Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia aglikonowej pochodnej czynnika B mieszani¬ ny antybiiotyczmej A-35512.Antybiotyki A-35512 sa blisko spokrewnionymi antybiotykami glikopeptydowymi. Czynnik B anty¬ biotyków A-35512, najdokladniej scharakteryzo¬ wany skladnik kompleksu antybiotycznego A-35512, jest nowym antybiotykiem z grupy antybiotyków zawierajacych ugrupowanie peptydowe, takich jak wankomycyna (opis patentowy Stanów Zjednoczo¬ nych Ameryki Nr 3067099), antybiotyki A-4696, H, B i C (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3952095), awoparcyna (opis patento¬ wy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3855410), reistoimycyna A/N, Lonnakina, 7th Intetnnaitional Symposium of Chemistry of Natural Products, Ry¬ ga, 1970, str. 625) i rystocetyna A (opis paten¬ towy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 2990329.Antybiotyki A-35512 róznia sie od powyzszych znanych antybiotyków, miedzy innymi ruchliwo¬ scia w róznych ukladach chromatograficznych i skladem aminokwasowym i cukrowym.Chociaz znane sa obecnie liczne srodki przeciw- bakteryjne, istnieje w dalszym ciagu potrzeba po¬ szukiwania nowych, lepszych antybiotyków. Jed¬ nym z problemów wspólczesnej terapii antybio¬ tykami jest fakt róznej skutecznosci róznych an¬ tybiotyków w stosunku do patogennych drobno¬ ustrojów. Z drugiej strony szczepy drobnoustro- 10 jów uodporniaja sie na dzialanie obecnie stoso¬ wanych antybiotyków.Ponadto, u indywidualnych pacjentów czesto wystepuja powazne reakcje uboczne po podaniu okreslonych antybiotyków, takie jak nadwrazli¬ wosc i/lub dzialanie toksyczne. Dlatego tez ko¬ rzystne jest wytwarzanie nowych antybiotyków aktywnych w chorobach wywolywanych przez dro¬ bnoustroje.Ponadto korzystne jest otrzymanie dodatków paszowych zwiekszajacych efektywnosc karmienia zwierzat przezuwajacych i drobiu. Zwiekszenie e- fektywnosci karmienia nabiera coraz wiekszego 15 znaczenia. Srodkami zwiekszajacymi efektywnosc karmienia u wielu zwierzat i ptactwa sa dwuety- lostilbestrol i inne estrogeny.Polaczone jest to jednak z ryzykiem, ze resztki tych dodatków paszowych przechodza do miesa 20 przeznaczonego do spozycia. Dlatego tez istnieje realna potrzeba ekonomiczna poszukiwania nowych sposobów zwiekszania efektywnosci ograniczonych zasobów pasz, dostepnych dla produkcji miesa ze zwierzat przezuwajacych i drobiu. 25 Zastosowanie mieszaniny antybiotycznej A-35512 lub poszczególnych czynników i ich pochodnych jest postepem w tej dziedzinie. * Sposobem wedlug wynalazku wytwarza sie agli- 3< konowa pochodna czynnika B mieszaniny antybio- 128 225128 225 3 tycznej A-35512, okreslonego jako czynnik anty- biotyczny A-35512-B.Cecha sposobu wedlug wynalazku jest to, ze drobnoustrój Streptomyces candidus NRRL 8156, hoduje sie w pozywce zawierajacej zródlo przy¬ swajalnego weglowodanu i azotu oraz sole nie¬ ograniczone, w wairunkaich poidipowderzchiniciwej fer¬ mentacji aerobowej, do uzyskania znacznej ak¬ tywnosci antybiotycznej, po czym mieszanine an- tybiotyczna A-35512 wyodrebnia sie z pozywki ho¬ dowlanej, z mieszaniny tej wydziela sie czynnik B mieszaniny antybiotycznej A-35512 i czynnik ten poddaje sie hydrolizie za pomoca umiarkowanie mocnego kwasu.Aglikon czynnika A-35512-B oraz jago dopusz¬ czalne w fermentacji sole stosuje sie jako doda¬ tek do karmy dla drobiu w ilosci zwiekszajacej efektywnosc karmienia.Ponadto aglikon czynnika A-35512-B i jego do¬ puszczalne w farmacji sole podany doustnie zwie¬ rzetom przezuwajacym z rozwinieta funkcja zwa- cza, w dawce zwiekszajacej ilosc propionianu, po¬ woduje zwiekszenie przyswajania pokarmu u tych zwierzat.Aglikon czynnika A-35512-B i jego dopuszczal¬ ne w farmacji sole mozna takze stosowac do zwiekszania przyswajania pokarmu u drobiu, po¬ dajac tym zwierzetom doustnie skuteczna dawke aglikonu czynnika A-3i5612-B lub jego soli.Widmo w podczerwieni, w zawiesinie w oleju parafinowym, aglikonu czynnika A-35512-B przed¬ stawia fig. 1.Poszczególne czynniki A-35512 sa blisko spokre¬ wnionymi zwiazkami. Jako mieszanine antybioty- czna A-35512 izoluje sie z brzeczki fermentacyj¬ nej az siedem czynników antybiotycznych. Posz¬ czególne czynniki rozdziela sie i wyodrebnia czyn¬ niki A, B, C, E i H. Mieszanina A-35512 jest rozpuszczalna w wodzie, czesciowo rozpuszczalna w alkoholach, takich jak metanol i etanol, ale nierozpuszczalna w innych rozpuszczalnikach or¬ ganicznych, takich jak benzen, chloroform, aceton, eter dwuetylowy, octan etylu, toluen, heksan, ace- tonitryl i dioksan.Czynnik A-35512-B jest biala, bezpostaciowa, zasadowa substancja o przyblizonym wzorze empi¬ rycznym Coy.agHio^iosNg^C^e^gCl i nastepuja¬ cym przyblizonym skladzie elementarnym: C — 53,97%, H — 4,75%, N — 5,25%, O — 34,29%, Cl — 1,59%.Powyzsze wyniki analizy elemenltarnej w szcze¬ gólnosci sa zgodne z korzystnym wzorem empiry¬ cznym C9$Hio4NftC47Cl (obliczono: C — 53,60, H — 4,75, N — 5,47, O — 34,30, Cl — 1,61). Innym korzystnym wzorem empirycznym jest CggHioaNg- O47CI (obliczono: C — 54,00, H — 4,75, N — 5,15, O — 34,50, Cl — 1,60).W widmie absorpcyjnym w nadfiolecie czynni¬ ka A-35512-B wystepuje maksimum w kwasnym i obojetnym metanolu przy 282 nm (s = 15.000) 15 i w zasadowym metanolu przy 292 nm (* =* = 16.000), przy czym molarny wspólczynnik eks¬ tynkcji obliczono dla ciezaru czasteczkowego 2000.W widmie w nadfiolecie wystepuje takze pasmo 5 absorpcji koncowej przy 225 nm.Czynnik A-35512-B wykazuje nastepujace war¬ tosci skrecalnosci wlasciwej: [a]^*» —423° (c = 1, woda) oraz [a]JJB = ^446° -fc = 1, woda).Miareczkowanie elektrometryczne czynnika A- -35512-B w 66% roztworze wodnym dwumetylo- formamidu wskazuje na obecnosc czterech daja¬ cych sie miareczkowac grup o wartosciach pKa okolo 7,15, 8,81, 10,20, 12,00 i mozliwa ^becnosc grupy o pKa wyzszym niz 13,50. Prawdopodobny ciezar czasteczkowy czynnika A-355H2-B wynosi wedlug miareczkowania okolo 2143.Dwuchlorowodorek czynnika A-35512-B jest po 20 krystalizacji z 50% roztworu wodnego metanolu biala krystaliczna substancja. Chociaz dwuchloro¬ wodorek czynnika A-35512-B jest higroskopijny i nie posiada wyraznej temperatury topnienia, to termogram wykazuje ubytek wagi rozpoczynajacy 25 sie od temperatury 25°C i wyrazajacy sie 7,4% straty w temperaturze 121°C i rozkladem w tem¬ peraturze 135°C.Dwuchlorowodorek czynnika A-35512-B ma na¬ stepujacy sklad elementarny: C — 52,57%, H — 30 4,80%, N — 5,66%, O — 32,8fl%, Cl — 4,51%.Powyzsze wyniki analizy elementarnej sa w szczególnosci zgodne z innym alternatywnym wzo¬ rem empirycznym CgsH^NgC^TCl • 2HC1 (obliezo- 35 no: C — 51,93, H — 4,65, N — 5,57, O — 33,20, Cl — 4,65).W widmie absorpcyjnym w nadfiolecie dwuchlo- rowodorku* czynnika A-35512-B wystepuje maksi¬ mum w kwasnym i obojejtnym meltanolhi przy 282 40 nm (e = 12.000) i w zasadowym metanolu przy 292 nm (e = 14.000), przy czym molarny wspól¬ czynnik ekstynkcji obliczano dla ciezaru czastecz¬ kowego 2000. W widmie w nadfiolecie wystepuje takze pasmo absorpcji koncowej przy 225 nm. 45 Dwuchlorowodorek czynnika A-35S12-B wykazu¬ je nastepujace wartosci skrecallnosci wlasciwej: [«]d^ -128° (g * 1, woda) i WL- —475° (c = 1, woda). 50 Miareczkowanie elektrometryazne dwuchlorowo- dorku czynnika A-35512-B w 66% roztworze wod¬ nym dwumetyloformamidu wskazuje na obecnosc czterech dajacych sie miareczkowac grup o war¬ tosciach pKa okolo 7,15, 8,87, 10,30 i 12,10 i moz- 55 liwa obecnosc grupy o pKa wyzszym niz 13,1.Prawdopodobny ciezar czasteczkowy dwuchloro- wodorku czynnika A-35512-B wynosi na podsta¬ wie miareczkowania okolo 2027. 60 W widmie magnetycznym rezonansu jadrowego wegla 18C dwuchlorowodorku czynnika A-35512-B, wykonanym w D20, wystepuja nastepujace sygna¬ ly zestawione w tablicy 1.5 Tablica 1 Nr 2 3 4 5 6 7 8 9 10 U 12 13 14 15 16 17 18 . 19. . 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 152 63 ¦54- ¦ 55 56 57 58 69 [ 60 ppm 173,0 171,9 171,6 171,0 170,8 169,6 159,0 157,9 157,5 156,6 155,6 155,3 154,9 154,3 151,7 144,3 136,7 136,2 135,4 135,2 133,6 133,3 129,8 129,3 128,8 127,6 126,1 124,2 122,4 122,0 120,7 116,5 109,5 108,2 107,7 104,5 101,8 100,9 98,2 76,9 76,1 74,1 73,5 72,7 72,3 71,0 70,3 69,7 67,4 64,6 62,0 58,0 56,8 55,4 \ 54,3 24,5 17,9 17,2 16,3 wysokosc (%) 4,1 3,7 3,3 5,8 5,0 3,6 ¦ 4,1 4,4 3,7 4,8 6,1 4,2 3,3 4,2 3,3 3,1 3,5 4,9 4,0 4,4 4,2 4,1 1,7 3,0 2,6 1,5 3,9 5,6 1,4 4,4 3,3 2,7 0,8 1,1 2,7 1,7 . 2,9 1,6 1,0 1,2 1,8 2,0 2,7 ¦ 2,4 4,0 7,1 2,5 ' . 2,5'" 74,7* 1,2 1,5 1,3 1,7 3,9 2,5 2,0 . . 3,0 . 2,0 2,5 | * Sygnal stosowanego jako standard dioksanu 6 Dwuchlorowodorek czynnika A-35512-B, krystali- wany z mieszaniny metanol^woda, posiada naste¬ pujace widmo rentgenowskie wykonane metoda proszkowa (promieniowanie Cu++, 1,5405 X, filtr niklowy, d oznacza odleglosci miedzyplaszczyzno- we w angistremach) o charakterystyce przedsta¬ wionej w tablicy 2.Tablica 2 d 17,15 12,90 10,85 9,25 8,87 8,22 7,86 6,93 6,20 5,62 5,04 4,02 3,54 wzgledne natezenie 100 80 . 70 70 60 50 ¦ 50 40 40 40 05 02 a 02 Widmo w podczerwieni dwuchlorowodorku czyn¬ nika A-35512-B wykonane w tabletce z bromku potasowego, przedstawia fig. 2. Wazniejsze pasma absorpcji wystepuja przy nastepujacych czestotli¬ wosciach (cm-1): 3420 (silne), 3300 (przegiecie), 2950 (slabe), 1725 (slabe), 1675 (silne), 1630 (prze¬ giecie), 1605 (silne), 1520 (silne), 1470 (slabe), 1440 (slabe), 1410 (slabe), 1345 (przegiecie), 1312 (srednie), 1225 (srednie), 1180 (slabe), 1135 (slabe), 1080 (sil¬ ne) i 1020 (slabe).Analiza aminokwasowa hydrolizowanego kwa¬ sem dwuchloTowodorku czynnika A-35512-B wy¬ kazuje, ze czynnik ten zawiera co najmniej piec reszt aminokwasów, jednym z których jest glicy¬ na. Cztery pozostale reszty aminokwasowe czyn¬ nika A-35512-B tworza kompleks i wydaja sie byc identyczne ze znalezionymi w czynniku A-35512-A.Jedna z tych reszt aminokwasowych ma prawdo¬ podobnie budowe okreslona wzorem przedstawio¬ nym na rysunku.. Analiza produktów hydrolizy kwasnej wskazuje, ze dwucMorowodrek czynnika A-355L2-B zawliara % nastepujace cukry: glukoza, fukoza, mannoza, ram- noza i 3Hamiin,o-2,3,6-itrójdeizoksy-3^C-{meitylo-L-ksy- lo-heksopiranoza.7 188 22S * - W wyniku lagodnej hydrolizy kwasnej zostaja usuniete glukpza, fufeeza, mannpza oraz ramnoza 4 otraymuje sie charakterystyczna pochodna agli- kanowa. p^ruchlorowodore^ czynnika A-35512-B posiada co najmniej jedna dajaca sie estryfikowac grupe hydroksylowa.Dwuchlorowodorek czynnika A-35512-B jest roz¬ puszczalny w wodzie, czesciowo rozpuszczalny w alkoholach, takich jalc metanoj i etanol, i nieroz¬ puszczalny w innych mniej polarnych rozpuszczaU nikach organicznych, takich jak benzen, chloror form, aeeton, eter dwuetylowy, octan etylu, tor luen, heksan, acetonitryl i dioksan.Dwuchlorowodorek czynnika A-35312-B jest trwaly nawet w ciagu 72 godzin w ywqdnych roz^ tworach o pH od okolo 3 do okolo 10.Aglikon czynnika A-35512-B.Chlorowodorek aglikonu czynnika A-35512-B jest biala, bezpostaciowa substancja p nastepujar cym przyblizonym skladzie elementarnym: C — 54,29%, H t~ 4,34%, N — 7,40%, Cl -t- 5,02%, O -^ 28,95% (z róznicy).Widmo w podczerwieni chlorowodorku aglikonu czynnika Ar35512-B przedstawia fig. 1. Widmo wyT konane w zawiesinie w oleju parafinowym. Najr wazniejsze pasma absorpcji wystepuja przy na¬ stepujacych czestotliwosciach (cm_l)i 3440 (przer giecie), 3340 (przegiecie), 3215 (silne), 2950 (przer giecie), 2916 (silne), 284P (silne), 2640 (przegiecie), 1735 (slabe), J655 (silne), 1590 (sredraje), 1500 (sdlme), 1460 (silne), 1378 (srednie), 1365 (przegiecie), 1298 (srednie), 1115 (srednie), 1155 (srednie), 1120 (przer giecie), 1105 (slabe), 1060 (slabe), 1040 (slabe), 1008 (srednie), 925 (slabe), 875 (slabe), 765 (przegiecie), i 718 (slabe).Miareczkowanie elektriometryczne chlorowodorku aglikonu czynnika A-35512-B w 68% roztworze wodnym dwumetyloformaniidu wskazuje na obec¬ nosc trzech dajacych sie miareczkowac grup o wartosciach pKa okolo 7,5, 9,25 i 11,0 i mozliwa obecnosc dalszych dwóch grup o wartosciach pKa powyzej 11,6.Pfawdo|p4ot)ny cjejar (jgastecz^^wy phlorpwp- ^Ojrku. agli&pnu czymnilca A=?5^1?tB, objiczony na podstawie miareczkowania, wynos,i ejcofo 12£2.Chlorowodorek aglikonu czynnika A=35512-B wykasuje nastepujace wartosci fckrecalnosci wlas,- ciwej: [«]g = —178« (e = 5, metanol) i [a]% = == ^716,8° (c = 5, metanol).W wielmie absgppcyjnym w nac|fr(?l£Ci£ chlpro- y/adnricu. agljkonu czynnika A-,35512-B wystepuje in^J^imuin w obojetnym i jasnym metanolu pr^ m nm (ElVtcm= JQg,€3) oi:aa m^imum w /zasadowym metanolu przy 302 nrn (fifcm^ 182,09).W widmie magnetycznego rezonansu jadrowego wegla MC aglikonu czynnika A-35512-B, wykona¬ nym w dwumetylosulfetkfiku-de w tempea?aturae 90°C, wystepuja nastepujace sygnaly zestawione W tablicy 3.Tablioa 3 1 • Nr 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 ppm 187,8 172,0 170,7 170,1 169,6 168,4 166,7 157,4 156,6 •155,7 155,6 155,4 154,3 149,3 138,8 136,9 136,3 135,2 134,7 133,8 128,2 126,2 123,0 121,3 117,7 117,0 108,6 106,7 105,7 103,2 93,6 74,9 71,8 68,9 63,2 60,4 57,1 55,2 53,2 51,8 40,7 39,9 39,1 23,8 17,1 0,0 wysokosc (%} 37,2 40,9 45,2 46,9 47,7 57,6 52,5 49,9 45,5 55,8 71,5 56,7 50,5 , 43,0 38,8 54,3 40,? 31,7 28,4 40,9 102,9 77,? 57,5 38,1 44,4 31,5 31,0 47,9 81,3 26,5 33,4 39,Q 33,9 40,3 43,1 33,§ 57,a 33,1 30,1 36,Q 43,4* 60,3* 43,9* 55,7 47,8 43,7 *) Sygnal dwiiirnetylosulfotlenku-de 55 Widmo magnetycznego rezonansu jadrowego we¬ gla 13C wykazuje, ze w aglikonie czynnika A- -35512-B znajduje sie w dalszym ciagu 3ramino- -2,3,6-trójdezoksy-3-C-metyio-L^ksylorheks^e(ira- 60 noza, jeden z cukrów, znajdujacych sie w cza¬ steczce czynnika A-35512rB.Analiza aminokwasowa poddanego dalszej kwa¬ snej hydrolizie chlorowodorku aglikonu eaynnika A-35512-B wykazuje, ze aglikon ten zawiera gli- 65 cyne i oo najmniej tar^y ressaity aHiinokj^a&owe.9 128 223 it Jedna z tych reszt aminokwasowych posiada praw¬ dopodobnie budowe okreslona wzorem przedsta¬ wionym na rysunku.Chlorowodorek aglikonu czynnika A-35512-B po^ siada co najmniej jedna dajaca sie estryfikowac grupe hydroksylowa-.Chlorowodorek aglikonu czynnika A-35512-B jest rozpuszczalny w wodzie i w metanolu ale nierozpuszczalny w mniej polarnych rozpuszczal¬ nikach organicznych, takich jak benzen, chloro¬ form^ aceton, eter etylowy, octan etylu, toluen, heksan, acetonitryl i dioksan.Wartosc Rf chlorowodorku aglikonu czynnika A- -35512-B wynosi 0,80* podczas chromatografii cien¬ kowarstwowej na celulozie i rozwijaniu mieszani¬ na n-butanolu* pirydyny* kwasu octowego i wody (15;10:3:12)-. Korzystnym sposobem wywolywania jest biaautografia z zastosowaniem Sarcina Lutea.Wartosc Rf chlorowodorku aglikonu czynnika A-35518*B podczas chromatografii cienkowarstwo¬ wej na zelu krzemionkowym i (rozwijania miesza¬ nina metanolu^ chloroformu i stezonego NH4OH (3:2:1) wynosi 0,26.Aglifton czynnika A*35512-B (wolna zasada) jfesit bialA, Bezpostaciowa substancja o nastepujacym przyblizonym Skladzie elementarnym: C — 52,65%^ H -* 457*/l N — 6,9l«fo, Cl — 2,94tyo, O — 27,04°/*, po0i&l *^ 4,7 W widmtó w podczerwieni aglikonu czynnika A-3S512-B (Wolnej zasady), w tabletkach z brom¬ ku potóstfWego, wystepuja wazniejsze maksima ab¬ sorpcji przy nastepujacych czestotliwosciach (cm-1): 3360 (silne), 3z6Ó (przegieciem 2940 (przegiete), 1735 (przegiecie), ifafó (silne), 1598 (sredniej 1510 (silne), 1445 (srednie), lz95 (slabe), 1215 (srednie), 1169 (srednie), "lizz (slabe), 1070 (slabe), 1018 (sil¬ ne), Ub (slabe) i tófl (slabe).Miareczkowanie elektrometryczne aglikonu czynnika A-35Mz*B (wolnej zasady) w 66% roz^ tworze wodnym dwumetyloformamidu wskazuje iia obecnosc pieciu dajacych sie miareczkowac grup o Wartosciach pga okolo 6,2, 8,z, 10,1, li,4 i lz,4 l mozliwa obecnosc dalszych JSdnej lub ttarÓch grup ó wartosciach Wyzszych niz 12,5.Aglikón czynnika A-35512-B (wolna zasada) po* siada skrecalnoic wlasciwa [a] ^ = —64,5° (c=3, dwumetylosulfotlenek).W wakirriie afoisor,peyjtnyim w nadfiolecie aiglritoonu czynnika A»3'3512-B (wolnej zasady), wystepuje maksimum absorpcji w obojetnym i kwasnym me* tanolu przy 232 nm (Ej^ = 43,65) oraz maksi* ftttlm W zasadowym metanolu przy 301 nni CBf^* tt.tf).Przyblizone Wartosci ftf aglikonu czynnika A- &5512*-B (Wolnej zasady) sa takie same jak opisa^ he uprzednio dla chlorowodorku.Poza wolna zasada i chlorowodorkiem aglikonu czynnika A-3S5lz-E, aglikonu czynnika A-35512 mozna otrzymac w postaci dopuszczalnych W far¬ macji addycyjnych soli z kwasami. Okreslenie „do¬ puszczalne W farmacji" oznacza sole, których tok^ sycznosc wolbec zwierzat cieplokrwistych nie prze¬ kracza tdksycznóZci Wolnych czynników A-35512.Odpowiednimi i reprezentatywnymi solami agln konik czynnika A-35S12-B sa sole otrzymywane w typowej reakcji z kwasami organicznymi i nieor* gahiczhymi, takimi jak siarkowy, fosforowy, octo¬ wy, bursztynowy, cytrynowy, mlekowy, maleino»- * wy, fumarowy, palmitynowy, cholowy, pamowy, mukowy, D-glutaminowy, d-kamforowy, glutarowy, glikolowy, ftalowy, winowy, laurylowy, stearyno¬ wy, salicylowy, metanosulfonowy, behzen.osulfono- wy, sorbinowy, pikrynowy, benzoesowy* cynamo- M nowy i podobne.Antybiotyki A-35512 wytwarza sie podczas ho¬ dowania, Wytwarzajacego A-3S512, SBceepu Stefcfc- tomyces candidiis NRRL 8156, w warunkach fer- jl mehtacji podpowierzchhiowei z napowietrzaniem, w odpowiedniej pozywce, prowadzonej az do o- tfzymanla anaczlnej ilosci antybiotyków. Antybio¬ tyki Wyodrejbinia si£ za pomoca róznych technik izolacji i oczyszczania, stosowanych w procesach M fermentacyjnych.Nowy drobnoustrój stosowany dla wytwarzania antybiotyków A-35512 zostal wyizolowany z pró¬ bek gleby zebranej na atolu Eniwetok. Drobno¬ ustrój zostal sklasyfikowany jako nowy szczep & Streptomyeed candidus (Krassilnikov) Waksman, zgodnie z "opisem E. B. Shirlinga i D. Gottlieba w ,Coogierative Be«feription of Type Oultures of Strep- tomyceB; II. Speeies Bescriptioms from Second Stu- dy". Intern. J. Systemafóc BacterioL, 18 (4). 279— 10 302 (1968) i S.A. Waksmana „The Actinomycetes.Vol 8 CJaatóflcaitóGB^ Idenitiifieatiion and Deiserito- tions of Genera anid Speeies", Williams and Wiil- ktm Co., Baltimore, 1961.Itlasyfikateja pdWyftsza oparta jest na metodach U zalecanych prze* Mtea-hational Streptomyces Pro¬ jekt (fi.ft. ShirUhi i D. Gottlieb, „Methods fot Characlerl&atlon of Streptomyces Speeies", Intern.Buli; gystematlc Bacteriol., 16, 313—340, 1966) oraiz na Innych uzupelniajacych testach. Barwy * bpisyWalió ziodnte * metoda ISCC-NBS, wedlug K. L. Kelly,ego i D. B. Judde, „The ISCC-NB3 Method of Detefmming Colors and a Dieti^nary of Color Nam«etJ*,) \J-BK Department of Gommerce CM1. S58, Washingtclh, D. C, 1955.Symbole w hawissaeh zwyklych odnosza sie do serii barw wedlug Tresnera i Backusa (H. D. Tre-^ sner 1 S. J. feadtus, „System of Color Whecls for Streptomyces ltlait^tlbmy,^ Appl. Microbiol., 11 ^ 335—SS8, 1963), a oznaczenia barw z tablic sa pod* kreslone. W riaWlakach kwadratowych podano sym^ bole barw wedlug Maerza i Paula (A. Maerz 1 IM. R Paul, „Dictionary of Oalor'\ McGraw-Hill^ New-Yorkj N. Y., 1950). Hodowle prowadzono w w temperaturze 30ÓG, w ciagu 14 dni, jesli nie po¬ dano inaczeji Charakterystyka szczepu wytwarzajacego anty¬ biotyki A^35512. Morfologia.Wyparzane sa diugie, faliste feporotóry. Spory *6 laczace sie w lancuchy zawierajace 10—S6 j^dno-- stek, hiaja ksztaft cylindryczny i wymiary 0,7 dó 1,05 ^ 1,4 do 3,S mikronów. Na róznych pozyw¬ kach wytwarzane sa struktury przetrwalnikopo- tiobne. W niektórych przypadkach obserwuje si$ •• Rozwidlone lub ulozone w wiazki strzepki. Po^11 wierzchnia zarodników, obserwowana pod mikro¬ skopem elektronowym jest gladka.Charakterystyki hodowlane na róznych pozyw¬ kach przedstawia tablica 4.Tablica 4 Pozywka 1 1 ISP nr 2 (agar z wy¬ ciagiem drozdzowym i wyciagiem slodowym) ISP nr 3 (agar z ma¬ ka owsiana) ISP nr 4 (agar skro¬ biowy z solami nieor¬ ganicznymi) ISP nr 5 (agar aspa¬ raginowy z gliceryna) Agar Emersona • Zmodyfikowany. agar 1 Bennetta i Charakterystyka i 2 Wzrost obfity, spód szarawo-zólty (11J5), obfita grzybnia powie¬ trzna i zarodnikowanie, biala (w) a; brak roz¬ puszczalnych pigmen¬ tów Wzrost umiarkowany, spód blado-zólto-zie- lony (10B1); ladna grzybnia powietrzna i zarodnikowanie, biala (w) 13ba; brak rozpu¬ szczalnych pigmen¬ tów, obserwuje sie ciala przetrwalnikowo- podobne.Wzrost dobry; spód .bursztynowo-bialy (10C1), dobra grzybnia powietrzina i zarodni¬ kowanie, zóltawo-sza- ra (GY) 2dc; lekko- -brazowe rozpuszczal¬ ne pigmenty; obser¬ wuje sie ciala prze- trwalnikowo-podobne Wzrost dobry; spód bladozólto-zielony (10B2); dobra grzytalia powietrzna i zarodni¬ kowania, biala (w) a; brak pigmentów roz¬ puszczalnych; grzyb¬ nia wydaje sie byc ulozona w wiazki.Wzrost dobry; spód lekkooliwkowy (14L6); brak grzybni powie¬ trznej i zarodnikowa¬ nia; lekkobrazowe roz¬ puszczalne pigmenty.Wzrost obfity; spód umiarkowanie zólty (11J6); obfita grzybnia powietrzna i zarodni- 1 kowanie, biala (w) a; brak rozpuszczal¬ nych pigmentów. | 225 12 c.d. tablicy 4 1 Agar Czapek'a Agar z pasta pomido¬ rowa i maka owsiana Agar odzywczy Agar asparaginowy z glukoza.Agar z tryptonem i wyciagiem drozdzo¬ wym Agar tyrozynowy Agar z gliceryna i glicyna 1 2 Wzrost dobry; spód bladozóltozielony (10B1"; dobra grzyb¬ nia powietrzna i za¬ rodnikowanie, biala (w) b; brak rozpusz¬ czalnych pigmentów; grzybnia wydaje sie byc ulozona w wiazki.Wzrost obfity; slpód szarawozólty (1115); obfita grzybnia po¬ wietrzna i zarodniko¬ wanie, biala (w) a; grzybnia „stacza sie" z powierzchni agaru; brak rozpuszczalnych pigmentów.Wzrost umiarkowany do dobrego; spód bla¬ dozólto-zielony {1&D2); 1 dobra grzybnia powie¬ trzna i zarodnikowa¬ nie, biala (w) a; lek- i ko brazowe rozpusz¬ czalne pigmenty.Wzrost dobry; spód bladozóltozielony (17E1); dobra grzyb¬ nia powietrzna i za¬ rodnikowanie, biala i(w) 13ba; brak rozpu¬ szczalnych pigmen¬ tów.Wzrost wyrazny; spód bialy (10A1); wyrazna grzybnia powietrzna i zarodnikowanie, biala (w) b; brak rozpusz¬ czalnych pigmentów.Wzrost dobry, spód bialy (10B2); dobra grzybnia powietrzna i zarodnikowanie, bia¬ la (w) e; brazowe roz¬ puszczalne pigmenty; obserwuje sie ciala przetrwalnikowoipo- 1 dobne. 1 Wzrost dobry; spód bialy (10B2); dobra grzybnia powietrzna i zarodnikowanie, bia¬ la (w) b; brak pig¬ mentów rozpuszczal¬ nych. /128 225 13 c.d. tablicy 4 1 Agar z jablczanem wapnia 2 Wzrost dobry; sp6d bialy (10B1); dobra grzybnia powietrzna i zarodnikowanie, bia¬ la (w) a; brak roz¬ puszczalnych pigmen¬ tów; podloze staje sie przezroczyste wokól zakazonej powierzchni.Drobnoustrój badano pod wzgledem wybranych wlasciwosci fizjologicznych, stosujac standardowe postepowanie. Stwierdzono nastepujace wlasciwos¬ ci podane w tablicy 5.Tablica 5 Obserwowana wlasciwosc Dzialanie na mleko' Redukcja azotanów Wytwarzanie pigmentu maleinowego na: iskosiach z agaru zelazo¬ wego z peptonem; skosach z agaru tyro- zynowego, (pozywce zawierajacej tryptón i wyciag drozdzowy Uplynnianie zelatyny Wymagania temperatu¬ rowe (pozywka ISP nr 2 — skosy z wyciagiem drozdzowym i slodowym) Charakterystyka Koagulacja z pewny¬ mi przejasnieniami w ciagu 14 dni Zachodzi brak slabe wytwarzanie pigmentów po 7 dniach; brak; Calkowite w ciagu 14 dni 26—30°C — wzrost dobry ii zarodnikowanie 37°C — slaby wzrost; brak grzybni powietrz¬ nej i zarodników 40°C — slaby wzrost wegetatywny 45°C — brak wzrostu. | W tablicy 6 przedstawiono wyniki testów na przyswajanie wegla przez drobnoustroje NRRL 8156. Znaczenie uzytych symboli jest nastepujace: + — wzrost dobry, przyswajanie (+) — wzrost ubogi do wyraznego (—) — wzrost slaby, prawdopodobnie brak przy¬ swajania — — brak wzrostu, brak przyswajania 10 15 25 35 40 45 50 55 14 Tablica 6 Zródlo wegla Brak (negatywna próba kontrolna) D-glukoza (pozytywna próba kontrolna) L-arabinoza Sacharoza i-Inozyt 11-mannit D-fruktoza Ramnoza Rafinoza D-ksyloza Oznaczenie (-) + (-) (—) + + + (-) (-) (+)• Niektóre cechy charakterystyczne szczepu S. can- didus NRRL 8156, wytwarzajacego antybiotyki A- -35512, róznia sie cd cech drobnoustroju opisanego przez Elwooda B. Shirlinga i Davida Cottlieba w ,,Cooparaitive Deseription of Type Cultures of Stre,ptomyces III. Additional Spacies Descriptions from First and Second Studies", Intern. J. Sy- stematic Bacteriol., 18, (2), 69^189 (1968) oraz przez Waksmana S. A. w „The Actinomyce- tes. Classification, Identiiications and Descrip¬ tions of Genera and Species", Vol. 2, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, Ed., 1961.Róznice powyzsze zestawiono w tablicy 7.Tablica 7 Przyswaja¬ nie wegla L-arabinoza Ramnoza i-Inozyt Uplynnianie zelatyny Dzialanie na mleko NRRL 8156 — — + Calkowite w cia¬ gu 14 dni Koagulacja z pewnymi prze¬ jasnieniami w ciagu 14 dni Opublikowany opis ,+ i+ — Powolne Brak koagulacji, dobra peptoni- zacja 65 Szczep Streptomyces candidus wytwarzajacy an¬ tybiotyki A-35512 zostal zdeponowany w kolekcji szczepów Northern Regional Research Center, U. S.Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois, 61604, z której to kolekcji jest powszechnie dostepny pod numerem NRRL 8156.Jako pozywki wzrostowe dla Streptomyces can¬ didus NRRL 8156 mozna stosowac którekolwiek z wielu mozliwych. Jednak ze wzgledów ekono¬ micznych oraz ze wzgledu na optymalna wydaj¬ nosc i latwosc izolowania produktu, korzystne sa niektóre pozywki hodowlane. Na przyklad korzy¬ stnym srodkiem weglowodanów w produkcji na skale przemyslowa jest sacharoza, chociaz moznau lfifi 118 M stosowac równiez felukbze., dekafcryne z tapioki, fruktoze, mannit, maltoze, laktoze i podobne.Korzystnym Zródlem azotu JeSt ircApuszczalny pepton miesny, ale równiez mozna stosowac make sojowa, maczke miesna, aminokwasy, takie jak kwas glutaminowy i podobne produkty» Do od-^ zywczych soli nieorganicznych wchodzacych w sklad pozywek naleza handlowe roapufcaGaalne sole* bedace zródlem cynku, sodu, magnezu* wapnia, amonu, chloru, weglanów, siarczanów^ azotanów i podobnych jonów.W sklad pozywki moga równiez wchodzic pod¬ stawowe pierwiastki sladowe niezjbedne dla wzro¬ stu i rozwoju drobnoustroju. Pierwiastki takie zazwyczaj znajduja sie jako zanieczyszczenia w innych skladnikach pozywki, w ilosciach wystar¬ czajacych dla zaspokojenia potrzeb wzrostowych drobnoustroju.W razite fw^zefey (fodaje sie mala ilosc (0,2 ml/ /ntrj sroi^ pirtiec^^^ takiego jak glflcol ^^r^yie^bwy, jesli fodczas fermentacji w duzej skali Cenienie ftaje sU* proolemem.Dla wytwarzania znaczhych ilostfi antybiotyków A-SSbiZ korzystna jest fernlenta^ia fib^wierz- chniówa z napowietrzaniem. Male ilosci antybio¬ tyków A-SS5iz mozna ótriyimy^aC W hodOwli w kolbaen na trzeawkach, ie wzgie#u na dpóznie- nie w Wytwarzaniu antykót^ów1, zwiazane tfa ogól ze szbzepienieni duzych iklfpmfottttf zarj&aniku- jaca postaci^ b^rJtóus^ J&ft inb- sowanie ffidkuluni WegelatyWnego Inokulum wegetatywne przyrzadza sie zaszcze¬ piajac mala objetosc pozywki hodowlanej forma¬ mi zarodnikujacymi lub fragmentami grzybni drolb-^ houstroju, w celu otf^yfhafttó swiezej, aktywnie wzrastajacej hodowli drobnoustroju, inokulum we¬ getatywne przenosi sie nastepnie do wiejoszyeli fermentorów.Drobnoustrój wytwarzajacy antybiotyki A-3551Z mozna Hodowac w zakresie temperatur okolo &0—40°C Optymalna wydajnosc wytwarzania anty- ibiotyków A*dd612 osiaga sie W temperaturze &0^34°C. lak te SW^kle ma mi&JKse W hodowli poó&ó- wierahnlowej t napowietrzaniem, przez ftoiywke przetlacza sie jalowe powlelfte\ W celu uzyskania wydajfheso wzrostu drobno^ ustroju w fermentorach przemyslowych, przez po¬ zywke przepuszcza siekorzystnie powyzej 0,1 ob¬ jetosci powietrza na minute na jedna objetosc pozywki Dla uzyskania wydajnego wytwarzania antybiotyków A-35512 korjifstnie jest przepuszczac okolo 0,25 objetosci powietrza na minute na jed- dna objetosc pozywki.Proces wytwarzania antybiotyków A-35512 |od- cea« fermentacji moze byc kontrolowany za po¬ moga analizowania próbek brzeczki lub eftitraktów graybni na zawartosc antyfeiótyfrui Od leilówahia stosuje sie drobhoUtótfój, 6 któ¬ rym wiadomo, ze jest wtfazliwy na wyfwarzatie antybiotyki. Bo takich dróbnóustrojllW nalefcy &e cUIub subtilfc ATCC SB33. Oznaczenie biologicz¬ ne prowafel sie Korzystnie grzy uzyciu Krazków 10 bibulowych na plytkach z agarem zawierajacym ubogi w skladniki odzywcze agar.Po zakonczeniu fermentacji antybiotyki A-35512 mozna wyodrebniac z brzeozfei fermentacyjnej za pomoca znanych w praktyce sposobów, Anty-* biotyki wytwarzanie w .procesie fermentacji drobno-* ustroju wytwarzajacego A-35512 znajduja sie pra- wie wyiaoanie w przesaczu brzeczki. 3tad tez, najlepsza wydajnosc izolacji antybio¬ tyków A-3&513 uzyskuje sie odsaczajac najpierw mase grzybni. Prsesaezona brzeczke mozna oczy* szezac dla uzyskania mieszaniny A-35512, stosujac rozmaite soosoby. Korzystna metoda polega na adr- sorpcji na kolumnie z poliamidem i nastepnie elu- aeji woda i wodnym rtetworatn alkoholu. Frakcje eluatu sawterajaee antybiotyki lamy si% i ettfy* muje mieszanine A-8061& MoMa fówntea tt& po¬ moca takiej samej techniki iattyc ikft&Htee&ite frakcje na podstawie wyników chromatografii cienkowarstwowej i otrzymywac oczyszczony czyn¬ nik A-i35!5il2-B i "wzbogacone mLeszaokiy pozosta¬ lych czynników A-&5512.Dalsze oczyszczanie poszczególnych czynników A-35512 polega na dodatkowej a-dsoripcjl i, eluacjL Jako materialy ad^rbcyjne moznS z &Ó#oo4eniem stosowac tlenek glinu, zel krzemfóhkówy, wymiec niaoii»w* i gfcdeibne.Czynniki At&Slft wystepuja w brzeczce ferment tacyjnej "# postaci chlorowodorków. W korzysz nym sposobie rozdzialu na materiale poliamidom wym otrzymuje sie czynnik A-35912 i mieszanine. pozostalych czynników W postaci cfaOlOWod6lko%i Kazdy z poszczególnych czynników tfiozna ftfife.* ksztalcac w wolna zasade ftte zawierajaca fchldnl jonowego, stosujac na przyklad ehroffia^dgfafl^ na slabo aeamdowym wytnieniacau Jowvvym.Altefhatywni«v stale skladniki ihodowil^ w tym skladniki pozywki i grzybnie nfroina stosowac jako zródlo antybiotyków A-i5512, z pominieciem ope* racji ekstrakcji lub rozdzielania, ale korzystnie pd usunieciu Wody. Na 'pffzyklad po zakonczeniu fer-* mentaejl br^easte zawierajaca antybiotyki A-S86I2 mozna liofilizowac i stosowac bezposrednio jako domielfidt^ do fjaSk Aglitoii czynnika A-i5i512-B wytwarza si^ tta drodze laibdfifej kwainej hydrolley c*ynft*a A-^ -3SSlz*B, któty te czynnik najlatWtel :J«si Olfiy^ mywac w póstlfci dwucMorow^te¥ta*.^ StA& tez dWuchldroWodorek czynnika A-35512-B jest korzystnym materialem wyjsciowym do wy-* Warzania aglikonu czynhika A-39512-B. Mozna dó tego celu stosowac wolny czynnik A-35512-B lub inna jego addycyjna sól kwasowa. Hydrolize kwas¬ na prowadzi sie stosujac znane sposoby pos»te- g©waftla\ dhsciai moina do te#ó celu Stottiwac wtele r*fc riyeh ltWasow, to korzystnym Jest feWas sólhyi Jesli stosuje sie kwas solny to aglikon czynnika A-35512-B otrzymuje slfc W g^ostaci ehlor^woaor- ku. Hydrolize korzystnie prowadzi sie w wodzie, w temperaturze wrzenia — w ciagu od okolo 1 dó okolo 2 godzin. I31uzszy czas reakcji prowadzi do degradacji aglikonu, w wyniku której otrzy¬ muje sie mniej aktywne, a w koncu nieaktywne1T 128 225 produkty. Optymalny czas dla specyficznych wa¬ runków reakcji mozna wyznaczac za pomoca ana¬ lizowania mieszaniny reakcyjnej na aktywnosc biologiczna.W tablicy 8 podano aktywnosc aglikonu czyn¬ nika A-35512-B oznaczona metoda dyfuzji w agar.Test wykonano umieszczajac na plytkach agaro¬ wych zakazonych badanym drobnoustrojem krazki bibulowe o srednicy 6 mm zanurzone uprzednio w roztworze zawierajacym testowy zwiazek w ste¬ zeniu 1 mg/ml. 1S Tablica 10 Tablica 8 Drobnoustrój testowy Staphylococcus aureus Bacillus subtilis Saroina lutea Bacillus subtilis* Wielkosc strefy zaha¬ mowania (w mm) aglikonu czynnika A-35512-B wolnej zasady 19 i 13 14 22 *) Na ubogim w skladniki odzywcze agarze.W tafblicy 9 zestawiono najminiejisze stezenia ha¬ mujace (MIC), obrazujace aktywnosc chlorowo¬ dorku aglikonu czynnika A-35512-C wobec wy¬ branych szczepów Staphylococcus aureus, w stan¬ dardowym tescie rozcienczeniowym na agarze.Tablica 9 Drobnoustrój testowy Staphylocopcus aureus 3055 * SCaphyLocoopus aureus H290 * Staphylococcus aureus V92 * Staip^ylóccjccus aureus VI04* Staphylococcus aureus 3Q74** Staphylococcus aureus H43 ** Sitophylpcoccus aureus V57 ** S^aphylpooccus aureus £i3SJ6 ** Staphylocopcus aureus 373Q *** Staphylococcus aureus 3131 **** MIC (ug/ml) 0,5 0,5 0,5 0,25 0,25 0,5 0,5 1,0 0,5 0,5 *) wrazliwy na penicyline G **) oporny na penicyline G ***) oporny na penicyline G i metycyline ****) oporny na penicyline G, metycyline i klin- damycyne W tablicy 10 podano wyniki dodatkowego testu rozcie#czeniowego na agarze obrazujace aktywnosc chlorowodorlku aglikonu czynnika A-35512-B wo¬ bec roznych szczepów Streptocopci Grupy D. 10 15 40 45 50 55 60 65 Drobnoustrój testowy Streptococcus sp. Shrigley Streptococcus sp. Mitis Streptococcus sp. 12253F Streiptoooccus sp. SS992 Streptococcus sp. 9933 Streptococcus sp. 9913 Streptococcus sp. 292 Streptococcus sp. 238 MIC (^g/ml) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 20 25 30 35 Aglikon czynnika A-35512-B wykazuje in vivo aktywnosc przeciwbakteryjna wobec wywolywa¬ nych doswiadczalnie infekcji bakteryjnych. Zara¬ zonym myszom podawano dwie dawki i»dskóarne chlorowodorku aglikonu czynnika A-35512-B i ob¬ serwowana aktywnosc oznaczano jako ED50. Uzy¬ skane wartosci ED50 dla chlorowodorku czynnika A-35512-B podane sa w tablicy 11.Tablica 11 Drobnoustrój testowy Streptococcus pyogenes C203 Streptococcus pneumo- niae Staphylococcus aureus 3055 ED50 5,8 7,0 1,04 Natezenie infekcji {do- otrzewnowo) 1570XLDSO 374X U)5D 370XLD5Q Antybiotyki A-35512 sa wzglednie nietoksyczne, na przyklad LDso dla dwuohloirowodorku czyn¬ nika A-35512-B przy podawaniu dootrzewnowym myszom wynosi okolo 1356 mg/kg, a przy po¬ dawaniu dozylnym 1000—1250 mg/kg.Inna cenna wlasciwoscia mieszaniny A-35512 i jej skladników jest zdolnosc zwiekszania wydaj¬ nosci karmienia u zwierzat. Stwierdzono to na przykladzie zwierzat przezuwajacych, posiadajacych rozwinieta funkcje zwacza.Wiadomo jest, ze wydajnosc przyswajania weglo¬ wodanów u przezuwajacych wzrasta w wyniku dzialania, które stymuluje wytwarzanie przez flo¬ re bakteryjna zwacza propionianów zamiast octa¬ nów lub maslanów. Zostalo to szczególowo opisa¬ ne przez Churcha i wspólpracowników w „Digesti- ve Physiology and Nutrition of Ruminants", tom 2, 1971, str. 622 i 625.Wydajnosc paszy moze byc okreslana w testach in vivo u bydla z zalozona przetoka, przy zasto¬ sowaniu sposobu podanego przez Arthura P. Rauna w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ame¬ ryki nr 3794732, zwlaszcza w przykladzie VIII.W tablicy 12 przedstawiono wyniki takiego testu c)la dwuchlorowodorku czynnika A-35512-B. Poda¬ ne s|e^enie kwasu propionowego w zwaczu jest19 srednim z pieciu analiz przeprowadzonych w ciagu 21 dni.Tablica 12 Próba kon¬ trolna Próba z ozjoinilkieim A-35512-B (50 g/tone) Ilosc zwierzat 5 5 Sredni pro¬ cent molo¬ wy kwasu propiono- wego 19,3 26,0 Procent molowy wzrostu w stosunku do próby kontrolnej — 6,7 Mieszanina A-35512 i jej skladniki zwiekszaja stezenie propionianów i tym samymi wydajnosc paszy przy podawaniu przezuwajacym w dawkach dziennych 0,15—10,0 mg/kg. Lepsze wyniki osiaga sie przy podawaniu w dawkach 1,0—2,0 mg/kg/dzien.Korzystnym sposobem podawania mieszaniny A-35512 lub poszczególnego zwiazku jest miesza¬ nie ich z pasza dla zwierzat. Antybiotyki te mo¬ ga byc równiez podawane w inny sposób, na przyklad w postaci tabletek, wlewów do gardla lub kapsulek. Powyzsze formy farmaceutyczne przygotowuje sie sposobami dorze znanymi w far¬ macji leków weterynaryjnych. Kazda pojedyncza dawka leku powinna zawierac mieszanine A-35512 lub jej skladnik w ilosci odpowiadajacej dziennej dawce podawanej zwierzeciu.Mieszanina A-35512 i jej skladniki sa takze uzy¬ teczne jako czynniki wzrostowe dla zwierzat.Podane nizej przyklady ilustruja dokladniej spo¬ sób wedlug wynalazku. Z przykladów tych, przy¬ klady I—VI dotycza wytwarzania substancji wyj¬ sciowych.Przyklad I. A. Fermentacja A-35512 w kol¬ bach na trzesawkach.Liofilizowane pastylki Straptomyces candidus NRRL 8156 rozpuszcza sie w 1—2 ml jalowej wo¬ dy i zakaza roztworem skosy agarowe zawiera¬ jace wyciag drozdzowoHSlodowy Bacto (ISP nr 2, produkcji Difeo Laboratories, Detroit, Michigan).Zakazone stosy inkubuje sie w temperaturze 30°C, w ciagu okolo 7 dni. Dojrzala hodowle na skosach pokrywa sie 2 ml wody i zdrapuje ste¬ rylna pipeta spory. Porcje 0,1 ml wodnej zawie¬ siny sporów stosuje sie do zakazenia nastepnego skosu agarowego z pozywka ISP nr 2.Zakazony skos inkubuje sie w temperaturze 30°C w ciagu okolo 7 dni. Dojrzala hodowle na skosach pokrywa sie 5 ml wody i zdrapuje spo¬ ry sterylna pipeta. Porcje 2,5 ml otrzymanej za¬ wiesiny sporów stosuje sie do zakazenia 30 ml pozywki wegetatywnej o nastepujacym skladzie: 225 20 Skladnik Pozywka tryptykazowo-sojowa (Baltimore Biological Labora¬ tories, Cockeysville, Md).Woda odmineralizowana Ilo*c 30 g do 1 litra io Zakazona pozywke wegetatywna inkubuje sie w kolbach Erlenmayera o objetosci 250 ml, w tem¬ peraturze 30°C, w ciagu 48 godzin, na trzasawce obrotowej o 250 obrotach na minute i wychyle¬ niach 50 mm. 15 0,5 ml inkubowanej pozywki wegetatywnej sto¬ suje sie do zakazenia 50 ml pozywki produkcyj¬ nej o nastepujacym skladzie: Skladnik Dekstryna z tapioki Glukoza NH4NO3 KC1 MgS04 FeCl2-4H20 ZnCl2 KH2PO4 Kwas L-glutaminowy DL-citrulina CaC03 Woda odmineralizowana Ilosc w g/litr 25,0 10,0 2,5 1,5 1,1 0,03 0,03 0,1 1,0 0,1 5,0 do 1 litra Zakazona pozywke produkcyjna inkubuje sie w kolbach Erlenmayera o pojemnosci 250 ml, w tem¬ peraturze 32°C, w ciagu 8—10 dni, na trzesawce obrotowej o 250 obrotach na minute i wychyle¬ niach 50 mm.B. Fermentacja A-35512 w fenmentorach.W celu uzyskania wiekszej ilosci inokuktm, 20 ml inkubowanej pozywki wegetatywnej, otrzymanej w sposób opisany powyzej stosuje sde do zaka¬ zania 400 ml wzrostowej pozywki wegetatywnej II etapu o skladzie takim samym jak sklad po¬ zywki wegetatywnej. Pozywke II etapu inkubuje 50 sie w kolbach o pojemnosci 2 litry, w ciagu 24 go¬ dzin, w temperaturze 32°C, na trzesawce obroto¬ wej o 250 obrotach na minute i wychyleniach 50 mm. 800 ml pozywki wegetatywnej II etapu stosuje sie do zakazania 100 litrów jalowej pozywki pro¬ dukcyjnej. Zakazona pozywke produkcyjna pod¬ daje sie fermentacji w fermentojrze o pojemnosci 165 litrów, w ciagu okolo 8—10 dni, w tempe¬ raturze 32°C. Zawartosc fermentora napowietrza 6(J sie stosujac 0,25 objetosci powietrza na minute na objetosc pozywki, oraz miesza stosujac zwykle mieszadlo o 200 obrotach na minute.Przyklad II. Inkubowana pozywke wegeta¬ tywna, przygotowana w sposób podany w punk- 65 cie A, mozna ewentualnie przechowywac do póz-» niejszego uzycia, utrzymujac ja pod parami ciekle¬ go azotu.W tym celu, w probówce o wymiarach 13 X 100 mm wyjalowionej i zaopatrzonej w przykrywke srubowa, umieszcza sie 2 ml -zawiesiny srodka rozpraszajacego p nastepujacym skladzie: Skladnik Gliceryna Laktoza Woda odmineralizowana Ilosc 20% 10 70°/« Do powyzszej zawiesiny dodaje sie 2 ml inku- bowanej w ciagu 48 godzin hodowli wegetatywnej, przygotowanej w sposób opisany uprzednio. Mie¬ szanine zamraza sie i przetrzymuje pod oparami w pojemniku zawierajacym ciekly azot.Przechowywane w taki sposób inokulum wege¬ tatywne cozmrasa sie praed uzyciem zanurzajac fiolke w lazni wodnej o temperaturze 43°C. 1 ml rozmrozonego inokulum stosuje sie do zakazenia 30 mj pozywki wegeitaitywnej o skladzie poda¬ nym w punkcie A.Zakazona pozywke wegetatywna stosuje sie, jak to zostalo wyzej opisane do fermentacji w kol¬ bach na trzesawkach lub dla uzyskania wiekszej ilosci inokulum do fermentacji w fermentorach.Przyklad III. Proces fermentacji prowadzi sie w sposób opisany w przykladzie I, stosujac pozywke produkcyjna do hodowli w kolbach lub fermentorach o nastepujacym skladzie: Skladnik Peks,tryna z tapioki Melasa BQzjp(uszczalny pepton miesny MgS04-7H20 CaC03 Woda Ilosc (g/litr) 75,Q 40,0 15,0 0,5 2,0 do 1,0 litra Przyklad IV. Izolacja mieszaniny antybioty- cznej A-35512. x Calosc brzeczki fermentacyjnej (946 litrów) o- trzymanej w sposób opisany w przykladzie I, saczy sie stosujac pomoc filtracyjna (ziemia okrzem¬ kowa Hyflo Super-cel firmy Johns-Manville Pro¬ ducts Corp.). Wartosc pH brzeczki wynosi 6,8—7,2.Klarowny przesacz przepuszcza sie przez kolumne zawierajaca zywice Amberlit XAD-4 (produkcji firmy Rohm and Haas Co.), stosujac 10 ml zy¬ wicy jia 100 ml przesaczu brzeczki. Kolejne frak¬ cje bada sie na aktywnosc biologiczna stosujac standardowa analize krazkowa wobec Sarcina lu- tea. Frakcje nieaktywne biologicznie odrzuca sie.Kolumne przemywa sie woda w ilosci równej (225 22 1/8 objetosci brzeczki, z szybkoscia 150 ml/mi¬ nute.Nieaktywna wode z przemycia odrzuca sie. Na¬ stepnie eluuje sie produkt 600 litrami 50% roztwo- 5 ru wodnego metanolu z szybkoscia 200 ml/minute.Eluaty zawierajace mieszanine antybiotyków A- -35512 zateza sie pod zmniejszonym cisnieniem do objetosci okolo 15 litrów. W jednym litrze znajduje sie okolo 200 gramów mieszaniny anty- tf biotycznej A-35512.Przyklad V. Wyodrebnianie poszczególnych czynników z mieszaniny antybiotycznej A-35512.Okolo 3000 gramów mieszaniny antybiotycznej A-35512 rozpuszczonej w 15 litrach metanolu, o- !? trzymanej w sposób opisany w przykladzie IV, chromatografuje sie na kolumnie wypelnionej 100 litrami poliamidu produkcji firmy Woelm.Kolumne eluuje sie odmineralizowana woda z. szybkoscia okolo 80—120 ml/minute.W Odbierane frakcje bada sie metoda chromato- giraifiii cienkowarstwowej na celulozie lub chroma- togirafiL bdbujpwej, stosujac do rozwijania mieszani¬ ne n-butanolu, pirydyny, 'kwasu octowego i wody Q15:lli0:3:ll2) i do wywolywamia bioautoigpra!fie wobec ^ Sercina lu'tea.Pierwsze 100 litrów eluatu odrzuca sie i ustala szybkosc przeplywu na okolo 16—200 ml/minute, obiera sie-12 frakcji o objetosci 12 litrów kazda, nastepnie zmienia sie eluent i eluuje w gradiencie *° metanolu i wody, stosujac nastepujace postepowa- nie.Zbiornik zawierajacy 360 litrów metanolu laczy sie polaczeniem syfonowym ze zbiornikiem zawie¬ rajacym 120 litrów wody. Mieszanine rozpuszczal- *• nikow miesza sie i podaje na kolumne. Zbiera sie 24 frakcje o objetosci 24 litrów kazda, pro¬ wadzac eluacje z szybkoscia 200—300 ml/miinute.Na podstawie wyników bioautografii laczy sie poszczególne frakcje w grupy i odparowuje pod 40 zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac dwuchlorowo- dorek czynnika A-35512-B i nastepujace wzboga¬ cone mieszaniny innych czynników co przedsta¬ wia tablica 13. 45 Tablica 13 Frakcje 1—10 11^-24 15—31 32—44 ObjetOSC Qg^ i(w litrach) 120 216 168 312 A+H B B+C C, E, F, G Ilosc 192 g 269 g 590 g 224 g 55 Przyklad VI. Oczyszczanie czynnika A-35512- B.Czesciowo oczyszczone 400 g dwuchlorowodorku czynnika A-35512-B, otrzymanego wedlug przykla¬ du V, rozpuszcza sie w 1,2 litra 50*/o roztworu 60 wodnego metanolu i chromatografuje na kolum¬ nie z tlenkiem glinu. Kolumne przygotowuje sie w nastepujacy sposób. 10 kg kwasnego tlenku glinu (firmy Woelm) mie¬ sza sie z 50*/o roztworem wodnym metanolu. Mie- 65 szanine pozostawia sie do odstania, dekantuje su-23 12S 225 24 pennatant i odrzuca go. Tlenek glinu miesza sie powtórnie z 50% roztworem wodnym metanolu i wprowadza do kolumny o srednicy 13,5 cm a nastepnie przemywa 50% roztworem wodnym metanolu az do uzyskania klarownego eluatu.Produkt eluuje sie 50% roztworem wodnym me¬ tanolu z szybkoscia okolo 8—10 ml/minute, zbie¬ rajac frakcje o objetosci okolo 240—300 ml. Ko¬ lejne frakcje bada sie za pomoca chromatografii cienkowarstwowej, stosujac do wywolywania bio- autografie, jak to zostalo opisane w przykladzie V.Na podstawie wyników oznacza poszczególne frak¬ cje laczy sie i otrzymuje oczyszczony dwuehloro- wodorek czynnika A-35512-B. Wyniki przedstawia tablica 14.Tablica 14 Frakcje 17—21 22—29 30—37 Ilosc 9,6 g 72,0 g 117,0 g Kazda z powyzszych frakcji krystalizowano w temperaturze 4°C z zatezonego 50% roztworu wod¬ nego metanolu. Otrzymany dwuchlorowodorek czyn¬ nika A-35512-B zawiera okolo 4,6% chloru. War¬ tosc pH roztworu dwuchlorowodorku czynnika A- -3/5512-B w 66% roztworze wodnym dwumetylo- formamidu wynosi okolo 6,5.Przyklad VII. Wytwarzanie aglikonu czyn¬ nika A-35S12-B. 5,0 g dwuchlorowodorku czynnika A-35512-B, o- trzyimanego wedlug przykladu VI, rozpuszcza sie w 200 ml wody. Otrzymany roztwór zakwasza sie za pomoca 14 ml 4n kwasu solnego i ogrzewa w temperaturze wrzenia w ciagu dwóch godzin, po czym ochladza i odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem do 3/4 objetosci pierwotnej. Nastepnie wkrajpla sie 6n kwas solny az do calkowitego wytracenia osadu. Osad odsacza sie i suszy otrzy¬ mujac 3,56 g surowego chlorowodorku aglikonu A^35512-B.Po zatezeniu i zanalizowaniu przesaczu stwier¬ dza sie obecnosc glukozy, fukozy, mannozy i ram- nozy.Surowy aglikon A-35512-B oczyszcza sie za po^ moca chromatografii na przemywanym kwasem tlenku glinu (Woelm, typ I), stosujac do elucji mieszanine 1:9 wody i metanolu. Kolejne frakcje analizuje sie za pomoca chromatografii cienkowar¬ stwowej na celulozie. Frakcje zawierajace agli¬ kon A-35512-B laczy sie i zateza pod zmniejszo¬ nym cisnieniem. Otrzymuje sie 398 mg czesciowo 5 oczyszczonego produktu. Wyniki chromatografii cienkowarstwowej z zastosowaniem do wywolywa- • nia ninhydryny, wskazuja na obecnosc nieaktyw¬ nych biologicznie zanieczyszczen.Porcje (100 mg) powyzszego czesciowo oczysz¬ czonego aglikonu czynnika A-35512-B poddaje sie dalszemu oczyszczaniu za pomoca chromatografii na poliamidzie MN-SC-6 (producent Machery,. No- gel and Co., sprzedawca Brinkman Instruments Co., wielkosc 0,07 mm) przy zastosowaniu do elu¬ cji wody. Frakcje analizuje sie za pomoca chro¬ matografii cienkowarstwowej w sposób opisany uprzednio. Frakcje eluatu zawierajace aglikon czynnika A-35512-B laczy sie i liofilizuje. Otrzy¬ muje sie 64 mg oczyszczonego chlorowodorku agli¬ konu czynnika A-35512-B. Calkowita wydajnosc w stosunku do wyjsciowego czynnika A-35512-B wy¬ nosi 5,08%.Przyklad VIII. Wytwarzanie wolnej zasady aglikonu czynnika A-35512-B. 50 mg chlorowodorku aglikonu czynnika A- -35512-B, otrzymanego wedlug przykladu VII, roz¬ puszcza sie w 10 ml mieszaniny 1:1 metanolu i wody. Roztwór zobojetnia sie za pomoca 3,5 ml wymieniacza jonowego Bio-Rad AC-3-X w formie wodorotlenkowej. Calosc miesza sie w ciagu 15 minut w temperaturze pokojowej, po czym od¬ sacza wymieniacz a przesacz zateza pod zmniej¬ szonym cisnieniem do polowy objetosci, w tem¬ peraturze nie przekraczajacej 60°C i nastepnie lio¬ filizuje. Otrzymuje sie 68 mg wolnej zasady agli¬ konu czynnika A-35512-B.Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania aglikonowej pochodnej czynnika B mieszaniny antybiotycznej A-35512, znamienny tym, ze drobnoustrój Streptomyces candidus NRRL 8156 hoduje sie' w pozywce za¬ wierajacej zródlo przyswajalnego weglowodanu i azotu oraz sole nieorganiczne, w warunkach pod- powierzchniowej fermentacji aerobowej, do uzy¬ skania znacznej aktywnosci antybiotycznej, po czym mieszanine antybiotyczna A-35512 wyodreb¬ nia sie z pozywki hodowlanej, z mieszaniny tej wydziela sie czynnik B mieszaniny antybiotycz¬ nej A-35512 i czynnik ten poddaje sie hydroli¬ zie za pomoca umiarkowanie mocnego kwasu. 15 20 25 30 35 40 45 0128 225 HOOC NH. 0H Cl H^N COOH DO 80 60 40 20\ O e,5 Wzór i * i "iii i ' ¦ i—i—i—i—~ i i 1CW JSPO 3PPÓ 25ÓO 2000 1800 1500 1400 1200 1000 800 600 400 250 (OM-0 #6 / i.? 1M 80 £0 40 20 0 40 S ¦ 00 3 —' ' t' 5500 3000 A \ E50O 5 i 2ooo 4600 A^ 7 & 3 10 12 14 16lW0tfJ0/i0 - IWito. / ^ ¦ 16 00 lAOtf 4*00 400© 80O 60(7 W 15o FIG. 2. PL