Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania heparyny ó batdzo wysokim stopniu czystosci z solnych roztworów tkanek zwierzecych.Dzieki heparynie medycyna od dawna dysponuje natu¬ ralnym srodkiem antykoagulacyjnym, który równiez w me¬ dycynie nowoczesnej jest niezbedny i znajduje coraz szer¬ sze zastosowanie.W ostatnich latach opisano szereg metod, majacych za cel Wyodrebnianie heparyny z zawierajacych heparyne tkanek zwierzecych, takich jak pluca, watroba, a w ostat¬ nim Okresie czasu glównie sluzówka jelit (Mucosa — blona sluzowa) swin, bydla i owiec (brytyjski opis patentowy nr 754 885, opis patentowy RFN nr 1 228 241, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 058 884, opis pa¬ tentowy RFN nr 1 253 868). Surowce te ze wzgledu na latwosc psucia sie wykazuja wade ograniczonej mozli¬ wosci skladowania, które mozna wprawdzie przedluzyc przez zamrazanie, co jednak prowadzi do zwiekszenia nakladów technicznych i podwyzsza koszty. Zarówno personel jak i okoliczni mieszkancy sa czesto narazeni na dzialanie odofU, wydzielajacego sie podczas takiej obróbki.W opisie patentowym RFN nr 1 253 866 opisano zbior¬ czo znane metody uzyskiwania heparyny, Wedlug znanych metod tkanke zwierzeca miesza sie w stadium poczatko¬ wym z goracym roztworem wodnym soli w celu rozpusz¬ czeni* heparyny, znajdujacej sie w komórkach; Ilosc hepa- ffB& w powstajacym' s*odow»ku jest jednak bardzo mala.Stwierdzono óoWMtey ie laka soki*, uzyskiwana w rzez- jgtftite I iakladach pwmsttajacych sluzówka, zawiera hepa¬ ryn*. T* laka BKrta* powitaj* wtedy, gdy jelita zwierane, 10 15 30 15 uprzednio pozbawione blony sluzowej, posypuje sie w celu konserwacji i odwodnienia stala sola kuchenna.Sposób otrzymywania heparyny o bardzo wysokim stop¬ niu czystosci z solnych roztworów tkanek zwierzecych polega wedlug wynalazku na tym, ze lake solna, uzyskana przez nasolenie jelit (trzewi) zaszlachtowanych zwierzat, rozciencza sie woda w stosunku laka solna : woda równym 1:3 — 1:10, a nastepnie z zawierajacego heparyne, rozcien¬ czonego roztworu oddziela sie heparyne.Korzystnie z zawierajacego heparyne, rozcienczonego roztworu straca sie heparyne za pomoca czwartorzedowej soli amoniowej, albo przez zakwaszenie, zwlaszcza kwasem octowym, do odczynu o wartosci pH okolo 3, albo straca sie chlorkiem benzetoniowym. tj. chlorkiem benzylodwu- metylo{2- [2- (p^l,l,3,3-czterometylobutylofenok9yetok- sy] -etylo Jamoniowym.Z zawierajacego heparyne, rozcienczonego roztworu mozna heparyne oddzielic na drodze wymiany jonowej za pomoca zywicy amonitowej, zwlaszcza za pomoca srednio- zasadowej, makroporowatej zywicy amonitowej w postaci Cl- Niespodziewane jest w porównaniu z opisem patentowym RFN nr 1 253 868, ze laka solna, powstajaca przez samo nasolenie jelit zwierzecych) zawiera wieksze ilosci heparyny.Nieoczekiwane jest równiez to, ze heparyna ta jest prawie calkowicie wolna od chemicznie zblizonych produktów ubocznych, tak wiec laka solna znana dotychczas tylko jako produkt odpadkowy, zanieczyszczajacy srodowisko, sta¬ nowi now« zródlo surowcowe heparyny. Dzieki prawie ca&owkerau brakowi zanieczyszczen mozna obróbke; do 108607108 607 3 surowej heparyny prowadzic w warunkach szczególnie lagodnych, przy czym zbedne sie staja znane dotychczas uciazliwe metody wyodrebniania (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 451 996 i brytyjski opis patentowy nr 1 221 784). Uzyskuje sie ostatecznie hepa¬ ryne o takiej jakosci, której nie mozna uzyskac w dostep¬ nych na rynku preparatach heparyny.Uzyskiwana sposobem wedlug wynalazku surowa hepa¬ ryna, wyodrebniana z laki solnej jelit jako surowca, wyka¬ zuje juz taki stopien czystosci, ze po nastepnym oczysz¬ czeniu otrzymuje sie heparyne o ponad 200 jednostek USP/mg. Znajdujace sie obecnie w handlu preparaty he- pajyny posjadaja^z reguly aktywnosc heparyny, odpowiada- jacaAl££) jednostkom USP/mg, w nielicznych przypadkach 155 jednostkom USP/mg. Pod pojeciem jednostki USP/mg rozumie sie specyficzni aktywnosc, wynikajaca z U.S.P. assay, za pomoca której mierzy sie hamowanie tworzenia Maczków_w Jkphserwb^anej plazmie owczej. Jedna jed¬ nostka USP odpowiada okolo 1,1 jeclnostkom miedzyna¬ rodowym (UJ). Ze wzgledu na to, ze aktywnosc znajduja¬ cych sie w handlu preparatów heparyny pomimo licznych metod ulepszajacych jest nadal niezadowalajaca, wymaga sie, by preparaty heparyny (ze sluzówki jelitowej) zawie¬ raly co najmniej 140 jednostek USP. Dotychczas jedynie w laboratorium udalo sie L. W. Kananagh i L. B. Jaaues [Arzneimittelforschung (Drug Res.) 24, nr 12, 1942 (1974)] wyodrebnic heparyne w postaci soli barowej o maksymalnie 175 jednostek USP/mg droga kilkakrotnej krystalizacji.Stosujac w sposobie wedlug wynalazku lake solna z jelit jako surowiec udalo sie otrzymac heparyne, na skale te¬ chniczna o takim stopniu czystosci, ze wystepuje ona w postaci prawie bezbarwnej substancji. Wszystkie rodzaje surowej heparyny, uzyskiwane dotychczas z innych su¬ rowców, nalezy natomiast odbarwiac droga uciazliwych i powodujacych straty metod (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 179 566).Laka solna stanowi surowiec zdolny do skladowania, prawie bez zapachu, w którym nie zachodzi pogorszenie jakosci wskutek dluzszego skladowania. Dzieki temu zbedne staja sie chemiczne i inne metody konserwowania.Podane przyklady objasniaja blizej sposób wedlug wy¬ nalazku.Przyklad I. 600 litrów laki solnej w mieszalniku o pojemnosci 1500 litrów zadaje sie w temperaturze poko¬ jowej, mieszajac, w ciagu pól godziny 600 litrami metanolu* i Miesza sie dalej jeszcze w ciagu takiego samego czasu, po . czym mieszanine pozostawia sie na okres okolo 1 godziny.Nastepnie dekantuje sie metna ciecz znad osadu do innego naczynia, a wytracony placek solny pozostawia sie. Uzyska¬ na zawiesine pozostawia sie na okres dwóch dni. Nastepnie ponownie dekantuje sie, ciecz znad osadu odrzuca sie, a osad wyodrebnia droga wirowania. Po wysuszeniu pod obnizonym cisnieniem otrzymuje sie 1,68 kg produktu o 11 jednostkach USP/mg. Produkt ten w okolo 60% sklada sie jeszcze z soli kuchennej.Przykladll. Postepujac podobnie do brytyjskiego ' opisu patentowego nr 754 885 zakwasza sie 3 litry laki sol¬ nej, mieszajac, kwasem octowym do wartosc pH =3,1— —3,2 (okolo 50 ml). Po uplywie kilku godzin dekantuje sie, a pozostalosc odwirowuje. Osad odrzuca sie, a pola¬ czone roztwory zobojetnia sie lugiem sodowym. Nastepnie mieszajac zadaje sie mieszanine powoli taka sama objetoscia metanolu. Po uplywie 45 minut dekantuje sie Wytracona sól kuchenna. Zawiesine te pozostawia sie w ciagu kilku 4 godzin, po czym dekantuje ciecz znad osadu, a pozostalosc odwirowuje. Osad suszy sie pod obnizonym cisnieniem.Otrzymuje sie 3,76 g produktu o 23 jednostkach USP/mg.Przyklad III. 3 litry laki solnej rozciencza sie 14 5 litrami wody. Nastepnie dodaje sie 50 g ziemi okrzemkowej oraz roztwór 7 g chlorku benzetoniowego o nazwie handlo¬ wej Hyamin 1622, (firmy Rohm and Haas) w 100 ml wody.Po uplywie kilku godzin dekantuje sie, a pozostalosc od¬ sysa. Po przemyciu woda jeszcze wilgotny osad ekstrahuje 10 sie trzykrotnie porcjami po 200 ml 2 molarnego roztworu soli kuchennej wedlug opisu patentowego RFN nr 1 228 241.Z polaczonych wyciagów wytraca sie osad za pomoca 2 czesci objetosciowych metanolu. Osad wyodrebnia sie i suszy, otrzymujac 560 mg produktu o aktywnosci 163 15 jednostek USP/mg.Przyklad IV. 3 litry laki solnej doprowadza sie mieszajac do odczynu o wartosci pH = 3,1—3,2. Po uplywie kilku godzin dekantuje sie, a pozostalosc odwiro¬ wuje. Polaczone roztwory rozciencza sie woda do objetosci 20 15,5 litra i zadaje 40 g zelu krzemionkowego i 7 g chlorku benzetoniowego o nazwie handlowej Hyamin 1622 w 100 ml wody. Po uplywie kilku godzin osad wyodrebnia sie i poddaje obróbce, analogicznej jak w przykladzie III.Otrzymuje sie 796 mg produktu o 105 jednostkach USP/ 25 /mg.Przyklad V. 3 litry laki solnej rozciencza sie 13 li¬ trami wody (opis patentowy RFN nr 1 156 938). Nastepnie zakwasza sie kwasem octowym w ilosci okolo 50 ml do wartosci pH — 3,2. Po uplywie kilku godzin wytraca sie 30 osad, który po zdekantowaniu klarownej cieczy znad osadu odwirowuje sie. Po wysuszeniu otrzymuje sie 16,6 g suro¬ wej heparyny o 5,5 jednostkach USP/mg.Przyklad VI. 10 litrów laki solnej rozciencza sie 50 litrami wody. Roztwór ten przepompowuje sie przez 35 filtr na kolumne z wymiennikiem jonowym, przy czym kolumna ta ma srednice 26 mm i dlugosc 380 mm, a szyb¬ kosc przeplywu wynosi okolo 3 litry/godzine. Jako wymie¬ niacz jonowy stosuje sie zywice anionowymienna makro- porowata, o sredniej zasadowosci, w postaci Cl" (o nazwie 40 handlowej Lewatit CA 9249). Mozna równiez stosowac inne zywice anionowymienne, takie jak opisany w opisie patentowym RFN nr 1 253 868 produkt o nazwie handlo¬ wej (Dowex 1-X-1). Nastepnie zywice usuwa sie z kolumny, dwukrotnie przemywa porcjami po 500 ml 0,9 molarnego 45 roztworu soli kuchennej i eluuje mieszajac za pomoca 400 ml 2 molarnego roztworu soli kuchennej w ciagu 5 godzin w temperaturze 40 °C. Z roztworu tego wytraca sie osad za pomoca 1,5 czesci objetosciowych metanolu. Po wyodrebnieniu i wysuszeniu osadu otrzymuje sie 1,5 g 53 produktu o 152 jednostkach USP/mg.Przyklad VII. Ilosc surowej heparyny z przykladu I, odpowiadajaca 425 000 jednostkom USP lub 38,65 g, ekstrahuje sie trzykrotnie porcjami po 200 ml 2 molarnego roztworu soli kuchennej, przy czym kazdorazowo miesza 55 sie w ciagu 1 godziny w temperaturze 60°C. Polaczone wyciagi rozciencza sie woda az do momentu, w którym roztwór zawiera okolo 0,9 moli/litr jonów chlorkowych.Nastepnie dodaje sie 200 ml wymieniacza anionowego (Lawatit CA 9249) w postaci chlorkowej i miesza w ciagu 60 1 godziny. Nastepnie odsysa sie i przemywa okolo 200 ml 0,9 molarnego roztworu soli kuchennej. Wymieniacz jo¬ nowy miesza sie nastepnie w ciagu 5 godzin z 2 molarnym roztworem soli kuchennej w temperaturze 40 °C, po czym odsysa i przemywa 2 molarnym roztworem soli kuchennej. 65 Roztwór z eluowania laczy sie z roztworem z przemywania W & fe-108 607 i wytraca za pomoca 1,5 objetosci metanolu. Osad odwiro¬ wuje sie, przemywa najpierw ukladem woda-metanol w ilosci okolo 50 ml (1 + 1,5 czesci objetosciowych), a nastepnie metanolem w ilosci okolo 50 ml i suszy. Otrzy¬ muje sie 1,91 g heparynianu sodu o 202 jednostkach USP/ /mg.Przyklad VIII. 15 g heparynianu sodu, otrzymanego wedlug przykladu VII, o okolo 200 jednostkach USP/mg rozpuszcza sie w 200 ml 2-molarnego roztworu soli kuchen¬ nej. Roztwór odsysa sie przez nucze, a pozostalosc prze¬ mywa sie najpierw 50 ml 2 molarnego roztworu soli ku¬ chennej, a nastepnie okolo 250 ml calkowicie odminerali- zowanej wody. Polaczone roztwory doprowadza sie na¬ stepnie za pomoca calkowicie odmineralizowanej wody do molarnosci chlorkowej 0,9, po czym analogicznie do przy¬ kladu VII powtarza sie oczyszczanie za pomoca 1 litra Lewatitu CA 9249. Polaczone roztwory po eluowaniu i po przemywaniu poddaje sie obróbce w wyzej opisany sposób. Osad przemywa sie i suszy, otrzymujac 11,1 g heparynianu sodu o aktywnosci 254 jednostek USP/mg.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób otrzymywania heparyny o bardzo wysokim stopniu czystosci z solnych roztworów tkanek zwierzecych, znamienny tym, ze lake solna, uzyskana przez nasolenie jelit (trzewi) zaszlachtowanych zwierzat, rozciencza sie woda w stosunku laka solna: woda równym od 1:3 do 1:10, a nastepnie z zawierajacego heparyne rozcienczonego roz¬ tworu oddziela sie heparyne. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze z za¬ wierajacego heparyne, rozcienczonego roztworu straca sie 5 heparyne za pomoca czwartorzedowej soli amoniowej. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze z za¬ wierajacego heparyne, rozcienczonego roztworu straca sie heparyne przez zakwaszenie do odczynu o wartosci pH okolo 3. io 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze z za¬ wierajacego heparyne, rozcienczonego roztworu oddziela sie heparyne na drodze wymiany jonowej za pomoca zy¬ wicy amonitowej. 5. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze z za- 15 wierajacego heparyne, rozcienczonego roztworu straca sie heparyne chlorkiem benzylodwumetylo J 2-[2-(p-1,1,3,3- -czterometylobutylofenoksy)-etoksy] -etylol amoniowym. 6. Sposób wedlug zastrz. 3, znamienny tym. ze z za¬ wierajacego heparyne, rozcienczonego roztworu straca sie heparyne przez zakwaszenie kwasem octowym do odczynu o wartosci pH okolo 3. 7. Sposób wedlug zastrz. 4, znamienny tym, ze z za¬ wierajacego heparyne, rozcienczonego roztworu oddziela sie heparyne na drodze wymiany jonowej za pomoca srednio- zasadowej, makroporowatej zywicy amonitowej w postaci Cl". 20 25 PL PL PL PL PL PL PL PL