PL102110B1 - A process of obtaining rifamycin b - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywa¬ nia ryfamycyny B na drodze hodowli szczepu Strep¬ tomyces mediterranei.

Z opisów patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3150046 i nr 2988490 oraz opisu paten¬ towego nr 82636 znane sa sposoby otrzymywania ry¬ famycyny B na drodze hodowli szczepu Strepto- myces mediterranei na pozywkach posiewowych, za¬ wierajacych przyswajalne zródla wegla, azotu oraz sole mineralne i szczepieniu otrzymanym materia¬ lem posiewowym pozywek produkcyjnych, zawiera¬ jacych przyswajalne zródla wegla, azotu, sole mine¬ ralne oraz inhibitory tworzenia innych ryfamycyn.

Proces biosyntezy prowadzony jest w aparatach fermentacyjnych w warunkach ciaglego napowie¬ trzania i mieszania.

Zazwyczaj stosowane w przemysle fermentacyj¬ nym w procesie biosyntezy antybiotyków wartosci predkosci obwodowych mieszadel aparatów fermen¬ tacyjnych wynosza 260—310 m/minute.

W znanych publikacjach patentowych i literatu¬ rowych nie warunkuje sie prawidlowego przebiegu procesu biosyntezy ryfamycyny B wartosciami predkosci obwodowych mieszadej, stosowanych w aparatach fermentacyjnych.

W publikacji A. Virg;ilio, E. Marcelli w Biotech- nology and Bioengineering (Vol. 271—283, 1964) ba¬ dano wplyw mocy zuzytej na mieszlanie na wydaj¬ nosc procesu biosyntezy ryfamycyny.

Brak jest danych na temat wplywu mieszania oraz wartosci predkosci obwodowej mieszadel apa¬ ratów fermentacyjnych, uzywanych do hodowli ma¬ terialu posiewowego na otrzymana wydajnosc pro¬ cesu biosyntezy ryfamycyny B.

Wspólczesne tendencje w biosyntezie antybioty¬ ków ida w kierunku zwiekszania mocy, zuzywanej na mieszanie oraz zwiekszania wartosci predkosci obwodowej mieszadel aparatów fermentacyjnych, z czym wiaze sie podwyzszanie wydajnosci procesu biosyntezy.

Nieoczekiwanie okazalo sie, ze w przypadku pro¬ cesu biosyntezy ryfamycyny B zaleznosci te sa od¬ wrotne.

Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze ho¬ duje sie szczep Streptomyces mediterranei na po¬ zywce posiewowej, zawierajacej przyswajalne zród¬ la wegla, azotu oraz sole mineralne i otrzymanym materialem posiewowym szczepi sie pozywke pro¬ dukcyjna, zawierajaca przyswajalne zródla wegla, azotu, sole mineralne i inhibitory tworzenia innych ryfamycyn, przy czym hodowle na pozywce posie¬ wowej prowadzi sie przy wartosci predkosci obwo¬ dowej mieszadel aparatów fermentacyjnych 100—120 m/minute, a proces fermentacji na pozywce produk¬ cyjnej przy wartosci predkosci obwodowej miesza¬ del aparatów fermentacyjnych 160^190 m/minute.

Sposobem wedlug wynalazku szczególnie korzy¬ stne wyniki osiaga sie przy prowadzeniu hodowli szczepu Streptomyces mediterranei w wyzej opisa- 102 1103 nych warunkach mieszania na pozywce posiewowej o nastepujacym skladzie: glukoza maka z nasion bawelny wyciag namokowy kukurydzy CaC03 (NH4)2S04 MnS04 ' 5H20 ZnS04 ' 7H20 glikol polialkenowy UCON smalec woda wodociagowa 50% g g g g 6 g 0,05 g 0,05 g 1,25 g 1,25 g 1000 m Pozywka o takim skladzie znana jest jako po¬ zywka posiewowa, stosowana do hodowli szczepu Streptomyces mediterranei, produkujacego ryfamy¬ cyne S.

Nieoczekiwanie okazalo sie, ze pozywka ta jest szczególnie odpowiednia jako pozywka posiewowa takze do hodowli szczepu Streptomyces mediterra¬ nei, wytwarzajacego ryfamycyne B w warunliach mieszania, stanowiacych istote sposobu wedlug wy¬ nalazku.

Material posiewowy, otrzymany przy zazwyczaj stosowanych wartosciach predkosci obwodowej mie¬ szadel aparatów' fermentacyjnych, charakteryzuje sie szybka fragmentacja grzybni, spowodowana nad¬ miernymi wartosciami predkosci obwodowej mie¬ szadel, co stanowi zasadnicza wade tego materialu i znacznie obniza jego przydatnosc do procesu bio¬ syntezy ryfamycyny B.

Proces fermentacji ryfamycyny B, prowadzony przy zazwyczaj stosowanych wartosciach predkosci obwodowej mieszadel aparatów fermentacyjnych (260—310 m/minute) przebiega w sposób nietypowy, charakteryzuje sie szybkim i nieefektywnym zuzy¬ ciem cukrów, zawartosc biomasy w koncowym eta¬ pie procesu wynosi okolo 60%, co znacznie utrudnia proces izolacji, natomiast zawartosc ryfamycyny B jest niska i wynosi okolo 1800 mcg/ml brzeczki.

Sposób otrzymywania ryfamycyny B wedlug wy¬ nalazku gwarantuje prawidlowy przebieg procesu biosyntezy.

Material posiewowy, otrzymywany w wyzej po¬ danych warunkach mieszania, charakteryzuje sie typowym wygladem mikroskopowym grzybni: nie obserwuje sie szybkiego procesu jej fragmentacji oraz gwaltownego spadku pH, co umozliwia usta¬ lenie optymalnego momentu szczepienia pozywki produkcyjnej.

Proces fermentacji na pozywce produkcyjnej w wyzej opisanych warunkach mieszania charakte¬ ryzuje sie wolniejszym zuzyciem cukrów i powol¬ nym przyrostem biomasy, która w koncowym okre¬ sie procesu wynosi 35—40%, a zawartosc ryfamy¬ cyny B wynosi 4000—4500 mcg/ml brzeczki.

Porównanie wyników hodowli szczepu Strepto¬ myces mediterranei ma pozywkach posieWowych (P-73) .i produkcyjnych (FO) przy wartosci pred¬ kosci obwodowych mieszadel stosowanych standar¬ dowo i sposobem wedlug wynalazku przedstawia tablica 1. 110 4 Tablica 1 Pojemnosc aparatu w m3 0,25 0,8 2,0 ¥ 6,0 Predkosc obwodowa mieszadel m/minute 240 100 240 120 240 120 265 162 Ryfamycyna B i w mcg/ml wyniki z pilotazu 2000 5600 1S00 5000 1800 5200 1800 x 4500 x x — wyniki, otrzymane bezposrednio w aparatach fermentacyjnych.

Ponizsze przyklady wyjasniaja istote wynalaz¬ ku, nie ograniczajac jego zastosowania.

Przyklad I. Szczep Streptomyces mediterra¬ nei, wytwarzajacy ryfamycyne B, hoduje sie na podlozu agarowym o nastepujacym skladzie: eks¬ trakt drozdzowy 4 g, ekstrakt slodowy 10 g, glu- ; koza czysta 4 g, platki owsiane 20 g, woda desty- lowana 1000 ml. Pozywke .agarowa wyjalawia sie w temperaturze 120°C w ciagu 30 minut, tworzac agary skosne, które szczepi sie strzepkami szczepu Streptomyces mediterranei, zliofilizowanymi w no¬ sniku — mleku odtluszczanym. Agary skosne inku- bujesie w temperaturze 28°C w ciagu 7 dni.

Zdezintegrowanymi uprzednio strzepkami Strep¬ tomyces mediterranei, pochodzacymi z hodowli agarowej, szczepi sie 1 litr podloza P-73 o naste¬ pujacym skladzie: glukoza 30 g, wyciag namoko¬ wy kukurydzy 50% 20 g, maka z nasion bawelny g, (NH4)2S04 6 g, CaC03 5 g, ZnS04 • 7H20 0,05 g, MnS04 • 5H20 0,05 g, glikol polialkenowy UCON 1 g, woda wodociagowa 1000 ml, wartosc pH po wyjalowieniu 6,4—6,8. 45 Zaszczepione podloze inkubuje sie w warunkach tlenowych na trzesawce obrotowej o 150 obro¬ tach/minute przez 72 godziny w temperaturze 28°C.

Otrzymanym inoculum szczepi sie podloze P-73 50 o podanym powyzej skladzie. Po 60 godzinach in¬ kubacji otrzymanym materialem posiewowym w ilosci 10% szczepi sie podloze P-73 (druga gene¬ racja materialu posiewowego). Nastepnie po uply¬ wie 30 godzin inkubacji otrzymanym materialem szczepi sie podloze produkcyjne FO. Do szczepie¬ nia uzywa sie 10% materialu posiewowego.

Sklad podloza FO jest nastepujacy: maka arachidowa 25 g, maka sojowa 10 g, KH2P04 czysty 1 g, (NH4)2S04 Czysty 10 g, MgS04 • 7H20 60 czysty 1 g, glukoza krystaliczna 110 g, gliceryna czysta 40 g, kreda wloska 11 g, sól sodowa wero- nalu 1,7 g, glikol propylenowy 5 g, FeS04 • 7H20 czysty 0,01 g, CuS04 • 5H20 czysty 0,0033 g, ZnS04' 7H20 czysty 0,05 g, CoCl2 * 4H20 czysty 65 0,002 g, MnS04 • 4H20 czysty 0,004 g, (NH4)6Mo7024 •d • 4H20 czysty 0,001 g, glikol polialkenowy UCON 1,25 g, smalec 1,25 g, woda wodociagowa 1000 ml.

Po 220 godzinach prowadzenia procesu biosynte¬ zy ryfamycyny B w aparacie fermentacyjnym o predkosci obwodowej mieszadla 162 m/minute w warunkach tlenowych przy ciaglym mieszaniu otrzymano 4200 mcg/ml ryfamycyny B w brzeczce, oznaczonej metoda Caratorta et al. (Farmaoo , 303, 1970). Biomasa, oznaczona po zakonczonym procesie, wynosila 40%. Biomase oznaczano meto¬ da wirowania przy 3000 obrotach/minute w ciagu minut.

Przyklad II. Sposobem, opisanym w przy¬ kladzie I, zaszczepiono 150 litrów podloza P-73, przygotowanego w posiewowym aparacie fermen¬ tacyjnym.

Po 66 godzinach inkubacji otrzymanym materia¬ lem posiewowym zaszczepiono 1500 litrów podlo¬ za P-73. Po 36 godzinach inkubacji material ten uzyto do szczepienia podloza FO, przygotowanego w aparacie o predkosci obwodowej mieszadla 188 m/minute.

Po 190 godzinach prowadzenia procesu- w wa¬ runkach tlenowych przy ciaglym mieszaniu otrzy¬ mano 4120 mcg/ml ryfamycyny B w brzeczce, ozna- 110 6 czanej jak w przykladzie 1. Biomasa, oznaczona metoda wirowania, wynosila 42%.

Claims (2)

Zastrzezenia patentowe 5

1. Sposób otrzymywania ryfamycyny B, polega¬ jacy na tym, ze hoduje sie szczep Streptomyces mediterranei na pozywce posiewowej, zawieraja¬ cej przyswajalne zródla wegla, azotu oraz sole mi¬ neralne i otrzymanym materialem posiewowym szczepi sie pozywke produkcyjna, zawierajaca przyswajalne zródla wegla, azotu, sole mineralne i inhibitory tworzenia innych ryfamycyn, znamien¬ ny tym, ze hodowle na pozywce posiewowej pro¬ wadzi sie przy wartosci predkosci obwodowej mie- 5 szadel aparatów fermentacyjnych 100—120 m/minu¬ te, a proces fermentacji na pozywce produkcyjnej przy wartosci predkosci obwodowej mieszadel apa¬ ratów fermentacyjnych 160—190 m/minute.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze ja¬ ko pozywke posiewowa stosuje sie pozywke, skla¬ dajaca sie. z glukozy 30 g, maki z nasion bawelny 10 g, wyciagu namokowego kukurydzy 50% 20 g, (NH4)2S04 6 g, CaC03 5 g, MnS04 • 5H20 0,05 g, ZnS04 * 7H20 0,05 g, glikolu polialkenowego UCON 5 1,25 g, smalcu 1,25 g, wody wodociagowej 1000 ml. j