NO880918L - Preparat og metode for immunologisk kastrering og sterilisering. - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører undertrykkelsen av sosial og seksuell oppførsel hos husdyr av hannkjønn og undertrykkelse av ovulasjon og østral syklisitet hos husdyr av hunnkjønn, og mere spesielt et preparat og metode for immuno-logisk kastrering og sterilisering.

Normal seksuell oppførsel hos hanndyr opprettholdes ved hjelp av androgener, eller mannlige kjønnshormoner, idet disse i alt vesentlig fremstilles i testiklene. Ett av de viktigste androgener er testosteron. Det er vanlig praksis hos bønder å eliminere seksuell aktivitet og redusere aggressiv oppførsel hos buskapen ved hjelp av operativ kastrering. Imidlertid er en rekke ulemper tilknyttet operativ kastrering. Disse omfatter blødning, infeksjon og stressassosiert vekttap (Schanbacher, 1984). Videre reduserer kastrering både veksthastig-het og mengden mager vevsavsettelse (Robertson et al., 1970).

Et alternativ til operativ kastrering er aktiv immunisering mot luteiniserende hormonfrigjørende hormon (heretter omtalt som LHRH) eller analoger derav. LHRH frigjøres fra hypotalamus inn i hypofyseportåren. Man har foreslått at LHRH binder seg til gonadotrofene fra hypofysens forlapp for å stimulere sekresjon og frigjøring av luteiniserende hormon (LH). LH virker på Leydig-cellene i testikkelen for å øke produksjonen av testosteron. Aktiv immunisering med henblikk på LHRH av-bryter forbindelsen mellom hypotalamus og hypofysen. Man antar at det sted hvori antistoff over LHRH vil inhibere re-produktiv funksjon er i hypofyseportblodårene (Schanbacher, 1984).

Aktiv immunisering med henblikk på LHRH fører til markerte forandringer i funksjon og morfologi av hypofyseforlappen, dette resulterer i en reduksjon i vekten, gonadotrofininnhold og LHRH-binding hos hypofysen i en rekke arter omfattende rotter (Kock, 1977, Fraser et al., 1982), kanin (Arimura et al., 1974) og apekatt (Chappel et al., 1980). I tillegg har man en reduksjon i sekresjon av testosteron og involusjon av testiklene (rotter: Fraser et al., 1982, kloape: Hodges and Hearn, 1977, vær: Schanbacher et al., 1982, Jeffcoate et al., 1982, okse: Robertson og andre, 1979, 1981, 1982, 1984).

Graden av vektøkning hos okser som aktivt er immunisert med henblikk på LHRH er betydelig større enn hos kastrerte ungstuter (Robertson et al., 1982). Immunokastrater omsetter også maten mere effektivt, har en større prosentandel som er slakteferdige, magrere skrotter og har mindre høyde ved rygg-kammen og er smalere rundt forparten enn kastrerte ungstuter (Robertson et al., 1982).

Oksekalver som responderer godt på aktiv immunisering med henblikk på LHRH viser redusert sekresjon av gonadotrofiner (Jeffcoate et al., 1982) og testosteron og en reduksjon i testikkelstørrelse (Robertson og andre, 1 979, 1 981 , 1 982, 1984). Ut fra en subjektiv vurdering av adferden viser det seg at immunokastrater ligner kastrerte ungstuter idet de er mere medgjørlige og er lettere å behandle enn okser (Robertson og andre, 1979, 1981, 1984). Når immuniserte okser fikk betjene en brunstig ku eller en kunstig vagina gjorde tre av fem dyr som hadde antistofftitrer ikke noe forsøk på å bestige kua mens de andre to forsøkte å bestige og en av disse opp-nådde ejakulasjon (Robertson et al., 1982). I en fortsettende undersøkelse, sammenlignet Robertson et al. (1984) ikke-immuniserte okser med dyr som hadde respondert godt på immunisering med henblikk på LHRH og fant at immunokastratene var mindre aktive enn oksene med hensyn på ridning, stanging og slikking og bevegelse.

Aktiv immunisering med henblikk på LHRH er rapportert å under-trykke ovulasjon og brunst hos hunnsauer (Clarke, Fraser og McNeilly, 1 979.) og forårsaker gonadal atrofi i kaniner (Arimura et al., 1973), hamstere (de la Cruz et al., 1976) og rotter (Fraser og Baker, 1978).

I undersøkelsene av Clarke et al. (1978) i sauer, Fraser et al. (1974) i rotter, og McCormack et al. (1977) i rhesusaper, resulterte anti-LHRH-behandling i en markert nedsettelse i plasma LH-konsentrasjoner. Det har således vist seg at anti-LHRH-behandling har en lignende effekt på plasma LH-nivået og den gonade funksjon i hunndyr såvel som i hanndyr. Under-søkelsen av Clarke et al. (1978) er særlig relevant da søyene som tydelig hadde økt LHRH-antistoff ikke ble anovulatoriske og viste ikke østral syklisitet i to påfølgende sesonger.

Skjønt aktiv immunisering med henblikk på LHRH har vært vel-lykket i oksekalver og andre dyr, har man hatt betydelig variasjon mellom individuelle dyr i deres respons overfor immunisering. I de flere undersøkelser responderte bare om-trent halvparten av oksekalvene som var immunisert med henblikk på LHRH på behandling og hadde høye antistofftitrer. Dette ble rapportert for oksekalver som var immunisert når de var tolv uker gamle (Robertson og andre, 1979, 1981), 20 uker gamle (Robertson et al., 1984), og 28 uker gamle (Robertson et al., 1982). Jeffcoate et al. (1982) immuniserte aktivt en måned gamle oksekalver med henblikk på LHRH og rapporterte at antistofftitrene steg etter at dyrene hadde mottatt to injeksjoner av immunogen, men begynte å falle etter en tredje injeksjon. Dette nødvendiggjorde en fjerde injeksjon for å opp-rettholde antistoffti trene.

Fenomenet med mangel på immunrespons overfor et antigen-stimulerende middel er godt dokumentert. F. eks. i læreboken for Veterinary Immunology av Herbert (1976) er det gitt på side 199-200 at "Generelt vil antistofftitre som er funnet hos medlemmer av en vaksinert populasjon bli fordelt på en statistisk normalkurve, idet noen få dyr har høye titrer og en annen liten gruppe responderer ikke i det hele tatt." I et annet avsnitt er det angitt at "Dersom et stort nok antall under-søkes (med antigen) vil noen blant dem som er vaksinert bli funnet å være ubeskyttet. Tekniske feil kan være årsak til noen av disse mens andre ikke er i stand til å oppnå en til- stand av beskyttelsesimmunitet uansett hvor mange ganger anti-genet tilføres, eller uansett om andre forholdsregler (d.v.s. anvendelse av hjelpestoffer) blir tatt for å stimulere immuniteten i dem."

LHRH er et lite peptid med ni aminosyrer. Innen området immunologi er det vel kjent at små immunogener utløser en dårlig immunrespons når de injiseres inn i en vert. Følgelig, i hver av de ovennevnte undersøkelser, har LHRH blitt kjemisk konjugert til et spesielt bærerprotein, f. eks. humant serumalbumin.

Man har nå overraskende funnet at en synergistisk veksel-virkning finner sted når dyrene immuniseres med en kombinasjon av to eller flere forskjellige bærere, koblet til LHRH eller analoger av LHRH. Kombinasjoner av LHRH eller analoger av LHRH konjugert med bærere utløser en effektiv immunrespons (målt med hensyn på antistofftiter) i en større del av dyrene enn dersom LHRH eller analoger av LHRH som er konjugert til en eneste bærer tilføres.

I henhold til et formål med den foreliggende oppfinnelse, har man tilveiebragt et preparat for dannelse av antistoffer i dyr som er spesifikke overfor LHRH eller analoger av LHRH, idet nevnte preparat omfatter to eller flere forskjellige bærere som individuelt er koblet til LHRH eller analoger av LHRH.

Analoger av LHRH er peptider hvori tilføyinger, fjerning, modifikasjoner eller forandringer er gjennomført på den naturlige sekvens av LHRH. Forandringer i den naturlige sekvens omfatter tilføying av en eller flere aminosyrer til den amino-eller karboksylterminale enden av LHRH.

Husdyrarter som faller innenfor området for den foreliggende oppfinnelse omfatter kveg, sauer, geiter, katter, marsvin, svin, hunder, reinsdyr, hester og primater omfattende hunn-kjønn.

Bærere av enhver type som er anvendelige immunogener kan anvendes. Foretrukket er bærerne proteiner og mere foretrukket er proteinene oppløselig i vandig løsning skjønt presipiterte proteiner kan anvendes.

Eksempler på foretrukne proteiner er Diphtheria Toxoid (DT), humant serbumalbumin (HSA), stafylokokkers protein A (P.A.),

Keyhole Limpet Haemocyanin (KLH), og Tetanus Toxoid (TT).

Generelt kan enhver kombinasjon av to eller flere bærere anvendes. Foretrukket er bærerne proteiner slik som HSA og P.A., eller KLH og TT, idet hvert av disse proteinene er konjugert til LHRH. Særlig foretrukket er imidlertid to eller flere bærere hvor hver bærer, koblet til LHRH og tilført separat til et dyr, utløser en generelt god titerrespons. Særlig foretrukket er preparater hvor en av bærerne er Diphtheria Toxoid (DT).

Andre bærere som kan anvendes i henhold til den foreliggende oppfinnelse omfatter lipopolysakkarider, polysakkarider, glykopeptider, muramylpeptidanaloger, peptidoglykaner (fra bakteriecellevegger), liposomer, lecitinlignende materialer og bakterieproteiner, for eksempel rensede proteinderivater fra tuberkulin.

Vanlige teknikker kan anvendes ved konjugering av LHRH og analoger av LHRH til forskjellige bærere. F. eks., er hetero-bifunksjonelle midler slik som SPDP (Pharmacia, Piscataway New Jersey), karbodiimid, glutaraldehyd eller biotin/avidin-systemer anvendelige. Betingelsene velges generelt slik at LHRH eller analoger av LHRH opprettholdes i sin biologiske aktive konformasjon når de er koblet til bæreren.

Foretrukket inneholder preparatene et hjelpestoff. Eksempler på hjelpestoff som kan anvendes er aluminiumhydroksyd, Freunds "incomplete" hjelpestoff, Freunds "complete" hjelpestoff, DEAE-dekstran, levamisol, PCG og polyA, polyC eller polyU.

Særlig foretrukket som hjelpestoffer er materialer som ikke forårsaker lokal inflammasjon. Et eksempel på et slikt material er en mineraloljeblanding som omfatter bakterie-celleveggmaterial slik som peptidoglykaner, eller et syntetisk derivat av et slikt celleveggmaterial. Et slikt syntetisk material er kjent som muramyldipeptid.

Preparatet kan eventuelt bufres til fysiologisk pH ved anvendelse av buffere som TRIS-HC1, Hepes, Pipes eller andre passende buffere.

I henhold til et annet formål ved den foreliggende oppfinnelse, har man tilveiebragt en metode for undertrykkelse av mannlig sosial og seksuell oppførsel hos husdyr omfattende tilførsel av et preparat til et husdyr, idet nevnte preparat omfatter to eller flere forskjellige bærere som individuelt er konjugert til LHRH eller analoger av LHRH.

På den annen side har man en metode for undertrykkelse av ovulasjon ogøstral syklisitet hos husdyr av hunnkjønn ved tilførsel av de ovennevnte beskrevne preparater.

Tilførselen kan være parenteral, f. eks. subkutan og/eller intramuskulær eller intravenøs injeksjon, oralt eller ved absorpsjon gjennom huden eller ved hjelp av en minipumpe som enten er implantert i dyret eller festet utenpå dyret.

Når det gjelder kveg, immuniseres oksekalver foretrukket med preparatet når de er mellom åtte og 40 uker gamle. Når det gjelder sau, immuniseres værlam foretrukket når de er fra åtte til 24 uker. Booster-injeksjoner gis foretrukket med åtte ukers mellomrom og foretrukket gis en til tre booster-in jeks joner .

I den tidligere definerte metode i henhold til den foreliggende oppfinnelse har man innen området for denne metode en behandling hvori tilførsel av substanser (f. eks. LHRH), koblet til to individuelle bærere, er separat, men tilførselen finner sted over en relativt kort tidsperiode. En periode på minutter eller timer vil vanligvis være tilfredsstillende, skjønt det vil være klart upassende sammenlignet med en eneste tilførsel av substansen koblet til minst to bærere.

Den foreliggende oppfinnelse har særlig anvendelse i den immunologiske kastrering og sterilisering av kjeledyr eller selskapsdyr, særlig katter og hunder. Vanlig operativ behandling gjennomført av veterinærer kan være kostbar, og ofte vond for dyret som behandles og dyrets eier.

En økning i omfanget av dyr som responderer kan også fore-komme når andre substanser som utløser en immunrespons, andre enn LHRH eller analoger av LHRH, er konjugert til minst to forskjellige bærere og kombinasjoner av disse konjugater til-føres deretter til dyrene. Eksempler på slike substanser som utløser en immunrespons omfatter peptider og proteiner slik som adrenocortikotropisk hormon, substans P, humant choriion-gonadotrofin, somatostatin, epidermale og insulinlignende vekstfaktorer, steroider omfattende androstenedion (fecundin), testosteron og andre substanser slik som melatonin og prosta-glandinene.

I beskrivelsene har følgende uttrykk den betydning som er angitt under: LHRH: Luteiniserende hormonfrigjørende hormon er en spesifikk substans som er involvert i stimulering av luteiniserende hormon og follikelstimulerende hormon fra adenohypo-fysen.

Bærer: Enhver substans, særlig protein som, når den er koblet til små substanser, kan utløse en immunrespons til dyr.

Antistofftiter: Fortynningen av antiserum som binder

50 % av 0,15 nCi<131>I-merket LHRH i 16 timer ved 4°C. Pre-sipitering av gammaglobuliner ble oppnådd ved anvendelse av polyetylenglykol ved en sluttkonsentrasjon på 14,5 %.

DT: Diphtheria toxoid.

HSA: Humant serumalbumin.

KLH: Keyhole limpet haemocyanin.

TT: Tetanus toxoid.

CP: Corynebacterium parvum.

P. A.: Protein A fra Staphylococcus aureus.

Carb: 1-etyl-3 (3-dimetylaminopropyl) karbodiimid. Glut: GLuteraldehyd.

Den foreliggende oppfinnelse vil nå beskrives ved hjelp av eksempler med referanse til følgende eksperimentelle prosedyrer, eksempler og tabeller.

Fig. 1 og 2 viser antistofftiter (Log-skala) plotted mot forskjellige behandlingsgrupper for henholdsvis værlam og oksekalver. Fig. 3 og 4 viser gjennomsnittlig testikkelvolum hos værlam som har fått Corynebacterium Parvum (CP), Keyhole Limpet Haemocyanin (KLH), Diphteria Toxoid (DT), Diphtheria Toxoid (DT), Tetanus Toxoid (TT) og en kombinasjon av disse bærere koblet til LHRH, CP, KLH, DT i fig. 4, og KLH, TT og DT i fig. 3.

A. EKSPERIMENTELLE PROSEDYRER.

1. Fremstilling av LHRH- konjugater.

(a) Tetanus toxoid - LHRH.

LHRH (240 mg) og tetanus toxoid (35,5 ral, 248 mg) ble oppløst med 20 ml destillert vann og pH i blandingen ble justert til 6,0 med 0,1 N NaOH. En nylaget løsning av 0,4 mg 1-etyl-3 (3-dimetylaminopropyl) karbodiimidhydroklorid (ECDI) i 2 ml destillert vann ble tilsatt dråpevis og reaksjonen fikk fortsette ved romtemperatur (22°C) over natten. Løsningen ble dialysert mot tre skift av saltvann (5 ltr.) For å anslå antall mol LHRH som er bundet til tetanus toxoid ble 3nCi av 1 31

I merket LHRH tilsatt til reaksjonsblandingen. Ved anvendelse av denne prosedyren er det mulig å bestemme den til-synelatende forening av merket LHRH til bærerproteinet, ved å

telle mengden<131>I-LHRH i løsningen før og etter omfat-

tende dialyse. I dette eksempel ble 39 mol LHRH koblet til hvert mol tetanus toxoid. (b) Fremstilling av LHRH - Tetanus toxoid immunogen ved anvendelse av gluteraldehydkoblingsmetoden.

En mengde på 10 mg LHRH og 1200^ul (13,6 mg) tetanus toxoid ble oppløse i 34 ml vann og 0,1 M NaOH ble tilsatt til å gi en endelig pH på 8,0. Gluteraldehyd (4 ml 25 % v/v) ble deretter tilsatt dråpevis og reaksjonen fikk fortsette i 18 timer ved 25°C. Løsningen ble dialysert som beskrevet i (a).

1 31

Beregning av I-LHRH aktivitet før og etter dialyse ga en verdi på 38 mol LHRH pr. mol tetanus toxoid. (c) Fremstilling av LHRH - Protein A immunogen ved anvendelse av karbodiimidkoblingsmetoden.

En mengde LHRH (10 mg i 10 ml vann) ble tilsatt til 500^1 Protein A (50 mg) og 10 ml destillert vann. pH ble justert til 6,5 med 0,01 M NaOH eller HC1, og 200 mg ECDI ble tilsatt i 10 ml destillert vann.

Reaksjonen inkuberes ved 25°C i 18 timer som beskrevet i

del (a).

Forening av 1 31I - LHRH til Protein A ble beregnet til å gi

et LHRH/Protein A forhold på 1:36 etter dialyse mot tre skift fysiologisk saltvann. (d) Fremstilling av LHRH - Protein A immunogen ved anvendelse av gluteraldehydkoblingsmetoden.

En mengde på 10 mg LHRH og 500 ^1 (50 mg) Protein A ble oppløst i 34 ml destillert vann og pH ble justert til 8 ved anvendelse av 0,01 M NaOH. Til blandingen ble det tilsatt dråpevis 4 ml av en 25 % gluteraldehydløsning, og løsningen ble inkubert ved 25°C i 18 timer. Etter dialyse mot tre skift saltvann ble den mengden LHRH som var forent med

(h) Corynebacterium parvum - LHRH.

LHRH (100 mg) og corynebacterium parvum (60 mg) ble opp-løst i 5 ml destillert vann og pH justert til 6,0 ved anvendelse av 0,1 N NaOH. En nylaget løsning av 0,2 g ECDI i 2 ml destillert vann ble tilsatt dråpevis og blandingen ble inkubert ved romtemperatur over natten. Løsningen ble dialysert mot tre skift saltvann (5 liter).

(i) Keyhole limpet haemocyanin - LHRH.

LHRH (120 mg) og Keyhole limpet haemocyanin (80 mg) ble oppløst i 10 ml destillert vann og pH justert til 6,0 ved anvendelse av 0,1 N NaOH. En nylaget løsning av 0,4 g ECDI i 4 ml destillert vann ble tilsatt dråpevis og blandingen ble inkubert ved romtemperatur over natten. Løsningen ble dialysert mot tre skift saltvann (5 liter).

For å måle effektiviteten av koblingen, d.v.s. antall mol LHRH bundet til bærerproteiner, ble 0,15 nCi<125>I-LHRH tilsatt til ovennevnte blanding. Etter hver reaksjon ble prosent bundet<125>I-LHRH beregnet basert på tellingene oppnådd før og etter dialyse. Generelt var effektiviteten av koblingen god.

B. RESULTATER.

Forsøk 1.

En gruppe på 42 værlam av type Merino ble anvendt i dette forsøket. Værene ble utvalgt på grunnlag av levende vekt og oppdelt i syv grupper på seks værer. (Under forsøket mistet man imidlertid noen værer, idet dødsfallene skyldtes pneumonia). Behandlingen er vist i det følgende:

Gruppe. Behandling.

1. Alle værer injisert med bærerproteinene KLH, Protein A og tetanus toxoid.

2. Værer operativt kastrert ti uker gamle.

3- Værer immunisert overfor et LHRH-tetanus toxoid konjugat. 4. Værer immunisert overfor et LHRH-Protein A konjugat.

5. Værer immunisert overfor et LHRH-KLH konjugat.

6. Værer immunisert overfor et LHRH-HSA konjugat.

7. Værer immunisert overfor LHRH-TT, LHRH-Protein A, og LHRH-KLH konjugater.

Dosen, sammensetningen og injeksjons tiden for konjugatene er vist i tabell 1. (Side 13)

Hver individuelle immunogenløsning ble emulgert med like volumer av "Freund's complete"-tilsetningsmiddel. Værlammene ble deretter gitt subkutant 2 ml av blandingen på fire separate steder i bakleggen nær lysken. De kombinerte immunogener ble injisert med 8 ml av emulsjonen. Booster-injeksjoner ble fremstilt ved anvendelse av like mengder "Freund's incomplete"-tilsetningsmiddel.

Blodprøver ble samlet ved venepunksjon to uker etter den andre Booster-injeksjon. Antistofftitrene fra dette forsøk er vist i tabell 3. (Side 16)

Forsøk 2.

En flokk på 35 oksekalver av stort sett rasen Friesian ble anvendt i dette forsøk. Kalvene ble alt opp på skummet melk og avvendt til gress i en alder av ti uker. Oksene ble oppdelt i fem grupper på syv dyr ved anvendelse av den levende vekt som grunnlag for utvelgelsen (under forsøket gikk det tapt tre okser på grunn av pneumonia). Behandlingene er vist under.

Gruppe. Behandling.

1. Alle oksekalvene ble immunisert med henblikk på bærerproteiner, tetanus toxoid, Keyhole limpet haemocyanin og Protein A (n=6). 2. Oksekalver operativt kastrert i en alder av 14 uker (n=6). 3. Oksekalver immunisert med henblikk på LHRH-HSA konjugat (n= 6). 4. Oksekalver immunisert med henblikk på LHRH-tetanus toxoid konjugat (n=6). 5. Oksekalver immunisert med henblikk på LHRH-koblet til tetanus toxoid, Keyhole limpet haemocyanin og Protein A (n=6).

Sammensetningen, dosen og immuniseringsfortegnelsen for for-søket er gitt i tabell 2. (Side 15)

For immuniseringsprosedyren ble den immunogene løsning emulgert i et likt volum av "Freund's complete"-tilsetningsmiddel. For alle individuelle behandlingsgrupper ble et totalt volum på 2 ml av emulsjonsløsningen injisert på fire til fem steder. For den kombinerte immunogene gruppe ble oksekalver injisert med 8 ml av emulsjonsløsningen på fire til fem steder. Injek-sjonene ble gitt subkutant nær den fremre skulder og bryst-stykket hos kalvene. For booster-injeksjoner ble immunogenene emulgert ved anvendelse av "Freund's incomplete"-tilsetningsmiddel. Blodprøver ble samlet på heparinglass to uker etter den andre booster-injeksjon. Antostofftitrene for dette for-søk er gitt i tabell 4. (Side 17)

En test ble utviklet for å studere den sosiale og seksuelle oppførsel av oksene. Dette omfattet av hver oksekalv ble ut-satt for en ikke-brunstig hunn i 15 minutter idet man obser-verte og målte den sosiale og seksuelle oppførsel hos dyrene. Resultatene fra disse forsøk er vist i tabell 5.

Antistofftitrene som er vist i tabell 3 og 4 for værlam og oksekalver som henholdsvis er immunisert med forskjellige LHRH-konjugater og henholdsvis kombinasjoner derav, er gitt grafisk i fig. 1 og 2.

I fig. 1, som ventet, viste ingen av værlammene som var immunisert med bærerproteinet alene noen immunrespons i måle-systemet. Lam som var immunisert med ett eneste LHRH-konjugat ga variable resultater i både antistofftiter og antall dyr som responderte. Med KLH responderte bare 40 % av dyrene. Det gjennomsnittlige titer av denne respons er 1:130. Et lignende resultat ble oppnådd med Protein A, hvor, skjønt 66 % av de utprøvede dyrene ga en immunrespons (to av dyrene i forsøkene døde av pneumonia), var det gjennomsnittlige titer for denne respons 1:130. De beste resultater ved anvendelse av et eneste konjugat ble oppnådd for tetanus toxoid (TT), hvor 60 % av dyrene viste en immunrespons med et gjennomsnittlig titer på 1:2200.

Resultatene oppnådd på immunisering med en blanding av LHRH-TT, LHRH-Protein A og LHRH-KLH konjugater viser effektiviteten av den foreliggende oppfinnelse. Alle lammene som ble testet ga en vesentlig immunrespons med et gjennomsnittlig titer på 1:5146, idet antostofftitrene for de individuelle dyr varierte fra 1:600 til 1:20.000. Disse resultater er klart overlegne og er statistisk mer signifikante (p<0,05 på x<2>test av delen av dyrene som responderer) i forhold til dem som er oppnådd ved anvendelse av ett eneste LHRH-konjugat.

Lignende resultater, omfattende den samme statistiske signi-fikans som den ovennevnte, er vist i fig. 2 hvor alle oksekalvene som var immunisert med en blanding av LHRH koblet til tetanus toxoid, Keyhole limpet haemocyanin og Protein A, viste en god immunrespons med et gjennomsnittlig titer på 1:170, idet dette står i kontrast til resultatene som er oppnådd med LHRH koblet til et eneste bærerprotein.

Dataene med hensyn på oppførsel som er presentert i tabell 5 viser at kontrolldyrene brukte mere tid med sosial og seksuell oppførsel og sosial og seksuell undersøkelse enn dyr som var kastrert, eller behandlet med en kombinasjon (LHRH individuelt koblet til KLH, TT og PA), og behandlet med tetanus toxoid (TT koblet til LHRH). Som ventet tilbragte de kastrerte hanner minst tid involvert i sosial og seksuell oppførsel. Tiden som okser brukte i sosial og seksuell oppførsel i den kombinerte behandling var mere enn den tid kastratene brukte men var mindre enn den som kontrolldyrene brukte. Dette antyder at aktiv immunisering med henblikk på LHRH kan influere på den sosiale og seksuelle oppførsel hos oksene. Skjønt kontrolldyrene tilbragte mindre tid involvert i aggressiv gjensidig påvirkning enn både kastratene og kombinasjonsdyrene, er det oppløftende å merke seg at denne egenskap var lik for kastratene og kontrolldyrene i kombinasjonsgruppen (det er mulig at lydige forsøksdyr kan være assosiert med aggressiv gjensidig påvirkning). Igjen antyder dette at immuniseringen kan påvirke aggresjon. Det er klart at det var en større effekt på oppførselen hos dyrene i kombinasjonsbehandlingen enn på dyrene som var injisert med tetanus toxoid-LHRH og HSA-LHRH konjugater.

Forsøk 3.

En flokk på 80 værer av typen Merino X Corredale i en alder av fem måneder ble anvendt i dette forsøk. Værene (16 uker gamle) ble fordelt i åtte grupper på ti værer. En gruppe ble kastrert operativt 16 uker gamle, og en annen gruppe forble ubehandlet. De gjenværende 60 værer ble behandlet med et antall LHRH-antigener.

Forskjellige LHRH-bærerproteinkonjugater ble fremstilt som beskrevet tidligere. Antigenene som anvendes var LHRH koblet separat til diphtheria toxoid, tetanus toxoid, Keyhole limpet haemocyanin og corynebacterium parvum. To andre grupper ble injisert med to forskjellige kombinasjoner av de individuelle LHRH-komplekser. Behandlingene er vist i tabell 6, sammen med totalt antall anvendte konjugater. Værer ble injisert subkutant i nakken med disse eneste LHRH-bærerproteiner ved anvendelse av "Freund's complete" tilsetningsmiddel.

Åtte uker etter booster-injeksjonen ble inngjerdingstester

gjennomført på alle dyrene for å bestemme om de var seksuelt aktive. Dette omfattet at hver hann ble forestilt for fire brunstige hunner i et område (5 m x 5 m) i 15 minutter og måling av omganger med anogenital undersøkelse, omganger med beiling, antall bestigninger og antall ejakulasjoner gjennom-ført av hanndyrene. Seks hanner ble observert samtidig og alle dyrene ble observert på samme dag. Dyrene ble holdt i testarenaene i tolv timer før inngjerdingstesten slik at dyrene skulle bli vant med testforholdene. Et dyr ble betraktet å være seksuelt aktiv dersom han besteg og/eller ejakulerte under testen.

Levende vekt og testikkelstørrelse (som bestemt ved anvendelse av en serie kalibrerte kuler) ble målt hver fjerde uke.

Antistofftiter til LHRH ble målt med både radioimmuniassay (RIA) og ELISA-teknikker. Plasmaprøver ble fortynnet i serie med fosfalinbuffer (0,05 M, pH 7,6). De fortynnede prøvene (100/Ul) ble tilsatt til 100^ul bovint gammaglobulin (3 % 9 w/v) og 100^ul av en bufferløsning inneholdende 2nCi<12>^I-LHRH. Rørene ble inkubert over natten ved 4°C.

Fri og bundet LHRH ble separert ved tilsetning av 1 ml 21 % polyetylenglykol 4000 og supernatanten avsuges etter sentri-fugering. Rørene ble talt i ett minutt i en clinigamma-teller.

De levende vekter av alle værer er vist i tabell 7. Det var ingen betydelig forskjell blant gruppene skjønt de gjennomsnittlige verdier for den levende vekt for de immuniserte værer var større enn for de kastrerte hanner, men lavere enn for kontrollværene. Gjennomsnittlig testikkelvolum for hver behandling er vist i tabell 8 og fig. 3 og 4.

Det var betydelig variasjon med hver individuelle antigen-behandling. Den største nedsettelse for individuelle bærere ble observert i værer som var immunisert med henblikk på LHRH koblet til diphtheria toxoid. De nest beste bærere var tetanus toxoid etterfulgt av Keyhole limpet haemocyanin og corynebacterium parvum. De to forskjellige kombinasjoner av tre separate antigener ga lavere testvolumer enn hvert av de individuelle antigener.

En lignende utvikling i resultater ble observert for RIA-resultatene. De gjennomsnittlige titrer var høyere i de to grupper med de kombinerte antigener, etterfulgt av diphtheria toxoid, tetanus toxoid, Keyhole limpet haemocyanin, corynebacterium parvum. De individuelle RIA og ELISA IgC-resultater er vist i tabell 9.

Generelt hadde de værer med høye RIA-titer forhøyede titere målt ved hjelp av ELISA-assay. Avvik ble imidlertid funnet hos individuelle værer, i noen tilfeller ble høye RIA-titere funnet i prøver med lave IgC-titere. Disse resultater fore-slår at RIA-assay måler et større antall antistoffunder-grupper enn den mere spesifike IgG ELISA-assay.

Andelen av værer i hver gruppe som var seksuelt aktive to måneder etter booster-injeksjonen er vist i tabell 10. Ti ut av et totalt antall på ti værer i kontrollgruppen viste seksuell aktivitet. Det beste antigen alene var diphtheria toxoid med en til ni værer seksuelt aktive. Effektivitets-rekkefølgen var diphtheria toxoid, tetanus toxoid, Keyhole limpet haemocyanin og corynebacterium parvum. De to grupper med de kombinerte antigener var ikke seksuelt aktive. For de værer som var gitt en kombinasjon av TT, DT og KLH koblet til LHRH var det ingen aktive værer i et totalt antall på ti værer. Lignende resultater ble oppnådd ved anvendelse av forskjellige kombinasjoner av bærere, DT, CP og KLH hvor det igjen var ingen aktive værer i et totalt antall på åtte værer (to værer døde under forsøket). Ingen av de kastrerte værer var seksuelt aktive.

Disse resultater indikerer at en kombinasjon av forskjellige bærerproteiner gir en bedre fysiologisk respons enn hvert individuelle antigen gitt separat. Denne effekt ble observert for testikkelstørrelse, RIA-titere og for andelen av dyr som var seksuelt aktive. Totalt indikerer disse resultater at kombinasjoner av LHRH-antigener gir en bedre immunrespons sammenlignet med individuelle antigener.

Andre aspekter med den foreliggende oppfinnelse og modifikasjoner og variasjoner derav vil være tydelig for den fag-kyndige på området ved å lese denne ansøkning, og alle slike andre aspekter og modifikasjoner og variasjoner betraktes å være innenfor området for den foreliggende oppfinnelse.

REFERANSER.

Arimura et al. (1974) - Blockage of the Preovulatory surge of LH and FSH and ovulatlon by anti-LHRH serum in rats. Endocrinology 95: 323-325.

Chappel et al. (1980) - Active immunization of male rhesus monkeys against luteinizing hormone releasing hormone. Biology of Reproduction. 22: 333-3^2.

Clarke et al. (1978) - Active immunization of ewes against luteinizing hormone releasing hormone, and its effect in ovulation and gonadotrophin, prolactin and ovarian steroid secretion.

de al Cruz et al. (1976) - Effect of adminstration of antiserum to luteinizing hormone-releasing hormone on gonadal function during the oestrous cycle in hamster.

Endocrinology 98: 490-497.

Fraser et al. (1974) - Effect of active immunization to luteinizing hormone releasing hormone on serum and pituitary gonadotrophins, tests and accessory sex organs in the male rat. J. Endocr. 63: 399-406.

Fraser et al. (1978) - Changes in the ovaries of rats after immunization against luteinizing hormone releasing hormone.

J. Endocrinology 77: 85-93-

Fraser et al. (1982) - In: Progress Towards a Male Contraceptive, (ss. 41-78 Ed. Jeffcoate, S.K., and

Sandler, M. John Wiley & Sons, Bristol).

Herbert, W.J. - In: Veterinary Immunology (Blackwell) Scientific, Pub.).

Hodges and Hearn (1977) - Effect of immunization against luteinizing hormone release hormone on reproduction of the mamoset monkey. Nature, 265: 746-748.

Jeffcoate et al. (1982) - Effects of active immunization of ram lambs and bull calves against synthetic luteinizing hormone releasing hormone. Theriogenology, 18: 65-77.

Kock (1977) - In: Proceedings of the 5th International Congress of Endocrinology (ss. 374-378. Ed. by James, V.H.T., July 18-24).

McCormack et al. (1977) - The effect of luteinizing hormone releasing hormone (LHRH) antisera administration of gonadotrophin secretion in the rhesus monkey.

Endocrinology 100: 663-667.

Nieschlag and Kleg (1974) - Loss of sexual activity in rabbits actively immunized with testosterone.

Experimentia 30, 434, 435.

Robertson et al. (1970) - Affect of castration and diatary protein level on growth and carcass composition in beef cattle. Journal of Agricultural Science (Cambridge 74: 299-310).

Robertson et al. (1979) - Immunological castration in male cattle. Vet. Ree. 105: 556-557.

Robertson et al. (1981) - Further studies on immunological castration in male cattle. Vet. Ree. 111: 529-531.

Robertson et al. (1984) - Immunological castration of young bulls for beef production. In "Manipulation of growth in farm animals" (Eds. Roche, J.F. and D'Callaghan, D) ss. 137-145. Schanbacher (1982) - Responses of ram lambs to active immunization against testosterone and luteinizing hormone releasing hormone. J. Physiol. 242E, 201-205.

Schanbacher (1984) - Active immunization against LHRH in the male. In "Immunological Aspects of Reproduction in Mammals".' ss. 345-362. Ed. D.B. Crighton. Butterworths.

Claims (10)

1. Et preparat for dannelse av antistoffer i dyr som er spesifikke for LHRH, karakterisert ved at ovennevnte preparat omfatter to eller flere forskjellige bærere som individuelt er koblet til LHRH eller analoger av LHRH, i mengder som er tilstrekkelig til å utløse en immunrespons med henblikk på LHRH.

2. Preparat som angitt i krav 1, karakterisert ved at minst to av bærerne er bærerproteiner.

3. Preparat som angitt i krav 2, karakterisert ved at minst ett av bærerproteinene er Diphtheria toxoid.

4. Preparat som angitt i krav 1 - 3, karakterisert ved at preparatet ytterligere omfatter et hjelpestoff.

5. Preparat som angitt i krav 4, karakterisert ved at det utvalgte hjelpestoff er slik at preparatet ikke forårsaker inflammasjon.

6. En fremgangsmåte for undertrykkelse av mannlig sosial og seksuell oppførsel hos husdyr, karakterisert ved tilførsel av et preparat som angitt i krav 1 - 5.

7. Fremgangsmåte for undertrykkelse av ovulasjon og østral syklisitet hos husdyr av hunnkjønn, karakterisert ved tilførsel av et preparat som angitt i krav 1 - 5.

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 6, karakterisert ved at nevnte preparater til-føres to eller flere ganger.

9. Fremgangsmåte som angitt i krav 6-8, karakterisert ved at dyrene er valgt fra hunder, katter, kveg, sauer, esler, kaniner og hjort.

10. Preparat for fremstilling av antistoff i dyr som er spesifikt overfor en substans som, når den er konjugert til en bærer, er i stand til å utlø se en immunrespons i dyret, karakterisert ved at preparatet omfatter en blanding av substansen konjugert til minst to forskjellige bærere.