagte krav 1. I dette kravet, skal bestemmelse dekke deteksjon, identifikasjon, kvantifikasjon, konsentrasjonsmål-inger og lignende som blir utført på en analytt.

Nukleinsyreproben blir bundet ved bruk av vanlige eller nye metoder til en optisk klar fase som virker som en lysleder, eller bølgeleder. Enkel-trådet prøve nukleinsyre reagerer med proben med tilstedeværelse av interkalert fluorescent-farge. Slike farger innskyter seg selv mellom trådene til dobbelttrådet nukleinsyre (d.v.s. de interkalerer). Etter interkaleringen er det en forøkning av farge fluorescens kvantumutbytte, en økning i fluorescens-halveringstid og et rødt-skift av fluorescens-emisjonsbølgelengden som kan bli optisk overvåket. Proben blir immobilisert på bølgeleder-overflaten enten før eller etter hybridiseringen men bare fluorescent-sentrene til dupleksen som er bundet til bølge-lederen gir fluorescentsignalet som blir brukt for bestemmel-sen .

Det er verdt å merke seg det ikke vil være mulig ved bruk av konvensjonelt transmisjonsfotometri og på samme tid se forskjell på hybridisasjon av molekyler som er festet til faseoverflaten og hybridisasjonsreaksjoner som skjer i løsningen. Derimot, ved indre reflektering av fluorescens-eksitasjonslyset innenfor bølgelederfasen, d.v.s. diskrimin-ering av den delen av det optiske signalet som fremkommer fra interaksjon av kort vektor med komplekset ved bølgelederover-flate-analytten fra andre optiske forandringer som skjer innenfor løsningen, kan hybridisasjonsreaksjonen ved bølge-lederoverflaten bli målt. Ved bruk av denne fremgangsmåten i fremstilling av denne oppfinnelsen, ble kinetiske målinger av nukleinsyrehybridisasjonsreaksjoner utført, uten nødvendig-heten av å på forhånd fremstille merkede prober, uten nødvendigheten av å la reaksjonen gå fullstendig (slik som overvåking er ved riktig tid) og uten nødvendigheten av å separere de andre stoffene fra systemet før målingen (da bare overflatereaksjonen blir avlest).

Flere detaljer vil nå bli fremlagt med referanse til vedlagte tegninger.

I denne tegningen, representerer fig. 1 skjematisk en hybridisasjonsreaksjon som skjer med polynukleotider som har komplementære basesekvenser, hvor noen (proben) er festet til overflaten av en fase. Fig. 2 representerer skjematisk en metode som er å foretrekke ved binding av proben til faseoverflaten. Fig. 3 illustrerer skjematisk forplantning av en lysstråle ved indre refleksjon i en bølgeleder med brytningsindeks ni større enn n2 i det omgivende mediet. Fig. 4 d.v.s. fig 4A, 4B, 4C og 4D illustrerer skjematisk anordninger for belysning av en bølgeleder som skal settes i kontakt med en analytt inneholdende spesies som danner et optisk signal ved interfasen med bølgelederen og for detekte-ring og samling av nevnte signal. Fig. 5 (A & B) illustrerer kurver som er representative for målingene som blir gjort med anordningene i fig. 4.

Fig. 6 representerer en annen kurve lik den i fig. 5.

Fig. 7 representerer skjematisk en hul sylindrisk fremstilling av en bølgeleder. Fig. 8 er et diagram som illustrerer forskjellige fremstillinger av metoden i denne oppfinnelsen. Fig. 1 viser skjematisk en bølgeleder 1 i kontakt med en analytt løsning 2 som inneholder enkel-trådet nukleinsyre kjeder 7 og interkalerende fargemolekyler 9. Bølgeleder 1 er dekket med oligonukleotid-prober 5 som er immobilisert på bølgelederoverflaten ved bruk av fysiske eller kjemiske linkere 6. Nukleotidbaser som er kovalent bundet til polynukleotid-ryggraden er nummerert 8. Noen av nukleinsyre-prøvekjeden 7 har en basesekvens som er homolog med probe 5 og de hybridiserer og danner baseparene 5a-7a. Dannelse av binding mellom trådene er indikert ved nummer 8a. Andre hybrider dannes også innenfor selve løsningen som vist i tegningen. Når dupleksstrukturene er blitt dannet, interkalerer fargemolekylene 9 mellom kjedene (9a) og blir fluorescent. Normalt, interkalerer et fargemolekyl for hvert femte basepar i DNA og for hvert tiende par for RNA. (J.B. LEPECQ et al., J. Mol. Biol. 27 (1967), 87-106). Eksitasjonslys 3 går gjennom bølgelederen ved flere eller enkelte indre refleksjon ved en vinkel G større enn den kritiske vinkel Øc. Dette eksitasjonslyset reagerer ved nærheten av interfasegrensen med dets korte vektorkomponent. Grad av penetrering av denne lyskomponenten (en fraksjon av en bølgelengde) blir justert til å gi den elektromagnetiske feltet med maksimum styrke som korresponderer til interaksjon med maksium effektivitet med fluorescent sentrene til det bundne komplekset; en måte å variere denne penetreringen på er ved å forandre vinkelen G som fremlagt i USP 4,608,344. Dermed er forbedrede sensitiviteter når det gjelder overflatereaksjoner i tynne filmer når 0 blir selektert fra verdier som er nær til Gc. En annen nyttig referanse innenfor dette området er N.J. HARRICK, Internal Reflection Spectroscopy, Wyley Interscience, New-York (1967). Fluorescensen som resulterer fra denne interaksjonen blir deretter igjen injisert inn i bølgelederen og kan bli samlet og avlest som et utløp derav på vanlig måte. Alternativt eller i kombinasjon, kan fluorescensen som blir emittert fra siden, f.eks. vanligvis (10a) til bølgelederoverflaten kan også bli samlet og målt i noen tilfeller, når bølgelederen består av en kuvette-vegg som holder reaktantløsningen og fluorescensen 10a blir emittert gjennom veggen mot utsiden. Et av hoved-trekkene i denne oppfinnelsen er at signalet som kommer fra fluorescens-sentrene bundet til bølgelederoverflaten kan skjelnes fra det som kommer fra hovedlengden av løsningen. Derfor kan bakgrunnseffekten av sidereaksjonene som skjer i analytt-løsningen uavhengig av proben som er bundet til bølgelederen bli effektivt deletert. Dermed, blir i denne metoden, bare dobbelt-trådet materiale som er blitt dannet ved bølgelederoverflaten (d.v.s. med probe-polynukleotid) detektert siden eksitasjonslyset bare penetrerer en brøkdel av en bølgelengde utenfor den faste/væske interfasen. Fluorescensresponsen blir emittert i alle retninger (10,10a) men har en foretrukken vinkelsannsynlighet som er i nærheten av det innfallende lysrefleksjonskritiske vinkel Øc.

En annen hovedfaktor er immobil isasjonen av probenukleinsyren på overflaten av bølgelederen enten før eller etter hybridi-sasjonen. Mye teknologi er tilgjengelig når det gjelder immobilisering av biologiske makromolekyler slik som nukleinsyre på faste faser. Disse, eller modifikasjonene derav, er like brukbare i denne oppfinnelsen. Når det gjelder en optisk klar bølgeleder blir visse begrensninger påtvunget hvor immobilisasjonsteknikken ikke bør påvirke de optiske egenskapene til overflaten ufordelaktig. To hovedteknikker for immobilisering av biologiske forbindelser til overflater er fysisk adsorpsjon og kovalent kjemisk binding. For en oversikt se WB Jakoby og M. Wilcheck, (1974). Affinitets-teknikker, Methods in Enzymology, vol. XXXIV, Academic Press, N.Y; Mosbach, K (1976). Immobiliserte enzymer, Methods in Enzymology, Vol. XLIV, Academic Press, NY; Scouten, WH

(1981). Affinitetskromatografi, Wiley Interscience, NY; Meinkoth, J og Wahl, G (1984). Anal. Biochem. 138; 267-284. Disse teknikker har både fordeler og ulemper slik de blir brukt i dag. Fysisk adsorpsjon til bølgelederoverflaten kan resultere i at en stor del av probemolekylene ikke blir tilgjengelige for reaksjon når nukleotidbasene er festet rett på bølgelederoverflaten. Likeledes, når det gjelder kovalent binding av proben stoler de nåværende metodene på en kovalent reaksjon mellom funksjonelle grupper på basene og en reaktiv gruppe som er blitt plassert på den faste fasen. Den resulterende proben vil bli festet på multiple-seter hvor mange baser ikke er tilgjengelige for hybridisasjon. Et ideelt system ville feste proben til overflaten hvor alle relevante baser er tilgjengelige for reaksjon med prøve-nukleinsyren, og hoveddelen av proben bør bli immobilisert innenfor penetrasjonsdybden til det eksiterende lyset for å gi et maksimalt signal etter reaksjon med prøvenukleinsyren.

Bølgeledere med prober festet i henhold til de ovenfor nevnte hensynene er gjort tilgjengelige i denne oppfinnelsen. Dette er illustrert i fig. 2. Her er det terminale nukleotid 12 i probe 5 blitt modifisert (f.eks. ved dets fosfatende) for å få en kovalent binding av en ende av proben til en aktiv gruppering 13 på bølgelederoverflaten 3. Denne grupperingen 13 kan være NHg i en amino-silan som, etter reaksjon med proben, fører til en fosfamidat binding. Alternativt, er en uretan-fosfamido-binding med formel -C0NH-(CH2)n-NH-P også mulig fra reaksjon av, blant annet, en isocyanato-silan og et alkylendiamin. På bølgelederoverflaten ligger molekylene 14 med en positiv ladning mot løsningen 2. Positivt ladete molekyler 14 tiltrekker de negativt ladete nukleotidfosfat-gruppene 15 i proben 5. Forholdet mellom gruppene 13 og positivt ladete setene er justert for å oppnå en optimal immobilisasjon av proben selv om basene 8 holdes frie for hybridisasjon, d.v.s. den ekvivalente mengden av 13 som er tilgjengelig vil omtrent korrespondere til molaliteten av proben mens mengden av positive sentere vil stort sett avhenge av dets gjennomsnittlige lengde (gjennomsnitts-antall av baser i segmentene). Det resulterende komplekset proberpositivt ladete molekyler kan medføre et probemolekyl som helt eller delvis er immobilisert parallelt til bølge-lederoverf laten med de relevante basene 8 tilgjengelige for reaksjon med prøvenukleinsyrene. En fremstilling av dette systemet vil bli nærmere beskrevet i den eksperimentelle delen. Den uventede fordelen med denne fremgangsmåten er at man ved konsentrering av DNA-probene på en slik overflate i en slik konfigurasjon har man funnet en rask og sensistiv deteksjonsmetode for hybridisasjonsanalyse. Det er også uventet at denne probe:overflatemolekylkomplekset når det først er blitt dannet motstår utbytting ved kjemisk eller konkurrerende binding fra andre nukleinsyremolekyler. De positivt ladete sentrene på bølgelederen kan blant annet være kvaternære aminogrupper. Slike grupper kan oppnås, for eksempel, ved å kvaternisere en dialkylamino endegruppe til et dialkyl-amino-alkyl-amin som er festet til bølgelederover-flaten ved bruk av en kvaterniserende agens, f.eks. et alkylhalid. Et eksempel er behandling av bølgelederover-flaten med trihydroksy-"Y-amino-propylsilan og kvaternisering med metylbromid.

Det er ingen spesiell begrensning når det gjelder valg av bølgeledere som kan benyttes i denne oppfinnelsen og de fleste typer som nå er kjente innenfor dette fagområdet kan benyttes, slik som klare plater, staver, optiske fibre og lignende. Mange av disse er beskrevet i flere publikasjoner som også beskriver belysningskildene som er nødvendige, fotodetektorer og optiske konfigurasjoner for håndtering av probene og utføring av testene. Fluorescens deteksjons-analyser og kvanitifisering av signalene som fremkommer i henhold til denne metoden kan også bli forsterket ved bruk av foton tellings-anordninger (foto-multiplikatorer). Differen-siering mellom fritt og interkalert farge kan bli gjort ved å kombinere teknikken i denne oppfinnelsen med andre kjente fluroescens-teknikker sliks om fluroescens polarisasjon og/eller tidsbestemt fluorescens. Andre teknikker som også er nyttige i denne sammenheng er "Fluorescence Råman Scatter-ing", Fluorescence-korrelasjons-spektroskopi, og Fluorescence fluktuasjons-spektroskopi. Signifikante referanser innenfor dette området er "Modem Fluorescence Spectroscopy (198...) Ed. WEBRY, Heydn, New-York; WO-83011230; USP-3,975,084; 3,436,159; 4,447,548; 3,999,855; 3,604,977.

Selv om denne metoden hovedsakelig baserer seg på måling av et fluorescens-signal ved et utløp av bølgelederen, d.v.s. ved en eller begge ender derav eller sidelengs dertil, er den ikke begrenset til denne interaksjonstypen. Reaksjon av nukleinsyrer på interfasen i en bølgeleder kan også bli detektert ved bruk av andre optiske fenomener slik som signalabsorpsjon, spredning og lignende, spesielt siden nukleotidbasene har sterk optisk absorpsjon ved noen spesifikke frekvenser. Derfor er også eksitasjon ved stråling i UV, synlig og IR områder mulig.

Selv om det ovenfor er blitt nevnt standard bølgeledere slik som prismer, plater, fibre laget av glass, kvarts eller hensiktsmessig plastikk, foreligger muligheten, i denne oppfinnelsen, av å forsterke de optiske interaksjonene ved interfasen ved bruk av flere teknikker som inkluderer bruk av veldig tynne bølgeledere kalt optiske hulrom som er veldig tynne (en eller flere) ikke-ledende lag (på 1-10 mikron) lagt på et annet ikke-ledende materiale (se de referanse som er nevnt før av Harrick, s. 147-177 og J. DELAY et al, eur. J. Biochem 12 (1970), 133; V.A.R. HUSS et al., System Appl. Microbiology 4 (1983), 184-192). Hule bølgeledere, d.v.s. bølgeledere i kapillær og sylinderform hvor analytten blir sirkulert er også mulig.

En annen potensiell metode for forsterkning av signalet fra en slik interfase er å tilsette et tynt metall-lag (på 500-600 ÅngstrOm) mellom den immobiliserte nukleinsyren og bølgelederen. Denne teknikken, kan med hensiktsmessig valg av optiske betingelser (f.eks. metalltype, tykkelse på lag, vinkel på innfallende lys, polarisasjon av innfallende lysstråler, bølgelengde på innfallende lysstråler) generere et elektromagnetisk felt i det optisk sjeldnere mediet, d.v.s. prøven, som er helt opp til åtti ganger sterkere enn uten metallfilmen, (for referanser, se H. Raether, (1977). Surface Plasmon Osclllations and Their Applications in Physics of Thin Films, Advances in Reasearch and Development, Eds, G. Haas, og MH Francombe, Academic Press, NY. pp. 145-261; H. Raether (1980). Excitation of Plasmons and Interband Transition by Electrons. Springer-Verlag, FRG; B. Liedberg, C. Nylander og I. Lundstrom, (1983). Sens. Actuators 4,299-304). Teknikken overflate-plasmon-resonans, kan bli brukt som en sensitiv detektor av en forandring i tykkelse og laget ved interfasen. Det kan også være en metode for forsterking av fluorescens-intensiteten ved overflaten på grunn av den forhøyede intensiteten i eksitasjonslys-magnetiske felt. Selv om de ovenfor nevnte publikasjonene beskriver i detalj prinsippene ved indre refleksjonsspektroskopiske teknikker, vil en kort beskrivelse bli gitt som følger med referanse til fig. 3, og få en klarhet og kontinuitet i denne oppfinnelsen.

Når en lysstråle 21 bestråler interfasen 22 mellom to klare medier (n^>n2som vist i fig. 3A, fra mediet med høyere brytningsindeks n^23, skjer en total indre refleksjon når refleksjonsvinkelen 0 er større enn den kritiske vinkelen Øc, verdien gitt ved:

I dette tilfellet penetrerer den korte bølgen en avstand (dp) på størrelse med en brøkdel av en bølgelengde, bak reflekter-ingsoverflaten og inn i det fortynnede mediet 26. I henhold til Maxwells ligning, etableres en strålende sinusformet bølge, vinkelrett i forhold til den reflekterende overflaten, i det tettere mediet (Fig. 3B). Selv om det ikke er noen netto energistrøm inn i en ikke-absorberende, fortynnet medium, er det et kort felt i dette mediet. På grunn av kontinuitetsbetingelser til feltvektorene er den elektriske feltamplituden (E) størst ved overflateinterfasen (EG) og avtar eksponentielt med avstanden (Z) fra overflaten i henhold til:

Penetrasjonsdybden (dp), definert ved avstanden som er nødvendig for at den elektriske feltampl1tuden faller til exp (-1) av dets verdi ved overflaten, er gitt ved:

Denne størrelsen minker med økende 0 og øker med nærmere indeksberegning (d.v.s. når ng/n^->> 1). Også, fordi, dp er proporsjonal med bølgelengden, er den større ved lengre bølgelengder.

Altså, ved et hensiktsmessig valg av brytningsindeksen n^til det indre refleksjonselementet, til innfallende vinkel, og av bølgelengde, kan man selektere en dp for å fremme optisk interaksjon hovedsakelig med forbindelser som er nære til eller festet til interfasen og minimalt med hovedmengden av løsningen.

Penetrasjonsdybden er en av fire faktorer som bestemmer dempingen som blir dannet av absorberende filmer i indre refleksjon.

De andre faktorene er polarisasjonsavhengig elektrisk felt intensiteten ved den reflekterende interfasen, prøveområdet som øker med økende 0 og tilpassing av brytningsindeksen til det tettere mediet til det fortynnede mediet som igjen kontrollerer styrken på den optiske koblingen. Den hensiktsmessige kvantiteten som tar hensyn til alle disse faktorene er den effektive tykkelsen, de. Den representerer den aktuelle tykkelse på filmen som ville være nødvendig for å oppnå den samme absorpsjonen i et transmisjonseksperiment. For å øke sensitiviteten, blir ofte multiple refleksjons-elementer brukt. Antall refleksjoner (N) er en funksjon av lengden (L), tykkelse (T) av bølgelederen og innfallsvinkel (9).

Desto lengre og tynnere bølgelederen er, desto større er N og desto oftere reagerer den korte bølgen med overflatelaget av antistoff-antigen kompleksene. For en refleksjon er reflek-tiviteten (R): hvor a er absorpsjonskoeff isienten og de er den effektive tykkelse på et svakt absorberende lag, etter N refleksjoner er refleksjonstapet:

d.v.s. det blir øket med en faktor N.

Den korte bølgen kan med fordel bli brukt i denne oppfinnelsen til å overvåke overflatereaksjoner ved bruk av en mengde optiske teknikker, hvor en er beskrevet i detalj nedenfor med referanse til figurene 4A, B og C for illustrasjon, selv om dette ikke er begrensende.

Apparatet som blir brukt er skjematisk representert på fig. 4C som viser som et blokkdiagram hovedkomponentene; disse komponentene Innbefatter en monokromator 39, en lyskilde 36, en strømcelle 37 med bølgeleder 38, et filter 52 og elektro-nikk med data-tilegnelse og prosesserende mikrocomputer Inkludert et fotomultiplikator detektor 40, en for-forsterker 41, en mikroprosessor lyskilde kontrollsystem 42, en mikro-computer 43, en printer 44, og en "memory" (f.eks. floppy dise) 45.

Å samle fluorescensen ved en bølgeleder/væske interfase kan forskjellige signaloppsamlingsteknikker bli benyttet (fig. 4A og 4B). Fluorescens som blir emittert ved en interfase kan bli detektert enten konvensjonelt hvor detektoren 54 er plassert i rett vinkel i forhold til interfasen (fig. 4A), og/eller, som detektor 40, i linje med den primære lysstrålen (fig. 4B). Når man ser på den veldig lille faste emisjons-vinkelen i i-linje deteksjon sammenlignet med emisjons-vinkelen i rett-vinkel geometri deteksjon, ser det ut som om den første ikke ville være særlig effektiv. Men, det er en forsterker effekt, og teorien antar at det for en fusert silika bølgeleder med vann som n2medium, så vil i-linje fluorescens-intensiteten være 50 ganger høyere enn fluorescensen emittert ved rett-vinkler med hensyn til bølgeled-eren. Denne effekten, at fluorescensen blir ført tilbake inn i bølgelederen er verifisert både teoretisk og eksperimentelt (f.eks. C.K. Carniglia et al., I. Opt. Soc. Amer. 62 (1972); 479-485 ).

I første steget, danner en tilfallende plan bølge en kort bølge som eksiterer molekylet nær overflaten med en lokal distribusjon proporsjonalt til elektrisk felt intensiteten (se ligning 2). Etter en karakteristisk eksitert-fase livslengde, emitterer disse molekylene fluorescent utstråling med en lokal distribusjon i nærheten av overflaten som er veldig lik den eksiterende intensitetsdistribusjonen beskrevet ved ligning 2 d.v.s. til en kort bølge, men ved fluorescent bølgelengden. Spørsmålet om hva hender til den fluorescerende korte bølgen kan bli besvart ved bruk av optisk resiprokisitet-prinsippet, som sier at dette lyset blir koblet tilbake til bølgelederen som en plan bølge på samme måte som den primære prosessen når en plan bølge generer en kort bølge. Teorien viser at fluorescens-intensiteten emitterer topper ved den kritiske vinkelen ved total indre refleksjon slik at den kan bli reflektert i det indre. For å øke sensitiviteten, kan de indre reflekterte elementene bli strukturert til å samle fluorescens-lys fra flere refleksjoner og lede det til detektoren.

Dette er spesielt fordelaktig når et optisk fiber blir brukt som et indre refleksjonselement, da fluorescens-lys emittert ved rett-vinkler fra et elongert fiber ikke med letthet kan bli samlet opp i en detektor. I-linje deteksjon unngår måling av fluorescens gjennom hovedmengden av prøveløsningen som omgir fibre, som ellers kan gi en signifikant interferens, avhengig av fluorescens-farge som blir brukt.

Lyskilde 36 i denne fremstillingen var en Xenon blitz-lampe (E.G. & G. Salem, MA, USA) og monokromatoren ble utstyrt med et konkavt halografisk nettverk (JOBIN-YVON, Paris) tillater en resolusjon på 5 nm. Bruk av blitz-lampen ble kontrollert ved mikro-computer 42. For å Injisere prøvene gjennom et innløp 48 til celle 37 ble en programmerbar automatisk pipette (Microlab-P; Hamilton Bonaduz AG, Bonaduz, Sveits) helst brukt. Den optiske komponenten innbefattet videre to speil Mi og M2og to prismer 46 og 47. Et fotomultiplikator-rør til detektor 40 (R928; Hamamatsu, Tokyo, Japan) plassert ved utløpet til bølgelederen overvåker direkte forandringen i lysintensiteten. Alternativt eller simultant, ga en detektor 54 med filter 53 et signal fra rett-vinkel fluorescens-emlsjon (se fig. 4A). Signalene fra fotomultiplikatorrørene ble amplifisert (41), integrert i løpet av blitz-tiden (42) og overført av en standard 12-bit analog/digital overfører (ikke vist) til et digitalt format. Det I-hus utviklede mikrocomputer 42 utførte faste signal gjennomsnittsutregnin-ger, og alle data ble justert for variasjoner i blitz-lampe intensiteten ved referanse til en fotodiode 49 plassert i monokromatoren. Signalene ble transmittert til en mikro-computer 43, fortrinnsvis en APPLE II modell, for fremvisning og lagring.

Den analytiske cellen eller kuvetten illustrert i figur 4C er basert på et mikroskop objektglass bølgeledersystem. Det illustrerte systemet viser strømcelle 37 hvor bunnen faktisk er mikroskop objektglasset 38. Fasthet blir forsikret med en tetningsanordning 50; objektglassene 38 ble plassert i direkte optisk kontakt ved bruk av indekstilpassende olje med to kvart-runde silikaprismer 46 og 47, helst fra Heraeus. Indekstilpassende olje, gjorde spesielt polerte, optisk flate bølgelederflater unødvendige. Prismene ble lagret slik at de tillot en lett justering av innfallende lysvinkelen 0 (se figur 3A) og å forhindre lyskontakt med den lukkende tet-ningsanordningen 50.

Strømcellene, laget fra aluminiumlegering, ivaretok kriteriet og tillater rask, boble-fri laminært flyt langs lysveien. Designet forsikret også rask og nøye demontering og tilbake-stilling. Vi valgte en aluminiumlegering, selv om andre metaller også er egnede, f.eks. messing, på grunn av dets gode termiske konduktivitet, mangel på reaktivitet med saltholdig løsning, og lav optisk reflektivitet etter å ha blitt anodizert matt svart for å forhindre lett-lyseffekter. Tetningsanordning 50 var 0.5 mm tykk medisinsk type sillkon-gumml og vanntett ved et konstant tetningstrykk på 2 kg/cm<2>. Inkludert Innførsel 58 og utførsel 51 kanalene var det totale cellevolumet 1.8 ml, volumet rett ovenfor bølgelederen var 0.66 ml(53 x 25 x 0.5 ) og volumet ovenfor lysveien var 0.29 ml (36 x 16 x 0,5). Det foran beskrevne apparatet blir brukt som følger: I første steget, blir bølgelederplate 38 dekket med probe DNA ved bruk av teknikken beskrevet i henhold til fig. 2 og beskrevet i detalj heretter, og deretter blir den tildekkede bølgelederen som danner bunnen av den analytiske kuvetten 37 installert og etter påsetting av de strømførende og detekter-ende elementer, blir en analytt-løsning (inneholdende nukleinsyrefragmenter og en farge) tilsatt til cellen hvorpå hybridisasjon mellom komplementære polynukleotidtråder skjer. Fargemolekylene interkaleres mellom de duplekse trådene og danner fluorescens ved eksitasjon. Fluorescens dannet ved bølgelederinterfasen blir derfor emittert ved utløpet til bølgelederen og samlet av detektorene 40 eller emittert i rett vinkel til bølgelederen og samlet av detektor 54 etter utfiltrering av gjenværende eksitasjonskomponent med filter 52 eller 53, respektivt. Det korresponderende signalet i detektor 40 blir deretter prosessert av de gjenværende komponenter 41 - 45 i apparatet for å danne de ønskede resultatene. Grad av økende fluorescens er et mål på hybridisasjonsgraden og avhenger derfor av konsentrasjonen i prøven av DNA som er komplementært til proben og dets affinitet dertil. Fast tid og endepunkt målinger kan også bli utført for å fremskaffe lignende eller relaterte resultater. Standardtester kan bli kjørt for å kalibrere utstyret med kjente prøver bestående av komplementært DNA og deretter brukt til bestemmelse av ukjente prøver. Dette utstyret kan også bli brukt I tilfeller hvor proben festes til bølgelede-ren etter hybridisering med polynukleotider som skal bestemmes, den eneste hovedforskjellen er at reaktantene får reagere før blandingen blir introdusert inn i cellen.

Fig. 4D illustrerer et alternativt apparat for å detektere og overvåke fluorescentlyset som blir ført tilbake gjennom bølgelederen og eksiterer derifra på innførselssiden. Arbeidskomponentene i denne fremstillingen er nesten de samme som i den første fremstillingen og innbefatter en kilde 57, et filter 58, en bølgelengde 59, en referansedetektor 61, et fluorescensemisjonsfilter 62 og en signaldetektor 63. Den Innbefatter i tillegg en strålebunnsplitter 60 som reflekterer den innfallende bølgelengden fra kilden mot bølgelederen.

Her, blir eksitasjonslys som er dannet av kilde 57 og filtrert gjennom filter 58 reflektert og lys-innførselstiden 64 til bølgeleder 57 via den optiske strålebunnsplitter 60. Fluorescenslys dannet ved interfasen til bølgelederen og analyttløsningen (ikke vist) blir ført tilbake til bølgelede-ren og eksiterer fra side 64. Ved riktig valg av optisk utførelse av strålebunnsplitter 60, blir en stor del av dette fluorescentsignalet sendt direkte gjennom strålebunnsplitte-ren for å bli detektert etter filtrering (62) av detektor 63.

En fordel med dette oppsettet i forhold til det som er illustrert i fig. 4C er at det eksiterte lyset er ikke direkte innfallende på prøvedetektor 63, slik at bakgrunns-signalnivåer blir mindre. En hensiktsmessig strålebunnsplitter kan være en enkelt kvartsobjektglass eller et mere kompleks dikroisk laminat. Det sistnevnte er å foretrekke da det selektivt reflekterer eksitasjonslyset inn i bølgeleder 59 og transmitterer fluorescentlyset til signaldetektor 63.

I en variant av fremstillingen i fig. 4D, kan planbølgeleder 59 bli erstattet av en hul bølgeleder 70 (se fig. 7) hvor væsken som skal bli testet blir sirkulert ved innførsel 71 og utførsel type 72. Denne hule bølgeleder med belegg 70a kan bestå av et kapillært rør hvor det indre området kan være veldig stort relativt til dets interne volum hvor arrangemen-tet gir en høy tetthet når det gjelder interaksjonsseter mellom det korte bølgesignal og flurorescens-sentrene til det hybridiserte materialet representert konvensjonelt ved dekking 73. Posisjonene til innløp 71 og utløpkanalene 72 er valgfrie. Inn i fig. 7 er endene til røret, som virker som en testkuvette, sperret av pluggene 74 og 75; en hvilken som helst annen måte å holde væsken i røret og forhindre det fra å lekke ved endene kan benyttes.

Betjening av denne bølgeledervarlanten er omtrent den samme som den som er illustrert 1 fig. 4D. Innførselslyset vist ved pilene 76, propageres gjennom veggene 70 til bølgelederen og den korte bølgekomponenten reagerer med materiale 73 og danner et fluorescentslgnal skjematisert ved de prikkede pilene 77. Denne fluorescensen blir plukket opp av en detektor lik detektor 63 1 fig. 4D. Når det gjelder det gjenværende, er oppsettet og betjeningen nøyaktig lik fremstillingen i fig. 4D.

Fordelene ved tubeformet bølgeleder er at den tillater sirkulasjon av et relativt stort løsningsvolum (som er holdt i et reservoir, og ikke representert på tegningen) eller resirkulasjon av den samme prøven for å forsikre maksimalt opptak av alle analyttmolekyler ved proben som er dekket på innsiden av rørveggen.

Derfor, selv i de tilfeller hvor nukleinsyren som skal bli detektert ved hybridisasjon er veldig fortynnet, vil den progressivt festes til proben når sirkulasjonen fortsetter og sensitiviteten vil være sterkt forøket.

Fargestoffene brukt som interkalatorer er blitt karakteri-serte og undersøkte og deres bruk i måling av dobbelt-trådet nukleinsyrer er kjent innenfor dette fagområdet. Lister med hensiktsmessige fargestoffer er gitt i EPA 84107624.3 og FR-A-8107928. Av spesiell interesse I denne søknaden er fenantridin-fargestoffer (f.eks. etidiumbromid og etidium-bromidhomodimerer) og akridin fargestoffer. En oversikt over noen av de viktigste optiske og strukturelle egenskapene er gitt i RH Sarma, (1980), Nukleinsyregeometri og dynamikk, Pergamon Press, London. Andre nøkkelreferanser er J-B LePecq og C. Paoletti, (1967). J. Mol. Biol. 27,87-106; J-B LePecq, M. LeBret, J. Barket, og B. Roques, (1975). Proe. Nati. Acad. Sei. (USA). 72, 2915-2919; J. Olmsted og DR Kearns,

(1977). Biochem. 16, 3647-3654., M. LeBret og 0. Chalvet

(1977). J. Mol. Struct. 37, 299-319.; AR. Morgan, DH. Evans, JS Lee og D. Pulleybank, (1979). Nucleic Acids Res. 7, 571-594.; J. Markovits, B-P Roques og J-B LePecq, (1979). Anal. Biochem. 94, 259-264. De viktigste faktorene vedrørende disse fargestoffene er forandring i de spektrale egenskaper etter at fargestoffet har interkalert seg mellom dobbelt-trådete nukleinsyrer. Etter interkaleringen, er det en forøkning i fluorescens-levetiden, fluorescens kvantumutbyt-tet blir øket og det skjer et skift til rødt i fluorescens-emisjonsbølgelengden. Ved et hensiktsmessig valg av optisk system, kan fluorescensen fra Interkalerte fargestoffer lett bli differensiert fra ikke-interkalerte fargestoffer, f.eks. ved valg av hensiktsmessig emisjonsfilter. Fluorescenssignalet er direkte proporsjonalt til konsentrasjonen av dobbelt-trådet nukleinsyre (hvor fargestoffet er i overskudd med hensyn på konsentrasjon). Dette er hovedpunktene i U.S. patentnummer 4,423,153, en metode for deteksjon av totalt cellulært DNA.

Slike fargestoffer har vist seg å reagere med dobbelt-trådet DNA fra mange spesles (f.eks. kalvtymus-DNA, musfag T4, E. coli, P. vulgarls, M. lysodelkticus, human DNA, forskjellige RNA'er, og homopolynukleotider slik som polydArpolydT, polydCrpolydG (fra ovenfornevnte referanser)) og er derfor universalt nyttbar.

Interaksjonen av visse fargestoffer (f.eks. Acridine orange) med dobbelt-trådet nukleinsyre kan bli inhibert av andre interkalatorer (f.eks. Actinomycin D). Dette er grunnlaget i et testsystem for deteksjon av forbindelser som reagerer med nukleinsyrer beskrevet i U.S. patentnummer 4,257,774.

Siden nukleinsyrer må være i en dobbelt-trådet form for at lnterkalasjon skal skje, kan brekking av denne dobbelt-tråden, slik det skjer ved lave strålingsdoser eller visse kjemikalier, resultere i et lavere fluorescensslgnal 1 forhold til kontrollprøver som ikke er blitt utsatt for skadelige stoffer. Dette er hovedpunktene i EPA 82300376.01 som er en metode for deteksjon av skadet DNA.

Ingen av disse metodene kan bli brukt til deteksjon av spesifikke nukleotidsekvenser 1 en blanding som består av mange nuklelnsyremolekyler. Dette er hovedformålet i denne oppfinnelsen.

Bruk av fotokjemisk aktiverte interkalerende forbindelser for syntese av merkede prober er blitt beskrevet i EPA 84107624.3. Her er den fotokjemiske aktive interkalatoren bundet til nukleotidet og enten blir fargefluorescensen brukt til å detektere proben etter hybridisasjon eller så blir interkalatoren brukt som en "bro" for å binde andre stoffer som skal bli detektert som merker f.eks. enzymer, avidin-biotin, antistoffer. Denne fremgangsmåten er rettet mot konvensjonelle hybridisasjonsanalysesystemer og er ikke relatert til bølgeledere, ikke-separasjon/ikke-vasking/kinetiske hybridasjonsanalyser og de før nevnte teknikkene krever en på forhånd merking av probene før reaksjonen, og ikke en in situ merking som i denne metoden.

Det bør nevnes at det er mulig å danne dobbelt-trådet DNA ved en interfase slik som det er fremlagt her, og deretter merke dobbelt-trådet DNA med en interkalator som vil kryss-binde trådene. Dette tillater det immobiliserte materialet å arbeide uten tap av spesifikk signal med en videre øking i sensitivitet på grunn av minimale bakgrunnssignaler. Det kan være nødvendig når det er nødvendig med veldig høy sensitivitet. Man kan også forestille en reaksjonssekvens hvor mere enn en probe blir brukt. For eksempel en type sandwich-hybridisasjonsanalyse (M. EADOKI et al., Gene 21 (1983), 77-85) hvor prøve DNA reagerer med den immobiliserte proben og en andre (eller mere) fluorescensmerket probe(r) i løsning. Det resulterende komplekset kan bli målt ved interfasen ved bruk av teknikker i denne oppfinnelsen. Fordelene med et slikt system er at det tillater bruk av "generisk" fast-fase probe som passer med et antall selekterte anvendelser mens den spesifikke proben kan bli satt til løsning, og dermed prekludere nødvendigheten av å fremstille en rekke fast-fase probe-bølgeledere.

Denne oppfinnelsen er forskjellig sammenlignet med tidligere typer og har en rekke unike egenskaper som gjør den veldig brukbar for utføring av analyser av klinisk diagnostisk art, og som ikke eksisterer i andre nåværende systemer. Disse egenskapene består spesielt av: rask deteksjon av definerte nukleinsyresekvenser i det kinetiske målsystemet; den tekniske lettheten ved bruk av et kit/instrumentelt system som denne oppfinnelsen er basert på på grunn av at det ikke er nødvendig å pre-merke reagenser; ikke nødvendig å vaske den faste fasen og in situ deteksjon av den hybridiserte proben; sensitiviteten som skyldes forsterket fluorescens av det interkalerte fargestoffet og på grunn av bruk av indre refleksjonsdeteksjonsteknikker; spesifisiteten som skyldes nukleinsyreproben og bruk av indre refleksjon for bare å detektere den tynne overflateflimen og ingen andre utenfor-liggende stoffer.

For på-stedet-bruk (f.eks. kliniske laboratorier, landbruks-messige testlaboratorier, mat-teknologi, råmaterial kvali-tetskontroll, o.s.v.) foreligger det et kit-system i denne oppfinnelsen. Slik kit inneholder følgende komponenter: en prøveanordning (sprøyte, vattpinne, osv.); en prøve fremstil-lingsanordning for deproteiniserte løsninger bestående av enkelttrådet nukleinsyre; kit'et inneholder også et nuklein-syrehybridisasjonssystem i henhold til metoden i denne oppfinnelsen. Avhengig av hvilken fremstilling som benyttes, består systemet av en enkel anordning med lav produksjons-kapasitet eller en stor multi-analytt, et analytisk utstyr til multiprøver, manuelle eller automatiske. I begge tilfeller er bølgelederen en del av en billig disponibel kuvette (f.eks. støpt plastikk) blir probenukleinsyre festet på deler av innsiden av overflaten. Alle reaksjoner foregår innenfor kuvetten og de optiske målingene involverer de tildekkede delene av kuvetten. Når det gjelder mer sofisti-kert fremstilling, er det hensiktsmessig å feste probene til en anordning som kan benyttes på nytt hvor den analytiske enheten er av strøm-celle type (se fig. 4C) med bølgelederen som en intregrert del. Når det gjelder DNA blir en serie løsninger sendt gjennom cellen for måling av base-linje signal, spesifikk bindingssignal etter injeksjon av prøven og fargestoff, deretter bryting av dobbelt-trådet DNA og ved ekvilibrering av systemet som da er klar for å motta den neste prøven. Bryting av dupleks DNA kan oppnåes ved bruk av vanlige kjemiske eller fysiske metoder. Den enkleste måten å denaturere dupleks DNA på er å varme prøven ved en temperatur som avhenger av den relative base-par-konsentrasjonen, lengden av det hybridiserte molekylet og "goodness-of-fit" til de to sammensmeltede kjedene. Det eksisterer en gjennom-snittlig denatureringstemperatur (Tm) hvorpå de to trådene separeres. Tm-verdien kan bli brukt til å separere tråder når man er klar for den andre prøven, men en temperatur-kontrollanordning som inkorporerer egenskapene i denne oppfinnelsen har en rekke fordeler.

Relasjonen mellom base-par-sekvens og Tm blir definert med følgende ligning:

hvor G og C er de ekvivalente ^-konsentrasjonene til guanin og cytosin, respektivt og X er en ione-styrken på bufferen. Denne formelen må kanskje modifiseres ved tilstedeværelse av visse polymerer, f.eks. polyetylenglykol, på grunn av eksklusjonsegenskaper til slike polymerer (se M. GILLIS et al, European Journal of Biochemistry 12 (1970), 143-153). Som en generell regel, skjer maksimum effektivitet av nukleinsyre-rehybrldisasjon ved reaksjonsbetingelser ved moderat forhøyede temperaturer (> 30°C) og maksimumshastig-heten til reaksjonen mellom komplementære tråder skjer ved en temperatur på omtrent 25 °C under Tm (J. MARMUR eta 1., J. Molec, Biology 3 (1961), 585-600). Måten man oppnår denne fremgangsmåten som innbefatter temperaturkontrollert hybridisasjon og denaturering kan lett bli optimalisert til å virke ved maksimal bindingseffektivitet ved å velge hensiktsmessige temperaturer i henhold til ovenfornevnte relasjon.

En annen hensikt med temperaturkontroll er relatert til "goodness-of-fit" mellom to nukleinsyretråder. Ved å bruke en temperatur-gradient gjennom cellen, kan en nøyaktig måling av Tm bli utført når man utsetter det hybridiserte molekylet for ikke-sammensmelting og kinetisk overvåking. Tm forandrer seg når "goodness-of-fit" blir mindre, d.v.s. når de passer dårligere sammen (R.B. WALLACE et al., Nucleic Acid Res. 6

(1979), 3543-3557). Innretningen som inkorporerer teknikken i denne oppfinnelsen medfører til en nøyaktig måling av Tm, sammenligning av det observerte Tm i en prøve DNA med en ventet Tm og dermed bestemme "goodness-of-fit" til DNA-trådene som er av interesse. Dette er veldig viktig ved deteksjon av partiell base-par homolog! som kan eksistere beslektede mikroorganismer, eller ved deteksjon av enkel-punkt mutasjoner som er relatert til visse arvelige sykdommer. Andre teknikker som involverer "goodness-of-fit" som denne oppfinnelsen er relatert til omfatter blant annet følgende: Ionestyrkevariasjoner (B.J. McArthy et al., Biochemical Journal 2 (1968), 37-48). Formamidkonsentrasjon (B.C. Mc CONAUGHY et al., Biochemistry 8 (1969), 3289-3295). Andre kaotropiske agens slik som natriumperiodat (K. HAMA-GUCHI et al., J.A.C.S. 84 (1962), 1329-1338); natriumper-klorat, natriumtiocyanat og kaliumjodid (D.R. ROBINSON et al., J. Biological Chem. 241 (1966), 4030-4042), dekstransulfat (G.M. WAHL et al., Proe. of the Nat. Acad. Sc. USA 76

(1979), 3683-3687. Nylig er det blitt demonstrert en signifikant hybridisasjonsrate-økning ved bruk av noe polyetylenglykol I reaksjonsbufferen (R.M. AMASINO et al, Annals Biochem. 152 (1976), 304-307). De optimale betingelsene for hybridisasjonsbuffere vil også ta hensyn til det som er nevnt ovenfor.

I reaksjonene som immobiliserer nukleinsyre (enkel-trådet prober eller dupleks strukturer) på bølgelederoverflater (glass eller plastikk) er det tre hovedmåter som er mulige: a) immobilisering av proben, d.v.s. kjente polynukleotidsekvenser, på bølgeleder og deretter la proben på bølgelederen

reagere med en analytt av DNA som skal bestemmes.

b) immobilisering av hybridisasjonsproduktet med spesiell bindingssekvens på proben og c) immobilisering av DNA-blandingen som skal bli analysert på bølgelederen og la DNA reagere med en løsning som inneholder kjent probe-DNA. Teknikkene (a) og (b) er spesielt viktige i denne oppfinnelsen .

For å oppnå immobilisasjon av DNA på et substrat, kan substratet være nukleofilt, d.v.s. substratet vil deretter binde elektrofile nukleinsyresentere (elektron-manglende seter, f.eks. C=0 til aktivert karboksylestere, eller fosfatestere). Substratet kan også være elektrofilt (blant annet positivt ladet) og tiltrekker da nukleofile nukleinsyrer (f.eks. fosfat). Dette er alternativet som er illustrert i fig. 2 hvor dupleks DNA ligger flatt på substrat-overflaten etter farge-interkalering, selv om proben bare er immobilisert kovalent ved et punkt (3' eller 5' ende). Forankring ved bare et enkelt punkt øker reaktiv!teten siden kjeden har mulighet til å tvinne fritt og tvinnes opp i løsning. Orientering av fluorescenskomplekset parallelt til bølgelederinterfasen øker interaksjonen av fluorescens-sentrene med den korte bølgekomponenten og øker testsensi-tiviteten.

Festing av proben på bare en ende krever utvikling av spesiell kjemi.

Noen teknikker er blitt rapportert for binding av ikke-modifisert DNA på cellulose eller agarose. De følgende referanser er indikative: M.S. Poonian et al.; Biochemistry 10 (1971) 424-27; P.T. Gilham Adv. Exp. Biol. Med. 42 (1974), 172-185; P. Venetianer et al.; P.N.A.S. USA 71 (1974) 3892-3895; D.J. Arndt-Jovin et al., Eur. J. Bioch. 54 (1975 ), 411-418; T.Y. Shih et al., Biochemistry 13 (1974), 3411-18; B.E. Noyes et al., Cell 5

(1975), 301-310; M.L. Goldberg et al., Methods in Enzymol. 68

(1979), 206-220; L.G. Moss et al., J. Biol.Chem. 256, (1981), 12655-58. Dårlig utbytte er blitt rapportert når det gjelder faste faser som bærer enten nukleofile eller elektrofile grupper. Gode resultater er blitt beskrevet ved bruk av sterke basiske betingelser med en elektrofil fast fase (se MOSS ovenfor). Men flere betingelser kan ikke bli brukt med labile linkere på plater. Modifikasjon av DNA/RNA eller i det minste aktivering av nukleinsyrer var også nødvendig for å oppnå gode resultater ved milde betingelser.

Bølgelederoverflåtene ble blant annet silanerte med trihydr-oksy eller trialkoksysilaner med reaktive grupper så som amino, SH, NCS, NCO, epoksy, azid, CHO, hal id, karboksy, ester og lignende. Silane forbindelser som bærer 3-aminopropyl, 3-tiohydroksyalkyl, glysidoksypropyl kan bli brukt ved silanering; kobling av amin med en aryl eller alkyl-diisotiocyanat danner deretter NCS-terminerte deler. Polylysin kan deretter bli bundet den frie NCS for å øke antallet av nukleofile aminogrupper på bølgelederoverflaten.

Probe DNA ble syntetisert ved vanlige teknikker, blant annet metoder som egner seg for dannelse av oligonukleotider. Se blant annet S.L. Beaucage et al., Tetrahedron Letters 22

(1981), 1859-1862; M.H. Caruthers, Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments, Ed. H.G. Gasser & A. Lang (Verlag Chemie, Weinheim, FRG) (1981) pp. 71-79.

I en utførelse, ble en oligo-(dC)-3'-metylglukosid med omtrent 25 nukleotider Immobilisert, etter oksydering med periodat, på en glassplate som var silanert med en aminopropylsilan i en cyanoborohydridløsning.

Ifølge en annen fremstilling, kan polyrIbonukleotider også bli immobilisert ved bruk av samme prosedyre. Polydeoksy-ribonukleotlder kan bli modifisert enzymatisk på (3')-enden ved tilsetting av en ribonukleotid ved bruk terminal deoksy-nukleotidyl-transferase og ribonukleosid trifosfater (se R. ROYCHOUDHURY et al., Metoder i enzymologi 65 (1980), 43-62). Deretter, som nevnt ovenfor, fører periodatoksydasjon og reduktiv kondensasjon til effektiv immobilisering av DNA på en silanert bølgelederoverflate.

Syntese av oligonukleotider med en amingruppe ved 3'-enden ble også utført. Dermed, ble oligo (dC)-3')-metylglukosid (25-mer) oksydert med periodat som beskrevet tidligere renset kromatografisk og boblet med en 1,6-diaminoheksan i tricinbuffer. Deretter ble produktet redusert med cyanoborohydrid, renset ved H.P.L.C. og immobilisert på en isotiocyanat podet bølgelederglassplate.

Modifisering av nukleinsyrer ved 5'-terminalenden ble oppnådd ved bruk av teknikker som innbefatter aktivering med imidazol eller analoger ved svakt syrebetingelser. Denne teknikken ble benyttet analogt med fremstillingen til B.C.F. CHU et al., Nukleinsyre res. II (1983), 6513-29; P.N.A.S. USA 1982, 963-967. Det ble med hell utført med både Immobiliserte korte syntetiske DNA-kjeder og lange restriksjonsfragmenter.

Oligonukleotider, f.eks. dC (30) fremstilt ved bruk av fast-fase metoden på en kontrollert poreglassbaerer ble fosforylert med ATP og T4 polynukleotidkinase, hvor reaksjonen ble fulgt ved bruk av en 1/10 aliquot merket med"y-(32P) ATP. Fosforylert oligonukleotid ble aktivert med p<->imidazol ved tilstedeværelse av en karbodiimid, deretter ble den bundet til overflaten av en bølgelederplate som var silanert med en aminopropylsilan ved pH 8.5.

Dupleks DNA ble også applisert på en bølgeleder. Fag X DNA ble fragmentert med hensiktsmessige endonukleaser og etanol-presipiterte fragmentene ble aktivert med Imidazol og koblet til aminopropylresldier podet på en bølgelederplate ved bruk av en karbodiimid. Denne konstruksjonen demonstrerer bruken av oppfinnelsen i fremstilling (b) nevnt ovenfor når også med hensyn til optisk fluorescensrespons ved tilsetting a en interkalatorfarge. For utføring av de optiske målingene i henhold til oppfinnelsen, ble opp-settet som er illustrert i fig. 4 benyttet. Bølgeledere som ble benyttet besto av plane glass eller injeksjonsstøpte plastikk mikroskop-objektglass. Innfallsvinkelen ble kontrollert ved bruk av speil Ml og M2. Løsningen som skulle analyseres ble pumpet Inn i strøm-celle 37 og fluorescensresponsen som ble dannet ved interfasen ble detektert enten ved rett vinkel (53) eller ved et utløp i bølgelederen (40). Filter 52 blokkerte gjenværende emisjons-bølgelengde. Signalet som ble dannet ved detektor 40 (eller 53) ble deretter prosessert 1 de elektroniske elementene 41-45 og detektert 1 henhold til vanlige metoder.

I tillegg til å teste sensitiviteten ved kontrollering av den aktuelle overflatetettheten til probe DNA på bølgelederover-flaten, ble andre sensltivltetsforøkende teknikker gjort tilgjengelige ifølge tidligere teknikker innenfor DNA-deteksjon i løsnings-området.

Det er blant annet, i henhold til oppfinnelsen, helt sannsyn-lig at størrelsen på signalet fra multiple Indre reflektans-fotometrier avhenger av konsentrasjonen av fluorescens-generatorsetene innenfor rommet som er tilgjengelig for den korte bølgekomponenten. For en gitt interkalatorfarge, er denne responsen en funksjon av den total mengden av dupleks DNA Innenfor det området (når man antar den lineære tettheten av interkalerende seter forblir konstant).

Men dupleks DNA som er tilstede behøver ikke nødvendigvis å være begrenset til hybriden som innbefatter den opprinnelige probe DNA som er assosiert med komplementært sammensmeltet testDNA. Det finnes metoder som supplerer de tidligere dannede duplekse strukturene, disse metodene innbefatter, blant annet, utviding av eksisterende polynukleotidprobe-kjedene og hybridisering av enkelt-trådet DNA som er komplementær til den utvidede sekvensen; en annen fremgangsmåte ville være å tilsette dobbelt-trådete hybrider.

En fremgangsmåte innbefatter å supplere reaksjonsmediet inkludert probehybridiserte materialer med DNA som er komplementær til test DNA, d.v.s. til den delen av test DNA-sekvensen som ikke er homologt til probe DNA. Dette fører til en økning av baseparmengden som er tilgjengelig for fluorescentsetedannelsen innenfor det optiske området ved bølgelederinterfasen.

I en variant, kan det supplementerte DNA'et oppnåes i prehybridisert form som vil øke tilgjengelige kjedelengder og fluorescenssetekonsentrasjon. Videre supplering kan oppnås ved nettverkdannelse ved alternering av komplementære og ikke-komplementære sekvenser.

En annen fremgangsmåte er å oppnå flere fluorescensseter som på forhånd merkede komplementært DNA, hvor merkingen er blitt utført med fluorescerende komplekser, slik som FITC; dermed, hvis fluorescerende nukleotidsubstitutter blir brukt i syntesen av supplementerende DNA som reagerer som indikert, vil dette øke den totale fluorescensen innenfor det optiske området som er av interesse.

Når det gjelder den andre varianten b) ovenfor (se side 21) hvor proben reagerer med analytt DNA i løsningen før dupleksen blir bundet til bølgelederen, er hovedfordelen en øking i hybridisasjonskinetikken. Her, har proben sin immobilisa-sjonssekvens (blant annet en del av et immuno-par kompleks) festet til den ikke-hybridiserende enden og bølgelederen er dekket med den respektive bindingspartner. Eksempler på flere mulige fremstillinger er gitt i de ovenfornevnte referansene og innbefatter de følgende spesifikke tilfellene: i): - Tilsetting av et polynukleotid til (3') enden til proben og dekking av bølgelederen med den komplementære polynukleotiden. 11): - Kobling av en (eller flere) deler av et immunologisk bindings-par til proben og dekking av bølgelederen med den immunologiske bindingspartneren (f.eks. biotin-probe og anti-biotin antistoff på overflaten).

ili): - Kobling av en (eller flere) deler av en naturlig eller modifisert bindingspar til proben og dets respektive partner til bølgelederen (f.eks. biotin-probe og avidin på overflaten).

Praktiske detaljer blir nå gitt i den eksperimentelle delen som følger:

Eksperimentell del.

1. Fremstilling av bølgelederoverflate for binding av DNA.

a) Bruk av nukleofile seter, f. eks. poding med"y-amino propylsilan: Bølgeledere i form av glass eller plastikk støpte mikroskop-objektglass ble skylt i rensevaeske (glass ble etset i 30 minutter ved romtemperatur i F3C-COOH) og under argon lagt i en 2$ ved vekt toluenløsning bestående av 3-aminopropyl-trietoksysilan over natt ved 100°C under argon. Deretter ble platene vasket med etanol og vann og tørket under vakuum. Podingstettheten var omtrent 10"<10>til IO"<9>mol/kvadrat cm men kan også være høyere.

De podete platene ble oppbevart under argon før bruk i aceton løsning.

a2) Poding med -y-merkaptopropylsilan.

Den ovenfornevnte fremgangsmåten ble brukt med unntak av at aminsilan ble erstattet med -y-tiohydroksypropyl-trietoksy-silan. Podingstettheten var omtrent som nevnt ovenfor. b) Dannelse av elektrofile seter, f.eks. poding med isotiocyanat.

Plater som ble oppnådd som under (a) ble dyppet i 2 timer i en 5$ ved vekt tørr DMF-løsning bestående av 1,4-fenylendi- isotiocyanat. Deretter ble platene vasket 1 DMF, tørket med eter og oppbevart under argon. c) Dekking av bølgeledere med polylysin for å øke amintett-heten på bølgelederen.

En bølgelederplate podet med isotiocyanatgrupper som fremstilt i (b) ble reagert i 3 t i 0.1 M Hepes buffer (pH 7.6) med et overskudd 10-<3>M polylysin-løsning (Mrø~~4000 ) ved romtemperatur. Platen ble vasket med metanol og vann, den ble tørket og oppbevart under argon før bruk. Dekkingstett-heten var omtrent 50 picomol lysin/cm<2>av bølgelederover-flaten.

d) Dannelse av positivt ladete grupper på bølgeleder.

Plater fra (a) eller (c) ovenfor ble kvaternert med metylbromid eller metylsulfat i henhold til vanlige fremgangsmåter. Denne kvaterneringsreaksjon innbefattet omtrent 10 til 40$ av de tilgjengelige aminogruppene. Alternativt, kan binding av kvaternære ammoniumforbindelser på bølgelederoverflaten oppnås med behandling av overflaten med en vandig løsning bestående av en silan med følgende formel (MeO)3SI-(CHg )3~NR3 hvor R er en lavere alkyl, f. eks. Me eller Et. Et silan av denne typen er kommersielt tilgjengelig. 2. Modifikasjoner av nukleinsyrer for binding til den podete bølgelederen.

a) 3'-endemodifikasjon av oligonukleotid med en terminal sukker eller ribonukleosid - syntese av CPG som bærer en

immobilisert metylglukosidgruppe.

Metyl a-glukopyranosid (1.94 g, 10 mmol) ble eterisert med en dimetoksytrityl beskyttende gruppe (DMT) på vanlig måte ved bruk av den korresponderende klorid (4.2 g, 11 mmol) i pyridin (20 ml) og DMF (30 ml). Den resulterende metyl 6-0-dimetoksytrityl-glukosid (3.3 g, 62$) ble reagert i pyridin som inneholdt dimetylaminopyridin (1$) med suksinik anhydrid

(1.8 g, 3 ekvivalenter), og produktet ble renset ved blitz-kromatografi på silikagel (eluert med CHC13/MeOH 80/20 med 1% pyridin). Etter fordamping av eluatet, ble syren tatt opp med pyridin og fordampet for å eliminere gjenværende metanol; utbytte 2.5 g. Det suksinylerte sukkeret ble løst opp i dioksan (12 ml) inneholdende pyridin (1.5 ml), DCC (0.88 g, 4 mol) og p-nitrofenol (0.56 g, 4 mmol), og denne løsningen ble ristet i to timer ved romtemperatur. Dicykloheksylurea ble fjernet ved filtrering og løsningen ble med en gang brukt til kobling på kontrollert poreglass (CPG) kuler [CPG/lang kjede alkylamin (LCAA); porediameter: 500 Ångstrøm; sort 24875 fra Pierce Inc.] CPG (5 g) ble raskt vasket med en løsning bestående av diisopropyletylamin (5$ i eter) og suspenderet i tørr DMF (30 ml). p-nitrofenylsuksinylert sukkerderivat ble tilsatt og suspensjonen ble satt i romtemperatur med lett risting. Etter vask med DMF ble gjenværende fri amin og hydroksylgrupper tilsatt eddikanhydrid (1 ml) 1 pyridin (7 ml) inneholdende dimetylaminopyridin ( 1%). Etter vask (DMF) ble CPG-kulene resuspendert i tørr pyridin (10 ml) inneholdende DCC (0.6 g) og p-nitrofenol (0.4 g) og ristet forsiktig i seks timer. Morfolin (0.4 ml) ble deretter tilsatt og suspensjonen ble ristet i 15 minutter til.

Etter vasking og tørking ble den faste fasen analysert for tritylkation: 19 pmol sukker ble immobilisert per gram CPG.

Kjemisk syntese av oligonukleotider inneholdend en (3')-modifisert ende.

CPG (53 mg; 1 pmol sukker) ble lagt i bunnen av en 2.5 ml glass-sprøyte med et makroporøst poyletylenfilter, og oligonukleotidet ble syntetisert i denne anordningen ved hjelp av fosforamidit-metoden fremlagt av S.L. Beaucage et al. Tetrah. Letters 1982, 22- 1859.

Den åpne sprøyten med CPG ble lagt inn i et reagensrør og skylt med dikloreddiksyre (2%) til (5')-ende deproteksjonen var fullstendig. Etter vask med acetonitril og DMF ble sprøyten satt sammen igjen, og faste fasen ble tørket med tre etterfølgende vaskinger ved sug I tørr acetonitril gjennom et septa ved bruk av en nål festet til sprøyten. CPG ble suspendert i tørr acetonitril (1 ml) og løsningen ble påført til et 1.5 ml plastikk Eppendorf-rør med tørr deoksycytosin nukleosid-fosforamidit (16 mg; 20 ekvivalenter). Denne oppløste byggestenen ble deretter overført til et annet 1.5 ml plastikk Eppendorf-rør som inneholdt tetrazol (14 mg; 200 ekvivalenter). Deretter ble den oppløste aktiverte fosfor-amlditen suget inn i sprøyten. Og sprøyten ble rotert på en mekanisk roterende anordning i tre minutter. Etter vask med 2,6-lutidin ble stoffet som Ikke hadde reagert tilsatt en løsning (1 ml) eddikanhydrid (5%), lutidin ( 2056), dimetylaminopyridin (10#) i THF i to minutter.

Deretter ble sprøytepluggen fjernet og alle gjenværende oksydasjons-, vaskings- og syre-behandlingsstegene ble utført med åpen sprøyte som var satt på en nål i et septa som dekket en vakuum Erlenmeyer flaske.

Jod-løsning (2 ml) inneholdende jod (1.7 g), THF (40 ml), 2,6-lutidin (20 ml) ble tilsatt flasken. Etter 30 til 45 sekunder ble CPG vasket med acetonitril og diklormetan. Etter en ny behandling med dikloreddiksyre (2$) var den faste fasen klar for en ny tilsetting av en ny byggesten.

Oligonukleotider ble laget med metylglukosid- og nukleosid-avledete bærere ved bruk av den beskrevne teknikken. Etter hver syklus ble et 20-ganger overskudd av det ønskede nukleosid-fosforamiditet brukt, og syklusen ble gjentatt så mange ganger som det var nødvendig. Disse syntetiske stegene kan også bli utført ved bruk av gen-maskin.

Frigjøring og deprotektering ble utført som beskrevet i M.H. Caruthers, Kjemisk og enzymatisk syntese av genfragmenter, GASSER & LANG (Verlag Chemie, Weinheim, BRD; p. 71-79 (1982) og i Oligonukleotidsynteser, en praktisk fremstilling, M.J. GAIT Editor (IRL Press, Oxford, p. 35-81 (1984).

(3')enzymatisk modifikasjon av oligo-d(C).

Oligo d(C)-mer) ble fremstilt med protektert -d(C) avledet CPG og renset ved gelelektroforese (20$ ureagel) og BPLC på reversert fase C-8 kolonne (25 cm) etter fullstendig deprotektering.

Oligo d(C) (40 jig), 10x transferasebuffer (20 pl), rCTP (2 nmol) og terminal transferase (40 enheter) i et finalt volum på 200 pl ble inkubert i 6 timer ved 37 grader. Etter behandling med EDTA (0.5M; 20 pl) og ekstrahering med fenol/kloroform som vanlig ble den resulterende nukleinsyren avsaltet på en Sephadex G-50 kolonne (Pharmacia Fine Chemicals) og detektert ved UV-absorpsjon (løsning :1 mM Tricinbuffer).

Periodat oksydasjon av oligo d(C)-(3')-metylglukosid eller oligo d(C)-(3')-oligo rC.

Oligo d(C)-(3')-metylglukosid (25-mer) (10 Gpug i 100 pl) eller oligo d(C) (30-mer) cytidinert ved (3')-enden (10 pg i 100 pl) ble reagert med natrium-metaperiodat (1$ løsning; 1 pl) ved 4 grader. Etter 30 minutter NaCl (4M; 100 pl), Na2HP04(0.5M; 100 pl) og glyserol (1# løsning; 10 pl) ble tilsatt. Etter gjentagende inkubering ved 4 grader i 30 minutter ble løsningen frysetørket og residuet avsaltet på en Sephadex G-50 kolonne som beskrevet tidligere. Til slutt ble nukleinsyreløsningen justert til 1 ml.

Immobilisering av oligo d(C) på aminopropyl glassplate.

En aminpropyl-avledet glassplate ble dekket med periodatoksy-dert oligonukleotldløsning (500 pl; 3-5 pg) i Tricine-buffer (pH 7.0). Det ble inkubert i tre timer med risting en gang imellom. Deretter ble cyanoborohydrid ( 1% løsning; 1 pl) tilsatt, og reaksjonen fikk stå i to timer til. Etter en omfattende vask med vann ble platen satt under argon ved 4 grader til den skulle brukes.

Den før nevnte teknikken ble også brukt for å fremstille oligo d(A) dekket bølgeledere.

Immobilisering av nukleinsyre som inneholder nukleofilamin ved dets (3')-ende.

Oksydert oligo d(C)-(3')-metylglukosid (25-mer) (omtrent 10 pg) ble avsaltet som vanlig, og halve løsningen ble reagert med 1,6-dlaminoheksan (1$ løsning; 1 pl) i to timer ved romtemperatur i Tricinbuffer (0.1 M; pH 7.0). Deretter ble cyanoborohydrid (1$ løsning; 1 pl) tilsatt, og etter to timer ved romtemperatur ble forbindelsen renset på H.P.L.C. på en C-8 kolonne i ammonlumacetatbuffer (0.1M; pH 5.5). Immobilisasjon ble utført på en isotiocyanat-avledet glassplate i boratbuffer (0.1M; pH 9.5) i to timer ved romtemperatur.

b) (5')-ende modifikasjoner av nukleinsyre.

Den direkte kondensasjonen av (5 *)-fosforylert nukleinsyrer

med tilstedeværelse av oppløselig DCC og en "nukleofil" fast fase er vanligvis dårlig. Men ved aktivering med imidazol eller analoger ved pH på rundt 6, er kondensasjonen mere effektiv og spesifikk, som rapportert av Chu B.C.F. og Orgel L.E.; P.N.A.S 1985, 82, 963-67 og Chu B.C.F. , Wahl G.M., Orgel L.E.; Nukleic Acids Research 1983, 11, 6513-29.

Denne fremgangsmåten har blitt brukt til å immobilisere korte syntetiske DNA-kjeder og lange restriksjonsfragmenter. Aktivering og immobilisering av syntetiske oligo d(C) (30-mer) ved dets (5')-ende.

Oligo d(C) (30-mer) (40 pg) ble fosforylert med T4 polynukleotidkinase (10 enheter) i kinasebuffer ved 37 grader i to timer med tilstedeværelse av ATP.

Fosforylering ble utført i en 1/10 aliquot med -v (32P)-ATP. Etter opparbeidelse og frysetørring ble oligonukleotidet avsaltet på en Sephadex G-50 kolonne.

Omtrent 4 pg ble løst opp i 300 pl imidazol. HC1 buffer (0.1M; pH 6.1) inneholdende N-Etyl-N'-(3-dimetylaminopropyl)-karbodiimid-hydroklorid (oppløselig DCC) (0.1M). Løsningen ble hensatt i romtemperatur i tre timer med risting av og til. Det aktiverte nukleotidet ble renset på revers fase opparbeidelse med en trietyl ammoniumacetat (0.1M, pH 7.0)/acetonitrilgradient. Det ble deretter reagert med en bølgelederplate med aminogrupper i 10% lutidin/vann løsning ved 60°, pH 8.5 i 4 minutter. Deretter ble platen vasket grunding og oppbevart ved 4 grader til den skulle brukes.

c) Immobilisering av enkelt og dobbelt trådet DNA.

X DNA (3 pg i 50 pl) ble behandlet med restriksjonsenzym Hpa

II i lav saltbuffer i to timer ved 37 grader. Etter opparbeidelse, ble DNA'et etanolpresipitert og tatt opp i imida-zolbuffer (300 pl; pH 6.2) inneholdende løselig DCC (0.1M) og NaCl (0.5M). Løsningen ble hensatt ved romtemperatur 1 to timer med sporadisk risting. Citrat-buffer (0.2M; 300 pl; pH 8.4) inneholdende NaCl (4M) ble satt til den aktiverte aminopropyl glassplaten som nylig var blitt vasket med diisopropyletylamin (5$) i eter. Det aktiverte DNA'et ble tilsatt og blandet på platen og hensatt ved 40 grader i en halv time. Etter vask med NaCl (2M) ble platen hensatt under argon ved grader 1 lukket atmosfære.

Alternativt ble enkelt-trådet DNA bundet til glassplaten i fravær av NaCl ved oppvarming ved 70 grader i 4 minutter. En ny løsning med kuttet X DNA ble denaturert ved oppvarming i 3 minutter ved 100°C og satt til platen som var dekket med NaCl løsning (4M; 300 pl) og hensatt ved 80" C i 3 minutter. Deretter ble løsningen sakte avkjølt hvorpå hybridisasjon oppsto.

d) Utvidelse av den immobiliserte proben langs den hybridiserte nukleinsyren ved inn-fyllingsteknikken ved bruk av de

fire dNTP'ene og DNA-polymerase I (Klenov fragment).

En syntetisk 45-mer ikke-kodende kjede til pBR-322 (nukleotid nr. 3871 til 3916) ble immobilisert på en bølgeleder som vist under seksjon 2(b).

EcoR I kutting av pBR322 ble denaturert i 3 min ved 100 grader i 200 pl buffer B løsning (40 mM Tris.HCl Ph 7.5 20 mM MgCl2). Etter en rask avkjøling ble 1 M NaCl (200 pl) tilsatt, og enkelttrådet DNA ble hybridlsert til proben som var på bølgelederen (5 min ved 80 grader med sakte avkjøling til romtemperatur (15')).

Etter vask med buffer inneholdende NaCl (0.5M) og ditiotreitol (ImM) 40 pl NTP (3 mM av alle fire deoksyribonukleosid trifosfater) ble satt til 400 pl buffer B inneholdende NaCl (0.5M) og ditiotreitol (1 nM) ved romtemperatur og deretter ble 20 enheter Klenov store fragment tilsatt. e) Eksempel på "sandwich-hybrldisasjon" ved bruk av en andre probe med en oligo dC- (3')-ende og poly dG og poly dC for

dannelse av en dobbelt-trådet kompleks nettverk.

EcoR kutting av plasmid pBR322 (1 pg) ble denaturert 1 5' ved 100 grader og ble hybridlsert til en syntetisk 45-mer festet ved dets (5') fosfatende til bølgelederen (Nukleotid nr 3871 til 3916 på den ikke-kodende tråden). En andre oligonukleotid (0.5 pg) med primær struktur som nukleotid nr. 70 til 100 på ikke-kodende tråden til pBR322 ble elongert ved dets (3') ende med dCTP (5mM) i kakodylat-buf f er (i henhold til Meth. of Enzymology No 65, p. 435). Etter hybridisering av den andre proben til den immobiliserte nukleinsyre poly dG og poly dC ble det tilsatt for dannelse av et dobbelttrådet kompleks nettverk.

f) Eksempel på "sandwich hybridisering" (som i det foregående eksemplet), hvor deoksycytidin til poly dC er erstattet av

N<4->(6-aminoheksyl)deoksycytidin (dah dC), og ble reagert med

FITC.

Poly(dC) (5A enheter; 0.3-0.4 mg) i 1 ml i nylaget løsning bestående av IM Na2S205/lM 1.6-diaminoheksan/10mM hydroquinon (pH 7.3) ble varmet opp ved 60 grader i 4 dager. Deretter ble løsningen dialysert mot lOOmM boratbuffer (pH 9.0) og kjørt gjennom en Sephadex G-50 kolonne. Denne modifiserte polymeren ble reagert med fluorescein-isotiocyanat i boratbuffer (pH 9.0) for dannelsen fluoresceinert poly(dah dC), som ble brukt som i det foregående eksemplet i en "sandwich hybridisering" eksperiment fra en poly dG for dannelsen av et kompleks nettverk.

g) Eksempel på løsningshybridisering etterfulgt av immobilisering og (deteksjon av det hybridiserte komplekset som er

vedlagt i neste seksjon).

I korte trekk, blir en enkel genetisk sekvens, for eksempel poly-dG bundet til bølgelederen. Deretter blir et andre probeelement, en kontinuerlig poly-dC som har lengde som poly-dG, som bærer en sekvens som er komplementær til nukleotidene, for eksempel 1-50, til analyttsekvensen blir hybridlsert i løsning i med nevnte analyttsekvens; deretter hybridiserte signalet som danner dupleks med den bundne genetiske sekvensen.

Eksperimentelt, som i e) ovenfor, ble den fremstilte oligo-nukleotiden (0.5 pg) på 70 til 100 b.p. av ikke-kodende tråden til pBR322 elongert ved dets (3') med dCTP hybridlsert til varmedenaturert EcoR I kutting av plasmid pBR322 (1 pg) i 5 min. Løsningen ble deretter reagert med en bølgeleder dekket med polydG for immobilisering av proben.

Sensitiviteten til teknikken nevnt ovenfor kan bli bedre (i de tilfeller hvor testsekvensen har, f.eks. 200 bp) ved tilsetting, før hybridisering med probe DNA, en tredje probesekvenselement som er komplementær til, f.eks. nukleotidene 55-200 i testsekvensen, hvor hybridisering av dette tilleggselementet utføres under optimale betingelser med et overskudd av probe. Det partielle hybridet blir deretter hybridlsert til proben som er bundet til bølgelederen. Signalet som danner potensialet til hybridet blir derfor forsterket.

3. Eksperimenter til måling av DNA.

Appartur som er blitt brukt er beskrevet ovenfor i forbindelse med figurene 4A, 4B og 4C. Bølgeleder 38 er plant injeksjon støpt plastikk mikroskop objektglass. Lys fra en blitzlampe 36 blir sendt gjennom en monokromator 39 for seleksjon av spesifikk bølgelengde. Innfallsvinkel til eksitasjonslyset ved bølgeleder/væskeinterfasen blir kontrollert ved bruk av to speil Ml, M2. Lys blir koblet inn og ut av bølgelederen ved bruk av to kvart-runde kvarts-prismer, 46, 47. Fluorescerende lys blir detektert enten rette vinkler til bølgelederen med en detektor 54 ellers så blir det flurorescerende lyset som ført tilbake Inn i bølgelederen detektert ved bølgelederutførselen med en detektor 40, inkludert et fotomultiplikator-rør som detekterer fluorescerende lys som går gjennom emisjonsfilter 52. Systemet er illustrert for å samle tilbakeført fluorescerende lys, men kan lett justeres for måling av fluorescens ved rette vinkler ved å sette filter/detektor som i fig. 4A. Signalet blir pre-forhøyet ved 41, og sendt til mikroprosessor-kontrollert blitz kontroll/data system 12-45. Det digitiserte signalet blir deretter lagret på floppy disk 45, eller skrevet som hard kopi 44. Prøvene blir introdusert ved bruk av en strømcelle 37, og volumet i kontakt med bølgelederoverflaten er definert ved gummitetningsklemmen 50. Prøvene blir injisert i cellen ved bruk av en automatisk pipette (f.eks. Microlab P, Hamilton Industries, Bonaduz, CH) som kontrollerer lnjeksjonsvolumene og hastighetene. Generelt, ble probenukleotidene koblet til bølgelederen ved bruk av teknikkene beskrevet i seksjon 2 ovenfor. Den podete bølgelederen ble deretter plassert i det optiske opp-sett feltet og strøm-cellen ble satt på toppen som vist i fig. 4C. Deretter ble en løsning bestående av hybridiseringsbuffer (NaCl M) plassert 1 cellen og, etter opp-start, ble en baselinje dannet. Deretter ble den spesifikke reaksjonen startet ved tilsetting av en testløsning til cellen og avlest ved forandringen i fluorescens enten ved bølgelederutløpet eller under bølgelederen.

To hovedeksperimenter ble utført:

a) Ende-punkt (Fig. 5A). Dette er et kontrolleksperlment for å vise gjennomførbarheten av testen, d.v.s. dannelse av et

tilstrekkelig sterkt signal ved tilsetting av en interkalatorfarge til dobbelt-trådet DNA. I en første variant, ble bølgeledere som er fremstilt slik som beskrevet I seksjon 2 (c), d.v.s. dekket med ikke-denaturerte X DNA fragmenter ble behandlet med forskjellige mengder etidiumbromid i samme buffer (NaCl M; 100 pg farge/ml stokk-løsning). Brukbare responser ved etidiumbromid ble oppnådd 1 konsentrasjoner i cellen fra 1 til 100 pg/ml. Responsen var også proporsjonal til tettheten av DNA på bølgelederen.

Fig. 5A illustrerer forholdene hvor DNA-proben har en tetthet på omtrent 10-3 - 10-1 pmol XDNA/cm<2>av probeoverflaten mot en konsentrasjon på 60 pg/ml etidiumbromid i cellen. I fig. 5A, representerer linje B øking I respons som resulterer fra tilsetting av fargen til cellen ved tilstedeværelse av dupleks DNA på bølgelederen. Linje A er kontrollen som er oppnådd ved identiske betingelser men med ikke noe DNA på bølgelederen. Det lille hoppet i kurve A skyldes mindre løsningsfluorescens og det lille fluorescenssignalet fra ikke-interkalert farge.

I en annen variant, ble enkelt-trådet DNA på bølgeledere brukt. Probeplatene som ble brukt er i henhold til prosedyre nr. 2 (c) i seksjon 2 ovenfor etterfulgt av denaturering og innbefattet enkelttrådet DNA avledet fra X DNA. Deretter, ble en DNA løsning inneholdende denaturert DNA tilsatt. Denne løsningen ble fremstilt ved denaturering av en blanding DNA etter behandling med Hpa II endonuklease som indikert under seksjon 2(c), første paragraf ovenfor. Etter tilsetting av enkelttrådet DNA, ble hybridisering utført i 20 min. ved romtemperatur hvorpå etidiumbromid løsning ble tilsatt som i første variant ovenfor. En respons lignende fig. 5A, linje B ble oppnådd. For en gitt mengde av etidiumbromidrea-gens, var den proporsjonal til det komplementære DNA i analyttprøven.

I en tredje variant, ble effekten av elongering av dobbel-helisk polynukleotid etter hybridisering testet.

Referanse er gitt til seksjon 2(d) ovenfor. I fremstillingen i denne seksjonen, første paragraf, ble et pBR322 kuttet denaturat hybridlsert med en syntetiske polynukleotidprobe. Når etidiumbromid ble satt til hybridiseringsløsnlngen, ble en responskurve som den som er illustrert i kurve B i figur 5A oppnådd.

Når en bølgeleder som var fremstilt på lignende måte ble satt i kontakt med løsningen som Inneholdt det elongerte hybridiserte produktet fremlagt i andre paragraf i seksjon 2(d) ovenfor i 15 minutter ved romtemperatur og deretter ble etidiumbromid i 0.5M vandig NaCl tilsatt, ble en responskurve på omtrent to ganger høyden av det første signalet oppnådd.

I en fjerde variant, ble løsningshybridisering og deteksjon av det hybridiserte komplekset etter dannelse, ved konstruk-sjon av en probeoligonukleotid som inneholder en immobili-seringssekvens testet. Her var sekvensen et polynukleotid med repterende kjente baser, men det kan like gjerne være hvilket som helst repeterende polymer som tillater immobilisering av komplekset til overflaten via dets komplementære binding men som ikke vil interferere med hybridiseringsreak-sjonen med proben (f.eks. immunologiske bindingspar, lektiner og sukker, andre proteiner og haptenbindere). For å utføre løsningshybridisering etterfulgt av immobilisering og deteksjon av det hybridiserte komplekset, ble fremgangsmåten beskrevet under 2(g) fulgt, deretter ble etidiumbromid i vandig NaCl (0.5M) tilsatt og fluorescens målt. Dataene viser to responskurver som ligner kurve B i fig. 5A men med forskjellig høyde. Første lavere kurven, er responsen som er oppnådd uten denaturert mål-DNA pBR322, og signalet er avledet fra hybridisering av bare sammensmeltet probe-polydC til polydG festet til bølgelederen.

En annen lignende kurve, en som var høyere, ble oppnådd etter hybridisering av proben til mål-DNA og utføring av immobiliseringsreaksjonen; dette demonstrerte tilstedeværelse av hybridlsert probe/pBR322 kompleks og beviste at proben bandt seg til overflaten av bølgelederen etter hybridisering med dets komplementære DNA. Dermed kan løsningshybridisering bli utført og det hybridiserte produktet kan bli målt i henhold til metoder i denne oppfinnelsen. Løsningshybridi-sasjon kan innbefatte spesielle fordeler i noen tilfeller men hensyn på hvor raskt man oppnår resultater.

b) Kinetisk respons.

Fremstillingsmåten var essensielt den samme som for den andre

varianten i fremstilling 3(a) ovenfor bortsett fra at etidiumbromid (50 jig/ml i cellen) ble injisert samtidig med den komplementære DNA-prøven. Resultatene er vist i fig. 5B. Her har baselinje C samme betydning som linje A i fig. 5A. Linje D viser fluorescensøkningshastigheten som er proporsjonal til hybridisasjonsgraden til komplementært DNA i analytten med DNA på proben. Høyden på linje D er proporsjonal til mengde DNA i nevnte analytt. Resultatene ovenfor viser at fargeinterkalering skjer med en gang relativt til hybridiser-ingsgraden.

De generelle eksperimentelle betingelsene er gitt nedenfor.

Hybridiseringsbufferen var alltid 1 ml/L NaCl i destillert vann. Hybridiseringer som var utført før reaksjonen med fargen ble reagert ved 100°C. Hybridisasjoner utført i cellen ble utført ved 22°C. De detaljerte effektene av temperatur på in situ avlesning av hybridisasjoner er ikke blitt bestemt ennå. Eksitasjonsbølgelengden ble valgt til 300 nm. Et smalt bånd-pass interferens-filter ble plassert over P.M. røret for å måle fluorescens ved 600 nm (type 600S10-25, Oriel). Innfallsvinkel til eksitasjonslyset ved interfasen ble valgt, så nære den kritiske vinkel som mulig, ved 66°C. Dette var veldig viktig for å maksimalisere sensitiviteten til systemet for ved denne vinkelen er det et maksimalt antall refleksjoner og derfor blir maksimalområdet av overflaten oppdaget, og feltstyrken ved overflaten er sterkest ved vinkler som er nære den kritiske vinkelen som dermed øker muligheten til avlesning av overflatereaksjonen. Etldiumbromidkonsentrasjon (Fluka Chemicals) ble variert, men best mellom 1 og 100 pg/ml.

c) Effekt av eksitasjonsbølgelengde.

For å demonstrere effekten av eksitasjonsbølgelengden på

signaldektesjon ble en bølgeleder med dobbelttrådet DNA på

overflaten plassert i den optiske anordningen; eksitasjons-lambda ble scannet fra 300 til 600 nm med buffer i cellen og etter reaksjon med etidiumbromid. Dette ble gjentatt med en ren bølgeleder uten DNA på overflaten for å virke som en kontroll. Resultatene av fire bølgelengder 300, 360, 500 og 550 nm er gitt nedenfor i vilkårlige enheter;

Resultatene ovenfor illustrerer at 300 nm er den lambda'en som er best å bruke i dette spesielle systemet. Disse resultatene demonstrerer at den interkalert fargen utøver lignende fluorescensegenskaper når DNA'et er festet til overflaten som når DNA'et er fritt i løsning eller 1 en gel.

d) Kinetisk avledning av dannelse av dobbelttrådet DNA.

En plate bølgeleder med poly-dA festet dertil ble brukt (se

fremstillingen under seksjon 2 (a)). Deretter, ble bølgeled-eren festet til strømcellen og et base-linje signal ble oppnådd med buffer i cellen. Både etidium bromid og .25U/ml poly-dT ble blandet og Injisert i strømcellen på samme tid og reaksjonen ble avlest. Resultatene er gitt i figur 6, linje

F. Et kontroll eksperiment er også vist hvor bare etidium bromid ble injisert inn i cellen (linje E). Disse resultatene demonstrerer at bindingen mellom komplementære DNA-tråder kan bli avlest slik det skjer i denne oppfinnelsen. Avles-ningsreaksjonen er effektiv med en gang og bare spesifikk interkalering mellom dobbelttrådet DNA ble detektert. Dette kunne være veldig nyttig for dannelse av en analysator som brukes til å utføre DNA probeanalyser ved klinisk og diagnostisk bruk. Lignende data ble funnet med poly-dC og poly-dG, men signalene var sterkere. En annen test ble utført for å illustrere den generelle nytten ved bruk av "sandwich" type hybridisering kombinert med dannelse av en dobbelttrådet kompleks nettverk med polydC: polydG for å gi mange interkal-eringsseter. Fremgangsmåten beskrevet i seksjon 2(e) ble fulgt og hybridisering ble utført med tilstedeværelse av etidiumbromid. Graden ble målt ved fluorescens som ovenfor og kurver som ligner de som er illustrert i fig. 6 ble oppnådd. Den første kurven (den nedre) representerer signalet som oppnås før det endelige steget med kompleks dannelse. En annen kurve (lik F i fig. 6) ble oppnådd ved blanding av de to polynukleotidene (polydG, og polydC) med etidiumbromid og kinetisk avlesning av reaksjonen. Disse data illustrerer den høyere sensitiviteten ved denne fremgangsmåten i forhold til ikke-kompleks dannelse.

Fig. 8 illustrerer, ved en serie diagrammer (A, B, C og D) noen av hoved-analytiske teknikkene fremstilt ved denne oppfinnelsen. Hensikten til disse diagrammene er å vise en kort oppsummering av de forskjellige metodene som er fremlagt i denne spesifikasjonen.

Diagram A viser en bølgeleder 100 hvorpå en probe polynukleotid 101 er blitt festet via en linker 102 til et bindingssete 103 på bølgelederen. Diagrammet viser også et segment av analytt polynukleotid 104 hvorpå senterseksjonen er komplementær til proben og som hybridiseres til proben.

Diagram B viser tilfellet hvor et stykke DNA 104 hybridlsert med en probe 101 festet til en bølgeleder 100 hvorpå den enkeltendete tråden 106 er blitt fylt av komplementære baser 105 for å oppnå ekspansjon (se seksjon 2(d)).

Diagram C illustrerer den progressive supplementering av DNA 107 komplementært til den frie seksjon 106 til test DNA 104, dette supplement DNA 107 bærer en sekvens 108 som går videre som senere skal bli supplementert av DNA 109 og 110. Disse supplerende sekvenser kan bestå av syntetiske homopolynukleotider (poly-dA, poly-dT, poly-dC, poly-dG). Dette illustrerer at "sandwich hybridiserings prosedyre i seksjon 2(e). Denne elongeringen øker antall fluorescens seter probeenhet og øker sensitiviteten. En bør merke seg at sekvensene er definert ved tallene 109 og 110 selv om de er representert som heterogene, kan bestå av samme eller forskjellige nukleotider, betingelsen er at en del av 109 er komplementær til 108 og at i hvert fall en del av 110 er komplementær til i hvert fall en del av 109. Dermed, som et eksempel, kunne 109 bestå av bare poly-dG og 110 bare poly-dC.

Det er også viktig å merke seg at for betydningen av fremstilling illustrert i diagram C, kan probe DNA bestå av et DNA-stykke som skal festet til bølgelederen ved hybridisering med et komplementært DNA som allerede er festet til bølgeled-eren ved en link 102-103.

Diagram D illustrerer løsningshybridisering av proben med test DNA 104 og etterfulgt festing av hybridet til bølgeleder 100 via linking-delene 102 og 103.

Målingsteknikken i denne oppfinnelsen vedrører både avlesning av fluorescens variasjon (d.v.s. når hybridisering skjer på overflaten av bølgelederen eller når dupleksen som resulterer fra løsningshybridisering festes til bølgelederen og til ende-punkt bestemmelse (d.v.s. måling av fluorescens ved utløpet av bølgelederen etter at reaksjonen er fullført eller at det hybridiserte produktet har festet seg til bølgelede-ren). I dette tilfellet, kan utløpsslgnalet bli målt når bølgelederen ennå står i kontakt med analytt-prøveløsningen eller etter separering av bølgelederen fra løsningen. Fordelene med å utføre denne separasjonen før måling av signalet er å øke eller eliminere løsningens bakgrunnsstøy.

Claims

1. Metode for bestemmelse av nukleinsyrer (a) som innbefatter en eller polynukleotidsekvenser av interesse som er tilstede i en væske analytt prøveblandingen bestående av polynukleotider, karakterisert ved at metoden innbefatter: i) kontakting av nevnte prøve i et reaksjonsmedium med en polynukleotidprobe (b) som innbefatter polynukleotid motstyk-ker til nevnte sekvens som er av interesse med tilstedeværelse av en fast fase som har bindings-affinitet for nevnte probe, hvorpå hybridisasjon mellom (a) og (b) skjer med dannelse av en to-trådet dupleks struktur,

11) tilsetting av en merket forbindelse laget for å spesifikt merke nevnte dupleks, f.eks. interkalere mellom trådene i nevnte dupleks, som dermed danner et fluoriscerende kompleks signal frembringer som indikerer dannelse av nevnte dupleks, karakterisert ved at nevnte faste fase er en bølgeleder hvorpå nevnte probe er bundet før eller etter steg i) og som bærer en indre reflektert bølgesignal og som reagerer med nevnte bundne kompleks ved overflaten derav og produserer en f luorescensrespons som blir målt ved et utløp på nevnte bølgeleder og som dermed frembringer data som er representative for nevnte bestemmelse.

2. Metode ifølge krav 1, karakterisert ved at proben er bundet til bølgelederen før steg i, hvorpå hybridisering ved overflaten av bølgelederen og fluorescensøkingen er representativ for graden av nevnte hybridisering, d.v.s. for mengden av nukleinsyreanalytt i prøven.

3. Metode ifølge krav 1, karakterisert ved at steg i) blir begynt før proben bindes til bølgelederen hvorpå fluorescensøking med tiden betegner graden av binding av dupleks strukturen til bølgelederoverflaten og den totale ende-punkt fluorescensen relaterer til mengden av analytt nukleinsyre I prøven.

4. Metode ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte bølgeleder er en rettlinjet transparent fast materiale, hvorpå et signalutløp i nevnte bølgeleder blir samlet lateralt ved de rette vinkler til nevnte bølgeleder eller aksilær i en ende av de nevnte bølgeleder eller ved begge.

5 . Metode ifølge krav 1, karakterisert ved at bølgelederen er en optisk stav eller fiber eller en plate som danner en vegg i en analytisk reaksjonstest-kuvette.

6. Metode ifølge krav 5, karakterisert ved at et utløpssignal i nevnte bølgeleder blir samlet lateralt i rette vinkler til nevnte interfase hvorpå det emitterte fluorescerende lyset blir plukket fra en side av bølgelederen som er motstående til nevnte interfase.

7. Metode ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte interaksjon mellom det reflekterte bølgeslgnalet og nevnte fluorescerende kompleks skjer hovedsakelig ved en brøkdel av en bølgelengde bort fra bølgeleder/analytt interfasen som klart kan skjelne mellom fluorescensen som fremstilles av nevnte kompleks som er bundet til bølgelederen fra den som skjer innenfor hovedmengden av analytten.

8. Metode ifølge krav 2, karakterisert ved at nukleinsyreproben er kovalent festet til bølgelederen ved et terminalt nukleotid, hvorpå alle eller de fleste basene til nevnte nukleinsyre er tilgjengelige for hybridisering.

9. Metode ifølge krav 8, karakterisert ved probenukleotidene innordner seg i et parallelt forhold til bølgelederoverflaten, da denne orienteringen er et resultat av tilstedeværelse på bølgelederoverflaten av seter med elektrostatisk affinitet for fosfatdelen i nevnte probepoly-nukleotider.

10. Metode ifølge krav 9, karakterisert ved at nevnte seter resulterer fra tilstedeværelse på bølgeleder-overf laten av positivt ladete grupper, f.eks. kvaterne ammoniumgrupper.

11. Metode ifølge krav 8, karakterisert ved at nevnte kovalent binding oppnåes ved først å pode trialkoksy-silan-bærende reaktive grupper slik som -NHg, -0H, -SH, glysidoksy, -NCO og lignende på bølgelederen og deretter bruke disse gruppene eller derivater derav som linkere for probe-polynukleotidene.

12. Metode ifølge krav 8, karakterisert ved at nukleinsyreproben består av oligonukleotider i et område på omtrent 10 til 105 nukleotider.

13. Metode ifølge krav 8, karakterisert ved at nevnte kovalent binding oppnåes ved å reagere probenuklein-syrene med reaktive grupper som tidligere er blitt inkorporert på bølgeledersubstansen.

14. Metode ifølge krav 1, karakterisert ved at bølgelederen er en del av eller består av hele den støpte disponible plast-kuvetten.

15. Metode ifølge krav 1, karakterisert ved at bølgelederen er støpt fra høyt optisk kvalitetsplast slik som polykarbonat eller polymetyl-metakrylat.

16. Metode ifølge krav 1, karakterisert ved at bestemmelse av fluorescenssignalet utføres ved enten å måle nevnte fluorescens ved likevekt (ende-punkt bestemmelse) eller ved måling av forandringsgraden av fluorescensen mens reaksjonen pågår, eller begge.

17. Metode ifølge krav 1, karakterisert ved at reaksjonen utføres ved kontrollerte temperaturbetingelser.

18. Metode ifølge krav 17, karakterisert ved at temperaturen blir variert kontinuerlig, lineært eller i henhold til en steg-vis gradient.

19. Metode ifølge krav 18, karakterisert ved at de målte resultatene blir beregnet for å oppnå gjennom-snittlig termisk denatureringstemperatur Tm til det hybridiserte produktet.

20. Metode Ifølge krav 1, karakterisert ved at en eller flere kaotropiske agens eller polymerer selektert fra dekstransulfat-polymerer, polyetylen glykol, natrium-jodid, og perkloratsalter blir satt til reaksjonsmediet.

21. Kit for gjennomføring av metode ifølge krav 1, karakterisert ved at det inneholder følgende komponenter : en prøvetakings-anordning for biologisk cellemateri- aler; en prøve-prepareringsanordning for ekstrahering, deproteinisering og separering av trådene i den selekterte nukleinsyreprøven fra nevnte cellemateri-ale; en kuvette-bølgeleder som inkorporerer en nuklein syreprobe; en måte for introdusering av den preparerte prøven og en interkalatorfarge inn i kuvette-bølgelederen; en optisk anordning for opplysing av bølgelederen med et totalt reflektert signal og tidsbestemme og bestemme fluorescensen som er blitt dannet ved bølgelederoverflaten ved hybridisering av nuklein-syreprøven med proben; en signal prosesseringsanordning og et ustyr som elektronisk prosesserer den bestemte fluorescensen og som fremlegger tidlige resultater som er representative for nevnte hybridiseringsreaksjon.

22. Kit ifølge krav 21, karakterisert ved at kuvette-bølgelederen enten er en disponibel billig støpt kuvette eller en strøm-celle som kan benyttes flere ganger.

23. Metode ifølge krav 1, karakterisert ved at den innbefatter amplifikasjon av fluorescenssignalet som er av interesse ved øking av den tilgjengelige fluorescerende setekonsentrasjonen i rommet som er optisk probet av eksita-sjonssignalet.

24 . Metode ifølge krav 23, karakterisert ved at nevnte konsentrasjonsøkning oppnåes ved utviding av dupleks-strukturmengden som resulterer fra hybridisasjon ved probeoverflaten.

25. Metode ifølge krav 24, karakterisert ved at nevnte lengdeøkning oppnåes ved tilsetting av flere nukleinsyre-homologer til de ennå ikke hybridiserte sekvensene den bundne test-nukleinsyren, hvorpå en videre sammensmelting skjer med oppnåelse av flere fargeinterkalatorseter.

26. Metode ifølge krav 1, karakterisert ved at en 5'-fosfat-linked nukleinsyreprobe blir forlenget langs den hybridiserte formen ved bruk av de fire deoksynukleosid-trifosfat og en DNA-polymerase eller en revers transkriptase (inn-fyllings teknikk), eller begge.

27. Metode ifølge krav 1, karakterisert ved at proben bindes til bølgelederen ved hybridisering med komplementær DNA som er festet til nevnte bølgeleder eller dekket derpå.

28. Metode ifølge krav 1, karakterisert ved at proben er festet til en partner av et bindingspar og hvorpå en annen partner av nevnte par er festet til bølgelederover-flaten, hvorpå probefesting til bølgelederen skjer via dannelse av bindingsparet.

29. Metode ifølge krav 28, karakterisert ved at nevnte første partner blir selektert fra antigener, haptener, glykosider, sukker, biotin, avidin og andre bindingsproteiner, hvorpå den andre partneren er komplementær til nevnte første partner.

30. Metode ifølge krav 1, karakterisert ved at bølgelederen er et hult rør og proben blir immobilisert på den indre eller ytre overflaten derav eller på begge.

31. Metode ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte måling utføres enten i løpet av hybridiseringen ved bestemmelse av fluorescensen, eller, etter at hybridiseringen er fullført, ved fluorescens ende-punkt bestemmelse.

32. Metode ifølge krav 31, karakterisert ved at den innbefatter fluorescens ende-punkt bestemmelse, hvorpå målingen utføres enten ved tilstedeværelse eller uten væskeanalytt-løsning.