NO904856L - Innretning for detektering eller bestemmelse av naervaer avantigener eller antistoffer i en proeve og testsett for saadan anvendelse. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en innretning for detektering eller bestemmelse av nærvær av antigener eller haptener eller antistoffer i en prøve, og det særegne ved testsettet i henhold til oppfinnelsen er et flertall rør- eller kapillarelementer konstruert av glass eller plastmaterial, idet hvert av disse elementer har antistoffer eller antigener eller haptener festet til deres innside ved hjelp av adsorpsjon eller kovalent binding, og innretninger for å bringe fluider til å passere samtidig eller sekvensmessig gjennom flertallet av kapillarelementer.

Oppfinnelsen vedrører også et testsett for anvendelse ved deteksjon eller bestemmelse av nærvær av antigener eller haptener eller antistoff i en prøve ved hjelp av enzymbundet immunosorbent-testteknikk, og det særegne ved testsettet i henhold til oppfinnelsen er (i) et flertall kapillarelementer konstruert av glass eller plastmaterial, idet hvert av disse elementer har antistoffer eller antigener eller haptener festet til deres innside ved hjelp av adsorpsjon eller kovalent binding, og innretninger for å bringe fluider til å passere samtidig eller sekvensmessig gjennom ovennevnte flertall av kapillarelementer , (ii) et antistoff-enzym- eller antigen-enzymkonjugat, og

(iii) et enzymsubstrat/indikatorsystem.

Disse og andre trekk ved oppfinnelsen fremgår av patent-kravene.

Foreliggende oppfinnelse vedrører forbedringer i metoder, test-sett og apparatur for gjennomføring av enzymkoblede immunosorbentprøver for deteksjon og kvalitativ bestemmelse av antigener og antistoffer. Spesielt vedrører den foreliggende oppfinnelse forbedringer i metoder, test-sett og apparatur som muliggjør at slike prøver kan gjennomføres ved å følge en enkel fremgangsmåte som ikke krever bruk av innviklet laboratorieutstyr eller øvet laboratoriepersonell og følgelig kan gjennomføres under forholdsvis ugunstige betingelser, f.eks. ute i marken.

I den tidligere australske patentansøkning 68.117/81 beskrives det forbedrede metoder og apparatur for gjennom-føring av enzymkoblede immuno-sorbentforsøk (ELISA) og som er spesielt beskrevet med henvisning til deres bruk ved deteksjon av anti-tetanus antistoffer i sauer og deteksjon og identifisering av slangegift som eksempler på slike prøver.

Den tidligere ansøkning beskriver apparatur for deteksjon eller bestemmelse av nærvær av antigeniske eller hapteniske substanser eller antistoffer i en prøve som omfatter et flertall beholdere, hvorav en av beholderne er forsynt med en hette som har antistoffer eller antigeniske eller hapteniske substanser knyttet til den indre overflate, idet hetten er innrettet til å overføres fra den ene til den andre av de nevnte beholdere slik at dens indre overflate bringes i kontakt med oppløsningene inneholdt i det nevnte flertall av beholdere i en forut bestemt sekvens. Ved en utførelsesform inkluderer den "indre overflate" av hetten de overflater av selve hetten som når denne påføres en beholder, utsettes for innholdet av beholderen, såvel som overflatene av utstående partier anordnet på hetten til å strekke seg inn i det indre av beholderen når hetten påføres beholderen, og overflater som er fysisk knyttet til eller inneholdt i en hette og som i seg selv utsettes for innholdet av beholderen når hetten påføres derpå. Ved en alternativ utførelsesform omfatter den "indre overflate" av hetten hvortil antistoffene eller de antigeniske eller hapteniske substanser er knyttet, den indre overflaten av et rør festet til hetten, f.eks. rørdelen av en hette av "dråpetypen" med en gummiblære eller lignende slik at fluidet kan trekkes opp i røret og trykkes ut fra dette.

En av de vesentlige begrensninger ved apparaturen omhandlet i den tidligere ansøkning ligger i det forhold at bare et enkelt antistoff eller en antigenisk eller haptenisk substans kan knyttes til hetten. Dette er en forholdsvis alvorlig begrensning når apparatet skal anvendes ved en test av den såkalte "screening-type". F.eks. ved deteksjon og identifisering av slangegifter i Australia, er det vanligvis nødvendig å detektere i det minste to og i de fleste tilfeller fem primære slangegifter for å muliggjøre seleksjon av den passende antigift. Dette betyr at når man anvender apparatet omhandlet i den tidligere ansøkning, må i det minste og ofte fem separate tester gjennomføres for å identifisere den ukjente gift i den kliniske prøve, sammen med kontrolltester når dette trenges. Nødvendigheten av å gjennomføre et antall separate tester er selvfølgelig spesielt ufordelaktig fra et synspunkt med å gjennomføre de nødvendige tester ute i marken, og det er et formål for den foreliggende oppfinnelse å gjennomføre en ytterligere forbedring i det nevnte apparat hvorved behovet for å gjennomføre et flertall separate tester unngås.

Ved bruk av innretningen i samsvar med oppfinnelsen kan fluider inkluderende ukjente prøver og testreagenser trekkes inn i innretningen og deretter til kontakt med innsiden av hver av kapillarelementene og deretter trykkes ut derfra. Som et eksempel kan innretninger omfatte en gummiblære eller en injeksjonssprøyte.

Innretningen i henhold til den foreliggende oppfinnelse er spesielt egnet for bruk med testapparatur av den type som er generelt omhandlet i den tidligere australske ansøkning nevnt i det foregående. Innretningen i samsvar med den foreliggende oppfinnelse kan således anordnes i kombinasjon med et flertall beholdere hvorved en prøve kan gjennomføres ved å bringe innsiden av kapillarelementene av innretningen i kontakt med oppløsninger inneholdt i det nevnte flertall av beholdere i en forutbestemt sekvens. Alternativt kan de forskjellige testoppløsninger og reagenser anordnes i fordypningene i en reagensskål.

Generelt kan kapillarelementene som inngår i innretningen i den foreliggende oppfinnelse fremstilles av et hvilket som helst egnet material som f.eks. glass, polyvinylklorid, polystyren eller andre passende plastmaterialer, men det er viktig at elementene er transparente slik at de reaksjoner som foregår inne i hvert element kan iakttas fra utsiden. Antistoffene eller de antigeniske eller hapteniske substanser kan knyttes til innsiden av kapillarelementene ved hjelp av kjent teknikk, f.eks. i tilfellet med glass-kapillarelementer ved adsorpsjon eller kovalent binding, og i tilfellet med elementer av plastmaterialer, ved adsorpsjon eller kovalent binding. Som eksempel kan kapillarelementene være 1,5 til 2,0 cm lange og ha en indre diameter på omtrent 1 mm, og en utvendig diameter på omtrent 2 mm. Slike elementer har et rominnhold på omtrent 5 til 20 mikroliter.

Ved en utførelsesform av innretningen i henhold til oppfinnelsen er flertallet av kapillarelementer forbundet i serie ved rørformede forbindelseselementer. Med denne utførelses-form trekkes fluider som f.eks. ukjente prøver og testreagenser inn i og trykkes ut fra elementene i rekkefølge. De rørformede forbindelseselementer som forbinder de enkelte rørformede elementer med hverandre kan være av et hvilket som helst egnet material, og som eksempel er silikongummi og polyvinylklorid funnet å være passende materialer.

Det sees at generelt vil bruken av en innretning i samsvar med oppfinnelsen muliggjøre at en enkel prøve kan gjennomgå en "screening" overfor et antall kjente antistoffer eller antigeniske eller hapteniske substanser i en eneste testsekvens. Ved en slik "screening-prøve" vil kapillarelementene være forsynt med forskjellige kjente antistoff eller antigeniske eller hapteniske substanser, og et kapillar-element for "positiv kontroll" kan også inkluderes i innretningen. For å teste en ukjent prøve mot hver av antistoffene eller de antigeniske eller hapteniske substanser knyttet til innsiden av kapillarelementene, er det bare nødvendig å gjennomføre en enkel testsekvens ved å trekke de forskjellige testfluider i sekvens inn i innretningen i samsvar med oppfinnelsen slik at hvert fluid passerer inn i samtlige kapillarelementer før det trykkes fra innretningen. Et spesielt eksempel på bruk av innretningen i samsvar med oppfinnelsen på denne måte er gjennomføring av en såkalt-prøve for deteksjon av slangegifter og som skal beskrives detaljert i det følgende.

Alternativt kan innretningen i henhold til oppfinnelsen anvendes ved en semi-kvantitativ type av "screening-test" hvori en enkelt ukjent prøve testes sammen med én eller flere kjente positive kontroller overfor et enkelt antistoff eller antigenisk eller haptenisk substans i en enkel testsekvens. Denne kjente positive kontroll eller kontroller kan ha kjente innhold av det material som skal detekteres i prøven, og også her gjennomføres en enkel testsekvens ved å trekke de forskjellige testfluider i sekvens inn i innretningen og deretter inn i kapillarelementene før de trykkes ut derfra. Bruken av innretningen på denne måte ved gjennomføring av "screening-tester" for dioksin og tetanus er beskrevet senere som ytterligere eksempler på bruk av innretningen.

Den foreliggende oppfinnelse kan utnyttes for detektering eller bestemmelse av nærværet av antistoffer eller av antigeniske eller hapteniske substanser i en prøve. Den tidligere australske ansøkning 68.117/81 omhandler tester for deteksjon eller bestemmelse av nærværet av antistoffer eller antigeniske eller hapteniske substanser ved hjelp av en forbedret enzymkoblet immunosorbent-prøvemetode hvori enzymet urease anvendes i de antistoff-enzymforeningen, idet urea er det tilsvarende enzymatiske substrat anvendt for å indikere nærværet av antistoffer eller antigeniske eller hapteniske substanser i prøven. Nærværet av ammoniakk fremstilt ved innvirkningen av enzymet urease på ureasub-stratet anvendes så for å indikere nærværet av antistoffer eller antigeniske eller hapteniske substanser i prøven.

Denne forbedrede ELISA-teknikk har mangeartet anvendelse, ikke bare i forbindelse med bruken av apparatet omhandlet ovenfor og i den tidligere ansøkning, men også som en generell ELISA-teknikk for bruk i forbindelse med kjent apparatur som plater, skåler o.l.

Oppfinnelsen kan anvendes ved en fremgangsmåte for detektering eller bestemmelse av nærværet av antistoffer eller en antigenisk eller haptenisk substans i en prøve ved hjelp av den enzymkoblede immuno-sorbent-prøveteknikk hvori bindingen av en antistoff-enzymforening til en fast fase anvendes for å indikere nærvær eller fravær av antistoffer eller antigeniske eller hapteniske substanser i prøven, ved at enzymet i den nevnte forening er urease, den faste fase bringes i kontakt med urea som enzymsubstrat, og nærværet av ammoniakk detekteres eller bestemmes under anvendelse av di-brom-o-cresolsulfonftalein for å indikere nærvær av antistoffer eller antigeniske eller hapteniske substanser i prøven. Generelt kan denne fremgangsmåte tilpasses for gjennomføring av en lang rekke prøvemetoder. De følgende er illustrerende og ikke begrensende for de typer av metoder som kan gjennom-føres :

A: Antigen-deteksjon, f.eks. hepatitis, digoksin.

(a) Sandwich-antigenforsøk:

1. Fast fase: Rør - Anti-hepatitis Ab

2. Prøve: ± Hepatitis underenhet eller virus

3. Forening: Anti-hepatitis Ab - enzym

(b) Dobbelt antistoff Sandwich-antigenprøve:

1. Fast fase: Rør - Anti-hepatitis Ab

Type 1 (f.eks. saue-antistoff)

2. Prøve ± Hepatitis underenhet eller virus

3. Annet anti-

stoff: Anti-hepatitis Ab

Type 2 (f.eks. kanin-antistoff)

4. Forening: Anti-type 2 Ab - enzym

(c) Konkurrerende antigenforsøk:

1. Prøve: ± Digoksin

2. Forening: Anti-digoksin Ab - enzym

3. Fast fase: Rør - digoksin ,

(Bemerk: Ved dette forsøk blandes prøven og foreningen og inkuberes før tilsetningen til røret.)

B: Antistoff-deteksjon, f.eks. tetanus, rubella.

(a) Sandwich antistoff-forsøk:

1. Fast fase: Rør - Tetanus Ag

2. Prøve: ± Anti-tetanus Ab (human)

3. Forening: Antihuman Ab - enzym

(b) Dobbelt antistoff Sandwich antistoff-forsøk:

1. Fast fase: Rør - Tetanus Ag

2. Prøve: Tetanus Ab (human)

3. Annet anti-

stoff: Anti-human Ab type 2 (f.eks.

saue-antistoff mot human-antistoff)

4. Forening: Anti-type 2 Ab - enzym

Ved en første foretrukket utførelsesform av en slik fremgangsmåte for deteksjon eller bestemmelse av nærvær av en antigenisk eller haptenisk substans i en prøve omfattes de følgende trinn i sekvens: 1. Prøven bringes i kontakt med en fast fase med antistoff tilsvarende den nevnte antigeniske eller hapteniske substans knyttet dertil, og deretter bringes den faste fase i kontakt med en antistoff-enzymforening. 2. Prøven bringes i kontakt med en antistoff-enzymforening, idet antistoffet i foreningen er antistoffet tilsvarende den nevnte antigeniske eller hapteniske substans og enzymet i foreningen er urease, og deretter bringes den resulterende blanding i kontakt med en fast fase med den nevnte antigeniske eller hapteniske substans knyttet dertil. 3. Den faste fase bringes i kontakt med urea som det enzymatiske substrat, og 4. Nærværet av ammoniakk detekteres eller bestemmes under anvendelse av di-brom-o-cresolsulfonftaleinindikator for å indikere nærværet av de nevnte antigeniske eller hapteniske substanser i prøven.

Ved en annen slik fremgangsmåte for deteksjon eller bestemmelse av nærværet av antistoffer i prøven omfattes de følgende trinn i sekvens: 1. Prøven bringes i kontakt med en fast fase med antigen tilsvarende de nevnte antistoffer knyttet dertil. 2. Den faste fase bringes i kontakt med en antistoff-enzymforening idet antistoffet i foreningen er rettet mot dyreartene tilsvarende antistoffene som testes og enzymet i den nevnte forening er urease. 3. Den faste fase bringes i kontakt med urea som det enzymatiske substrat, og 4. Nærværet av ammoniakk detekteres eller bestemmes under anvendelse av di-brom-o-cresolsulfonftalein-indikator for å indikere nærværet av de nevnte antistoffer i den nevnte prøve.

Oppfinnelsen tilveiebringer som nevnt også det nærmere angitte testsett for deteksjon eller bestemmelser av nærværet av antistoffer eller en antigenisk eller haptenisk substans i en prøve ved hjelp av den enzym-koblede immunosorbent-prøveteknikk, hvori bindingen av en antistoff-enzymforening eller antigen-enzymforening til en fast fase anvendes for å indikere nærværet eller fraværet av antistoffer eller antigeniske eller hapteniske substanser i prøven.

Det vil skjønnes at testsettene som generelt beskrevet i det foregående kan anordnes med passende komponenter for å muliggjøre gjennomføring av en lang rekke av de tidligere nevnte prøvemetoder inklusive de såkalte "Sandwich" og "konkurrerende" prøver og prøver av dobbelt-antistoff type.

Ved en første foretrukket utførelsesform tilveiebringes et test-sett for deteksjon eller bestemmelse av nærværet av en antigenisk eller haptenisk substans i en prøve, idet prøvesettet i kombinasjon omfatter: 1. En fast fase med antistoff tilsvarende den nevnte antigeniske eller hapteniske substans knyttet dertil. 2. En antistoff-enzymforening, idet enzymet i foreningen er urease, og 3. Et substrat-indikatorsystem omfattende urea som det enzymatiske substrat og di-brom-o-cresolsulfonftalein som indikator.

Tilsvarende tilveiebringer oppfinnelsen i en annen foretrukket utførelsesform et testsett for deteksjon eller bestemmelse av nærværet av antistoffer i en prøve, idet testsettet i kombinasjon omfatter: 1. En fast fase med antigen tilsvarende de nevnte antistoffer knyttet dertil. 2. En antistoff-enzymforening, idet enzymet i foreningen er urease, og 3. Et substrat/indikatorsystem omfattende urea som det enzymatiske substrat og di-brom-o-cresolsulfonftalein som indikator.

En forbedring kan tilveiebringes ved bruk av den spesielle indikator di-brom-o-cresolsulfonftalein eller "Bromcresol-Purpur" som indikator på nærvær av ammoniakk. Dannelsen av ammoniakk kan lett detekteres ved hjelp av en pH-endring som det er funnet best detekteres ved den kraftige fargeendring

(gull til purpur) av Bromcresol-Purpur innlemmet i en ubufret substratoppløsning. Bruken av urease-urea som et enzym-substratsystem frembyr et antall vesentlige fordeler: substratet er stabilt og kan lagres klart for bruk; titre-rings-endepunkter er skarpe og lett synlige; enzymet forgiftes ikke av natriumazid og derfor kan testreagenser fremstilles med dette konserveringsmiddel og lagres ferdig til bruk (dette er ikke tilfellet med pepperrot-peroksidase (Horse Radish Peroxidase (HRP), et enzym som tidligere har vært anvendt ved EIA-tester). Disse faktorer gjør således enzymet egnet for EIA-testsett bestemt for bruk i marken. Enzymet er kommersielt tilgjengelig med en høyere spesifikk aktivitet enn andre vanlige anvendte enzymmerker og pga. at urease ikke forekommer i pattedyrvev, mens derimot andre enzymer som peroksidaser, fosfataser og galaktosidaser kan forekomme i slikt vev, er det egnet for ved EIA-tester for å detektere celle-assosierte antigener og deres antistoffer. Endelig kan enzymreaksjonen om ønsket stanses øyeblikkelig ved tilsetning av det organiske kvikksølvkonserveringsmiddel "Thiomersal", slik at lagring av EIA-resultater for senere undersøkelse tillates.

Det faktum at Bromcresol-Purpur er av spesiell fordel som en indikator ved metodene beskrevet i det foregående er overraskende, da fargeendringen tilveiebragt av Bromcresol-Purpur foregår i pH-området 5,2 til 6,8. Urease har på den annen side en maksimal aktivitet ved pH-verdier i området 7 til 8. Det er ikke desto mindre funnet at bruken av Bromcresol-Purpur for detektering av nærværet av ammoniakk er effektivt til å gi en fullstendig og ganske hurtig fargeendring. I motsetning hertil vil andre testede pH-indikatorer ikke gi en sammenlignbar fargeendring eller fremvise en lignende reaksjonshurtighet for en gitt konsentrasjon av antigenisk substans, f.eks. slangegift. Fig. 1 i de vedføyde tegninger illustrerer følsomheten av Bromcresol-Purpur (BCP) som en indikator på nærvær av ammoniakk fremstilt ved innvirkning av urease på urea, i sammenligning med andre pH-indikatorer cresol-rødt (CR), bromthymol-blått (BTB), klorfenol-rødt (CPR) og fenol-rødt (PR) idet alle disse også ga en fargeendring i pH-området fra 5 til 8, som angitt i den etterfølgende tabell 1.

Det sees av fig. 1 at i et ubufret system gir pH-indikatorene BCP, BTB og PR lineære plottinger av absorpsjon i forhold til tiden, mens CR og CPR gir krumme forhold. I tillegg er BCP mye mer følsomt enn de andre indikatorer og gir en markert fargeendring fra gult til purpur som lett kan detekteres visuelt da disse farger ligger langt fra hverandre i det synlige lysspektrum. BCP tilveiebringer derfor et antall fordeler som indikator for bruk ved EIA-tester som innbe-fatter urease i sammenligning med de andre pH-indikatorer som man kunne forvente å gi høyere reaksjonshastigheter og således være mer følsomme ved pH-optimum for urease i EIA-systemet.

Bromcresol-Purpur er også spesielt fordelaktig i sammenligning med bruk av Nessler-reaksjonen for å detektere dannelsen av ammoniakk, da bruken av en pH-indikator muliggjør en kontinuerlig måling av urease-aktiviteten og ikke ødelegger enzymet som i tilfellet med bruk av Nessler-reaksjonen. Bruken av Bromcresol-Purpur er følgelig av spesiell fordel ved gjennomføring av prøver under anvendelse av urease-urea som enzym-substrat-system ved ELISA-teknikk. En forbedring av testmetodene er basert på at forekomsten av ikke-spesifikk binding under testgjennomføringen, spesielt av antistoff-enzymforeningen i den faste fase, kan reduseres dramatisk ved innlemmelse av ovalbumin i antistoff-enzym-foreningsreagenset. Generelt omfatter denne reagens foreningen i en bærer av standard fortynnede buffer, f.eks. bufret saltløsning (pH 7,2) inneholdende 0,5 vekt% overflate-aktivt middel ("Tween" 20), 0,25 vekt% bovinserumalbumin og 0,1 vekt% konserveringsmiddel (natriumazid). I samsvar med denne ytterligere utvikling tilsettes ovalbumin til dette reagens i en mengde på 0,1 vekt% eller mer, foretrukket 0,25 til 1 vekt%.

Innretningene og testsettet i henhold til oppfinnelsen er illustrert ved hjelp av eksempler i og med henvisning til de vedføyde tegninger hvori: Fig. 2 er et riss delvis i snitt gjennom en første utførel-sesf orm av en innretning i samsvar med oppfinnelsen, og fig. 3 er et riss delvis i snitt av en annen utførelsesform av en innretning i samsvar med oppfinnelsen.

Innretningen avbildet i fig. 2 er beregnet spesielt for bruk som et slangegift-detekteringsapparat og skal beskrives i det følgende med spesiell henvisning til dets bruk på denne måte. Innretningen omfatter en glassrørmontasje 10 og en sprøyte-sylinder 11 som er anordnet til å trekke fluider inn i og trykke fluider ut fra glassrørmontasjen 10. Montasjen 10 omfatter 6 rørformede elementer 1, 2, 3, 4, 5, 6 som er knyttet til hverandre i serie ved hjelp av stykker av silikongummirør 8. Hvert av rørene 1 til 5 har et for-skjellig gift-antistoff som kleber til innsiden som følger:

1 tillegg er rør 6 anordnet som et positivt kontrollrør. Den fri ende av røret 6 er forseglet ved hjelp av et forseglet plastrør 7 som i motsetning til de transparente rør 1 til 5 kan være farget eller opakt. Innretningen illustrert i fig. 2 i tegningene anvendes for deteksjon og identifisering av slangegifter i kombinasjon med et antall oppløsningsholdige kolber som følger:

Følgende metode følges ved gjennomføring av testen:

(1) Skjøtene mellom rørene i innretningen kontrolleres med hensyn til sikkerhet. Umiddelbart før bruken skjæres den forseglede spiss av fra plastrøret og væske trykkes ut fra rørene. (2) Klinisk prøve trekkes opp inntil rørmontasjen er fylt. (3) Det hele settes bort ved romtemperatur i omtrent 10 minutter. (4) Innholdet trykkes ut (avfall). Vaskevæske trekkes inn (kolbe 1) inntil sprøyten er halvfull (tilnærmet). Innholdet trykkes ut (avfall). Dette gjentas 3 ganger. (5) Trekk inn luft, etterfulgt av forening (kolbe 2) inntil alle rør er fylt. (6) Tillat henstand ved romtemperatur i omtrent 10 minutter. (7) Trykk ut innholdet (avfall). Trekk inn vaskevæske (kolbe 3) inntil sprøyten er halvfull (tilnærmet). Trykk ut (avfall). Dette gjentas 3 ganger. (8) Trekk inn luft, etterfulgt av substrat (kolbe 4) inntil alle rør er fylt. (9) Iaktta omhyggelig mot en hvit bakgrunn i 20 minutter fra trinn 8. Alle slangegifter kryssreagerer immunologisk slik at man derfor noterer det første rør til å følge fargeendringssekvensen av gul-grønn-grå-blå-purpur vist av det positive kontrollrør 6.

Det bemerkes at i testen beskrevet i det foregående er den indikator som anvendes for å detektere dannelsen av ammoniakk i urease-ureasystemet Bromcresol-Purpur. Som tidligere beskrevet er denne indikator funnet å være spesielt fordelaktig i dette system og det er funnet at deteksjonsgrensen for testen som gjennomført i det foregående er omtrent 10 til 20 nanogram/ml av prøven anvendt i trinn 2. Videre kan større følsomhet oppnås ved å gjenta testen under anvendelse av lengre inkubasjoner i trinnene 3 og 6 (f.eks. omtrent 20 til 30 minutter). Som tidligere beskrevet er imidlertid bruken av denne indikator i urease-enzymsystemet ikke på noen måte begrenset til bruk med innretningene omhandlet heri eller i de tidligere patentansøkninger som er nevnt tidligere, og den fagkyndige vil skjønne at indikatoren har utstrakt anvendelse som en generell indikator for deteksjon av urease-aktivitet i ELISA-metoder under anvendelse av annen apparatur. Tilsvarende er innretningen beskrevet detaljert i det foregående ikke begrenset for bruk ved deteksjon av slangegifter, og den kan anvendes ved deteksjon av tetanus-antistoffer som beskrevet i de tidligere patentansøkninger som er nevnt tidligere, såvel som i andre screening-tester hvor det anvendes ELISA-teknikk.

Innretningen avbildet i fig. 3 illustrerer en alternativ

utførelsesform av innretningen i henhold til oppfinnelsen for bruk f.eks. i en screening-test for digoksin eller tetanus og skal beskrives i det følgende med henvisning til dens bruk på denne måte.

Innretningen 20 omfatter 3 glassrør eller kapillarelementer 21, 22 og 23 montert i en felles volder eller bærer 24. Hver av disse elementer har en haptenisk substans som kleber til innsiden som beskrevet i det etterfølgende. Bæreren 24 er også forsynt med 3 boringer 25, 26 og 27 som kommuniserer med elementer henhv. 21, 22 og 23. Stempler 28, 29 og 30 er anordnet inne i de respektive boringer 25, 26 og 27 og er innrettet til å trekke opp fluider gjennom de respektive kapillarelementer og inn i boringene og å trykke disse fluider ut gjennom de respektive elementer ved bevegelse av stemplene inne i boringene. Stemplene 28, 29 og 30 er forbundet med hverandre ved hjelp av et enkelt håndtak 31 slik at fluider trekkes samtidig inn i og trykkes ut fra hver av kapillarelementene 21, 22 og 23. Et hvitt bakgrunnsareal 32 er anordnet bak en del av elementene 21, 22 og 23 for å fremme den visuelle sammenligning av fargeutviklingen i disse elementer.

Innretningen 20 kan anvendes ved en digoksin-screening-test basert på inhibering av urease-antidigoksin antistoff-forening som binder til digoksin immobilisert på innsiden av glass-kapillarelementene bevirket av fritt digoksin tilstede i det ukjente serum. Denne test kan innrettes til å detektere digoksin i serum fra pasienter i innhold under 1,0 nanogram/ml, mellom 1,0 og 3,0 nanogram/ml og over 3,0 nanogram/ml. Det aksepterte terapeutiske område for digoksin er mellom 1,0 og 3,0 nanogram/ml idet seruminnhold under dette område kan være ineffektive og seruminnhold over dette område kan være giftige. Denne enkle screening-test muliggjør at legen kan bedømme pasientens tilpasning til foreskrevet medisinsk behandling og i tilfeller av mulig giftighet hurtig å kunne bekrefte diagnosen.

På grunn av den hapteniske natur av digoksin virker denne test ved inhibering av fargeutvikling i kontrast til slangegift-deteksjonstesten beskrevet tidligere. Den ukjente prøve av pasientens serum og urease-antidigoksin-forening for-inkuberes sammen i et testrør eller en skål på en reagensplate. Samtidig blir kjente positive serumprøver (1 nanogram/ml og 3 nanogram/ml fritt digoksin) for-inkubert med forening i naborør eller skåler. Etter en forutbestemt inkubasjonsperiode ved romtemperatur blir blandingene samtidig trukket inn i respektive kapillarelementer 21, 22 og 23 hvor hver av disse har digoksinforbindelse med humanserum-albumin kovalent knyttet til innsiden. Etter en ytterligere inkubasjonsperiode trykkes blandingene ut av elementene 21, 22 og 23, elementene vaskes og den tidligere beskrevne urea-indikator trekkes samtidig inn i elementene.

Graden av inhibering av fargeutviklingen i tilfellet med den ukjente prøve sammenlignes så med den som sees i tilfellene med sera-ende inneholdende kjente mengder av fritt digoksin til å gi en semi-kvantitativ bedømmelse av den ukjente prøve.

En alternativ bruk av innretningen 20 er ved en tetanus-screening-prøve hvori det foretas en screening av en prøve av blodet eller serumet av en pasient i forhold til referanse-sera eller blod til å fastslå innholdet av tetanus-antistoffer i prøven. Prøven baseres på deteksjon av tetanus-antistoffer som binder til renset tetanus-antigen immobilisert på innsiden av glass-kapillarelementene, idet metoden omfatter inkubering av prøven av serum eller blod og sammenligningssera eller blod med høyt innhold (f.eks. minst 1,28 internasjonale enheter/ml) og lave innhold (f.eks. ikke over 0,01 internasjonal enhet/ml) inne i individuelle elementer 21, 22 og 23 i innretningen 20 i en periode på omtrent 10 minutter og etter passende vasking, innføres anti- human (IgG) - ureaseforening og det inkuberes i en ytterligere periode på omtrent 10 minutter. Etter ytterligere vasking innføres substratet/indikatorsystemet omfattende urea og Bromcresol-Purpur som tidligere beskrevet og fargeutviklingen i testprøven sammenlignes med den tilsvarende i referansetestene med høye og lave innhold for å indikere tetanus-antistoffinnholdet i prøven.

Ved å anvende prøvemetoden som skissert i det foregående, kan prøven klassifiseres i en av tre kategorier: (a) Et innhold lik eller større enn referanseprøven med høyt innhold - indikerer at pasienten er meget immun og antagelig ikke krever booster-vaksinasjon (som mulig ville innbefatte risiko for skadelig reaksjon).

(b) Et innhold mellom høy og lav referanse-prøve

- indikerer at pasienten er immun men en booster-vaksinasjon er antagelig behøvelig. (c) Et innhold lik eller mindre enn referanseprøven med lavt innhold - indikerer at pasienten er ikke-immun og i tilfeller med skader er tilførsel av tetanus-immunglobulin og vaksine antagelig behøvelig.

I hvert av eksemplene angitt i det foregående fremstilles ureaseforeningen ved hjelp av standard metoder, enten ved hjelp av den entrinns-glutaraldehyd-metode (Aurameas, S., Ternynck, T. og Guesdon, J.L. "Coupling of enzymes to antibodies and antigens", 1978 Scand. J. Immunol. 8 (Suppl.

7), sidene 7-23) eller ved hjelp av M.B.S.-metoden (Monji, N., Malkus, H. og Castro, A., "Maleimid derivative of hapten for coupling to enzyme: A new method in enzyme immunoassay", Biochem. Biophys. Res. Comm., 85, 671 (1978)). Forenings-reagenset utgjøres av bufret saltløsning (pH 7,2) som beskrevet detaljert i det foregående og inkluderer ovalbumin i en mengde på fra 0,25 til 1 vekt% for å nedsette ikke-spesifikk binding av foreningen til et minimum.

Substratoppløsningen omfatter en fortynnet urea-oppløsning, f.eks. inneholdende 1 mg/ml urea i glassdestillert vann, hvortil tilsettes EDTA for å kompleksdanne tunge metallioner som kan forgifte ureasen.

Claims (6)

1. Innretning for detektering eller bestemmelse av nærvær av antigener eller haptener eller antistoffer i en prøve, karakterisert ved et flertall rør- eller kapillarelementer konstruert av glass eller plastmaterial, idet hvert av disse elementer har antistoffer eller antigener eller haptener festet til deres innside ved hjelp av adsorpsjon eller kovalent binding, og innretninger for å bringe fluider til å passere samtidig eller sekvensmessig gjennom flertallet av kapillarelementer.

2. Innretning som angitt i krav 1, karakterisert ved at kapillarelementene er forbundet i serie ved hjelp av rørformede forbindingselemen-ter og at rekken av elementer er forbundet til en enkel innretning for å bringe fluider til å passere derigjennom, idet den enkle innretning for å bevirke fluider til å passere gjennom den nevnte rekke av kapillarelementer foretrukket omfatter en sprøyteinnretning med en boring i fluid forbindelse med en ende av den nevnte serie av kapillarelementer, og et stempel bevegbart i boringen.

3. Innretning som angitt i krav 1, karakterisert ved at kapillarelementene er montert ved siden av hverandre i en holder og i forbindelse med individuelle boringer i holderen, idet innretningene for å bevirke fluider til å passere gjennom de nevnte kapillarelementer omfatter innretninger for samtidig å trekke fluider inn i og trykke fluidene ut av boringene gjennom de respektive kapillarelementer, idet innretningene foretrukket omfatter individuelle stempler montert i boringene for bevegelse i forhold til disse for å trekke fluider inn i og trykke fluider ut av de nevnte boringer, idet de nevnte individuelle stempler er forbundet med hverandre, for samtidig bevegelse i forhold til de respektive boringer.

4. Testsett for anvendelse ved deteksjon eller bestemmelse av nærvær av antigener eller haptener eller antistoff i en prøve ved hjelp av enzymbundet immunosorbent-testteknikk, karakterisert ved (i) et flertall kapillarelementer konstruert av glass eller plastmaterial, idet hvert av disse elementer har antistoffer eller antigener eller haptener festet til deres innside ved hjelp av adsorpsjon eller kovalent binding, og innretninger for å bringe fluider til å passere samtidig eller sekvensmessig gjennom ovennevnte flertall av kapillarelementer , (ii) et antistoff-enzym- eller antigen-enzymkonjugat, og (iii) et enzymsubstrat/indikatorsystem.

5. Testsett som angitt i krav 4, karakterisert ved at kapillarelementene og innretningene for å bringe fluider til å passere gjennom elementene er som angitt i krav 2 og 3.

6. Testsett som angitt i krav 4 eller 5, karakterisert ved at enzymet i konjugatet er urease og enzymsubstratet er urea og indikatoren er di-brom-o-kreosolsulfonftalein.