NO880918L

NO880918L - PREPARATION AND METHOD OF IMMUNOLOGICAL CASTING AND STERILIZATION.

Info

Publication number: NO880918L
Application number: NO880918A
Authority: NO
Inventors: Alan John Tilbrook; Robert John Fairclough
Original assignee: Victoria State
Priority date: 1986-07-03
Filing date: 1988-03-02
Publication date: 1988-05-03
Also published as: NO880918D0

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører undertrykkelsen av sosial og seksuell oppførsel hos husdyr av hannkjønn og undertrykkelse av ovulasjon og østral syklisitet hos husdyr av hunnkjønn, og mere spesielt et preparat og metode for immuno-logisk kastrering og sterilisering. The present invention relates to the suppression of social and sexual behavior in male domestic animals and the suppression of ovulation and estrous cyclicity in female domestic animals, and more particularly to a preparation and method for immunological castration and sterilization.

Normal seksuell oppførsel hos hanndyr opprettholdes ved hjelp av androgener, eller mannlige kjønnshormoner, idet disse i alt vesentlig fremstilles i testiklene. Ett av de viktigste androgener er testosteron. Det er vanlig praksis hos bønder å eliminere seksuell aktivitet og redusere aggressiv oppførsel hos buskapen ved hjelp av operativ kastrering. Imidlertid er en rekke ulemper tilknyttet operativ kastrering. Disse omfatter blødning, infeksjon og stressassosiert vekttap (Schanbacher, 1984). Videre reduserer kastrering både veksthastig-het og mengden mager vevsavsettelse (Robertson et al., 1970). Normal sexual behavior in male animals is maintained with the help of androgens, or male sex hormones, as these are mainly produced in the testicles. One of the most important androgens is testosterone. It is common practice among farmers to eliminate sexual activity and reduce aggressive behavior in livestock by means of operative castration. However, a number of disadvantages are associated with operative castration. These include bleeding, infection and stress-associated weight loss (Schanbacher, 1984). Furthermore, castration reduces both growth rate and the amount of lean tissue deposition (Robertson et al., 1970).

Et alternativ til operativ kastrering er aktiv immunisering mot luteiniserende hormonfrigjørende hormon (heretter omtalt som LHRH) eller analoger derav. LHRH frigjøres fra hypotalamus inn i hypofyseportåren. Man har foreslått at LHRH binder seg til gonadotrofene fra hypofysens forlapp for å stimulere sekresjon og frigjøring av luteiniserende hormon (LH). LH virker på Leydig-cellene i testikkelen for å øke produksjonen av testosteron. Aktiv immunisering med henblikk på LHRH av-bryter forbindelsen mellom hypotalamus og hypofysen. Man antar at det sted hvori antistoff over LHRH vil inhibere re-produktiv funksjon er i hypofyseportblodårene (Schanbacher, 1984). An alternative to operative castration is active immunization against luteinizing hormone-releasing hormone (hereafter referred to as LHRH) or analogues thereof. LHRH is released from the hypothalamus into the pituitary portal vein. It has been proposed that LHRH binds to the gonadotrophs from the anterior lobe of the pituitary gland to stimulate the secretion and release of luteinizing hormone (LH). LH acts on the Leydig cells in the testicle to increase the production of testosterone. Active immunization with a view to LHRH interrupts the connection between the hypothalamus and the pituitary gland. It is assumed that the place in which antibody to LHRH will inhibit re-productive function is in the pituitary portal veins (Schanbacher, 1984).

Aktiv immunisering med henblikk på LHRH fører til markerte forandringer i funksjon og morfologi av hypofyseforlappen, dette resulterer i en reduksjon i vekten, gonadotrofininnhold og LHRH-binding hos hypofysen i en rekke arter omfattende rotter (Kock, 1977, Fraser et al., 1982), kanin (Arimura et al., 1974) og apekatt (Chappel et al., 1980). I tillegg har man en reduksjon i sekresjon av testosteron og involusjon av testiklene (rotter: Fraser et al., 1982, kloape: Hodges and Hearn, 1977, vær: Schanbacher et al., 1982, Jeffcoate et al., 1982, okse: Robertson og andre, 1979, 1981, 1982, 1984). Active immunization with a view to LHRH leads to marked changes in the function and morphology of the pituitary gland, this results in a reduction in the weight, gonadotrophin content and LHRH binding in the pituitary in a number of species including rats (Kock, 1977, Fraser et al., 1982) , rabbit (Arimura et al., 1974) and monkey (Chappel et al., 1980). In addition, there is a reduction in the secretion of testosterone and involution of the testes (rats: Fraser et al., 1982, hoof: Hodges and Hearn, 1977, weather: Schanbacher et al., 1982, Jeffcoate et al., 1982, ox: Robertson and others, 1979, 1981, 1982, 1984).

Graden av vektøkning hos okser som aktivt er immunisert med henblikk på LHRH er betydelig større enn hos kastrerte ungstuter (Robertson et al., 1982). Immunokastrater omsetter også maten mere effektivt, har en større prosentandel som er slakteferdige, magrere skrotter og har mindre høyde ved rygg-kammen og er smalere rundt forparten enn kastrerte ungstuter (Robertson et al., 1982). The degree of weight gain in bulls actively immunized with regard to LHRH is significantly greater than in castrated steers (Robertson et al., 1982). Immunocastrates also convert food more efficiently, have a greater percentage that are ready for slaughter, leaner carcasses and have less height at the withers and are narrower around the forequarters than castrated young steers (Robertson et al., 1982).

Oksekalver som responderer godt på aktiv immunisering med henblikk på LHRH viser redusert sekresjon av gonadotrofiner (Jeffcoate et al., 1982) og testosteron og en reduksjon i testikkelstørrelse (Robertson og andre, 1 979, 1 981 , 1 982, 1984). Ut fra en subjektiv vurdering av adferden viser det seg at immunokastrater ligner kastrerte ungstuter idet de er mere medgjørlige og er lettere å behandle enn okser (Robertson og andre, 1979, 1981, 1984). Når immuniserte okser fikk betjene en brunstig ku eller en kunstig vagina gjorde tre av fem dyr som hadde antistofftitrer ikke noe forsøk på å bestige kua mens de andre to forsøkte å bestige og en av disse opp-nådde ejakulasjon (Robertson et al., 1982). I en fortsettende undersøkelse, sammenlignet Robertson et al. (1984) ikke-immuniserte okser med dyr som hadde respondert godt på immunisering med henblikk på LHRH og fant at immunokastratene var mindre aktive enn oksene med hensyn på ridning, stanging og slikking og bevegelse. Calves that respond well to active immunization for LHRH show reduced secretion of gonadotrophins (Jeffcoate et al., 1982) and testosterone and a reduction in testicular size (Robertson et al., 1979, 1981, 1982, 1984). Based on a subjective assessment of the behaviour, it appears that immunocastrates are similar to castrated young steers in that they are more docile and easier to treat than bulls (Robertson and others, 1979, 1981, 1984). When immunized bulls were given access to a cow in heat or an artificial vagina, three out of five animals that had antibody titers made no attempt to mount the cow, while the other two attempted to mount and one of these achieved ejaculation (Robertson et al., 1982). . In a follow-up study, Robertson et al. (1984) compared non-immunized bulls with animals that had responded well to immunization for LHRH and found that the immunocastrates were less active than the bulls for riding, barring and licking and locomotion.

Aktiv immunisering med henblikk på LHRH er rapportert å under-trykke ovulasjon og brunst hos hunnsauer (Clarke, Fraser og McNeilly, 1 979.) og forårsaker gonadal atrofi i kaniner (Arimura et al., 1973), hamstere (de la Cruz et al., 1976) og rotter (Fraser og Baker, 1978). Active immunization with LHRH has been reported to suppress ovulation and oestrus in ewes (Clarke, Fraser and McNeilly, 1979) and to cause gonadal atrophy in rabbits (Arimura et al., 1973), hamsters (de la Cruz et al. ., 1976) and rats (Fraser and Baker, 1978).

I undersøkelsene av Clarke et al. (1978) i sauer, Fraser et al. (1974) i rotter, og McCormack et al. (1977) i rhesusaper, resulterte anti-LHRH-behandling i en markert nedsettelse i plasma LH-konsentrasjoner. Det har således vist seg at anti-LHRH-behandling har en lignende effekt på plasma LH-nivået og den gonade funksjon i hunndyr såvel som i hanndyr. Under-søkelsen av Clarke et al. (1978) er særlig relevant da søyene som tydelig hadde økt LHRH-antistoff ikke ble anovulatoriske og viste ikke østral syklisitet i to påfølgende sesonger. In the investigations by Clarke et al. (1978) in sheep, Fraser et al. (1974) in rats, and McCormack et al. (1977) in rhesus monkeys, anti-LHRH treatment resulted in a marked decrease in plasma LH concentrations. It has thus been shown that anti-LHRH treatment has a similar effect on the plasma LH level and the gonadal function in female animals as well as in male animals. The sub-research by Clarke et al. (1978) is particularly relevant as the ewes that had clearly increased LHRH antibody did not become anovulatory and did not show estrous cyclicity in two consecutive seasons.

Skjønt aktiv immunisering med henblikk på LHRH har vært vel-lykket i oksekalver og andre dyr, har man hatt betydelig variasjon mellom individuelle dyr i deres respons overfor immunisering. I de flere undersøkelser responderte bare om-trent halvparten av oksekalvene som var immunisert med henblikk på LHRH på behandling og hadde høye antistofftitrer. Dette ble rapportert for oksekalver som var immunisert når de var tolv uker gamle (Robertson og andre, 1979, 1981), 20 uker gamle (Robertson et al., 1984), og 28 uker gamle (Robertson et al., 1982). Jeffcoate et al. (1982) immuniserte aktivt en måned gamle oksekalver med henblikk på LHRH og rapporterte at antistofftitrene steg etter at dyrene hadde mottatt to injeksjoner av immunogen, men begynte å falle etter en tredje injeksjon. Dette nødvendiggjorde en fjerde injeksjon for å opp-rettholde antistoffti trene. Although active immunization with LHRH has been successful in bull calves and other animals, there has been considerable variation between individual animals in their response to immunization. In the several studies, only about half of the bull calves immunized for LHRH responded to treatment and had high antibody titers. This was reported for bull calves immunized at twelve weeks of age (Robertson et al., 1979, 1981), 20 weeks of age (Robertson et al., 1984), and 28 weeks of age (Robertson et al., 1982). Jeffcoat et al. (1982) actively immunized one-month-old bull calves against LHRH and reported that antibody titers rose after the animals had received two injections of immunogen, but began to fall after a third injection. This necessitated a fourth injection to maintain the antibody levels.

Fenomenet med mangel på immunrespons overfor et antigen-stimulerende middel er godt dokumentert. F. eks. i læreboken for Veterinary Immunology av Herbert (1976) er det gitt på side 199-200 at "Generelt vil antistofftitre som er funnet hos medlemmer av en vaksinert populasjon bli fordelt på en statistisk normalkurve, idet noen få dyr har høye titrer og en annen liten gruppe responderer ikke i det hele tatt." I et annet avsnitt er det angitt at "Dersom et stort nok antall under-søkes (med antigen) vil noen blant dem som er vaksinert bli funnet å være ubeskyttet. Tekniske feil kan være årsak til noen av disse mens andre ikke er i stand til å oppnå en til- stand av beskyttelsesimmunitet uansett hvor mange ganger anti-genet tilføres, eller uansett om andre forholdsregler (d.v.s. anvendelse av hjelpestoffer) blir tatt for å stimulere immuniteten i dem." The phenomenon of lack of immune response to an antigen-stimulating agent is well documented. For example in the textbook of Veterinary Immunology by Herbert (1976) it is given on pages 199-200 that "In general, antibody titers found in members of a vaccinated population will be distributed on a statistical normal curve, with a few animals having high titers and others low group is not responding at all." In another paragraph it is stated that "If a large enough number is tested (with antigen) some among those vaccinated will be found to be unprotected. Technical errors may account for some of these while others are unable to to achieve a state of protective immunity regardless of how many times the antigen is administered, or regardless of whether other precautions (i.e. the use of adjuvants) are taken to stimulate immunity in them."

LHRH er et lite peptid med ni aminosyrer. Innen området immunologi er det vel kjent at små immunogener utløser en dårlig immunrespons når de injiseres inn i en vert. Følgelig, i hver av de ovennevnte undersøkelser, har LHRH blitt kjemisk konjugert til et spesielt bærerprotein, f. eks. humant serumalbumin. LHRH is a small peptide with nine amino acids. In the field of immunology, it is well known that small immunogens trigger a poor immune response when injected into a host. Accordingly, in each of the above investigations, LHRH has been chemically conjugated to a special carrier protein, e.g. human serum albumin.

Man har nå overraskende funnet at en synergistisk veksel-virkning finner sted når dyrene immuniseres med en kombinasjon av to eller flere forskjellige bærere, koblet til LHRH eller analoger av LHRH. Kombinasjoner av LHRH eller analoger av LHRH konjugert med bærere utløser en effektiv immunrespons (målt med hensyn på antistofftiter) i en større del av dyrene enn dersom LHRH eller analoger av LHRH som er konjugert til en eneste bærer tilføres. It has now surprisingly been found that a synergistic interaction takes place when the animals are immunized with a combination of two or more different carriers, linked to LHRH or analogues of LHRH. Combinations of LHRH or analogues of LHRH conjugated with carriers elicit an effective immune response (as measured by antibody titer) in a greater proportion of animals than if LHRH or analogues of LHRH conjugated to a single carrier are administered.

I henhold til et formål med den foreliggende oppfinnelse, har man tilveiebragt et preparat for dannelse av antistoffer i dyr som er spesifikke overfor LHRH eller analoger av LHRH, idet nevnte preparat omfatter to eller flere forskjellige bærere som individuelt er koblet til LHRH eller analoger av LHRH. According to an object of the present invention, a preparation has been provided for the formation of antibodies in animals which are specific to LHRH or analogues of LHRH, said preparation comprising two or more different carriers which are individually linked to LHRH or analogues of LHRH .

Analoger av LHRH er peptider hvori tilføyinger, fjerning, modifikasjoner eller forandringer er gjennomført på den naturlige sekvens av LHRH. Forandringer i den naturlige sekvens omfatter tilføying av en eller flere aminosyrer til den amino-eller karboksylterminale enden av LHRH. Analogues of LHRH are peptides in which additions, deletions, modifications or changes have been made to the natural sequence of LHRH. Changes in the natural sequence include the addition of one or more amino acids to the amino or carboxyl terminus of LHRH.

Husdyrarter som faller innenfor området for den foreliggende oppfinnelse omfatter kveg, sauer, geiter, katter, marsvin, svin, hunder, reinsdyr, hester og primater omfattende hunn-kjønn. Livestock species that fall within the scope of the present invention include cattle, sheep, goats, cats, guinea pigs, pigs, dogs, reindeer, horses and primates including females.

Bærere av enhver type som er anvendelige immunogener kan anvendes. Foretrukket er bærerne proteiner og mere foretrukket er proteinene oppløselig i vandig løsning skjønt presipiterte proteiner kan anvendes. Carriers of any type that are useful immunogens may be used. Preferably, the carriers are proteins and more preferably the proteins are soluble in aqueous solution, although precipitated proteins can be used.

Eksempler på foretrukne proteiner er Diphtheria Toxoid (DT), humant serbumalbumin (HSA), stafylokokkers protein A (P.A.), Examples of preferred proteins are Diphtheria Toxoid (DT), human serum albumin (HSA), staphylococcal protein A (P.A.),

Keyhole Limpet Haemocyanin (KLH), og Tetanus Toxoid (TT). Keyhole Limpet Haemocyanin (KLH), and Tetanus Toxoid (TT).

Generelt kan enhver kombinasjon av to eller flere bærere anvendes. Foretrukket er bærerne proteiner slik som HSA og P.A., eller KLH og TT, idet hvert av disse proteinene er konjugert til LHRH. Særlig foretrukket er imidlertid to eller flere bærere hvor hver bærer, koblet til LHRH og tilført separat til et dyr, utløser en generelt god titerrespons. Særlig foretrukket er preparater hvor en av bærerne er Diphtheria Toxoid (DT). In general, any combination of two or more carriers can be used. Preferred carriers are proteins such as HSA and P.A., or KLH and TT, each of these proteins being conjugated to LHRH. Particularly preferred, however, are two or more carriers where each carrier, coupled to LHRH and administered separately to an animal, triggers a generally good titer response. Particularly preferred are preparations where one of the carriers is Diphtheria Toxoid (DT).

Andre bærere som kan anvendes i henhold til den foreliggende oppfinnelse omfatter lipopolysakkarider, polysakkarider, glykopeptider, muramylpeptidanaloger, peptidoglykaner (fra bakteriecellevegger), liposomer, lecitinlignende materialer og bakterieproteiner, for eksempel rensede proteinderivater fra tuberkulin. Other carriers that can be used according to the present invention include lipopolysaccharides, polysaccharides, glycopeptides, muramyl peptide analogues, peptidoglycans (from bacterial cell walls), liposomes, lecithin-like materials and bacterial proteins, for example purified protein derivatives from tuberculin.

Vanlige teknikker kan anvendes ved konjugering av LHRH og analoger av LHRH til forskjellige bærere. F. eks., er hetero-bifunksjonelle midler slik som SPDP (Pharmacia, Piscataway New Jersey), karbodiimid, glutaraldehyd eller biotin/avidin-systemer anvendelige. Betingelsene velges generelt slik at LHRH eller analoger av LHRH opprettholdes i sin biologiske aktive konformasjon når de er koblet til bæreren. Conventional techniques can be used in conjugating LHRH and analogs of LHRH to various carriers. For example, hetero-bifunctional agents such as SPDP (Pharmacia, Piscataway New Jersey), carbodiimide, glutaraldehyde, or biotin/avidin systems are useful. The conditions are generally chosen so that LHRH or analogs of LHRH are maintained in their biologically active conformation when coupled to the carrier.

Foretrukket inneholder preparatene et hjelpestoff. Eksempler på hjelpestoff som kan anvendes er aluminiumhydroksyd, Freunds "incomplete" hjelpestoff, Freunds "complete" hjelpestoff, DEAE-dekstran, levamisol, PCG og polyA, polyC eller polyU. Preferably, the preparations contain an excipient. Examples of excipients that can be used are aluminum hydroxide, Freund's "incomplete" excipient, Freund's "complete" excipient, DEAE-dextran, levamisole, PCG and polyA, polyC or polyU.

Særlig foretrukket som hjelpestoffer er materialer som ikke forårsaker lokal inflammasjon. Et eksempel på et slikt material er en mineraloljeblanding som omfatter bakterie-celleveggmaterial slik som peptidoglykaner, eller et syntetisk derivat av et slikt celleveggmaterial. Et slikt syntetisk material er kjent som muramyldipeptid. Particularly preferred as excipients are materials that do not cause local inflammation. An example of such a material is a mineral oil mixture comprising bacterial cell wall material such as peptidoglycans, or a synthetic derivative of such a cell wall material. One such synthetic material is known as muramyl dipeptide.

Preparatet kan eventuelt bufres til fysiologisk pH ved anvendelse av buffere som TRIS-HC1, Hepes, Pipes eller andre passende buffere. The preparation can optionally be buffered to physiological pH using buffers such as TRIS-HC1, Hepes, Pipes or other suitable buffers.

I henhold til et annet formål ved den foreliggende oppfinnelse, har man tilveiebragt en metode for undertrykkelse av mannlig sosial og seksuell oppførsel hos husdyr omfattende tilførsel av et preparat til et husdyr, idet nevnte preparat omfatter to eller flere forskjellige bærere som individuelt er konjugert til LHRH eller analoger av LHRH. According to another object of the present invention, a method for the suppression of male social and sexual behavior in domestic animals has been provided comprising the administration of a preparation to a domestic animal, said preparation comprising two or more different carriers that are individually conjugated to LHRH or analogues of LHRH.

På den annen side har man en metode for undertrykkelse av ovulasjon ogøstral syklisitet hos husdyr av hunnkjønn ved tilførsel av de ovennevnte beskrevne preparater. On the other hand, there is a method for suppressing ovulation and estrous cyclicity in female livestock by administering the above described preparations.

Tilførselen kan være parenteral, f. eks. subkutan og/eller intramuskulær eller intravenøs injeksjon, oralt eller ved absorpsjon gjennom huden eller ved hjelp av en minipumpe som enten er implantert i dyret eller festet utenpå dyret. The supply can be parenteral, e.g. subcutaneous and/or intramuscular or intravenous injection, orally or by absorption through the skin or by means of a mini-pump either implanted in the animal or attached outside the animal.

Når det gjelder kveg, immuniseres oksekalver foretrukket med preparatet når de er mellom åtte og 40 uker gamle. Når det gjelder sau, immuniseres værlam foretrukket når de er fra åtte til 24 uker. Booster-injeksjoner gis foretrukket med åtte ukers mellomrom og foretrukket gis en til tre booster-in jeks joner . In the case of cattle, bull calves are preferably immunized with the preparation when they are between eight and 40 weeks old. In the case of sheep, wether lambs are preferably immunized when they are from eight to 24 weeks old. Booster injections are preferably given at eight-week intervals and preferably one to three booster injections are given.

I den tidligere definerte metode i henhold til den foreliggende oppfinnelse har man innen området for denne metode en behandling hvori tilførsel av substanser (f. eks. LHRH), koblet til to individuelle bærere, er separat, men tilførselen finner sted over en relativt kort tidsperiode. En periode på minutter eller timer vil vanligvis være tilfredsstillende, skjønt det vil være klart upassende sammenlignet med en eneste tilførsel av substansen koblet til minst to bærere. In the previously defined method according to the present invention, one has within the scope of this method a treatment in which the supply of substances (e.g. LHRH), connected to two individual carriers, is separate, but the supply takes place over a relatively short period of time . A period of minutes or hours will usually be satisfactory, although it will be clearly inappropriate compared to a single delivery of the substance coupled to at least two carriers.

Den foreliggende oppfinnelse har særlig anvendelse i den immunologiske kastrering og sterilisering av kjeledyr eller selskapsdyr, særlig katter og hunder. Vanlig operativ behandling gjennomført av veterinærer kan være kostbar, og ofte vond for dyret som behandles og dyrets eier. The present invention has particular application in the immunological castration and sterilization of pets or companion animals, especially cats and dogs. Ordinary operative treatment carried out by veterinarians can be expensive, and often painful for the animal being treated and the animal's owner.

En økning i omfanget av dyr som responderer kan også fore-komme når andre substanser som utløser en immunrespons, andre enn LHRH eller analoger av LHRH, er konjugert til minst to forskjellige bærere og kombinasjoner av disse konjugater til-føres deretter til dyrene. Eksempler på slike substanser som utløser en immunrespons omfatter peptider og proteiner slik som adrenocortikotropisk hormon, substans P, humant choriion-gonadotrofin, somatostatin, epidermale og insulinlignende vekstfaktorer, steroider omfattende androstenedion (fecundin), testosteron og andre substanser slik som melatonin og prosta-glandinene. An increase in the extent of animals that respond can also occur when other substances that trigger an immune response, other than LHRH or analogues of LHRH, are conjugated to at least two different carriers and combinations of these conjugates are then added to the animals. Examples of such substances that trigger an immune response include peptides and proteins such as adrenocorticotropic hormone, substance P, human chorionic gonadotrophin, somatostatin, epidermal and insulin-like growth factors, steroids including androstenedione (fecundin), testosterone and other substances such as melatonin and the prostaglandins .

I beskrivelsene har følgende uttrykk den betydning som er angitt under: LHRH: Luteiniserende hormonfrigjørende hormon er en spesifikk substans som er involvert i stimulering av luteiniserende hormon og follikelstimulerende hormon fra adenohypo-fysen. In the descriptions, the following terms have the meaning indicated below: LHRH: Luteinizing hormone-releasing hormone is a specific substance involved in the stimulation of luteinizing hormone and follicle-stimulating hormone from the adenohypophysis.

Bærer: Enhver substans, særlig protein som, når den er koblet til små substanser, kan utløse en immunrespons til dyr. Carrier: Any substance, especially protein, which, when linked to small substances, can trigger an immune response in animals.

Antistofftiter: Fortynningen av antiserum som binderAntibody titer: The dilution of antiserum that binds

50 % av 0,15 nCi<131>I-merket LHRH i 16 timer ved 4°C. Pre-sipitering av gammaglobuliner ble oppnådd ved anvendelse av polyetylenglykol ved en sluttkonsentrasjon på 14,5 %. 50% of 0.15 nCi<131>I-labeled LHRH for 16 hours at 4°C. Precipitation of gamma globulins was achieved using polyethylene glycol at a final concentration of 14.5%.

DT: Diphtheria toxoid.DT: Diphtheria toxoid.

HSA: Humant serumalbumin.HSA: Human serum albumin.

KLH: Keyhole limpet haemocyanin.KLH: Keyhole limpet haemocyanin.

TT: Tetanus toxoid.TT: Tetanus toxoid.

CP: Corynebacterium parvum.CP: Corynebacterium parvum.

P. A.: Protein A fra Staphylococcus aureus.P. A.: Protein A from Staphylococcus aureus.

Carb: 1-etyl-3 (3-dimetylaminopropyl) karbodiimid. Glut: GLuteraldehyd. Carb: 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide. Glut: GLuteraldehyde.

Den foreliggende oppfinnelse vil nå beskrives ved hjelp av eksempler med referanse til følgende eksperimentelle prosedyrer, eksempler og tabeller. The present invention will now be described by way of example with reference to the following experimental procedures, examples and tables.

Fig. 1 og 2 viser antistofftiter (Log-skala) plotted mot forskjellige behandlingsgrupper for henholdsvis værlam og oksekalver. Fig. 3 og 4 viser gjennomsnittlig testikkelvolum hos værlam som har fått Corynebacterium Parvum (CP), Keyhole Limpet Haemocyanin (KLH), Diphteria Toxoid (DT), Diphtheria Toxoid (DT), Tetanus Toxoid (TT) og en kombinasjon av disse bærere koblet til LHRH, CP, KLH, DT i fig. 4, og KLH, TT og DT i fig. 3. Figs 1 and 2 show antibody titers (Log scale) plotted against different treatment groups for weather lambs and bull calves respectively. Figs 3 and 4 show the average testicular volume in weather lambs that have received Corynebacterium Parvum (CP), Keyhole Limpet Haemocyanin (KLH), Diphtheria Toxoid (DT), Diphtheria Toxoid (DT), Tetanus Toxoid (TT) and a combination of these carriers linked to LHRH, CP, KLH, DT in fig. 4, and KLH, TT and DT in fig. 3.

A. EKSPERIMENTELLE PROSEDYRER.A. EXPERIMENTAL PROCEDURES.

1. Fremstilling av LHRH- konjugater.1. Preparation of LHRH conjugates.

(a) Tetanus toxoid - LHRH.(a) Tetanus toxoid - LHRH.

LHRH (240 mg) og tetanus toxoid (35,5 ral, 248 mg) ble oppløst med 20 ml destillert vann og pH i blandingen ble justert til 6,0 med 0,1 N NaOH. En nylaget løsning av 0,4 mg 1-etyl-3 (3-dimetylaminopropyl) karbodiimidhydroklorid (ECDI) i 2 ml destillert vann ble tilsatt dråpevis og reaksjonen fikk fortsette ved romtemperatur (22°C) over natten. Løsningen ble dialysert mot tre skift av saltvann (5 ltr.) For å anslå antall mol LHRH som er bundet til tetanus toxoid ble 3nCi av 1 31 LHRH (240 mg) and tetanus toxoid (35.5 ral, 248 mg) were dissolved in 20 ml of distilled water and the pH of the mixture was adjusted to 6.0 with 0.1 N NaOH. A freshly prepared solution of 0.4 mg of 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (ECDI) in 2 ml of distilled water was added dropwise and the reaction was allowed to proceed at room temperature (22°C) overnight. The solution was dialyzed against three shifts of saline (5 ltr.) To estimate the number of moles of LHRH bound to tetanus toxoid, 3nCi of 1 31

I merket LHRH tilsatt til reaksjonsblandingen. Ved anvendelse av denne prosedyren er det mulig å bestemme den til-synelatende forening av merket LHRH til bærerproteinet, ved å In labeled LHRH added to the reaction mixture. Using this procedure, it is possible to determine the apparent binding of labeled LHRH to the carrier protein, by

telle mengden<131>I-LHRH i løsningen før og etter omfat-count the amount of<131>I-LHRH in the solution before and after covering

tende dialyse. I dette eksempel ble 39 mol LHRH koblet til hvert mol tetanus toxoid. (b) Fremstilling av LHRH - Tetanus toxoid immunogen ved anvendelse av gluteraldehydkoblingsmetoden. tend dialysis. In this example, 39 moles of LHRH were coupled to each mole of tetanus toxoid. (b) Preparation of LHRH - Tetanus toxoid immunogen using the gluteraldehyde coupling method.

En mengde på 10 mg LHRH og 1200^ul (13,6 mg) tetanus toxoid ble oppløse i 34 ml vann og 0,1 M NaOH ble tilsatt til å gi en endelig pH på 8,0. Gluteraldehyd (4 ml 25 % v/v) ble deretter tilsatt dråpevis og reaksjonen fikk fortsette i 18 timer ved 25°C. Løsningen ble dialysert som beskrevet i (a). An amount of 10 mg of LHRH and 1200 µl (13.6 mg) of tetanus toxoid was dissolved in 34 ml of water and 0.1 M NaOH was added to give a final pH of 8.0. Gluteraldehyde (4 ml 25% v/v) was then added dropwise and the reaction was allowed to proceed for 18 h at 25°C. The solution was dialyzed as described in (a).

1 31 1 31

Beregning av I-LHRH aktivitet før og etter dialyse ga en verdi på 38 mol LHRH pr. mol tetanus toxoid. (c) Fremstilling av LHRH - Protein A immunogen ved anvendelse av karbodiimidkoblingsmetoden. Calculation of I-LHRH activity before and after dialysis gave a value of 38 mol LHRH per mol tetanus toxoid. (c) Preparation of LHRH - Protein A immunogen using the carbodiimide coupling method.

En mengde LHRH (10 mg i 10 ml vann) ble tilsatt til 500^1 Protein A (50 mg) og 10 ml destillert vann. pH ble justert til 6,5 med 0,01 M NaOH eller HC1, og 200 mg ECDI ble tilsatt i 10 ml destillert vann. An amount of LHRH (10 mg in 10 ml of water) was added to 500 µl of Protein A (50 mg) and 10 ml of distilled water. The pH was adjusted to 6.5 with 0.01 M NaOH or HCl, and 200 mg of ECDI was added in 10 ml of distilled water.

Reaksjonen inkuberes ved 25°C i 18 timer som beskrevet iThe reaction is incubated at 25°C for 18 hours as described in

del (a).part (a).

Forening av 1 31I - LHRH til Protein A ble beregnet til å giAssociation of 1 31 I - LHRH to Protein A was calculated to give

et LHRH/Protein A forhold på 1:36 etter dialyse mot tre skift fysiologisk saltvann. (d) Fremstilling av LHRH - Protein A immunogen ved anvendelse av gluteraldehydkoblingsmetoden. an LHRH/Protein A ratio of 1:36 after dialysis against three shifts of physiological saline. (d) Preparation of LHRH - Protein A immunogen using the gluteraldehyde coupling method.

En mengde på 10 mg LHRH og 500 ^1 (50 mg) Protein A ble oppløst i 34 ml destillert vann og pH ble justert til 8 ved anvendelse av 0,01 M NaOH. Til blandingen ble det tilsatt dråpevis 4 ml av en 25 % gluteraldehydløsning, og løsningen ble inkubert ved 25°C i 18 timer. Etter dialyse mot tre skift saltvann ble den mengden LHRH som var forent med An amount of 10 mg of LHRH and 500 µl (50 mg) of Protein A was dissolved in 34 ml of distilled water and the pH was adjusted to 8 using 0.01 M NaOH. To the mixture was added dropwise 4 ml of a 25% gluteraldehyde solution, and the solution was incubated at 25°C for 18 hours. After dialysis against three shifts of saline, the amount of LHRH that was combined with

(h) Corynebacterium parvum - LHRH.(h) Corynebacterium parvum - LHRH.

LHRH (100 mg) og corynebacterium parvum (60 mg) ble opp-løst i 5 ml destillert vann og pH justert til 6,0 ved anvendelse av 0,1 N NaOH. En nylaget løsning av 0,2 g ECDI i 2 ml destillert vann ble tilsatt dråpevis og blandingen ble inkubert ved romtemperatur over natten. Løsningen ble dialysert mot tre skift saltvann (5 liter). LHRH (100 mg) and corynebacterium parvum (60 mg) were dissolved in 5 ml of distilled water and pH adjusted to 6.0 using 0.1 N NaOH. A freshly prepared solution of 0.2 g ECDI in 2 ml distilled water was added dropwise and the mixture was incubated at room temperature overnight. The solution was dialyzed against three changes of saline (5 litres).

(i) Keyhole limpet haemocyanin - LHRH.(i) Keyhole limpet haemocyanin - LHRH.

LHRH (120 mg) og Keyhole limpet haemocyanin (80 mg) ble oppløst i 10 ml destillert vann og pH justert til 6,0 ved anvendelse av 0,1 N NaOH. En nylaget løsning av 0,4 g ECDI i 4 ml destillert vann ble tilsatt dråpevis og blandingen ble inkubert ved romtemperatur over natten. Løsningen ble dialysert mot tre skift saltvann (5 liter). LHRH (120 mg) and Keyhole limpet haemocyanin (80 mg) were dissolved in 10 ml of distilled water and pH adjusted to 6.0 using 0.1 N NaOH. A freshly prepared solution of 0.4 g ECDI in 4 ml distilled water was added dropwise and the mixture was incubated at room temperature overnight. The solution was dialyzed against three changes of saline (5 litres).

For å måle effektiviteten av koblingen, d.v.s. antall mol LHRH bundet til bærerproteiner, ble 0,15 nCi<125>I-LHRH tilsatt til ovennevnte blanding. Etter hver reaksjon ble prosent bundet<125>I-LHRH beregnet basert på tellingene oppnådd før og etter dialyse. Generelt var effektiviteten av koblingen god. To measure the effectiveness of the link, i.e. number of moles of LHRH bound to carrier proteins, 0.15 nCi<125>I-LHRH was added to the above mixture. After each reaction, percent bound<125>I-LHRH was calculated based on the counts obtained before and after dialysis. In general, the efficiency of the coupling was good.

B. RESULTATER.B. RESULTS.

Forsøk 1.Attempt 1.

En gruppe på 42 værlam av type Merino ble anvendt i dette forsøket. Værene ble utvalgt på grunnlag av levende vekt og oppdelt i syv grupper på seks værer. (Under forsøket mistet man imidlertid noen værer, idet dødsfallene skyldtes pneumonia). Behandlingen er vist i det følgende: A group of 42 Merino lambs was used in this experiment. The rams were selected on the basis of live weight and divided into seven groups of six rams. (During the experiment, however, some rams were lost, as the deaths were due to pneumonia). The treatment is shown in the following:

Gruppe. Behandling.Group. Treatment.

1. Alle værer injisert med bærerproteinene KLH, Protein A og tetanus toxoid. 1. All rams are injected with the carrier proteins KLH, Protein A and tetanus toxoid.

2. Værer operativt kastrert ti uker gamle.2. Is operatively neutered ten weeks old.

3- Værer immunisert overfor et LHRH-tetanus toxoid konjugat. 4. Værer immunisert overfor et LHRH-Protein A konjugat. 3- Be immunized against an LHRH-tetanus toxoid conjugate. 4. Are immunized against an LHRH-Protein A conjugate.

5. Værer immunisert overfor et LHRH-KLH konjugat.5. Are immunized against an LHRH-KLH conjugate.

6. Værer immunisert overfor et LHRH-HSA konjugat.6. Are immunized against an LHRH-HSA conjugate.

7. Værer immunisert overfor LHRH-TT, LHRH-Protein A, og LHRH-KLH konjugater. 7. Are immunized against LHRH-TT, LHRH-Protein A, and LHRH-KLH conjugates.

Dosen, sammensetningen og injeksjons tiden for konjugatene er vist i tabell 1. (Side 13) The dose, composition and injection time for the conjugates are shown in table 1. (Page 13)

Hver individuelle immunogenløsning ble emulgert med like volumer av "Freund's complete"-tilsetningsmiddel. Værlammene ble deretter gitt subkutant 2 ml av blandingen på fire separate steder i bakleggen nær lysken. De kombinerte immunogener ble injisert med 8 ml av emulsjonen. Booster-injeksjoner ble fremstilt ved anvendelse av like mengder "Freund's incomplete"-tilsetningsmiddel. Each individual immunogen solution was emulsified with equal volumes of Freund's complete additive. The lambs were then given subcutaneously 2 ml of the mixture at four separate sites in the hind leg near the groin. The combined immunogens were injected with 8 ml of the emulsion. Booster injections were prepared using equal amounts of Freund's incomplete adjuvant.

Blodprøver ble samlet ved venepunksjon to uker etter den andre Booster-injeksjon. Antistofftitrene fra dette forsøk er vist i tabell 3. (Side 16) Blood samples were collected by venipuncture two weeks after the second Booster injection. The antibody titres from this experiment are shown in table 3. (Page 16)

Forsøk 2.Attempt 2.

En flokk på 35 oksekalver av stort sett rasen Friesian ble anvendt i dette forsøk. Kalvene ble alt opp på skummet melk og avvendt til gress i en alder av ti uker. Oksene ble oppdelt i fem grupper på syv dyr ved anvendelse av den levende vekt som grunnlag for utvelgelsen (under forsøket gikk det tapt tre okser på grunn av pneumonia). Behandlingene er vist under. A herd of 35 bull calves of the mostly Friesian breed was used in this experiment. The calves were raised on skimmed milk and weaned to grass at the age of ten weeks. The bulls were divided into five groups of seven animals using the live weight as the basis for the selection (during the experiment three bulls were lost due to pneumonia). The treatments are shown below.

Gruppe. Behandling.Group. Treatment.

1. Alle oksekalvene ble immunisert med henblikk på bærerproteiner, tetanus toxoid, Keyhole limpet haemocyanin og Protein A (n=6). 2. Oksekalver operativt kastrert i en alder av 14 uker (n=6). 3. Oksekalver immunisert med henblikk på LHRH-HSA konjugat (n= 6). 4. Oksekalver immunisert med henblikk på LHRH-tetanus toxoid konjugat (n=6). 5. Oksekalver immunisert med henblikk på LHRH-koblet til tetanus toxoid, Keyhole limpet haemocyanin og Protein A (n=6). 1. All bull calves were immunized against carrier proteins, tetanus toxoid, Keyhole limpet haemocyanin and Protein A (n=6). 2. Beef calves operatively castrated at the age of 14 weeks (n=6). 3. Bull calves immunized with a view to LHRH-HSA conjugate (n= 6). 4. Calves immunized with LHRH-tetanus toxoid conjugate (n=6). 5. Calves immunized against LHRH linked to tetanus toxoid, Keyhole limpet haemocyanin and Protein A (n=6).

Sammensetningen, dosen og immuniseringsfortegnelsen for for-søket er gitt i tabell 2. (Side 15) The composition, dose and immunization schedule for the trial are given in table 2. (Page 15)

For immuniseringsprosedyren ble den immunogene løsning emulgert i et likt volum av "Freund's complete"-tilsetningsmiddel. For alle individuelle behandlingsgrupper ble et totalt volum på 2 ml av emulsjonsløsningen injisert på fire til fem steder. For den kombinerte immunogene gruppe ble oksekalver injisert med 8 ml av emulsjonsløsningen på fire til fem steder. Injek-sjonene ble gitt subkutant nær den fremre skulder og bryst-stykket hos kalvene. For booster-injeksjoner ble immunogenene emulgert ved anvendelse av "Freund's incomplete"-tilsetningsmiddel. Blodprøver ble samlet på heparinglass to uker etter den andre booster-injeksjon. Antostofftitrene for dette for-søk er gitt i tabell 4. (Side 17) For the immunization procedure, the immunogenic solution was emulsified in an equal volume of Freund's complete adjuvant. For all individual treatment groups, a total volume of 2 ml of the emulsion solution was injected at four to five sites. For the combined immunogenic group, bull calves were injected with 8 ml of the emulsion solution at four to five sites. The injections were given subcutaneously near the front shoulder and breast piece of the calves. For booster injections, the immunogens were emulsified using Freund's incomplete adjuvant. Blood samples were collected on heparin slides two weeks after the second booster injection. The antibody titres for this research are given in table 4. (Page 17)

En test ble utviklet for å studere den sosiale og seksuelle oppførsel av oksene. Dette omfattet av hver oksekalv ble ut-satt for en ikke-brunstig hunn i 15 minutter idet man obser-verte og målte den sosiale og seksuelle oppførsel hos dyrene. Resultatene fra disse forsøk er vist i tabell 5. A test was developed to study the social and sexual behavior of the bulls. This included each bull calf being exposed to a non-estrous female for 15 minutes while observing and measuring the social and sexual behavior of the animals. The results from these trials are shown in table 5.

Antistofftitrene som er vist i tabell 3 og 4 for værlam og oksekalver som henholdsvis er immunisert med forskjellige LHRH-konjugater og henholdsvis kombinasjoner derav, er gitt grafisk i fig. 1 og 2. The antibody titres shown in Tables 3 and 4 for weather lambs and bull calves which are respectively immunized with different LHRH conjugates and respective combinations thereof are given graphically in fig. 1 and 2.

I fig. 1, som ventet, viste ingen av værlammene som var immunisert med bærerproteinet alene noen immunrespons i måle-systemet. Lam som var immunisert med ett eneste LHRH-konjugat ga variable resultater i både antistofftiter og antall dyr som responderte. Med KLH responderte bare 40 % av dyrene. Det gjennomsnittlige titer av denne respons er 1:130. Et lignende resultat ble oppnådd med Protein A, hvor, skjønt 66 % av de utprøvede dyrene ga en immunrespons (to av dyrene i forsøkene døde av pneumonia), var det gjennomsnittlige titer for denne respons 1:130. De beste resultater ved anvendelse av et eneste konjugat ble oppnådd for tetanus toxoid (TT), hvor 60 % av dyrene viste en immunrespons med et gjennomsnittlig titer på 1:2200. In fig. 1, as expected, none of the weather lambs immunized with the carrier protein alone showed any immune response in the measurement system. Lambs immunized with a single LHRH conjugate gave variable results in both antibody titer and number of animals responding. With KLH, only 40% of the animals responded. The average titer of this response is 1:130. A similar result was obtained with Protein A, where, although 66% of the tested animals gave an immune response (two of the animals in the experiments died of pneumonia), the average titer for this response was 1:130. The best results using a single conjugate were obtained for tetanus toxoid (TT), where 60% of the animals showed an immune response with a mean titer of 1:2200.

Resultatene oppnådd på immunisering med en blanding av LHRH-TT, LHRH-Protein A og LHRH-KLH konjugater viser effektiviteten av den foreliggende oppfinnelse. Alle lammene som ble testet ga en vesentlig immunrespons med et gjennomsnittlig titer på 1:5146, idet antostofftitrene for de individuelle dyr varierte fra 1:600 til 1:20.000. Disse resultater er klart overlegne og er statistisk mer signifikante (p<0,05 på x<2>test av delen av dyrene som responderer) i forhold til dem som er oppnådd ved anvendelse av ett eneste LHRH-konjugat. The results obtained on immunization with a mixture of LHRH-TT, LHRH-Protein A and LHRH-KLH conjugates demonstrate the effectiveness of the present invention. All the lambs tested produced a significant immune response with an average titer of 1:5146, the antibody titers for the individual animals varying from 1:600 to 1:20,000. These results are clearly superior and are statistically more significant (p<0.05 on x<2>test of the proportion of animals responding) compared to those obtained using a single LHRH conjugate.

Lignende resultater, omfattende den samme statistiske signi-fikans som den ovennevnte, er vist i fig. 2 hvor alle oksekalvene som var immunisert med en blanding av LHRH koblet til tetanus toxoid, Keyhole limpet haemocyanin og Protein A, viste en god immunrespons med et gjennomsnittlig titer på 1:170, idet dette står i kontrast til resultatene som er oppnådd med LHRH koblet til et eneste bærerprotein. Similar results, including the same statistical significance as the above, are shown in Fig. 2 where all the bull calves immunized with a mixture of LHRH coupled to tetanus toxoid, Keyhole limpet haemocyanin and Protein A showed a good immune response with an average titer of 1:170, contrasting with the results obtained with LHRH coupled to a single carrier protein.

Dataene med hensyn på oppførsel som er presentert i tabell 5 viser at kontrolldyrene brukte mere tid med sosial og seksuell oppførsel og sosial og seksuell undersøkelse enn dyr som var kastrert, eller behandlet med en kombinasjon (LHRH individuelt koblet til KLH, TT og PA), og behandlet med tetanus toxoid (TT koblet til LHRH). Som ventet tilbragte de kastrerte hanner minst tid involvert i sosial og seksuell oppførsel. Tiden som okser brukte i sosial og seksuell oppførsel i den kombinerte behandling var mere enn den tid kastratene brukte men var mindre enn den som kontrolldyrene brukte. Dette antyder at aktiv immunisering med henblikk på LHRH kan influere på den sosiale og seksuelle oppførsel hos oksene. Skjønt kontrolldyrene tilbragte mindre tid involvert i aggressiv gjensidig påvirkning enn både kastratene og kombinasjonsdyrene, er det oppløftende å merke seg at denne egenskap var lik for kastratene og kontrolldyrene i kombinasjonsgruppen (det er mulig at lydige forsøksdyr kan være assosiert med aggressiv gjensidig påvirkning). Igjen antyder dette at immuniseringen kan påvirke aggresjon. Det er klart at det var en større effekt på oppførselen hos dyrene i kombinasjonsbehandlingen enn på dyrene som var injisert med tetanus toxoid-LHRH og HSA-LHRH konjugater. The data regarding behavior presented in Table 5 show that the control animals spent more time with social and sexual behavior and social and sexual examination than animals that were castrated, or treated with a combination (LHRH individually linked to KLH, TT and PA), and treated with tetanus toxoid (TT linked to LHRH). As expected, the castrated males spent the least amount of time involved in social and sexual behavior. The time that bulls spent in social and sexual behavior in the combined treatment was more than the time spent by the castrates but was less than that spent by the control animals. This suggests that active immunization with a view to LHRH can influence the social and sexual behavior of the bulls. Although the control animals spent less time involved in aggressive interaction than both the castrates and the combination animals, it is encouraging to note that this characteristic was similar for the castrates and control animals in the combination group (it is possible that obedient subjects may be associated with aggressive interaction). Again, this suggests that the immunization may influence aggression. It is clear that there was a greater effect on the behavior of the animals in the combination treatment than in the animals injected with tetanus toxoid-LHRH and HSA-LHRH conjugates.

Forsøk 3.Attempt 3.

En flokk på 80 værer av typen Merino X Corredale i en alder av fem måneder ble anvendt i dette forsøk. Værene (16 uker gamle) ble fordelt i åtte grupper på ti værer. En gruppe ble kastrert operativt 16 uker gamle, og en annen gruppe forble ubehandlet. De gjenværende 60 værer ble behandlet med et antall LHRH-antigener. A flock of 80 Merino X Corredale rams at the age of five months was used in this experiment. The rams (16 weeks old) were divided into eight groups of ten rams. One group was castrated operatively at 16 weeks of age, and another group remained untreated. The remaining 60 rams were treated with a number of LHRH antigens.

Forskjellige LHRH-bærerproteinkonjugater ble fremstilt som beskrevet tidligere. Antigenene som anvendes var LHRH koblet separat til diphtheria toxoid, tetanus toxoid, Keyhole limpet haemocyanin og corynebacterium parvum. To andre grupper ble injisert med to forskjellige kombinasjoner av de individuelle LHRH-komplekser. Behandlingene er vist i tabell 6, sammen med totalt antall anvendte konjugater. Værer ble injisert subkutant i nakken med disse eneste LHRH-bærerproteiner ved anvendelse av "Freund's complete" tilsetningsmiddel. Various LHRH carrier protein conjugates were prepared as described previously. The antigens used were LHRH linked separately to diphtheria toxoid, tetanus toxoid, Keyhole limpet haemocyanin and corynebacterium parvum. Two other groups were injected with two different combinations of the individual LHRH complexes. The treatments are shown in Table 6, along with the total number of conjugates used. Rams were injected subcutaneously in the neck with these single LHRH carrier proteins using Freund's complete adjuvant.

Åtte uker etter booster-injeksjonen ble inngjerdingstester Eight weeks after the booster injection, enclosure tests were performed

gjennomført på alle dyrene for å bestemme om de var seksuelt aktive. Dette omfattet at hver hann ble forestilt for fire brunstige hunner i et område (5 m x 5 m) i 15 minutter og måling av omganger med anogenital undersøkelse, omganger med beiling, antall bestigninger og antall ejakulasjoner gjennom-ført av hanndyrene. Seks hanner ble observert samtidig og alle dyrene ble observert på samme dag. Dyrene ble holdt i testarenaene i tolv timer før inngjerdingstesten slik at dyrene skulle bli vant med testforholdene. Et dyr ble betraktet å være seksuelt aktiv dersom han besteg og/eller ejakulerte under testen. conducted on all the animals to determine if they were sexually active. This included each male being presented to four estrus females in an area (5 m x 5 m) for 15 minutes and measuring the number of anogenital examination sessions, courtship sessions, number of mounts and number of ejaculations performed by the males. Six males were observed simultaneously and all animals were observed on the same day. The animals were kept in the test arenas for twelve hours before the enclosure test so that the animals would get used to the test conditions. An animal was considered to be sexually active if he mounted and/or ejaculated during the test.

Levende vekt og testikkelstørrelse (som bestemt ved anvendelse av en serie kalibrerte kuler) ble målt hver fjerde uke. Live weight and testis size (as determined using a series of calibrated spheres) were measured every four weeks.

Antistofftiter til LHRH ble målt med både radioimmuniassay (RIA) og ELISA-teknikker. Plasmaprøver ble fortynnet i serie med fosfalinbuffer (0,05 M, pH 7,6). De fortynnede prøvene (100/Ul) ble tilsatt til 100^ul bovint gammaglobulin (3 % 9 w/v) og 100^ul av en bufferløsning inneholdende 2nCi<12>^I-LHRH. Rørene ble inkubert over natten ved 4°C. Antibody titers to LHRH were measured by both radioimmunoassay (RIA) and ELISA techniques. Plasma samples were serially diluted with phosphaline buffer (0.05 M, pH 7.6). The diluted samples (100/µl) were added to 100 µl bovine gamma globulin (3% 9 w/v) and 100 µl of a buffer solution containing 2nCi<12>^I-LHRH. The tubes were incubated overnight at 4°C.

Fri og bundet LHRH ble separert ved tilsetning av 1 ml 21 % polyetylenglykol 4000 og supernatanten avsuges etter sentri-fugering. Rørene ble talt i ett minutt i en clinigamma-teller. Free and bound LHRH were separated by adding 1 ml of 21% polyethylene glycol 4000 and the supernatant was aspirated after centrifugation. The tubes were counted for one minute in a klinitamma counter.

De levende vekter av alle værer er vist i tabell 7. Det var ingen betydelig forskjell blant gruppene skjønt de gjennomsnittlige verdier for den levende vekt for de immuniserte værer var større enn for de kastrerte hanner, men lavere enn for kontrollværene. Gjennomsnittlig testikkelvolum for hver behandling er vist i tabell 8 og fig. 3 og 4. The live weights of all rams are shown in Table 7. There was no significant difference between the groups although the mean live weight values for the immunized rams were greater than for the castrated males, but lower than for the control rams. Average testicular volume for each treatment is shown in table 8 and fig. 3 and 4.

Det var betydelig variasjon med hver individuelle antigen-behandling. Den største nedsettelse for individuelle bærere ble observert i værer som var immunisert med henblikk på LHRH koblet til diphtheria toxoid. De nest beste bærere var tetanus toxoid etterfulgt av Keyhole limpet haemocyanin og corynebacterium parvum. De to forskjellige kombinasjoner av tre separate antigener ga lavere testvolumer enn hvert av de individuelle antigener. There was considerable variation with each individual antigen treatment. The greatest reduction for individual carriers was observed in rams immunized with LHRH coupled to diphtheria toxoid. The next best carriers were tetanus toxoid followed by Keyhole limpet haemocyanin and corynebacterium parvum. The two different combinations of three separate antigens gave lower test volumes than each of the individual antigens.

En lignende utvikling i resultater ble observert for RIA-resultatene. De gjennomsnittlige titrer var høyere i de to grupper med de kombinerte antigener, etterfulgt av diphtheria toxoid, tetanus toxoid, Keyhole limpet haemocyanin, corynebacterium parvum. De individuelle RIA og ELISA IgC-resultater er vist i tabell 9. A similar development in results was observed for the RIA results. The mean titers were higher in the two groups with the combined antigens, followed by diphtheria toxoid, tetanus toxoid, Keyhole limpet haemocyanin, corynebacterium parvum. The individual RIA and ELISA IgC results are shown in Table 9.

Generelt hadde de værer med høye RIA-titer forhøyede titere målt ved hjelp av ELISA-assay. Avvik ble imidlertid funnet hos individuelle værer, i noen tilfeller ble høye RIA-titere funnet i prøver med lave IgC-titere. Disse resultater fore-slår at RIA-assay måler et større antall antistoffunder-grupper enn den mere spesifike IgG ELISA-assay. In general, those rams with high RIA titers had elevated titers measured by ELISA assay. However, discrepancies were found in individual rams, in some cases high RIA titers were found in samples with low IgC titers. These results suggest that the RIA assay measures a greater number of antibody subgroups than the more specific IgG ELISA assay.

Andelen av værer i hver gruppe som var seksuelt aktive to måneder etter booster-injeksjonen er vist i tabell 10. Ti ut av et totalt antall på ti værer i kontrollgruppen viste seksuell aktivitet. Det beste antigen alene var diphtheria toxoid med en til ni værer seksuelt aktive. Effektivitets-rekkefølgen var diphtheria toxoid, tetanus toxoid, Keyhole limpet haemocyanin og corynebacterium parvum. De to grupper med de kombinerte antigener var ikke seksuelt aktive. For de værer som var gitt en kombinasjon av TT, DT og KLH koblet til LHRH var det ingen aktive værer i et totalt antall på ti værer. Lignende resultater ble oppnådd ved anvendelse av forskjellige kombinasjoner av bærere, DT, CP og KLH hvor det igjen var ingen aktive værer i et totalt antall på åtte værer (to værer døde under forsøket). Ingen av de kastrerte værer var seksuelt aktive. The proportion of rams in each group that were sexually active two months after the booster injection is shown in Table 10. Ten out of a total number of ten rams in the control group showed sexual activity. The best antigen alone was diphtheria toxoid with one to nine being sexually active. The order of effectiveness was diphtheria toxoid, tetanus toxoid, Keyhole limpet haemocyanin and corynebacterium parvum. The two groups with the combined antigens were not sexually active. For the rams that had been given a combination of TT, DT and KLH coupled to LHRH, there were no active rams in a total number of ten rams. Similar results were obtained using different combinations of carriers, DT, CP and KLH where again there were no active rams in a total of eight rams (two rams died during the experiment). None of the castrated rams were sexually active.

Disse resultater indikerer at en kombinasjon av forskjellige bærerproteiner gir en bedre fysiologisk respons enn hvert individuelle antigen gitt separat. Denne effekt ble observert for testikkelstørrelse, RIA-titere og for andelen av dyr som var seksuelt aktive. Totalt indikerer disse resultater at kombinasjoner av LHRH-antigener gir en bedre immunrespons sammenlignet med individuelle antigener. These results indicate that a combination of different carrier proteins produces a better physiological response than each individual antigen given separately. This effect was observed for testis size, RIA titers and for the proportion of animals that were sexually active. Overall, these results indicate that combinations of LHRH antigens produce a better immune response compared to individual antigens.

Andre aspekter med den foreliggende oppfinnelse og modifikasjoner og variasjoner derav vil være tydelig for den fag-kyndige på området ved å lese denne ansøkning, og alle slike andre aspekter og modifikasjoner og variasjoner betraktes å være innenfor området for den foreliggende oppfinnelse. Other aspects of the present invention and modifications and variations thereof will be apparent to the person skilled in the art upon reading this application, and all such other aspects and modifications and variations are considered to be within the scope of the present invention.

REFERANSER.REFERENCES.

Arimura et al. (1974) - Blockage of the Preovulatory surge of LH and FSH and ovulatlon by anti-LHRH serum in rats. Endocrinology 95: 323-325. Arimura et al. (1974) - Blockage of the Preovulatory surge of LH and FSH and ovulation by anti-LHRH serum in rats. Endocrinology 95: 323-325.

Chappel et al. (1980) - Active immunization of male rhesus monkeys against luteinizing hormone releasing hormone. Biology of Reproduction. 22: 333-3^2. Chappell et al. (1980) - Active immunization of male rhesus monkeys against luteinizing hormone releasing hormone. Biology of Reproduction. 22: 333-3^2.

Clarke et al. (1978) - Active immunization of ewes against luteinizing hormone releasing hormone, and its effect in ovulation and gonadotrophin, prolactin and ovarian steroid secretion. Clark et al. (1978) - Active immunization of ewes against luteinizing hormone releasing hormone, and its effect in ovulation and gonadotrophin, prolactin and ovarian steroid secretion.

de al Cruz et al. (1976) - Effect of adminstration of antiserum to luteinizing hormone-releasing hormone on gonadal function during the oestrous cycle in hamster. de al Cruz et al. (1976) - Effect of administration of antiserum to luteinizing hormone-releasing hormone on gonadal function during the oestrous cycle in hamsters.

Endocrinology 98: 490-497.Endocrinology 98: 490-497.

Fraser et al. (1974) - Effect of active immunization to luteinizing hormone releasing hormone on serum and pituitary gonadotrophins, tests and accessory sex organs in the male rat. J. Endocr. 63: 399-406. Fraser et al. (1974) - Effect of active immunization to luteinizing hormone releasing hormone on serum and pituitary gonadotrophins, testes and accessory sex organs in the male rat. J. Endocr. 63: 399-406.

Fraser et al. (1978) - Changes in the ovaries of rats after immunization against luteinizing hormone releasing hormone. Fraser et al. (1978) - Changes in the ovaries of rats after immunization against luteinizing hormone releasing hormone.

J. Endocrinology 77: 85-93-J. Endocrinology 77: 85-93-

Fraser et al. (1982) - In: Progress Towards a Male Contraceptive, (ss. 41-78 Ed. Jeffcoate, S.K., and Fraser et al. (1982) - In: Progress Towards a Male Contraceptive, (pp. 41-78 Ed. Jeffcoate, S.K., and

Sandler, M. John Wiley & Sons, Bristol).Sandler, M. John Wiley & Sons, Bristol).

Herbert, W.J. - In: Veterinary Immunology (Blackwell) Scientific, Pub.). Herbert, W.J. - In: Veterinary Immunology (Blackwell) Scientific, Pub.).

Hodges and Hearn (1977) - Effect of immunization against luteinizing hormone release hormone on reproduction of the mamoset monkey. Nature, 265: 746-748. Hodges and Hearn (1977) - Effect of immunization against luteinizing hormone release hormone on reproduction of the mamoset monkey. Nature, 265: 746-748.

Jeffcoate et al. (1982) - Effects of active immunization of ram lambs and bull calves against synthetic luteinizing hormone releasing hormone. Theriogenology, 18: 65-77. Jeffcoat et al. (1982) - Effects of active immunization of ram lambs and bull calves against synthetic luteinizing hormone releasing hormone. Theriogenology, 18: 65-77.

Kock (1977) - In: Proceedings of the 5th International Congress of Endocrinology (ss. 374-378. Ed. by James, V.H.T., July 18-24). Kock (1977) - In: Proceedings of the 5th International Congress of Endocrinology (pp. 374-378. Ed. by James, V.H.T., July 18-24).

McCormack et al. (1977) - The effect of luteinizing hormone releasing hormone (LHRH) antisera administration of gonadotrophin secretion in the rhesus monkey. McCormack et al. (1977) - The effect of luteinizing hormone releasing hormone (LHRH) antisera administration on gonadotrophin secretion in the rhesus monkey.

Endocrinology 100: 663-667.Endocrinology 100: 663-667.

Nieschlag and Kleg (1974) - Loss of sexual activity in rabbits actively immunized with testosterone. Nieschlag and Kleg (1974) - Loss of sexual activity in rabbits actively immunized with testosterone.

Experimentia 30, 434, 435.Experimentia 30, 434, 435.

Robertson et al. (1970) - Affect of castration and diatary protein level on growth and carcass composition in beef cattle. Journal of Agricultural Science (Cambridge 74: 299-310). Robertson et al. (1970) - Affect of castration and dietary protein level on growth and carcass composition in beef cattle. Journal of Agricultural Science (Cambridge 74: 299-310).

Robertson et al. (1979) - Immunological castration in male cattle. Vet. Ree. 105: 556-557. Robertson et al. (1979) - Immunological castration in male cattle. Know. Ree. 105: 556-557.

Robertson et al. (1981) - Further studies on immunological castration in male cattle. Vet. Ree. 111: 529-531. Robertson et al. (1981) - Further studies on immunological castration in male cattle. Know. Ree. 111: 529-531.

Robertson et al. (1984) - Immunological castration of young bulls for beef production. In "Manipulation of growth in farm animals" (Eds. Roche, J.F. and D'Callaghan, D) ss. 137-145. Schanbacher (1982) - Responses of ram lambs to active immunization against testosterone and luteinizing hormone releasing hormone. J. Physiol. 242E, 201-205. Robertson et al. (1984) - Immunological castration of young bulls for beef production. In "Manipulation of growth in farm animals" (Eds. Roche, J.F. and D'Callaghan, D) pp. 137-145. Schanbacher (1982) - Responses of ram lambs to active immunization against testosterone and luteinizing hormone releasing hormone. J. Physiol. 242E, 201-205.

Schanbacher (1984) - Active immunization against LHRH in the male. In "Immunological Aspects of Reproduction in Mammals".' ss. 345-362. Ed. D.B. Crighton. Butterworths. Schanbacher (1984) - Active immunization against LHRH in the male. In "Immunological Aspects of Reproduction in Mammals".' pp. 345-362. Oath. D. B. Crighton. Butterworths.

Claims

1. A preparation for the formation of antibodies in animals specific for LHRH, characterized in that the above preparation comprises two or more different carriers which are individually linked to LHRH or analogues of LHRH, in amounts sufficient to trigger an immune response with respect to LHRH.

2. Preparation as stated in claim 1, characterized in that at least two of the carriers are carrier proteins.

3. Preparation as stated in claim 2, characterized in that at least one of the carrier proteins is Diphtheria toxoid.

4. Preparation as specified in claims 1 - 3, characterized in that the preparation further comprises an excipient.

5. Preparation as specified in claim 4, characterized in that the selected excipient is such that the preparation does not cause inflammation.

6. A method of suppressing male social and sexual behavior in domestic animals, characterized by the administration of a preparation as specified in claims 1 - 5.

7. Method for suppressing ovulation and estrous cyclicity in female domestic animals, characterized by the administration of a preparation as specified in claims 1 - 5.

8. Method as stated in claim 6, characterized in that said preparations are added two or more times.

9. Procedure as stated in claims 6-8, characterized in that the animals are selected from dogs, cats, cattle, sheep, donkeys, rabbits and deer.

10. Preparation for the production of antibody in animals that is specific to a substance which, when conjugated to a carrier, is able to trigger an immune response in the animal, characterized in that the preparation comprises a mixture of the substance conjugated to at least two different carriers.