Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania mie¬ szaniny antybiotycznej A-35512, zawierajacej aktywne mikrobiologicznie i spokrewnione ze soba czynniki A, B, C, E, F, G i H. Antybiotyki A-35512 sa srodkami przeciw- bakteryjnymi i stymulujacymi wzrost oraz zwiekszaja przyswajanie pokarmu u zwierzat przezuwajacych i drobiu.Ponadto czynnik B antybiotyków A-35512 jest uzyteczny w leczeniu próchnicy zebów i tradziku.Antybiotyki A-35512 sa blisko spokrewnionymi antybio¬ tykami glikopeptydowymi. Czynnik B antybiotyku A-35512, najdokladniej scharakteryzowany skladnik kompleksu anty- biotycznego A-35512, nalezy do grupy antybiotyków za¬ wierajacych ugrupowanie peptydowe, takich jak wanko- mycyna (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3067099), antybiotyki A-4696 A, B i C (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 39520095), awoparcy- na (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3855410), rystomycyna A (N. Lomakina, 7th International Symposium of Chemistry of Natural Products, Ryga, 1970, - str. 625) i rystocetyna A (opis patentowy Stanów Zjedno¬ czonych Ameryki nr 2990329). Antybiotyki A-35512 róznia sie od powyzszych znanych antybiotyków, miedzy innymi ruchliwoscia w róznych ukladach chromatograficznych i skladem aminokwasowym i cukrowym.Chociaz znane sa obecnie liczne srodki przeciwbakteryjne, istnieje w dalszym ciagu potrzeba poszukiwania nowych, lepszych antybiotyków. Jednym z problemów wspólczesnej terapii antybiotykami jest fakt róznej skutecznosci róznych antybiotyków w stosunku do patogermych, drobnoustrojów, Z drugiej strony szczepy drobnoustrojów uodporniaja 10 15 20 25 30 sie na dzialanie obecnie stosowanych antybiotyków. Po¬ nadto, u indywidualnych pacjentów czesto wystepuja powazne reakqe uboczne po podaniu okreslonych anty¬ biotyków, takie jak nadwrazliwosc i/lub, dzialanie toksyczne.Dlatego tez korzystne jest wytwarzanie nowych antybioty¬ ków, aktywnych w chorobach wywolywanych przez drobno¬ ustroje.Ponadto korzystne jest otrzymanie dodatków paszowych, zwiekszajacych efektywnosc karmienia zwierzat przezuwa¬ jacych i drobiu. Zwiekszenie efektywnosci karmienia na¬ biera coraz wiekszego znaczenia. Srodkami zwiekszajacymi efektywnosc karmienia u wielu zwierzat i ptactwa sa dwu- etylostilbestrol i inne estrogeny. Polaczone jest to jednak z ryzykiem, ze resztki tych dodatków paszowych przechodza, do miesa, przeznaczonego do spozycia. Dlatego tez istnieje realna potrzeba ekonomiczna poszukiwania nowych spo¬ sobów zwiekszania efektywnosci organiczonych zasobów pasz, dostepnych dla prcdukqi miesa ze zwierzat prze¬ zuwajacych i drobiu. Zastosowanie mieszaniny antybio¬ tycznej A-35512 lub poszczególnych czynników i ich por chodnych jest postepem w tej. dziedzinie.Sposobem wedlug wynalazku wytwarza sie mieszanine antybiotyczna A-35512, zawierajaca czynniki A, B, C* E, F, GiH.Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze nowy szczep Streptomyces candidus NRRL 8156 hoduje sje j w pozywce zawierajacej przyswajalne zródla weglowodanów, azotu i soli nieorganicznych, w warunkach fermentacji podpowierzchniowej z napowietrzaniem, az do uzyskania znacznej aktywnosci antybiotycznej. Mieszanine antybio- 108 561108 561 3 tyczna A-35512 ewentualnie wydziela sie z brzeczki i w ra¬ zie potrzeby wyodrebnia sie z niej czynniki A, B, C, E, F, G i H.Ilosc i wzajemny stosunek poszczególnych czynników w mieszaninie antybiotycznej zalezy od stosowanych wa¬ runków fermentacji. Substancje antybiotyczne, otrzyma¬ ne sposobem wedlug wynalazku, zostaly nazwane antybio¬ tykami A-35512. Zasadniczym skladnikiem w tej miesza¬ ninie jest czynnik B. Poszczególne czynniki, wchodzace w sklad mieszaniny A-35512, wydziela sie z mieszaniny w postaci chlorowodorków.Kazdy z czynników mozna przeksztalcic w wolna zasade, niffizawkrajaca jonów chlorkowych, za pomoca np. chroma¬ tografii na sUbozaiaatmej zywicy jonowymiennej. Poza wjlnymi zasadami i chlorowodorkami, uzyteczne sa takze infa dopuszczalne w fahnacji sole poszczególnych czyn- nfców A"35512' Skrótofre okreslenie „zwiazek A-35512" doT^ysgynnikÓw A p, C, E i H mieszaniny A-35512 oraz ich dopuszczalnych w farmacji soli.Poszczególne czynniki A-35512, wytwarzane sposobem wedlug wynalazku, sa blisko spokrewnionymi zwiazkami.Jako mieszanine antybiotyczna A-35512 izoluje sie z brzecz¬ ki fermentacyjnej az siedem czynników antybiotycznych.Poszczególne czynniki rozdziela sie i wyodrebnia czynniki A, B, C, B i H w sposób opisany uprzednio. Mieszanina A-35512 jest rozpuszczalna w wodzie, czesciowo rozpusz¬ czali*^ alkoholach, takich jak metanol i etanol, ale nie¬ rozpuszczalna w innych rozpuszczalnikach organicznych, takich jak benzen, chloroform, aceton, eter dwuetylowy, octan etylu, toluen, heksan, acetonitryl i dioksan.Zalaczone rysunki przedstawiaja widma w podczerwieni, w tabletkach z bromku potasu, poszczególnych czynników A-35512, przy czym fig. 1 przedstawia widmo dwuchloro¬ wodorku czynnika A-35512-A; fig. 2 przedstawia widmo dwuchlorowodorku czynnika A-35512-B; fig. 3 przed¬ stawia widmo chlorowodorku czynnika A-35512-H; fig. 4 przedstawia widmo dwuchlorowodorku czynnika A-35512-C a fig. 5 przedstawia widmo chlorowodorku czynnika A- --3S512-E.Czynnik A-35512-A jest biala, bezpostaciowa, zasadowa substancja o nastepujacym przyblizonym skladzie ele¬ mentarnym: C — 54,29%, H — 5,19%, N — 5,58%, O -± 33,76%, Q — 1,69%, Dwuchlorowodorek czynnika A-35512-A jest biala, bez¬ postaciowa, hygroskopijna substanqa o nastepujacym sred¬ nim skladzie elementarnym: C — 51,03%, H — 5,10%, K — 4,75%* O — 34,20%, Cl — 4,80%.Widmo w podczerwieni, w tabletce z bromku potasu, dwuchlorowodorku czynnika A-35512-A przedstawia fig. 1.Wazniejsze pasma absorpcji wystepuja przy nastepujacych czestothwosciach (cm-1): 3405 (silne), 3300 (przegiecie), 2950 (slabe)* 1750 (slabe), 167Ó (sime), 1625 (przegiecie), 1602 (sime), 1520 (sime), 1470 (slabe), 1440 (slabe), 1345 (przegiecie), 1312 (srednie), 1225 (srednie), 1180 (slabe), 1080 (silne) i 1020 (przegiecie).W widmie absorpcji w nadfiolecie czynnika A-35512-A wystepuje maksimum absorpcji w kwasnym i obojetnym metanolu przy 282 mm (2T = 11.700) iw zasadowym me¬ tanolu przy 292 mm (Z = 14.000), przy czym molarny wspólczynnik ekstynkqi obliczano dla ciezaru czastecz¬ kowego 2000. W widmie w nadfiolecie wystepuje takze pasmo absorpcji koncowej przy 225 nm.W "widmie magnetycznego rezonansu jadrowego wegla **Q/"w ciezkiej wodzie, dwuchlorowodorek czynnika A- 3351&A:wykazuje sygnaly, zestawione w tablicy 1. 4 Tablica 1 1 Nr i 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 . 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 1 n 1 PPm 2 175,3 173,0 172,1 1 171,4 170,9 170,5 169,5 159,0 157,9 156,2 155,6 155,3 154,4 136,3 136,0 135,1 133,5 129,6 129,1 128,7 127,5 126,0 124,3 122,1 109,9 107,4 101,7 1 77,6 76,3 75,5 74,8 74,5 73,4 72,8 72,0 70,9 69,6 67,4 65,4 61,7 56,7 55,5 54,7 24,6 19,1 17,9 17,2 i 16,7 16,2 wysokosc (%) ~ "" 0,8 2,1 2,0 1,5 2,7 2,3 1,6 1,3 23 2,6 2,3 2,4 1,1 1,4 i,o ¦¦¦¦¦¦- M 1,2 1,6 1,7 1,8 1,0 1,4 2,8 1,6 W 1,6 0,9 3,8 4,6 2,6 2,5 2,4 1 3,7 6,0 4,4 7,0 2,8 90,9* 1,7 3,1 1,7 1,3 0,8 0,9 1,7 2,0 1,9 3,2 \ 3,0 *) sygnal stosowanego jako standard dioksanu Dwuchlorowodorek czynnika A-35512-A wykazuje na¬ stepujace wartosci skrecalnosci wlasciwej: [a]£ = —100° M (C = 1, woda) i [a]_l = —400° (C = 1, woda).Miareczkowanie elektrometryczne dwuchlorowodorku czynnika A-35512-A w 66% roztworze wodnym dwumety- loformamidu wskazuje na obecnosc czterech dajacych sie miareczkowac grup o wartosciach pKa okolo 7,35, 9,09i ss 19,49 i 12,44 (wartosc poczatkowa pH wynosila 6*2).108 561 5 Prawdopodobny ciezar czasteczkowy dwuchlorowodorku czynnika A-35512-A wynosi wedlug miareczkowania okolo 2106.Dwuchlorowodorek czynnika A-35512-A jest rozpusz¬ czalny w wodzie, czesciowo rozpuszczalny w alkoholach, takich jak metanol i etanol i nierozpuszczalny w innych rozpuszczalnikach organicznych, takich jak benzen, chlo¬ roform, aceton, eter dwuetylowy, octan etylu, toluen, heksan, acetonitryl i dioksan.Dwuchlorowodorek czynnika A-35512-A jest trwaly w ciagu 72 godzin w roztworach wodnych o pH od okolo 3 do okolo 10.Analiza aminokwasowa hydrolizowanego kwasu dwuchlo¬ rowodorku czynnika A-35512-A wykazuje obecnosc co najmniej pieciu reszt aminokwasów, jednym z których jest glicyna.Czynnik A-35512-B jest biala, bezpostaciowa, zasadowa substanqa o przyblizonym wzorze empirycznym C^.^ H101J105N8.fO46.48Cl i nastepujacym przyblizonym skladzie elementarnym: C — 53,97%, H — 4,75% N — 5,25%, O — 34,29%, Clr— 1,59%.Podane wyniki analizy elementarnej w szczególnosci sa zgodne z korzystnym wzorem empirycznym C98H104N49- 047C1 (obliczono: C — 53,60, H — 4,75, N — 574 O —* 34,30, Cl — 1,61). Innym korzystnym wzorem suma¬ rycznym jest CwH103NaO47Cl (obliczono: C — 54,00 H — 4,75, N — 5,15, O — 34,50, Cl — 1,60).W widmie absorpcyjnym w nadfiolecie czynnika A-35512- -B wystepuje maksimum w kwasnym i obojetnym metanolu przy 282 nm (Z = 15.000) i w zasadowym metanolu przy 292 nm (27 = 16.000), przy czym molarny wspólczynnik ekstynkcji obliczano dla ciezaru czasteczkowego 2000.W widmie w nadfiolecie wystepuje takze pasmo absorpcji koncowej przy 225 nm.Czynnik A-35512-B wykazuje nastepujace wartosci skrecalnosci wlasciwej: [a]£ =—123° (c = 1, woda) oraz [a]" = —446* (c = 1, woda).Miareczkowanie elektrometryczne czynnika A-35512-B w 66% roztworze wodnym dwumetyloformamidu wskazuje na obecnosc czterech dajacych sie miareczkowac grup o wartosciach pKa okolo 7,15, 8,81, 20,20, 12,00 i mozli¬ wa obecnosc grupy o pKa wyzszym niz 13,50. Prawdo¬ podobny ciezar czasteczkowy czynnika A-35512-B wynosi wedlug miareczkowania okolo 2143.Dwuchlorowodorek czynnika A-35512-B jest po krysta¬ lizacji z 50% roztworu wodnego metanolu biala krysta¬ liczna substancja. Chociaz dwuchlorowodorek czynnika A-35512-B jest higroskopijny i nie posiada wyraznej tem¬ peratury topnienia, to termogram wykazuje ubytek wagi rozpoczynajacy sie od temperatury 25 °C i wyrazajacy sie 7,4% straty w temperaturze 121 °C i rozkladem w tempe¬ raturze 135#C.Dwuchlorowodorek czynnika A-35512-B ma nastepujacy przyblizony sklad elementarny: C — 52,57%, H — 4,80%, N — 5,66%, O — 32,86%, Cl — 4,51%.Podane wyniki analizy elementarnej sa w szczególnosci zgodne z innym alternatywnym wzorem empirycznym CwH^NiC^Cl.2HC1 (obliczono: C — 51,93, H — 4,65, N — 5,57, O — 33,20, Cl — 4,65).W widmie absorpcyjnym w nadfiolecie dwuchlorowo¬ dorku czynnika A-35512-B wystepuje maksimum w kwas¬ nym i obojetnym metanolu przy 282 nm (Z1 = 12.000) i w zasadowym metanolu przy 292 nm (E —¦ 14.000), przy czym molarny wspólczynnik ekstynkcji obliczano dla 6 ciezaru czasteczkowego 2000. W widmie w nadfiolecie wystepuje takze pasmo absorpcji koncowej przy 225 nm.Dwuchlorowodorek czynnika A-35512-B wykazuje na¬ stepujace wartosci skrecalnosci wlasciwej: [«]!! = —128° 5 (c = 1, woda) i [a]II = —475° (c = 1, woda).Miareczkowanie elektrometryczne dwuchlorowodorku czynnika A-35512-B w 66% roztworze wodnym dwume¬ tyloformamidu wskazuje na obecnosc czterech dajacych sie t miareczkowac grup o wartosciach pKa okolo 7,15, 8,87, 10,30 i 12,10 i mozliwa obecnosc grupy o pKa wyzszym niz 13,1.Prawdopodobny ciezar czasteczkowy dwuchlorowodorku czynnika A-35512-B wynosi na podstawie miareczkowania 1C okolo 2027.W widmie magnetycznego rezonansu jadrowego wegla 13C dwuchlorowodorku czynnika A-35512-B, wykonanym w D20, wystepuja sygnaly, zestawione w tablicy 2.Tablica 2: 1 Nr * 2 ~~ 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 1 \ 40 41 42 43 | ppm ' 2 ¦ 173,0 171,9 171,6 171,0 170,8 169,6 159,0 157,9 157,5 156,6 155,6 155,3 154,9 154,3 151,7 144,3 136,7 136,2 135,4 135,2 133,6 133,3 129,8 129,3 128,8 ; 127,6 126,1 ', .124,2/ 122,4 122,0 120,7 116,5 109,5 108,2 107,7 104,5 101,8 100,9 98,2 76,9 76,1 . 74,1 | wysokosc (%) r * — r- 4i -¦ 3,7, 33 5,8 5,0 3,6 4,1 4,4 3,7 4,8 6,1 4,2 3,3 4,2 3,3 3,1 3,5 4,9 4,0 4,4 4,2 4,1 w 3,0 2,6 i 1,5 3,9, 5,6 M 4,4 3,3 2,7 0,8 W 2,7 17 * 2,9 1,6 1,0 1,2 1,8 2,0 \108 561 7 c.d. tablicy 2 1 1 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 . 58 59 60 2 73,5 72,7 72,3 71,0 70,3 69,7 67,4 64,6 62,0 58,0 56,8 55,4 54,3 24,5 17,9 17,2 16,3 3 2,7 2,4 4,0 7,1 ¦ 2,5 2,5 74,7* 1,2 W 1,3 1,7 3,9 2,5 2,0 3,0 2,0 2,5 | *) sygnal stosowanego jako standard dioksanu Dwuchlorowodorek czynnika A-35512-B, krystalizowany z mieszaniny metanol — woda, posiada widmo rentgenow¬ skie, wykonane metoda proszkowa (promieniowanie Cu+ +, 1,5405 X filtr niklowy, d oznacza odleglosci miedzy- plaszczyznowe w angstremach) o charakterystyce, przed¬ stawionej w tablicy 3.Tablica 3 | | wzgledne natezenie 1 17,15 12,90 10,85 9,25 8,87 8,22 7,86 6,93 6,20 5,62 5,04 4,02 3,54 | 100 80 70 70 60 50 50 40 40 40 05 02 02 | Widmo w podczerwieni dwuchlorowodorku czynnika A-35512-B, wykonane w tabletce z bromku potasowego, przedstawia fig. 2. Wazniejsze pasma absorpcji wystepuja przy nastepujacych czestotliwosciach (cm-1): 3420 (silne), 3300 (przegiecie), 2950 (slabe), 1752 (slabe), 1675 (silne), 1630 (przegiecie), 1605 (silne), 1520 (silne), 1470 (slabe), 1440 (slabe), 1410 (slabe), 1345 (przegiecie), 1312 (sred¬ nie), 1225 (srednie), 1180 (slabe), 1135 (slabe), 1080 (silne) i 1020 (slabe).Analiza aminokwasowa hydrolizowanego kwasem dwu¬ chlorowodorku czynnika A-35512-B wykazuje, ze czynnik ten zawiera co najmniej piec reszt aminokwasów, z których jednym jest glicyna. Cztery pozostale reszty aminokwasowe czynnika A-35512-B tworza kompleks i wydaja sie byc identyczne ze znalezionymi w czynniku A-35512-A. Jedna z tych reszt aminokwasowych ma prawdopodobnie budowe okreslona wzorem, przedstawionym na rysunku.Analiza produktów hydrolizy kwasnej wskazuje, ze dwu¬ chlorowodorek czynnika A-35512-B zawiera nastepujace 8 cukry: glukoza, fukoza, mannoza, ramnoza i 3-amino-2,3,6- -trójdezoksy-3-C-metylo-L-ksylo-heksopiranoza. W wyni¬ ku lagodnej hydrolizy kwasnej zostaja usuniete glukoza, fukoza, mannoza i ramnoza i otrzymuje sie charakterystycz- 5 na pochodna aglikonowa.Dwuchlorowodorek czynnika A-35512-B posiada co naj^- mniej jedna dajaca sie estryfikowac grupe hydroksylowa.Dwuchlorowodorek czynnika A-35512-B jest rozpusz¬ czalny w wodzie, czesciowo rozpuszczalny w alkoholach, io takich jak metanol i etanol i nierozpuszczalny w innych mniej polarnych rozpuszczalnikach organicznych, takich jak benzen, chloroform, aceton, eter dwuetylowy, octan etylu, toluen, heksan, acetonitryl i dioksan.Dwuchlorowodorek czynnika A-35512-B jest trwaly na* 15 wet w ciagu 72 godzin w wodnych roztworach o pH od okolo 3 do okolo 10.Czynnik A-35512-C jest biala, bezpostaciowa, zasadowa substanqa o nastepujacym przyblizonym skladzie elemen¬ tarnym: C —. 53,93%, H — 5,15%, N — 5,80%, O — 20 32,35%, Cl —1,90%.Podane wyniki analizy elementarnej sa w szczególnosci zgodne z korzystnymwzoremempirycznym C^H^NgOjgCl.Czynnik A-35512-C ma przyblizony ciezar czasteczkowy wynoszacy 1862. 25 Dwuchlorowodorek czynnika A-35512-C jest bialym, bezpostaciowym zwiazkiem o nastepujacym przyblizonym skladzie elementarnym: C — 51,76%, H — 5,07%, N — 5,61%, O — 30,29%, Cl — 4,88%.Dwuchlorowodorek czynnika A-35512-C posiada ha- 30 stepujacy przyblizony wzór empiryczny: C83-85H97_101 N8037_39C13.Analiza elementarna w szczególnosci odpowiada innemu korzystnemu wzorowi empirycznemu: C84H97N8038C1 • • 2HC1 (obliczono: C — 52,2, H — 5,1, N — 5,8, O — 31,5, 35 Cl —5,4%).Widmo w podczerwieni dwuchlorowodorku czynnika A-35512-C, wykonane w tabletce z bromku potasowego, przedstawia fig. 4. Wazniejsze pasma absorpcji wystepuja przy nastepujacych czestotliwosciach (cm-1): 3370 (silne), 3280 (przegiecie), 3040 (przegiecie), 2980 (przegiecie), 2920 (slabe), 1740 (slabe), 1658 (silne), 1620 (slabe), 1589 (srednie), 1503 (silne), 1460 (slabe), 1428 (srednie), 1385 (slabe),-1330 (slabe), 1295 (srednie), 1210 (silne), 1162 (srednie), 1120 (slabe), 1060 (silne) i 1005 (srednie): W widmie absorpcyjnym w nadfiolecie dwuchlorowo¬ dorku czynnika A-35512-C wystepuje maksimum w kwas¬ nym i obojetnym metanolu przy 282 nm (Z = 14.600) i w zasadowym metanolu przy 292 nm (£ = 16.400), przy czym molarny wspólczynnik ekstynkcji obliczano dla ciezaru czasteczkowego 2000.W widmie magnetycznego rezonansu jadrowego Wegla 13C wykonanym w D20, dwuchlorowodorek czynnika A- -35512-C wykazuje sygnaly, zestawione w tablicy 4. 55 Tablica4 | Nr 1 1 1 2 3 4 5 6 . ppm 2 172,9 172,2 171,5 171,0 169,6. 158,6..... wysokosc (%) 3 :, 1 2,5 1 2,0; . 2,2. 3,9 2,0 . .W. 1108 561 9 c.d. tablicy 4 ] 1 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 | 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 . 40 . . 41 42 1 43 44 1 2 1 157,8 J 156,5 156,1 155,6 154,6 151,1 143,3 136,0 135,4 133,2 128,7 126,5 124,6 • r 129,3 121,5 120,1 118,0 116,5 107,8 104,5 101,7 94,5 75,9 74,3 73,4 72,1 70,9 68,7 67,4 64,3 62,2 56,1 55,2 54,2 24,3 17,9 17,1 16,2 | 3 3,0 2,1 2,8 4,2 3,9 1,5 1,4 3,2 2,7 3,7 2,3 3,1 2,1 2,7 2,2 1,2 1,7 1,2 2,7 1,9 1,9 1,0 3,0 2,0 2,3 3,5 4,3 2,9 71,7* 1,3 1,6 1,4 3,5 2,1 1,9 2,2 2,0 2,0 | ') sygnal stosowanego jako standard dioksanu Dwuchlorowodorek czynnika A-35512-C wykazuje na¬ stepujace wartosci skrecalnosci wlasciwej: [a]" = —161 ° (c = 1,05, woda) oraz [a] ™5 = —614° (c = 1,05, woda).Miareczkowanie elektrometryczne dwuchlorowodorku czynnika A-35512-C w 66% roztworze wodnym dwume- tyloformamidu wskazuje na obecnosc trzech dajacych sie miareczkowac grup o wartosciach pKa okolo 7,30, 8,92 i 10,99 i mozliwa obecnosc dalszych dwóch lub wiecej grup o wartosciach pKa powyzej 11,5.Prawdopodobny ciezar czasteczkowy dwuchlorowodorku A-35512-C, obliczony na podstawie miareczkowania, wy¬ nosi okolo 1982.Analiza aminokwasowa hydrolizowanego kwasem dwu¬ chlorowodorku czynnika A-35512-C wykazuje, ze czynnik ten zawiera co najmniej piec reszt aminokwasów, jednym z których jest prawdopodobnie glicyna. Pozostale cztery reszty aminokwasowe nie zostaly jeszcze zidentyfikowane.Dwuchlorowodorek czynnika A-35512-C jest rozpusz¬ czalny w wodzie, dwumetylosulfotlenku i wodnym roztwo¬ rze dwumetyloformamidu, czesciowo rozpuszczalny w alko¬ holach, takich jak metanol i etanol, a nierozpuszczalny 10 w innych mniej polarnych rozpuszczalnikach organicznych, takich jak benzen, chloroform, aceton, eter dwuetylowy, octan etylu, toluen, heksan, acetonitryl i dioksan.Dwuchlorowodorek czynnika A-35512-C jest trwaly 5 w ciagu 146 godzin w roztworach wodnych o pH od okolo 3 do okolo 10.Czynnik A-35512-E jest biala, bezpostaciowa, zasadowa substancja O nastepujacym przyblizonym skladzie elemen¬ tarnym: C — 54,84%, H — 4,73%, N — 5,26%, O — 10 32,67%, Cl — 1,72%.Chlorowodorek czynnika A-35512-E jest biala, bez¬ postaciowa substancja o nastepujacym przyblizonym skla¬ dzie elementarnym: C — 52,67%, H — 4,59%, N — 5,55%, O —33,51%, Cl —3,62%. 15 Widmo w podczerwieni chlorowodorku czynnika A- -35512-E, wykonane w tabletce z bromku potasowego, przedstawia fig. 5. Najwazniejsze pasma absorpcji wyste¬ puja przy nastepujacych czestotliwosciach (cm-1): 3360 (silne), 3220 (przegiecie), 2900 (slabe), 1725 (slabe), 20 1650 (silne), 1580 (srednie), 1498 (silne), 1450 (slabe), 1419 (slabe), 1295 (srednie), 1205 (srednie), 1172 (sred¬ nie), 1110 (slabe), 1060 (silne) i 1000 (slabe).W widmie absorpcyjnym w nadfiolecie chlorowodorku czynnika A-35512-E wystepuja nastepujace maksima absor- 25 pcji: przy 270 nm (przegiecie) i 359 nm (Z = 16.216) w obojetnym metanolu, przy 286 nm (L = 18.018) i 310 nm (przegiecie) w kwasnym metanolu oraz przy 270 nm (przegiecie) i 300 nm (27 = 16.216) w zasadowym meta¬ nolu, przy czym molarny wspólczynnik ekstynkcji obli- 30 czano dla ciezaru czasteczkowego 2000.Chlorowodorek czynnika A-35512-E wykazuje skrecal- nosc wlasciwa [a]" = —108 ° (c = 1, woda).Miareczkowanie elektrometryczne chlorowodorku czyn¬ nika A-35512-E w 66% roztworze wodnym dwumetylo- 35 formamidu wskazuje na obecnosc trzech dajacych sie miareczkowac grup o wartosciach pKa okolo' 6,30, 9,09 i 11,62 i mozliwa obecnosc jednej lub dwóch dalszych grup o wartosciach pKa powyzej okolo 12,5 (wartosc poczatkowa pH wynosila 5,45). 40 Prawdopodobny ciezar czasteczkowy chlorowodorku czynnika A-35512-E, obliczony na podstawie miareczko¬ wania, wynosi okolo 2018.Analiza aminokwasowa hydrolizowanego kwasem chloro¬ wodorku czynnika A-35512-E wykazuje, ze czynnik ten 45 zawiera szesc, niezidentyfikowanych jak dotad aminokwa¬ sów.Chlorowodorek czynnika A-35512-E jest rozpuszczalny w wodzie, czesciowo rozpuszczalny w alkoholach, takich jak metanol i etanol, ale rozpuszczalny w wiekszosci roz- 5 puszczalników organicznych, takich jak benzen, chloro¬ form, aceton, eter dwuetylowy, octan etylu, toluen, heksan, acetonitryl i dioksan.Czynnik A-35512-H jest biala bezpostaciowa, zasadowa substanqa o nastepujacym przyblizonym skladzie ele¬ mentarnym: C — 53,76%, H — 5,32%, N — 5,53%, O — 33,48%, Cl — 1,59%.Czynnik A-35512-H posiada nastepujacy przyblizony wzór empiryczny: C85_87H103_io7N8038-4oCl, korzystny wzór 60 sumaryczny C86H104N8O39Cl i przyblizony ciezar czastecz¬ kowy 1908.Chlorowodorek czynnika A-35512-H jest biala, bezpo¬ staciowa, higroskopijna substancja o nastepujacym przy¬ blizonym skladzie elementarnym: C — 53,10, H — 5,37%, 65 N — 5,35%, O — 30,12%, Cl — 3,78%.108 561 u 12 Widmo w podczerwieni chlorowodorku czynnika A- -35512-H, wykonane w tabletce z bromku potasowego, przedstawia fig. 3. Najwazniejsze pasma wystepuja przy nastepujacych czestotliwosciach (cm-1): 3410 (silne), 3240 (przegiecie), 2940 (slabej 1670 (silne), 1630 (prze¬ giecie), 1605 (silne), 1520 (silne), 1470 (slabe), 1442 (slabe), 1400 (slabe), 1345 (przegiecie), 1310 (srednie), 1225 (srednie), 1180 (slabe), 1080 (silne) i 1020 (prze¬ giecie).W widmie absorpcyjnym w nadfiolecie chlorowodorku czynnika A-35512-H wystepuje maksimum w obojetnym i kwasnym metanolu przy 282 nm (27 = 12.500) i maksi¬ mum w zasadowym metanolu przy 292 nm (27 = 14.000), przy czym molarny wspólczynnik ekstynkcji obliczano dla ciezaru czasteczkowego 2000. W widmie w nadfiolecie wystepuje takze pasmo absorpcji koncowej przy 225 nm.W widmie magnetycznego rezonansu jadrowego wegla 13C chlorowodorku czynnika A-35512-H, wykonanym w D20, wystepuja sygnaly, zestawione w tablicy 5.Tablica 5 1 Nr 1 2 3 4 .-: 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14; 15 16 17 18 19. 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 ¦ 33 34 35 36 37 38 PPm ' 2 . 177,2 171,6 170,9 169,6 158,9 157,6 156,6 155,6 155,4 154,3 151,3 137,7 136,7 136,0 135,3 133,5 129,4 127,3 126,1 124,2 122,6 107,6 101,8 76,2 73,5 72,3 71,0 69,7 67,4 61,6 56,8 55,4 1 55,0 24,5 17,9 17,2 16,3 wysokosc (%) " * 1 .2,7 . 5,2 5,8 4,7 3,1 43 ; ¦ '3,8 • • . 4,1 • . 3,8 . ¦ 2,4 ¦ ¦ . 1,6 2,0 2,2 ¦4,0 1,9 5,0 3,7 1,3 3,2 6,9 4,1 2,7 .1,8 2,8 4,4 7,4 12,2 4,6 73,1* 3,5 1,8 2,8 1,5 2,6 4,6 2,6 3,6 | 20 25 SO 35 40 45 50 55 Miareczkowanie elektrometryczne chlorowodorku czyn¬ nika A-35512-H w 66% roztworze wodnym dwumetylo- formamidu wskazuje na obecnosc pieciu dajacych sie mia¬ reczkowac grup o wartosciach pKa okolo 5,0, 7,46, 9,80, 11,43 i 13,02 (wartosc poczatkowa pH = 5,93).Prawdopodobny ciezar czasteczkowy chlorowodorku czynnika A-35512-H, obliczony na podstawie miareczko¬ wania, wynosi okolo 1660.Analiza aminokwasowa hydrolizowanego kwasem chlo¬ rowodorku czynnika A-35512-H wykazuje, ze czynnik ten zawiera co najmniej piec reszt aminokwasów, jednym z których jest glicyna. Pozostale cztery reszty aminokwaso- we czynnika A-35512-H wydaja sie byc identyczne z resz¬ tami stwierdzonymi w czynnikach A-35512-A i B.Chlorowodorek czynnika A-35512-H jest rozpuszczalny w wodzie, czesciowo rozpuszczalny w alkoholach, takich jak metanol i etanol i nierozpuszczalny w wiekszosci roz¬ puszczalników organicznych, takich jak benzen, chloro¬ form, aceton, eter dwuetylowy, octan etylu, toluen, heksan; acetonitryl i dioksan.Chlorowodorek czynnika A-35512-H jest trwaly w ciagu 72 godzin w wodnych roztworach o pH od okolo 3 do okolo 10.Czynnik A-35512-A, B, C, E, H oraz wystepujace w mniejszej ilosci czynniki F i G, mozna wygodnie roz¬ dzielac za pomoca chromatografii bibulowej, stosujac do rozwijania mieszanine 15:10:3:12 n-butanolu, pirydyny, kwasu octowego i wody. Korzystnym sposobem wywoly¬ wania jest bioautografia z zastosowaniem Sarcina Lutea.Przyblizone wartosci Rp czynników A-35512 podane sa w tablicy 6.Tablica 6 A-35512 Czynnik A.2HC1 Czynnik B.2HC1 Czynnik C.2HC1 Czynnik E.HC1 Czynnik F Czynnik G Czynnik H.HC1 Wartosc RF | 0,21 1 0,34 0,46 0,64 0,81 0,93 0,15 . \ W wielu ukladach czynnik A-35512-H mial charakte¬ rystyke chromatograficzna bardzo podobna do charakte¬ rystyki antybiotyku AM374, opisanego w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3700768. Czynnik antybiotyczny A-35512-H mozna odróznic od antybiotyku AM374 za pomoca co najmniej dwóch ukladów chromato¬ grafii bibulowej. W tablicy 7podane sa wartosci Rp czyn¬ nika A-35512-H (dwuchlorowodorek) i antybiotyku AM374 w dwóch powyzszych ukladach.Tablica 7 *) sygnal stosowanego jako standard dioksanu Chlorowodorek czynnika A-35512-H wykazuje skrecal- nosc wlasciwa [a]£ = —123,5° (c = 1, woda).Uklad rozpuszczalników Kwas octowy, 1 n kwas solny (3:1) n-propanol, NH4OH, woda (6:3:1) Wartosc RF | A-35512-H 0,47 0,11 AM374 0,58 0,20 65 Poszczególne czynniki A-35512 mozna rozdzielac za pomoca wysokorozdzielczej chromatografii cieczowej (HP-108 561 13 LC), stosujac jako faze stacjonarna poliamid (typ ZIPAX firmy Dupont), a jako faze ruchoma 1,33 molarny wodny roztwór jednozasadowego fosforanu potasowego, i sto¬ sujac do wykrywania pomiary w nadfiolecie przy 250 nm.W tablicy 8 podane sa czasy retenqi dla poszczególnych czynników A-35512, dla przykladowego rozdzialu za po¬ moca wysokorozdzielczej chromatografii cieczowej, pro¬ wadzonej w nastepujacych warunkach: wymiary kolumny okolo 0,3 x 15 mm, nosnik — poliamid ZIPAX firmy Dupont, rozpuszczalnik — roztwór 327 g KH2P04 w 1800 ml wody, szybkosc przeplywu — 0*5 ml/min., szybkosc zapisu — 5 mm/godzine, cisnienie — okolo 105 kg/cm2.Tablica 8 Czynnik A-35512 A B C E F' .... ..'G ."': H Czas retencji w min. 9,375 1 13,125 26,25 5,625 7,5 7,5 7,5 | Poza poszczególnymi wolnymi zasadami i chlorowodor¬ kami czynników A-35512, czynniki A, B, C, E oraz H otrzymuje sie takze w postaci innych dopuszczalnych w farmacji addycyjnych soli z kwasami. Okreslenie „do¬ puszczalne w farmacji" oznacza sole, których toksycznosc wobec zwierzat cieplokrwistych nie przekracza toksycznosci wolnych czynników A-35512.Odpowiednimi i reprezentatywnymi solami czynników A-35512 A, B, C, E i H sa sole, otrzymywane w typowej reakqi z kwasami organicznymi i nieorganicznymi, takimi jak siarkowy, fosforowy, octowy, bursztynowy, cytrynowy, mlekowy, maleinowy, fumarowy, palmitynowy, cholowy, embonowy, mukowy, D-glutaminowy, d-kamforowy, glu- tarowy, glikolowy, ftalowy, winowy, laurylowy, stearynowy, salicylowy, metanosulfonowy, benzenosulfonowy, sorbowy, pikrynowy, benzoesowy, cynamonowy i podobne.Sposobem wedlug wynalazku nowe antybiotyki wytwarza sie podczas hodowania, wytwarzajacego A-35512 szczepu Streptomyces candidus NRRL 8156, w warunkach fer¬ mentami podpowierzchniowej, z napowietrzaniem, w od¬ powiedniej pozywce, prowadzonej az do otrzymania znacz¬ nej ilosci antybiotyków. Antybiotyki wyodrebnia sie za pomoca róznych technik izolaqi i oczyszczania, stosowanych w procesach fermentacyjnych.Nowy drobnoustrój przydatny dla wytwarzania antybio¬ tyków A-35512 zostal wyizolowany z próbek gleby, ze¬ branej na atolu Eniwetok. Drobnoustrój zostal sklasyfiko¬ wany jako nowy szczep Streptomyces candidus (Krasil- nikow) Waksman, zgodnie z opisem E. B. Shirlinga i D. Go- ttlieba w „Cooperative Description of Type Cultures of Streptomyces. II. Species Descriptions from Second Study". Intern. J. Systematic Bacteriol., 18 (4), 279—392 (1968) i S. A. Waksmana „The Actinomycetes. Vol. 2 Classification, Identification and Descriptions of Genera and Species*', Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1961.Klasyfikacja powyzsza oparta jest na metodach, zaleca¬ nych przez International Streptomyces Projekt (E. B.Shirling i D. Gottlieb, „Methods for Characterization of Streptomyces Species", Intern. Buli. Systematic Bacteriol., 16, 313—340, 1966) oraz na innych uzupelniajacych testach.Barwy opisywano zgodnie z metoda ISCC-NBS, wedlug 14 K. L. Kellyego i D. B. Judda, „The ISCC-NBS Method of Determining Colors and a Dictionary of Color Names".U. S. Departament of Commerce Cir. 553, Washington, D. C, 1955. 5 Symbole w nawiasach zwyklych odnosza sie do serii barw wedlug Tresnera i Backusa (H. D. Tresner i S. J. Backus, „System of Color Wheels for Streptomyces Taxonomy".Appl. Microbiol., 11, 335—338, 1963), a oznaczenia barw z tablic sa pokreslone. W nawiasach kwadratowych podano 10 symbole barw wedlug Maerza i Paula (A. Maerz i AL R.Paul, „Dictionary of Color", Mc Graw-Hill, New Yorki N. Y., 1950). Hodowle prowadzono w temperaturze 30 °C,! w ciagu 14 dni, jesli nie podano inaczej.Charakterystyka szczepu wytwarzajacego antybiotyki 15 A-35512. Morfologia/Wytwarzane sa dlugie, faliste sporo- fory. Spory, laczace sie w lancuchy, zawierajace 10-50 jednostek, maja ksztalt cylindryczny i wymiary 0,7 do 1,05 x 1,4 do 3,5 mikronów. Na róznych pozywkach wy-! twarzane sa struktury przetrwalnikopodobne. W niektórych! 20 przypadkach obserwuje sie rozwidlone lub ulozone w wiazki! strzepki. Powierzchnia zarodników, obserwowana pod; mikroskopem elektronowym jest gladka. Charakterystyki hodowlane na róznych pozywkach przedstawia tablica 9.Tablica 9 25 Pozywka | 1 ISP nr 2 (agar z wy¬ ciagiem drozdzowym i wyciagiem slodo¬ wym) ISP nr 3 (agar z maka owsiana) 1 ISP nr 4 (agar skro- 1 biowy z solami nie¬ organicznymi) 1 ISP nr 5 (agar aspa¬ raginowy z gliceryna) ' Agar Emersona Zmodyfikowana agar Bennetta Charakterystyka 2 Wzrost obfity, spód szarawo- -zólty (11J5), obfita grzybnia powietrzna i zarodnikowanie, biala (w) a; brak rozpuszczal¬ nych pigmentów Wzrost umiarkowany, spód bla- dozólto-zielony (10B1); ladna grzybnia powietrzna i zarodni¬ kowanie, biala (w) 13ba; brak rozpuszczalnych pigmentów, obserwuje sie ciala przetrwal- nikowo-podobne.Wzrost dobry; spód bursztynó- wo-bialy (10C1), dobra grzyb¬ nia powietrzna i zarodnikowa¬ nie, zóltawo-szara (CY) 2dc; lekko-brazowe rozpuszczalne^ pigmenty; obserwuje sie ciala przetrwalnikowo-podobner" Wzrost dobry; spód bladozól- 1 to-zielony (10B2); dobra grzyb¬ nia powietrzna i zarodnikowa¬ nia, biala (w) a; brak pigmen¬ tów rozpuszczalnych^ grzybnia l wydaje sie byc ulozona w wiaz¬ ki l Wzrost dobry; spód lekkooliw- 1 kowy (14L6); brak grzybni po- [ wietrznej i zarodnikowania; lekkobrazowe rozpuszczalne pi¬ gmenty Wzrost obfity; spód umiarko¬ wanie zólty (11J6); obfita grzybnia powietrzna i zarodni¬ kowanie, biala (w) a; brak roz¬ puszczalnych pigmentów |10S 561 15 16 c.d. tablicy 9 | 1 1 2 [ Agar Czapek'a Agar z pasta pomi¬ dorowa i maka owsiana 1 Agar odzywczy 1 Agar asparaginowy z glukoza 1 Agar z tryptonem i wyciagiem drozdzo¬ wym 1 Agar tyrozynowy i ¦...-¦ 1 Agar z gliceryna i glicyna 1 Agar z jablczanem wapnia Li :—: : : _ ' 1 Wzrost dobry; spód blado- zóltozielony (10B1); dobra grzybnia powietrzna i zarodni¬ kowanie, biala (w) b; brak rozpuszczalnych pigmentów; grzybnia wydaje sie byc ulozo¬ na w wiazki Wzrost obfity; spód szarawo- zólty (1115); obfita grzybnia powietrzna i zarodnikowanie, biala (w) a; grzybnia „stacza sie" z powierzchni agaru; brak rozpuszczalnych pigmentów Wzrost umiarkowany do dob¬ rego; spód bladozóltozielony (18D2); dobra grzybnia po¬ wietrzna i zarodnikowanie, bia¬ la (w) a, lekkobrazowe roz¬ puszczalne pigmenty Wzrost dobry; spód blado¬ zóltozielony (17E1); dobra grzybnia powietrzna i zarod¬ nikowanie, biala (w) 13ba; brak rozpuszczalnych pigmen¬ tów | Wzrost wyrazny; spód bialy 1 (10A1); wyrazna grzybnia po¬ wietrzna i zarodnikowanie, bia¬ la (w) b; brak rozpuszczalnych pigmentów Wzrost dobry, spód bialy 1 (10B2); dobra grzybnia po¬ wietrzna i zarodnikowanie, bia¬ la (w) a; brazowe rozpusz¬ czalne pigmenty; obserwuje sie ciala przetrwalnikopodobne Wzrost dobry; spód bialy (10B2); dobra grzybnia po¬ wietrzna i zarodnikowanie, bia¬ la (w) b; brak pigmentów roz¬ puszczalnych Wzrost dobry; spód bialy (10B1); dobra grzybnia po¬ wietrzna i zarodnikowanie, bia¬ la (w) a; brak rozpuszczalnych pigmentów; podloze staje sie przezroczyste wokól zakazonej powierzchni | Drobnoustrój badano pod wzgledem wybranych wlasci¬ wosci fizjologicznych, stosujac standardowe postepowanie.Stwierdzono wlasciwosci, podane w tablicy 10.Tablica 10 Obserwowana wlasciwosc Dzialanie na mleko Redukcja azotanów Charakterystyka Koagulacja z pewnymi przejasnieniami w ciagu 14 dni Zachodzi 10 15 20 55 60 65 | Obserwowana wlasciwosc Wytwarzanie pigmentu-ma- leinowegona;. skosach z agaru zelazo- L wego z peptonem; L skosach z agaru tyro- \ zynowegó | pozywce, zawierajacej trypton i wyciag droz¬ dzowy Uplynnianie zelatyny Wymagania temperaturowe (pozywka ISP nr 2— sko¬ sy z wyciagiem drozdzowym i slodowym 1 | Charakterystyka ¦ .-¦ • brak slabe Wytwarzanie pig¬ mentów po 7 dniach; brak Calkowite w ciagu 14 dni 26-30°C — wzrost dobry i zarodnikowanie 37°C — slaby wzrost; brak grzybni powietrznej i zarodników 40°C — slaby wzrost we¬ getatywny 45 °C — brak wzrostu W tablicy 11 przedstawiono wyniki testów na przyswa- 25 janie wegla przez drobnoustroje NRRL 8156; Znaczenie uzytych symboli jest nastepujace: + - —¦ wzrost dobry, przyswajanie (+) —'•wzrost ubogi do wyraznego (—) ¦—- wzrost slaby, prawdopodobnie brak przyswajania 30 -— — brak wzrostu, brak przyswajania Tablica 11 35 40 45 Zródlo wegla Brak (negatywny próba kontrolna) D-glukoza (pozytywna próba kontrolna) L-arabirioza Sacharoza i-Inozyt D-mannft D-fruktoza ¦¦*¦..Ramnoza Rafinóza D-ksylóza Oznaczenie (-) + "(-) '¦' ' "(-) "'+ + + (- (-) (+ ) Niektóre cechy charakterystyczne szczepu S. eandinus NRRL'8156, wytwarzajacego antybiotyki A-35512, róznia sie od cech drobnoustroju, opisanego przez Elwooda B. Shirlinga i Davida Gottlieba w „Cooperative Descrip- tion of Type Cultures of Streptomyces III. Additjonal Species Descriptions from First and Second Studies", Intern. J. Systematic Bacteriol., 18 (2), 69 — 189 (1968) oraz przez Waksmana S. A. w „The Actinomycetes. Clas- sification, Identifications and Descriptions of Genera and Species", Vol. 2, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, Md., 1961. Podane róznice zestawiono w tablicy 12.Szczep Streptomyces candidus wytwarzajacy antybiotyki A-35512 zostal zdeponowany w kolekcji szczepów Nort¬ hern Regional Research Center, U. pS» Department of Agri- culture, Agricurtural Research Service,. Peoria, Illinois, 61604* z której to kolekcji jest- powszechnie dostepny pod numerem NRRL 8156. r Jako pozywki wzrostowe dla Streptomyces candidus NRRL 8156 mozna stosowac którekolwiek z wielu mozli-10S 561 17 Tablica 12 Przyswajanie wegla L-arabinoza Ramnoza i-Inozyt Uplynnianie zelatyny Dzialanie na mleko NRRL 8156 — — + Calkowite w ciagu 14 dni Koagulacja z pew¬ nymi przejasnie¬ niami w ciagu 14 dni Opublikowany opis + + = Powolne Brak koagula¬ cji, dobra pe- ptonizacja wych. Jednak ze wzgledów ekonomicznych oraz ze wzgledu na optymalna wydajnosc i latwosc izolowania produktu, korzystne sa niektóre pozywki hodowlane. Np. korzystnym zródlem weglowodanów w produkcji na skale przemyslowa jest sacharoza, chociaz mozna stosowac, równiez glukoze, dekstryne z tapioki, fruktoze, mannit, maltoze, laktoze i podobne.Korzystnym zródlem azotu jest rozpuszczalny pepton miesny, ale równiez mozna stosowac make sojowa, maczke miesna, aminokwasy, takie jak kwas glutaminowy i podobne produkty. Do odzywczych soli nieorganicznych, wchodza¬ cych w sklad pozywek, naleza handlowe rozpuszczalne sole, bedace zródlem cynku, sodu, magnezu, wapnia, amo¬ nu, chloru, weglanów, siarczanów, azotanów i podobnych jonów.W sklad pozywki moga równiez wchodzic podstawowe pierwiastki sladowe, niezbedne dla wzrostu i rozwoju drob¬ noustroju. Pierwiastki takie zazwyczaj znajduja sie jako zanieczyszczenia w innych skladnikach pozywki, w ilos¬ ciach wystarczajacych dla zaspokojenia potrzeb wzrosto¬ wych drobnoustroju.W razie potrzeby dodaje sie mala ilosc (0,2 ml/litr) srodka przeciwpiennego, takiego jak glikol polipropylenowy, jesli podczas fermentacji w duzej skali pienienie staje sie problemem.-,,... .Dla wytwarzania znacznych ilosci-antybiotyków A-35512 korzystna jest fermentacja podpowierzchniowa z napo¬ wietrzaniem. Male ilosci antybiotyków A-35512 mozna otrzymywac w hodowli w kolbach na trzesawkach.Ze wzgledu na opóznienie w •wytwarzaniu antybiotyków, zwiazane na ogól ze szczepieniem duzych fermentorów zarodnikujaca postacia drobnoustroju, korzystne jest sto¬ sowanie inokulum wegetatywnego. Inokulum wegetatywne przyrzadza sie, zaszczepiajac mala objetosc pozywki hodo¬ wlanej formami zarodnikujacymi lub fragmentami grzybni drobnoustroju, w celu otrzymania swiezej* aktywnie wzras¬ tajacej hodowli drobnoustroju. Inokulum wegetatywne przenosi sie nastepnie do wiekszych fermentorów.Drobnoustrój, wytwarzajacy antybiotyki A-35512, mozna hodowac w zakresie temperatur okolo 20-40°C. Optymalna wydajnosc wytwarzania antybiotyków A-35512 osiaga sie w temperaturze 30-34°C.Jak to zwykle ma miejsce w hodowli podpowierzchniowej z napowietrzaniem, przez pozywke przetlacza sie jalowe powietrze. W celu uzyskania wydajnego wzrostu drobno¬ ustroju w fermentorach przemyslowych, przez pozywke przepuszcza sie korzystnie powyzej 0,1 objetosci powietrza na minute na jedna objetosc pozywki. Dla uzyskania wy- 18 dajnego wytwarzania antybiotyków A-35512 korzystnie jest przepuszczac okolo 0,25 objetosci powietrza na minute, Proces wytwarzania antybiotyków A-35512 podczas fer¬ mentacji moze byc kontrolowany za pomoca analizowania próbek brzeczki lub ekstraktów na zawartosc antybiotyku.Do testowania stosuje sie drobnoustrój, o którym wiadomo, ze jest wrazliwy na wytwarzane antybiotyki. Do takich drobnoustrojów nalezy Bacillus subtilis ATCC 6633.Oznaczenie biologiczne prowadzi sie korzystnie przy uzyciu krazków bibulowych na plytkach z agarem, zawiera¬ jacym ubogi w skladniki odzywcze agar.Po zakonczeniu fermentacji antybiotyki A-35512 mozna wyodrebniac z brzeczki fermentacyjnej za pomoca znanych w praktyce sposobów. Antybiotyki, wytwarzane w procesie fermentacji drobnoustroju wytwarzajacego A-35512, (Znaj¬ duja sie prawie wylacznie w przesaczu brzeczki. Stad tez, najlepsza wydajnosc izolacji antybiotyków A-35512 uzys¬ kuje sie, odsaczajac najpierw mase grzybni. Przesaczona brzeczke mozna oczyszczac dla uzyskania mieszaniny A- -35512, stosujac rozmaite sposoby. Korzystna metoda polega na adsorpqi na kolumnie z poliamidem i nastepnie elucji woda i wodnym roztworem alkoholu. Frakcje eluatu, zawierajace antybiotyki, laczy sie i otrzymuje mieszanine A-35512. Mozna równiez za pomoca takiej samej techniki laczyc poszczególne frakqe na podstawie wyników chroma¬ tografii cienkowarstwowej i otrzymywac oczyszczony czynnik A-35512-B i wzbogacone mieszaniny pozostalych czynników, A-35512. Dalsze oczyszczanie poszczególnych czynników A-35512 polega na dodatkowej adsorpcji i elucji.Jako materialy adsorpcyjne mozna z powodzeniem stosowac tlenek glinu, zel krzemionkowy, wymieniacze jonowe i po¬ dobne.Czynniki A-35512 wystepuja w brzeczce fermentacyjnej w postaci chlorowodorków. W korzystnym sposobie roz¬ dzialu na materiale poliamidowym otrzymuje sie czynnik A-35512-B i mieszanine pozostalych czynników w postaci chlorowodorków. Kazdy z poszczególnych czynników mozna przeksztalcac w wolna zasade, nie zawierajaca chloru jo* nowego, stosujac np. chromatografie na slabo zasadowym wymieniaczujonowym. .Alternatywnie, stale skladniki hodowli, w tym skladniki pozywki i grzybnie mozna stosowac jako zródlo antybioty¬ ków A-35512, z pominieciem operacji ekstrakcji lub roz¬ dzielania, ale korzystnie po usunieciu wody, np. po zakon¬ czeniu fermentacji brzeczke, zawierajaca antybiotyki A- -35512 mozna liofilizowac i stosowac bezposrednio jako domieszke do pasz.Mieszanina antybiotyczna A-35512 oraz czynniki anty- Tablica 13 Szczep testowy Staphylo- coceus aureus 3055 Staphylo- coceus aureus 3074 Strepto- coceus faecalis MIC 0 czynnik A-35512- -A.2HC1 6,25 25,0 6,25 czynnik A-35512- -B 2HC1 3,12 6,25 3,12 czynnik A-35512- -C.2HC1 6,25 6,25 3,12 czynnik A-35512- -H.HCl 25,0 25,0 12,5 | 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6019 108 561 Tablica 14 20 Szczep testowy Staphylococcus aureus 3055 (wrazliwy na penicyline G) Staphylococcus aureus 3074 (oporny na penicyline G) Staphylococcus aureus 3130 (oporny na metycyline) Streptococcus pyogenes (grupa A) Streptococcus sp. 9960 (grupa D) Diplococcus pneumoniae (Park I) Srednica strefy w mm 1 czynnik A-35512-A- •2HC! 13,4 13,2 14,4 17,0 15,5 — czynnik A-35512-B- •2HC1 18,4 16,8 18,4 19,6 19,4 — . czynnik A-35512-C- •2HC1 0 0 0 10,5 0 11,0 czynnik A-35512-E- •HCl 14,4 14,5 15,4 17,0 16,4 20,0 czynnik A-35512-H- •HCl 11,9 11,6 12,6 16,0 13,8 — biotyczne A, B, C, E i H hamuja wzrost róznych patogen- nych drobnoustrojów, szczególnie bakterii Gram-dodat- nich. W tablicy 13 zestawiono wartosci najmniejszych stezen hamujacych (MIC) przy których czynniki A-35512- -A, B, C i H hamuja wzrost wybranych bakterii w stan¬ dardowym tescie rozcienczonym na agarze.Antybiotyki A-35512 hamuja wzrost drobnoustrojów, opornych na dzialanie innych antybiotyków. W tablicy 14 podane sa wyniki testów na aktywnosc czynników A-35512- -A, B, C, H i E, wobec wybranych drobnoustrojów. Testy przeprowadzano standardowa metoda krazkowo-plytkowa (30 //g/krazek) i aktywnosc wyrazano w postaci wielkosci (srednica w mm) obserwowanych stref zahamowania.W tablicy 15 podano wyniki dodatkowego testu rozcien- czeniowego na agarze, ilustrujace aktywnosc dwuchloro- wodorku czynnika A-35512-B wobec róznych szczepów Streptococci, Grupa A i Diplococcus pneumoniae. Wyniki podano w postaci wartosci najmniejszych stezen hamuja¬ cych (MIC).Tablica 15 Drobnoustrój testowy Streptococcus pyogenes C203 Streptococcus pyogenes 10389 Streptococcus pyogenes 12344 Streptococcus pyogenes 12961 Streptococcus pyogenes 663-72 Streptococcus pyogenes 664-72 Streptococcus pyogenes 665-72 Streptococcus pyogenes 13234 Streptococcus pyogenes 19035 Streptococcus pyogenes M6517 Streptococcus pyogenes D27781 Diplococcus pneumoniae Park I Diplococcus pneumoniae Typ 14 MIC (//g/ml) 1 Czynnik A-35512-B 1 1 8 1 0,5 0,5 1 0,5 0,5 0,5 1 2 2 W tablicy 16 podano wyniki dodatkowego testu rozcien- czeniowego na agarze, ilustrujace aktywnosc dwuchloro- 25 30 35 40 45 50 55 60 65 wodorku czynnika A-35512-B wobec róznych szczepów Streptococci, Grupa D.Tablica 16 Drobnoustrój testowy Streptococcus sp. D282 Streptococcus sp. 9901 Streptococcus sp. 9913 Streptococcus sp. 9933 Streptococcus sp. 9960 Streptococcus sp. 12253F Streptococcus sp. Shrigley Streptococcus sp. Mitis Streptococcus sp. 238 Streptococcus sp. SS992 MIC (//g/ml) Czynnik A-35512-B 2 2 4 4 4 4 4 4 2 4 W tablicy 17 podane sa wyniki dodatkowego testu roz- cienczeniowego na agarze, ilustrujace aktywnosc dwuchlo- rowodorku czynnika A-35512-B wobec innych drobno¬ ustrojów Gram-dodatnich.Tablica 17 Drobnoustrój testowy Staphylococcus aureus 3123* Staphylococcus aureus H43* * Staphylococcus aureus 3124** Staphylococcus aureus 3126** Staphylococcus aureus 3127** Staphylococcus aureus H57** Staphylococcus aureus 3074** Staphylococcus aureus 3130*** Staphylococcus aureus 3131**** Staphylococcus aureus 3133*** Staphylococcus aureus 3136*** Staphylococcus aureus 3125*** 1. Staphylococcus epidermis 3064* * MIC (//g/ml) Czynnik A-35512-B 4 4 4 2 4 2 4 4 4 2 2 4 2 |108 561 21 22 c.d. tablicy 17 Drobnoustrój testowy Staphylococcus epidermis 3078** Bacillus subtilis ATCC 6633 Sarcina lutea PCI-10D1-FDA MIC 0*g/ml) Czynnik A-35512-B 1 1 2 1 * — wrazliwy na penicyline G ** — oporny na penicyline G **• — oporny na penicyline G i metycyline **** — oporny na penicyline G, metycyline i klindemycy- ne.Antybiotyki A-35512 hamuja takze wzrost niektórych bakterii beztlenowych. W tablicy 18 podano wyniki bada- nia aktywnosci dwuchlorowodorku czynnika A-35512-B wobec róznych bakterii beztlenowych, za pomoca standar¬ dowego testu rozcienczeniowego na agarze.Tablica 18 Drobnoustrój testowy Actinomyces israeli Clostridium perfringens Clostridium septicum Eubacterium aerofaciens Peptococcus asaccharoliticus Peptostreptococcus anaerobius Peptococcus prevoti Peptostreptococcus intermedius Propionibacterium acnes Bacteroides fragilis ssp. fragilis Ul Fusobacterium necrophorum MIC Gug/ml) 1 Czynnik A-35512-B 0,5 2,0 4,0 2,0 1,0 1,0 2,0 4,0 0,5 64,0 8,0 Dwuchlorowodorek czynnika A-35512-B wykazuje in vivo aktywnosc przeciwbakteryjna wobec róznych wywoly¬ wanych doswiadczalnie infekcji bakteryjnych. Zarazonym myszom podawano dwie dawki podskórnie czynnika A- -35512-B i obserwowana aktywnosc oznaczono jako ED50* •ED30, jest to dawka w mg/kg, chroniaca 50% testowa¬ nych zwierzat (Warren Wiek i wsp., J. Bacteriol., 81 233-235, 1961). Uzyskane wartosci ED50 dla dwuchloro- wodorku czynnika A-35512-B podane sa w tablicy 19.Tablica 19 Drobnoustrój testowy Streptococcus pyogenes C203 Diplococcus pneumoniae Parki Staphylococcus aureus 3055 ED50 1,75 4,3 6,9 Natezenie infekcji (dootrzew- nowo) 260xLD50 60,8xLD50 206xLD50 Dwuchlorowodorek czynnika A-35512-B chroni takze swinki morskie, zakazone drobnoustrojem beztlenowym Clostridium chauvoci, wywolujacym szelestnice u bydla.Test taki przeprowadzono wedlug U.S.D.A. Supplemental 10 15 20 SO 40 45 50 55 Assay Method for Potency Testing Clostridium chauvoci containing Products (SAM 200, U.S. Department of Agriculture, Animal and Plant Health Inspection Service, Veterinary Services Laboratories, Ames. Iowa 50010, April 7, 1975, 9 C.F.R. 113. 91). Wyniki testu podana w tablicy 20.Tablica 20 Czynnik Czynnik A-35512-B 10 mg/kg* Czynnik A-35512-B 1 mg/kg* Próba kontrolna Stosunek martwych do calko¬ witej ilosci 0/10 3/10 10/10 Procent ochrony 100 70 0 .*' — domiesniowo Antybiotyki A-35512 sa wzglednie nietoksyczne,, np.LD50 dla dwuchlorowodorku czynnika A-35512-A ma wartosc wieksza od 8000 mg/kg, przy podawaniu pod¬ skórnym myszom rasy Cox-Harlan IRC, plci zenskiej.Wartosc LD50 dla dwuchlorowodorku czynnika A-35512-B wynosi przy podawaniu dootrzewnowym myszom okolo 1356 mg/kg, a przy podawaniu dozylnym 1000-1250 mg/kg.Dwuchlorowodorek czynnika A-35512-C i chlorowodorek czynnika A-35512-E wykazuja przy podawaniu dootrzew¬ nowym myszom toksycznosc ostra przy dawce wiekszej niz 300 mg/kg.Inna cenna wlasciwoscia mieszaniny A-35512 i jej sklad¬ ników jest zdolnosc zwiekszania wydajnosci karmienia u zwierzat. Stwierdzono to na przykladzie zwierzat prze¬ zuwajacych, posiadajacych rozwinieta funkqe zwacza.Wiadomo jest, ze wydajnosc przyswajania weglowoda¬ nów u przezuwajacych wzrasta w wyniku dzialania, które stymuluje zwiekszanie wytwarzania przez flore bakteryjna zwacza raczej propionianów niz octanów lub maslanów.Zostalo to szczególowo opisane przez Churcha i wsp. w „Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants", tom 2, 1971, str. 622 i 625.Wydajnosc paszy moze byc okreslana w testach in vivo u bydla z zalozona przetoka, przy zastosowaniu sposobu podanego przez Arthura P. Ranna w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3794732, zwlaszcza w przykladzie VIII. W tablicy 21 przedstawiono wyniki takiego testu dla dwuchlorowodorku czynnika A-35512-B.Podane stezenie kwasu propionowego w zwaczu jest sred¬ nim z pieciu analiz, przeprowadzonych w ciagu 21 dni 65 Próba kontro¬ lna Próba z czyn¬ nikiem A- -35512-B | (50 g/tone) Tablica 21 Ilosc zwierzat 5 5 Sredni procent molowy kwasu propio¬ nowego 19,3 26,0 Procent 1 molowy f wzrostu 1 w stosunku 1 do próby kontrolnej — 6,7 1108 561 23 Mieszanina A-35512 i jej skladniki zwiekszaja stezenie propionianów i tym samym wydajnosc paszy przy poda¬ waniu przezuwajacym w dawkach dziennych 0,15-10,0 mg/Ig. Lepsze wyniki osiaga sie przy podawaniu w daw¬ kach 1,0-2,0 mg/kg/dzien. Korzystnym sposobem poda¬ wania mieszaniny A-35512 lub poszczególnego zwiazku jest mieszanie ich z pasza dla zwierzat. Antybiotyki te moga byc równiez podawane w inny sposób, np. w postaci tabletek, wlewów do gardla lub kapsulek. Powyzsze formy farmaceutyczne przygotowuje sie sposobami dobrze zna¬ nymi w farmacji leków weterynaryjnych. Kazda pojedyn¬ cza dawka leku powinna zawierac mieszanine A-35512 lub jej skladnik w ilosci odpowiadajacej dziennej dawce po¬ dawanej zwierzeciu.Mieszanina A-35512 i jej skladniki sa takze uzyteczne jako czynniki wzrostowe dla zwierzat. W tescie na kur¬ czetach brojlerach dwuchlorowodorek czynnika A-35512- -B, dodawany do karmy w ilosci 20 g/tone, zwiekszal przy¬ rost wagi i wydajnosc karmy. W tablicy 22 podano wyniki takiego testu, przeprowadzonego w wylegarnf wielopietro¬ wej, w którym to tescie stosowano 4 grupy po 8 ptaków dla kazdego z dwóch okresów czasowych! W tablicy 23 zestawiono wyniki testu przeprowadzanego w wylegarni klatkowej przy zastosowaniu 12 grup po 80 ptaków.Tablica 22 Próba Kontrolna Czynnik A-35512-B co bo 20 bo o 380 394 l i I & 3,68 i g ¦a 1,850 1,776 r. 4,00 Tablica 23 l ::Pr 'Kontrolnk "Czynnik A-25S12-B CO b0 20 t'n.'. V ••".•' Przyrost wagi wg 1898 1956* Na a i a o o g 3,06 Wydajnosc pokarmu 2,250 2,177 j % poprawy *¦ w stosunku do kontroli 2,81 | 10 15 35 W 40 24 nr 2. Zakazony skos inkubuje sie w temperaturze 30 °C w ciagu okolo 7 dni. Dojrzala hodowle na skosach pokrywa sie 5 ml wody i zdrapuje spory sterylna pipeta. Porcje 2,5 ml otrzymanej zawiesiny sporów stosuje sie do zakaze¬ nia 30 ml pozywki wegetatywnej o nastepujacym skladzie: Skladnik Ilosc Pozywka tryptykazowo-sojowa (Baltimore Biological, Laboratories, Cockeyville.,Md). 30 g Woda odmineralizowana do 1 litra Zakazona pozywke wegetatywna inkubuje sie w kolbach Erlenmayera o objetosci 250 ml, w temperaturze 30°C, w ciagu 48 godzin, na trzasawce obrotowej o 250 obrotach na minute i wychyleniach 50 mm. Po zakonczeniu inkubo- wania, 0,5 ml pozywkj wegetatywnej stosuje sie do zakaze¬ nia 50 ml pozywki produkcyjnej o nastepujacym skladzie: 25 Skladnik Dekstryna z tapioki Glukoza NH4N03 KC1 MgS04 FeCl2.4H20 ZnCl2 KH2P04 Kwas L-glutaminowy Dl-citrulina CaC03 Woda odmineralizowana Ilosc w g/litr 25,0 10,0 2,5 1,5 U 0,03 0,03 0,1 W 0,1 5,0 do 1 litra ¦i_ ZH5 - Mieszanina A-35512 i jej skladniki dzialaja skutecznie w zwiekszeniu wzrostu ptactwa przy podawaniu z karma w ilosci okolo 100 g na tone. karmy.Podane; przyklady ilustruja dokladniej sposób wedlug wynalazku. i Przyklad I." Fermentacja A-35512 w kolbach na trzesawkach.Liofilizowane pastylki Streptomyces candidus NRRL 8156 rozpuszcza sie* w 1-2 ml jalowej wody i zakaza roz¬ tworem skosy agarowe, zawierajace wyciag drozdzawo-slo- dowy Bacto (ISP nr 2, produkcji Difco Laboratories, Detroit, Michigan). Zakazone stosy inkubuje sie w tempera¬ turze 30 °C, w ciagu okolo 7 dni. Dojrzala hodowle na sko¬ sach pokrywa sie 2 ml wody i zdrapuje sterylna pipeta spory. Porcje 0,1 ml wodnej zawiesiny sporów stosuje sie do zakazenia nastepnego skosu agarowego z pozywka ISP 50 55 60 65 Zakazona pozywke produkcyjna inkubuje sie w kolbach Erlenmayera o pojemnosci 250 ml, w temperaturze 32°C, w ciagu 8-10 dni, na trzesawce obrotowej o 250 obrotach na minute i wychyleniach 50 mm.Fermentacja A-35512 w fermentorach. W celu uzyskania wiekszej ilosci inokulum, 20 ml pozywki wegetatywnej, otrzymanej w sposób opisany powyzej, stosuje sie do za¬ kazania 400 ml pozywki wegetatywnej II etapu o skladzie takim samym, jak sklad pozywki wegetatywnej. Pozywke II etapu inkubuje sie w kolbach o pojemnosci 2 litry, w ciagu 24 godzin, w temperaturze 32 °C, na trzesawce obrotowej o 250 obrotach na minute i wychyleniach 50 mm. 800 ml pozywki wegetatywnej II etapu stosuje sie do zakazania 100 litrów jalowej pozywki produkcyjnej. Zaka- . zona pozywke produkcyjna poddaje sie fermentami w fer- tffcicntorze o pojemnosci 165 litrów, w ciagu okolo 8-10 dni, sie, v§J&dujac 0,25 objetosci powietrza na minute na objetosc pozywki oraz miesza, stosujac zwykle mieszadlo o 200 obrotach na minute.Przyklad II. Inkubowana pozywke wegetatywna, przygotowana w sposób, podany w przykladzie I mozna przechowywac do pózniejszego, uzycia, przechowujac ja pod parami cieklego azotu. W tym celu, w probówce o wy¬ miarach 13 x 100 ml, wyjalowionej i zaopatrzonej w przy¬ krywke srubowa, umieszcza sie 2 "nil zawiesiny srodka rozpraszajacego o nastepujacym skladzie: Skladnik Ilosc Gliceryna 20% Laktoza ' 10% Woda odmineralizowana 70% Do podanej zawiesiny dodaje sie 2 ml inkubowanej w ciagu 48 godzin hodowli wegetatywnej, przygotowanej w sposób opisany uprzednio. Mieszanine zamraza sie i przetrzymuje pod oparami w pojemniku, zawierajacym108 561 25 ciekly azot. Przechowywane w taki sposób inokulum we¬ getatywne rozmraza sie. tprzed uzyciem, zanurzajac fiolke w lazni wodnej o temperaturze 43 °C. 1 ml rozmrozonego inokulum stosuje, sie do zakazania 50 ml pozywki wegeta¬ tywnej o skladzie, podanym w przykladzie 1. Zakazona 5 pozywke wegetatywna stosuje sie, jak to zostalo opisane . w przykladzie I, do fermentacji w kolbach na trzesawkach lub dla uzyskania wiekszej ilosci inokulum do fermentacji w fermentorach.Przyklad III. Proces fermentacji prowadzi sie w spo- 10 sób, opisany w przykladzie I, stosujac pozywke produkcyjna do hodowli w kolbach lub fermentorach o nastepujacym skladzie: s - "Skladnik Ilosc/g/litr Dekstryna ztapioki 75,0 15 Melasa 40,0 ¦ - Rozpuszczalny peptonmiesny 15,0 ' MgS04.7H2O 0,5 CaCQ3 : . 2,0 Woda do1,0 litra 20 Przyklad iy. Izolacja mieszaniny antybiotycznej A-3551Z Calosc brzeczki fermentacyjnej (946 litrów), otrzymanej w sposób* opisany w przykladzie I, saczy sie, ¦stosujac po¬ moc filtracyjna (ziemia okrzemkowa Hyflo Super-cel 25 firmy Johns-Manvjlle Products Corp.). Wartosc pH brzecz¬ ki wynosi 6,8-7,2. Klarowny przesacz przepuszcza sie przez kolumne, zawierajaca zywice Amberlit XAD-4 (produkqi firmy Rohm and Haas Co.), stosujac 10 ml zywicy na 100 ml przesaczu brzeczki. Kolejne frakcje bada sie na aktyw- 30 nosc -biologiczna, stosujac standardowa analize krazkowa Sarcina rutea. Frakcje nieaktywne biologicznie odrzuca sie.Kolumne przemywa sie woda w ilosci równej 1/8 objetosci brzeczki, z szybkoscia 150 ml/minute. Nieaktywna wode z przemycia odrzuca sie. Nastepnie eluuje sie produkt 35 600 litrami 50% roztworu wodnego metanolu z szybkoscia 200 ml/minute. Eluaty, zawierajace mieszanine antybioty¬ ków A-35512, zateza sie pod Zmniejszonym cisnieniem do objetosci okolo 15 litrów. W jednym litrze znajduje sie okolo 200 gramów mieszaniny antybiotycznej A-35512. 40 Przyklad V. Wyodrebnianie^ poszczególnych czyn¬ ników z mieszaniny antybiotycznej A-35512.Okolo 3000 gramów mieszaniny antybiotycznej A-35512,: rozpuszczonej w 15 litrach metanolu, otrzymanej w spo¬ sób, opisany w przykladzie IV, chromatografuje sie na 45 kolumnie, wypelnionej 100 litrami poliamidu produkcji firmy Woelnu Kolumne eluuje sie odmineralizówana*woda z szybkoscia okolo 80-120 ml/minute.Odbierane frakcje bada sie, stosujac chromatografie cienkowarstwowa na celulozie lub chromatografie bibulowa, 50 stosujac do rozwijania mieszanine n-butanolu, pirydyny, kwasu octowego i wody (15:10:3:12) i do wywolywania bioautografie wobec Sarcina lutea.Pierwsze 100 litrów eluatu odrzuca sie i ustala szybkosc przeplywu na okolo 160-200 ml/minute. Zbiera sie 12 55 frakqi o objetosci 12 litrów kazda. Nastepnie zmienia sie eluent i eluuje w gradiencie metanolu i wody, stosujac nastepujace postepowanie.Zbiornik, zawierajacy 360 litrów metanolu, laczy sie polaczeniem syfonowym ze zbiornikiem, zawierajacym 120 60 litrów wody. Mieszanine rozpuszczalników miesza sie i podaje na kolumne. Zbiera sie 24 frakcje o objetosci 24 litrów kazda, prowadzac eluacje z szybkoscia 200-300 ml/ /minute.Na podstawie wyników bioautografii laczy sie poszcze* 65 26 gólne frakcje w grupy i odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac dwuchlorowodorek czynnika A- -35512-B i nastepujace wzbogacone mieszaniny innych czynników* co przedstawia tablica 24.Tablica 24 Frakcje 1—10 11—24 15—31 32=44 Objetosc (w litrach) 120 216 168 312 Czynnik A + H B B + C C, E, P, G Ilosc 192 g 269 g 590 g 224 g Przyklad VI. Oczyszczanie czynnika A-35512-B.Czesciowo oczyszczone 400 g dwuchlorowodorku czyn¬ nika A-35512-B, otrzymanego wedlug przykladu V, roz¬ puszcza sie w 1,2 litra 50% roztworu wodnego metanolu i chromatografuje na kolumnie z tlenkiem glinu. Kolumne przygotowuje sie w nastepujacy sposób. 10 kg kwasnego tlenku glinu (firmy Woelrn) miesza sie z 50% roztworem wodnym metanolu. Mieszanine po¬ zostawia sie do odstania, dekantuje supernatant i pdrzuca go. Tlenek glinu miecza sie powtórnie z 50% roztworem wodnym metanolu i pakuje do kolumny o srecjnjcy, 13,5 cm, a nastepnie przemywa 50% roztworem wodja-gra metanolu az do uzyskania klarownego eluatu. Produkt eluuje sie 50% roztworem wodnym metanolu z szybkoscia okolo 8-^1$ml/ /minute, zbierajac frakcje o objetosci okolo 24^-3®jml.Kolejne frakcje bada sie za pomoca chromatografii cienko¬ warstwowej, stosujac do wywolywania bioautografie ;ak to zostalo opisane w przykladzie V. Na podstawie wynikpw oznacza poszczególne frakcje laczy sie i otrzymuje oczysz¬ czony dwuchlorowodorek czynnika A-35512-B. Wyniki przedstawia tablica 25.Tablica 25 - •¦ 1 Frakcje 17—21 22—29 30—37 Ilosc """:| 9,6 g- 72,0 g H7,0g | Kazda z podanych frakcji krystalizowano w tempera¬ turze 4°C z zatezonego 50% roztworu wodnego metanolu.Otrzymany dwuchlorowodorek czynnika A-35512-B za-' wiera okolo 4,6% chloru. Wartosc pH roztworu dwuchloro¬ wodorku czynnika A-35512-B w 66% roztworze wodnym dwumetyloformamidii wynosi okolo 6,5.Przyklad VII. Wytwarzanie czynnika A-35512-B, nie zawierajacego chloru jonowego. 1 g dwuchlorowodorku oczyszczonego czynnika A-35512- -B, otrzymanego w sposób opisany w przykladzie VI, rozpuszcza sie w wodzie i przepuszcza przez kolumne o wy- - miarach 2,5x18 cm, wypelniona wymieniaczem jonowym.; Bio-Rad AG3-4x w formie wodorotlenkowej, z szybkoscia 0,5 ml/minute, stosujac do eluacji odmineralizówana wode.Pierwsze 5 ml eluatu odrzuca sie. Nastepne 50 ml eluatu odparowuje sie do sucha pod zmniejszonym cisnieniem .: i otrzymuje 0,76 g nie zawierajacego chloru jonowego - czynnika A-35512-B w postaci bialego proszku, zawiera¬ jacego okolo 1,59% chloru. Wartosc pH roztworu tego preparatu w 66% roztworze wodnym dwumetyloformami- du wynosi9,13. * -.'-108 S61 27 28 Przyklad VIII. Oczyszczanie czynnika A-35512-A Czesciowo oczyszczony 1 g dwuchlorowodorku czynnika A-35512-A, frakcje 1-10 z przykladu V, rozpuszcza sie w 5 ml 50% roztworu wodnego metanolu. Roztwór chro¬ matografuje sie na kolumnie o wymiarach 3x16 cm, wypelnionej kwasnym tlenkiem glinu (firmy M. Woelm), przygotowanej w sposób opisany w przykladzie V. Eluuje sie 50% roztworem wodnym metanolu z szybkoscia 0,5 ml/minute. Zbiera sie frakcje o objetosci 5 ml i analizuje kazda, stosujac bioautografie cienkowarstwowa, opisana w przykladzie V. Na podstawie powyzszych oznaczen frakcje 7-15 laczy sie, zateza pod zmniejszonym cisnieniem do malej objetosci i liofilizuje. Otrzymuje sie 0,3 g dwu¬ chlorowodorku czynnika A-35512-A o zawartosci chloru 4,71%.Przyklad IX. Wytwarzanie czynnika A-35512-A, nie zawierajacego chloru jonowego. 200 mg dwuchlorowodorku czynnika A-35512-A, otrzy¬ manego w sposób podany w przykladzie VIII, rozpuszcza sie w 10 ml wody i roztwór ten przepuszcza sie przez kolumne o wymiarach 1,5x10 cm, zawierajaca wymie¬ niacz jonowy Bio-Rad AG3-4 x w formie wodorotlenkowej, z szybkoscia 0,5 ml/minute, stosujac do ehiacji wode odmineralizowana. Pierwsze 10 ml eluatu odrzuca sie, nastepne 20 ml zateza sie pod zmniejszonym cisnieniem do malej objetosci i liofilizuje. Otrzymuje sie 115 mg czynnika A-35512-A, nie zawierajacego chloru jonowego.Przyklad X. Oczyszczanie czynnika A-35512-C Czesciowo oczyszczone 15 g dwuchlorowodorku czyn¬ nika A-35512-C (frakqe 25-31 z przykladu V) rozpuszcza sie W odmineralizowanej wodzie (40 ml). Roztwór nanosi sie na kolumne o wymiarach 4x 115 cm, wypelniona poli¬ amidem (MN,<0,07 mm, Brinkman Instruments Inc.), przygotowanym w wodzie i przemywanym przez noc woda.Do ehiacji stosuje sie odmineralizowana wode z szybkoscia okolo 3 ml/minute. Pierwsze 250 ml eluatu odrzuca sie, a nastepnie zbiera sie frakcje o objetosci 24 ml.Kolejne frakcje kontroluje sie za pomoca chromato¬ grafii cienkowarstwowej na plytkach aluminiowych, po¬ krytych celuloza (produkcji firmy E. Merck, RFN). Do rozwijania stosuje sie uklad rozpuszczalników Il-rzed.- -butanol, pirydyna, kwas octowy, woda (10:10:3:8), a do wywolywania bioautografie za pomoca Bacillus subtilis.Na podstawie wyników chromatografii cienkowarstwowej frakcje 1-33 laczy sie, zateza pod zmniejszonym cisnieniem do objetosci 150 ml i liofilizuje.Dwie dalsze porcje czesciowo oczyszczonego dwuchloro¬ wodorku czynnika A-35512-C chromatografowano sto¬ sujac opisane powyzej warunki. W obu przypadkach laczo¬ no frakcje 1-33, zatezano je pod zmniejszonym cisnieniem do objetosci 150 ml i liofilizowano. Trzy porcje liofilizatu z trzech kolumn wazyly lacznie 12,3 g.Dwuchlorowodorek czynnika A-35512-C oczyszcza sie dalej za pomoca chromatografii na innej kolumnie z poli¬ amidem, prowadzac operacje w sposób uprzednio opisa¬ ny, ale zbierajac frakcje o objetosci 15 ml i stosujac szyb¬ kosc przeplywu wynoszaca 1 ml/minute. Kolejne frakq'e bada sie za pomoca chromatografii cienkowarstwowej z bioautografia. Frakcje 36*58 laczy sie, zateza pod zmniej¬ szonym cisnieniem do objetosci 150 ml i liofilizuje. Otrzy¬ muje sie 5,3 g oczyszczonego dwuchlorowodorku czynnika A-35512-C W celu ostatecznego oczyszczenia dwuchlorowodorek czynnika A-35512-.C chromatografuje sie na kolumnie 0 wymiarach 5x41, zawierajaca kwasny tlenek glinu (Wo¬ elm). Nosnik zawiesza sie i przemywa 50% roztworem wodnym metanolu az do uzyskania klarownego eluatu.Wtedy na kolumne nanosi sie 5,3 g czynnika A*35512-C. 5 Eluuje sie 50% roztworem,wodnym metanolu z szybkoscia 1 ml/minute. Zbiera sie frakcje o objetosci 12 ml i anali¬ zuje je za pomoca chromatografii cienkowarstwowej po¬ laczonej z bioautografia, jak to zostalo opisane uprzednio.Frakqe 22-74 laczy sie, zateza pod zmniejszonym cisnie- 10 niem do objetosci 250 ml i liofilizuje. Otrzymuje sie 3,86 g dwuchlorowodorku czynnika A-35512-C.Przyklad XI. - Wytwarzanie czynnika A-35512-C, nie zawierajacego chloru jonowego 200 mg dwuchlorowodorku czynnika A-35512-C, przy- 15 gotowanego w sposób podany w przykladzie X, chromato¬ grafuje sie na slabo zasadowym wymieniaczu jonowym, stosujac postepowanie opisane w przykladzie IX; Otrzy¬ muje sie 156 mg czynnika A-35512-C, nie zawierajacego chloru jonowego. Otrzymany preparat zawiera okolo 1,90% 20 chloru.Przyklad XII. Oczyszczanie czynnika A-35512-E Czesciowo oczyszczony chlorowodorek czynnika A- -35512-E (8,1 g), otrzymany wedlug przykladu V (frak¬ cje 32-44), rozpuszcza sie w 40 ml odmineralizowanej wody. 25 Roztwór nanosi sie na kolumne o wymiarach 5 X110 cm, wypelniona poliamidem. MN»<0»07 (Brinkman Instru¬ ments Inc.), przygotowanymwwodziei przemywanymprzez noc woda. Do eluaq'i stosuje'sie odmineralizowana wode, szybkosc ehiacji wynosi 20 ml na 15 minut. Zbiera sie Si frakcje o objetosci 20 ml, Po Odebraniu 118 frakcji zmienia sie rozpuszczalnik na $0% roztwór wodny metanolu.Kolejne frakcje analizuje sie za pomoca chromatografii cienkowarstwowej z bioautografia, opisanej w przykladzie X. Frakcje 148-193, zawierajace czynnik A-35512-E laczy 35 sie, zateza pod zmniejszonym cisnieniem do objetosci 150 ml i liofilizuje. Otrzymuje sie 2,7 g chlorowodorku czynnika A-35512-E.Czesc (615 mg) powyzszego czesciowo oczyszczonego chlorowodorku czynnika A-35512-E rozpuszcza sie w 5 ml 40 50% roztworu wodnego metanolu i nanosi na kolumne o wymiarach 1,5 x 50 cm, wypelniona kwasnym tlenkiem glinu (Woelm). Nosnik zawiesza sie i przemywa 50% roz¬ tworem wodnym metanolu az do uzyskania klarownego eluatu. Eluuje sie tym samym rozpuszczalnikiem z szyb- 45 koscia 1 ml/minute i zbiera frakq'e o objetosci 10 ml.Kolejne frakcje analizuje sie za pomoca chromatografii cienkowarstwowej z bioautografia. Frakcje 5-8 laczy sie i zateza pod zmniejszonym cisnieniem do objetosci okolo 10 ml, po czym dodaje 50 ml odmineralizowanej wody 50 i liofilizuje. Otrzymuje sie 480 mg chlorowodorku czyn¬ nika A-35512-E.Przyklad XIII. Wytwarzanie czynnika A-35512-E, nie zawierajacego chloru jonowego... 200 mg chlorowodorku czynnika A-35512-E, przygoto- 55 wanego wedlug przykladu XII, chromatografuje sie na slabo zasadowym wymieniaczu jonowym, stosujac postepo-' wanie, opisane w przykladzie IX. Otrzymuje sie 170 mg czynnika A-35512-E, nie zawierajacego chloru jonowego.Otrzymany preparat zawiera okolo 172% chloru. 60 Przyklad XIV. Oczyszczanie czynnika A-35512-H.Czesciowo oczyszczony chlorowodorek czynnika A- -35512-H (30 g), otrzymany wedlug przykladu V (frakcje 1-10), rozpuszcza sie w minimalnej ilosci mieszaniny 7:3 metanolu i wody. Roztwór nanosi sie na kolumne 55 o wymiarach 3x60 cm, wypelniona kwasnym tlenkiemmmi 29 glinu (Woelm), zaladowywanym w metanolu i przemywa¬ nym metanolem, az do uzyskania klarownego wyplywajace¬ go rozpuszczalnika. Do eluacji stosuje sie metanol z szyb¬ koscia przeplywu wynoszaca 4 ml/minute. Zbiera sie frak¬ cje o objetosci 24 ml. Po odebraniu 59 frakcji zmienia sie rozpuszczalnik na mieszanine 1:1 metanolu i wody. Kolej¬ ne frakcje analizuje sie za pomoca chromatografii cienko¬ warstwowej, stosujac jako uklad rozwijajacy mieszanine chloroformu, metanolu i wodorotlenku amonowego (2:3:1) oraz wywoluje chromatogramy za pomoca bioautografii w srodowisku alkalicznym, z zastosowaniem jako szczepu testowego Bacillus subtilis. Frakqe 51-118 laczy sie i od¬ parowuje pod zmniejszonym cisnieniem. Otrzymuje sie 6,4 g oczyszczonego chlorowodorku czynnika A-35512-H.Przyklad XV. Wytwarzanie czynnika A-35512-H, nie zawierajacego chloru jonowego. 200 mg chlorowodorku czynnika A-35512-H, przygoto- 10 15 30 wanego wedlug przykladu XIV, chromatografuje sie na slabo zasadowym wymieniaczu jonowym, stosujac postepo¬ wanie opisane w przykladzie IX. Otrzymuje sie 143 mg czynnika A-35512-H nie zawierajacego chloru jonowego.Otrzymany preparat zawiera okolo 1,59% chloru.Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania mieszaniny antybiotycznej A-35512 zawierajacej czynniki A, B, C, E, F, G i H, znamienny tym, ze szczep Streptomyces candidus NRRL 8156 hoduje sie w pozywce, zawierajacej przyswajalne zródlo weglo¬ wodanów, azotu i soli nieorganicznych, w warunkach fer¬ mentacji podpowierzchniowej z napowietrzaniem, az do uzyskania znacznej aktywnosci antybiotycznej i ewentual¬ nie wydziela sie mieszanine antybiotyczna A-35512 z brzecz¬ ki, po czym ewentualnie wyodrebnia sie czynniki A, B, C, E, F, G i H z mieszaniny antybiotycznej A-35512. 25 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 (CM"1) 4011 250 FIG. I FIG. 2108 561 7 8 9 10 12 U 181820 25 30 40 FIG. 3 7 8 9 10 12 14 1818 20 25 30 40 FIG. 4 25 3 4 5 8 7 8 9 10 12 U 181620 2530 40 r 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1—r-i 1—i 4000 3500 3000 2500 2000 1800 1600 1400 1200 ICM"1) 1000 800 600 4C0 250 FIG. 5 HOOC NH2 HO -v-0 Cl H,N COOH Wzór LZG Z~d 3, z. 790/1400/80, n. 90+20 egz.Cena 45 zl PL