Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania no- ivych metalicznych pochodnych glikozydów antracykliny.Antybiotyki z grupy glikozydów antracykliny sa to zwiaz¬ ki, w których chromofor czterowodoronaftacenowy jest owiazany z cukrem, zazwyczaj z cukrem prostym. Przykla¬ dami tej grupy antybiotyków sa nastepujace: doksorubi¬ cyna, daunorubicyna, daunorubicynol, pyrromycyna, ruty- lantyna, cinerubina A, cinerubina B, aklawina, rodomycy- naAj rofomycyna B, y-rodomycyna 1, y-rodomycyna 2fl y-rodomycyna 3, y-rodomycyna 4, izorodomycyna A, retikulomycyna A, doksorubicynol, retikulomycyna B, izochinocyklina A, galirubina, mycetyna, mycetyna A, wiolacyna, a-cytromycyna, y-cytromycyna, 10-dezoksyro- domycyna, p-izorodomycyna, y-izorodomycyna, e-izoro- domycyna, minomycyna, akwajamycyna, ajamycyna, no- galomycyna.Z powyzszych antybiotyków, doksorubicyna (opis patentowy Stanów Zjednoczonych nr 3590028), dannoru- bicyna (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 1003383) oraz ich pochodne i rózne inne analogi przycia¬ gaja szczególnie uwage jako srodki przeciwrakowe, uzy¬ teczne w leczeniu bialaczki i innych postaci raka. Strukture doksorubicyny przedstawia wzór 1, w którym Rx oznacza ^grupe —COCH2OH a R oznacza reszte daunozaminilu o wzorze 2. Jesli Rt oznacza grupe o wzorze —COCH3, to zwiazek o wzorze 1 jest daunorubicyna. Znanych jest wiele pochodnych powyzszych zwiazków, otrzymywanych glównie w reakcji z grupa hydroksyacetylowa doksyrubi- cyny, grupa acetylowa daunorubicyny i grupa aminowa daunozaminilu obu tych zwiazków. 10 15 20 25 30 Reprezentatywne pochodne omawianych zwiazków o- pisane zostaly np. w nastepujacych pracach: opis patento¬ wy St. Zjedn. Ameryki nr 3686136; K. Yamamoto i wsp., J. Med. Chem., 15, 872 (1973); opisy patentowe RFN nr nr 2327211, 2557537 i 1920198; E. Bachman i wsp., Agents and Actions, 5/4, 383(1975); P. Chandra, Cancer Chemother. Rep., 6, 115(1975); F. Arcamone i wsp., Cancer Chemother. Rep., 6, 125(1975) i G. Zbinder i wsp., Cancer Chemother. Rep., 4, 707(1975). Za jedna ze szczególnie interesujacych pochodnych uwazany jest rubidazon, to znaczy zwiazek o wzorze 1, w którym R oznacza grupe o wzorze —C(CH3)—NNHCO—C6H5.Innymi takimi pochodnymi sa doksorubicynol i dauno- rubicynol.Stalym problemem wystepujacym przy stosowaniu przeciwnowotworowych glikozydów antracyklinowych jest ich duza toksycznosc ogólna i toksycznosc wobec serca, krwi i ukladu trawiennego. Hamuje to szersze ich zas¬ tosowanie w ilosci wlasciwej dla przeprowadzenia skutecz¬ nej terapii przeciwnowotworowej. Dzialanie toksyczne w stosunku do serca jest szczególnie klopotliwe i czesto smiertelne przy stosowaniu doksorubicyny w lacznych dawkach wynoszacych ponad 500 mg na metr kwadratowy.Problem toksycznosci doksorubicyny inspirowal wiele usilowan modyfikacji czasteczki tego zwiazku w pozy¬ tecznym kierunku, lecz niedawno, bo w roku 1975, jedna z grup badaczy doszla do wniosku, ze „zwiazek, który laczylby silna i szeroka aktywnosc przeciwnowotworowa, taka jaka wykazuje adriamycyna (doksorubicyna) z bardzo niskim poziomem trujacego dzialania na serce, nie zostal 108 660108 660 3 jeszcze znaleziony" (G. Zbinden i wsp., Cancer Chemo- ther. Rep., 59.707).Podczas badania dzialania trujacego doksorubicyny dl|/|^rca stwierdzono, ze jest ona silnym inhibitorem przenoszenia zaleznej od sodu i potasu ATP-azy i tym samym inhibitorem przenoszenia potasu. Stwierdzono takze/*e inhibicji tej przeciwdziala wapn, co sugeruje, ze dofeorubicynaWorzy^ wapniem kompleks. Skumulowa¬ ne dzialanie trujace doksorubicyny dla serca moze byc wytlumaczone faktem, ze kompleks doksorubicyny z wa¬ pniem, wytwarzany we krwi, jest nieaktywny w stosunku do ATP-azy, natomiast mala ilosc wolnego glikozydu wiaze sie praktycznie nieodwracalnie z enzymem.W zwiazku z tym stwierdzono, ze monomeryczne, wy- sycone metalami pochodne glikozydów antracyklinowych, takie jak pochodne z metalami, których powinowactwo do dwukleszczowych ligandów glikozydu jest wieksze niz po¬ winowactwo wapnia, powinny byc nietoksyczne dla serca.Z drugiej strony jednak, powyzsze modyfikacje moga oddzialywac niekorzystnie na mechanizm dzialania prze- ciwnowotworówego. Jakikolwiek by jednak nie byl mecha¬ nizm dzialania, dla którego nie mozna sformulowac jeszcze zadnej teorii, zsyntetyzowane pochodne metaliczne an¬ tybiotyków antracyklinowych, które zachowuja skutecznosc dzialania przeciwnowotworowego zwiazków macierzystych, a przy tym sa pozbawione charakterystycznego dla nich dzialania trujacego dla serca. Nowe zwiazki charakteryzuja sie takze innymi cennymi wlasciwosciami, o których bedzie mowa ponizej.Niektórzy badacze opisywali kompleksy metali: z gliko¬ zydami antracyklinowymi. Np. D. W. Yesair i wsp.,/ A.A.C.R. Abstr. 285(1974) stwierdzili, ze adriazycyna (doksorubicyna) i daunorubicyna (daunomycyna) tworza kompleksy z kationami Fe11, Co11, Cu11 i innych metali.Badacze ci otrzymywali kompleksy Cu11 z adriamycyna 1 daunomycyna, przy czym w przypadku tej drugiej, sto¬ sunek jonu Cu11 do antybiotyku wynosil 1:1, i stwierdzili, ze „jon miedziowy obniza w pewnym stopniu opózniona toksycznosc antracykliny". Nastepnie, inni badacze pra¬ gnac potwierdzic ten wniosek stwierdzili, ze kompleks polimeryczny kationu Cu11 i daunomycyny w stosunku 1:2 mozna otrzymac stosujac metode Yesaira, przy czym 50% kationu Cu11 pozostaje nieskompleksowane, a in vivo zachodzi natychmiast calkowita dysocjacja kompleksu [K. Mailer i wsp., Biochem. Pharm., 25, 2085(1976)].-Badacze ci doszli do wniosku, ze obserwowany uprzednio in vivo efekt ,,nie moze byc wynikiem obecnosci postaci chelatowych badanych leków".Znane glikozydy antracykliny maja budowe polimerycz- na, czyli w czasteczkach tych zwiazków stosunek jonów antybiotyku do jonów metalu jest znacznie wiekszy niz 1.Polimeryczna budowa kompleksów powoduje, ze wielkie czasteczki nie moga przekroczyc bariery jaka stanowi dla nich komórka i jest to przyczyna braku aktywnosci ttych zwiazków.W przeciwienstwie do uznanych zwiazków metaliczne pochodne glikozydów antracykliny maja budowe mono- meryczna, czyli stosunek antybiotyku do metalu jest mniejszy lub równy 1. Dzieki monomerycznej budowie kompleksy glikozydów antracykliny wytwarzane sposobem wedlug wynalazku przenikaja latwo przez scianki komórek i sa aktywne.Pochodne metaliczne glikozydów antracyklinowych, otrzymywane sposobem wedlug Wynalazku, sa prawie wylacznie monomerami, to znaczy, ze w jednej czasteczce 4 pochodnej znajduje sie jedna czasteczka glikozydu. Pow¬ stawanie niepozadanych polimerów, które moga przeszka¬ dzac wbudowywaniu sie antybiotyku w czasteczke DNA komórek nowotworu, jest praktycznie wykluczone dzieki 5 zastosowaniu nowego sposobu, w którym zapobiega sie obecnosci metalu wolnego. Pochodne otrzymane sposobem wedlug wynalazku moga korzystnie zawierac kilka katio¬ nów metalu w czasteczce glikozydu antracyklinowego.Sposób wytwarzania nowych metalicznych pochodnych 10 antracykliny o wzorze 3, w którym R oznacza —OH lub H, R2 oznacza atom wodoru a co najmniej jeden z podsta¬ wników Me stanowi jon Fe111, Cu11, Ni11, Co11, Fe11, Zu11, Cd11, Pb11, Al111 lub Hgn, natomiast w przypadku gdy Me oznacza atom wodoru ugrupowanie ;—O—Me—O— 15 przybiera postac grup =0 i —OH, polega na poddaniu zwiazku o wzorze 4, w którym R2 ma wyzej podane znaczenie reakcji z chlorkiem, siarczanem, azotanem lub inna sola metalu okreslonego symbolem Me o wyzej podanym znaczeniu, w roztworze wodnym w temperaturze 15—50 °C, 20 przy wartosci pH odpowiadajacej odczynowi obojetnemu, lekko kwasnemu lub zasadowemu, zachowujac stosunek molowy metalu do antybiotyku 1:1, 2:1, 3:1, 4:1 z tym, ze metal stosuje sie w nadmiarze lub w innym stosunku wyzszym od 1:1. 25 Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze sporzadza sie roztwór doksorubicyny lub daunorubicyny posiadajacych co najmniej jeden dwukleszczowy ligand dwu- lub trój¬ wartosciowego kationu metalu, którego powinowactwo do ligandu jest wieksze niz powinowactwo kationu Ca11, 30 a nastepnie pH roztworu doprowadza sie do wartosci, przy której zachodzi chelatowanie metalu przez dwuklesz¬ czowy ligand, oddziela sie otrzymany roztwór od zawieraja¬ cych metal, stalych produktów ubocznych i natychmiast przerywa reakcje pomiedzy glikozydem i kationami metalu. 35 Podczas oddzielania roztworu usuwa sie znaczna czesc wielkoczasteczkowego poliglikozydu.Stwierdzono, ze nowe zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wynalazku, sa prawie nie trujace dla serca i zacho¬ wuja aktywnosc przeciwnowotworowa, taka sama jaka 40 mial macierzysty glikozyd. Wprowadzenie metalu do czaste¬ czki glikozydu zmienia obraz widm w obszarze widzial¬ nym, nadfiolecie, podczerwieni i NMR, w stosunku do zwiazków macierzystych. Wskazuje to na zmiany w struktu¬ rze czasteczki antybiotyku, wywolane obecnoscia wiazania 45 kowalencyjnego powstalego w wyniku reakcji z kationami metali. Obecnosc atomów metalu zmniejsza takze katabolize zwiazku macierzystego w toksyczne pochodne.Pochodne metaliczne otrzymane sposobem wedlug wynalazku wykazuja w porównaniu z macierzystymi 50 zwiazkami przeciwnowotworowymi znacznie mniejsza tok¬ sycznosc hematologiczna, ogólna i toksycznosc dla ukladu trawiennego. Wprowadzenie metalu zmienia wlasciwosci elektronowe zwiazku macierzystego i to wydaje sie byc jedna z przyczyn znacznego zwiekszenia ich zdolnosci 55 przenikania. Korzystny zwiazek otrzymany sposobem wedlug wynalazku, trójzelazowa doksorubicyna, zdolna jest do przechodzenia przez bariere (krew, mózg i jelitowa) w przeciwienstwie do samej doksorubicyny, która nie wykazuje dostatecznego przenikania. Nalezy spodziewac 60 sie, ze u innych zwiazków otrzymanych sposobem wedlug wynalazku beda równiez wystepowaly takie wlasciwosci.Zwiazki te mozna zatem stosowac w leczeniu chorób nowotworowych mózgu i w kazdym przypadku podawac doustnie, W postaciach rozpuszczalnych w jelitach. Ponad- 65 to, wprowadzenie kationów metali zmniejsza, jak sie wy-103 660 6 daje, wlasciwosc oslabiania odpornosci, która wykazuja zwiazki macierzyste. Np. testy porównawcze z doksorubi- cyna wykazuja, ze obniza ona .znacznie wage sledziony i ilosc komórek odpornosciowych, czego nie obserwuje sie prawie w przypadku doksorubicyny trójzelazowej. 5 Zwiazki otrzymane sposobem wedlug wynalazku po¬ dawane pozajelitowo nie powoduja miejscowej martwicy, co ma miejsce w przypadku macierzystych antybiotyków np. doksorubicyny. Pozornie wieksza specyficznosc po^ chodnych metalicznych otrzymanych sposobem wedlug 10 wynalazku moze byc przypisana zwiekszonej przenikal- nosci, która poprzednio omówiono. Jaki by nie byl mecha¬ nizm dzialania, jest oczywiste, ze zwiazki te wykazuja szeroki zakres pozadanego dzialania nie wystepujacy u zwiazków macierzystych. 15 Zalety zwiazków otrzymanych sposobem wedlug wyna¬ lazku mozna najlepiej omówic na przykladzie zwiazku o wzorze 3, ilustrujacym budowe róznych trójmetalicznych pochodnych antybiotyków antracyklinowych. Jesli R2 ozAiczi atom wodoru, a RL oznacza —H, to zwiazek ten 20 jest trójmetaliczna pochodna daunorubicyny, jesli natomiast Rj oznacza grupe —OH, to zwiazek jest pochodna doksoru¬ bicyny. Dla znajacych zagadnienia jest oczywistym, ze Rx i R2 moga oznaczac inne grupy. W kazdym przypadku wszystkie dwukleszczowe ligandy zwiazku macierzystego 25 sa obsadzone atomami metalu.Jesli podc-333 wytwarzania nowych zwiazków sposobem wedlug wynalazku stosuje sie odczynnik zawierajacy metal w ilosci mniejszej niz potrzebna do obsadzenia wszystkich dwukleszczowych ligandów macierzystego gli- 3-3 kozydu, otrzymuje sie mieszanine zwiazków w rózny sposób podstawionych atomami metalu. W takich przy¬ padkach nalezy sie spodziewac, ze uprzywilejowane beda ligandy aglikonu. Najbardziej korzystne jest jednak stoso¬ wanie podczas wytwarzania zwiazków sposobem wedlug 35 wynalazku co najmniej n moli kationów metalu na 1 mol glikozydu, przy czym n jest liczba dwukleszczowych ligandów w czasteczce glikozydu.W rzeczywistosci mozna stosowac nadmiar kationów metalu. W przypadku, gdy glikozydy maja trzy dwuklesz- 40 czowe ligandy, otrzymana pochodna powinna zawierac co najmniej okolo 2 moli metalu na 1 mol glikozydu.Bardziej korzystne jest, jesli stosunek metalu do antybio¬ tyku wynosi okolo 3:1. Chociaz, jak juz wspomniano nie bedzie sie tu tworzyc zadnej teorii, mozliwe jest, ze nie 45 zajete ligandy macierzystego glikozydu dzialaja jako centra wiazace w procesie inhibicji zaleznej od ATP-azy sodu i potasu. W zwiazku z tym nalezy zwrócic uwage na calko¬ wite obsadzenie ligandów przez metal.W przypadku omawianego zwiazku, dwukleszczowymi 50 ligandami antracyklinonu (aglikonu) sa ugrupowania dwukarbonylowe. Inny ligand znajdujacy sie w reszcie daunozaminilu sklada sie z grupy aminowej i sasiadujacej z nia glikozylowej grupy hydroksylowej. Poszczególne glikozydy antracyklinowe moga miec takze inne typy 55 ligandów. Wiele róznych dwukleszczowych ligandów opisal J. Kleinberga i wsp. w „Inorgamic Chemistry", str. 218—220, D. C. Heath and Co., Boston, 1960.Zwiazki otrzymane sposobem wedlug wynalazku wy¬ twarza sie w roztworze, korzystnie w roztworze wodnym, 6!) mieszajac macierzysty glikozyd ze zródlem kationów metalu, korzystnie w postaci soli. Jako kationy stosuje sie wymienio¬ ne wyzej kationy, których powinowactwo, oznaczone metoda Hilla do ligandów jest wieksza niz powinowactwo kationu Ca11. Korzystne sa kationy Fe11, Ee1", Cu11 i CoU, 65 a najbardziej korzystny jest kation zelazowy (Fe111). Ko¬ rzystnymi solami metali sa chlorki, siarczany i azotany, chociaz mozna stosowac równiez wodorotlenki.Na ogól po zmieszaniu odczynnika metalicznego i gliko¬ zydu w roztworze wodnym, roztwór ten jest wzglednie kwasny. Takie srodowisko ulatwia rozpuszczenie sie zwiaz¬ ków metali. Nastepnie odczyn roztworu doprowadza sie do prawie obojetnego, co ma na celu deprotonowanie ligandów i sprzyja tworzeniu sie chelatów. Tak wiec, pH mieszaniny reakcyjnej doprowadza sie do wartosci sprzyja¬ jacej chelatowaniu, korzystnie do odczynu prawie obojet¬ nego, np. do pH 6,5—7,5, najkorzystniej do okolo 6,8—7,2.Zmiany wartosci pH nalezy dokonywac stopniowo, aby uniknac wytracaniu sie osadu stalego zwiazku metalu, który jak mozna sadzic ulatwia powstawanie niepozadanych produktów poliglikozydowych.Temperatura reakcji jest z jednej strony limitowana rozpuszczalnoscia reagentów (dolna granica), a z drugiej degradacja antybiotyków (górna granica). Jak wspomniano podczas zobojetniania utrzymuje sie temperature w zakre¬ sie 15—50 °C.Po doprowadzeniu pH do odpowiedniej wartosci, monomeryczne pochodne z metalami natychmiast sie oddziela od stalych, zawierajacych metal produktów u- bocznych, np. przez odsaczenie. Wiekszosc glikozydu znajduje sie w przesaczu w postaci monomeru. Stosujac ultrafiltracje stwierdzono, ze w korzystnym przypadku ponad 95% a w optymalnym wiecej niz 99% glikozydu w przesaczu jest w postaci monomeru. Uzyskany roztwór moze zawierac nieco nieskompleksowanych rozpusz¬ czalnych kationów metalu. Nastepnie przerywa sie szybko reakcje, jaka moze zachodzic pomiedzy pozostalymi wol¬ nymi kationami i glikozydem i prowadzi do tworzenia niepozadanych poliglikozydów, podobnych do opisywanych w poprzednich pracach, np. w cytowanej pracy Yesaira.Wolny metal mozna absorbowac, np. za pomoca weglanu magnezowego lub usuwac chromatograficznie. Najbardziej jednak korzystne jest, po ewentualnym rozdozowaniu, natychmiastowe szybkie zamrozenie roztworu. W ten sposób zostaje zahamowana dalsza ewentualna reakcja kationów metali z glikozydem. Zamrozony produkt korzyst¬ nie liofilizuje sie i przechowuje w warunkach malej wil¬ gotnosci, korzystnie wynoszacej ponizej okolo 1%.Zliofilizowany produkt, zawierajacy zazwyczaj wiekszosc mannitolu lub innego rozcienczalnika, mozna stosowac pozajelitowo, natychmiast po powtórnym rozpuszczeniu, np. w jalowej wodzie, w stezeniu wynoszacym np. 2,5 mg/ml wielometalicznej pochodnej glikozydu antracyklinowego.Alternatywnie, zwiazki te, np. kompleks trójzelazowy doksorubicyny, mozna podawac doustnie w postaci pre¬ paratów rozpuszczajacych sie w jelitach.Chociaz w opisie podano korzystny sposób wytwarzania kompleksów glikozydów antracyklinowych z metalami, polegajacy na poddawaniu doksorubicyny lub daunoru¬ bicyny reakcji z sola odpowiedniego metalu, to jednak jest zrozumiale, ze reakcja ta moze byc ostatnim etapem syntezy glikozydu antracyklinowego, którego wtedy nie izoluje sie w wolnej postaci.Sposób wedlug wynalazku mozna równiez stosowac do glikozydów antracyklinowych, w których reszta glikozydo- wa rózni sie od normalnie przylaczonej do antracyklinonu (aglikonu) przez Streptomycetes. Takie glikozydy antracy¬ klinowe wytwarza sie w reakcji odpowiedniego antracykli¬ nonu, np daunorubicynonu, z odpowiednim srodkiem alkilujacym, jak to zostalo opisane przez Penco w Chim.108 660 Ind. (Milano), 50, 908(1968) i we francuskim opisie patentowym nr 2183710. Do odpowiednich srodków alkilu¬ jacych naleza: bromek 2,3,4,6-trój-O-acetylo-a-D-gluko- piranozylu, bromek 3,4,6-trój-0-acetylo-2-dezoksy-2-trój- fluoroacetamido-a-D-glukopiranozylu i dwu- (N-trójflu- oroacetylo-a-daunozamina).Stosujac powyzsze reakcje, omawiane powyzej aglikony mozna przeksztalcac w wiele róznych glikozydów antra- cyklinowych. Reszte daunozaminy w daunorubicynie i doksorubicynie mozna np. zastepowac rodozamina lub innym zasadowym cukrem.Opisane chelaty moga równiez byc uzyteczne dla regu¬ lowania ilosci metali sladowych, zwlaszcza moga sluzyc jako zródlo tych metali w uprawach roslin. Chelaty Fe111 przedstawiaja specjalna wartosc w zwalczaniu chlorozy lub deficytu zelaza u roslin. Ilosc stosowanego chelatu zelazowego zalezy od ilosci potrzebnej w glebie, w której hoduje sie rosliny. Pozadane jest stosowanie chelatu zela¬ zowego w ilosci wystarczajacej dla zahamowania chlorozy na okres 1—2 tygodni. Ponadto, zwiazki otrzymane spo¬ sobem wedlug wynalazku moga takze sluzyc jako stabili¬ zatory, np. stabilizatory tworzyw sztucznych, pochodnych chlorku winilidenu, w których sladowe ilosci chlorków powoduja nietrwalosc tworzywa. W tym przypadku chelat metalu stosuje sie w ilosci wystarczajacej dla zwiazania maksymalnej ilosci chlorków, jaka moze sie z tworzywa uwalniac.W tablicy 1 podano stale dysocjacji kompleksów dokso- rubicyny i daunorubicyny z róznymi metalami. Poszczególne metale zestawiono w kolejnosci zaleznej od ich zdolnosci do chelatowania, podajac dla niektórych z nich stale dy¬ socjacji. Jak widac, metalem o najwiekszym powinowactwie do doksorubicyny i daunorubicyny jest zelazo w postaci kationu trójwartosciowego, a metalem o najmniejszym powinowactwie wapn.Stale dysocjacji obliczano stosujac metode Hilla, pole¬ gajaca na ocenie zmiany barwy po utworzeniu metalicznych pochodnych antybiotyków. Podane stale dysocjacji dotycza w kazdym przypadku najsilniejszego wiazania metal-ligand.W zwiazku z tym, podane wielkosci powinowactwa dotycza, w przypadku glikozydów posiadajacych kilka ligandów, najsilniejszego wiazania metal-ligand, zgodnie z wynikiem oznaczenia metoda Hilla.Dane z tablicy 1 wykazuja, ze najwieksze powinowactwo do doksorubicyny i daunorubicyny wykazuja jony Fe111 i Cu11, najmniejsze jony Co11 i Ca11. Pozostale metale maja posrednia wielkosc powinowactwa, w zaleznosci od ich pozycji w tablicy. 8 Tablica 1 10 15 20 25 30 35 40 45 Metal | FeHi Hgn Cuii Aini Ni" Pb" Coli Fe" Cd" Mnii Ca" MgH Stale dysocjacji kompleksów metali z doksorubicyna i daunorubicyna 5 x 10-7 mola — 1 x 10-6 mola — — — 1,3 xl0-5 mola 3,5 x 10-5 mola — — 12,7 x 10-5 mola — W tablicy 2 przedstawiono wplyw kompleksów dokso¬ rubicyny z jonem zelazowym w stosunku 2:1 i 3:1 na aktyw¬ nosc zaleznej od sodu i potasu ATP-azy, izolowanej z serc królików.Wyniki przedstawione w tablicy 2 wykazuja, ze dokso¬ rubicyna jest silnym inhibitorem zaleznej od Na i K ATP- -azy, co wydaje sie byc scisle zwiazane z toksycznoscia dla serca. Kompleksy zelaza z doksorubicyna w stosunku 2:1 i 3:1 sa calkowicie nieaktywne w stosunku do enzymu, podczas gdy kompleks w stosunku 1:1 czesciowo go de- zaktywuje. Na podstawie tego mozna wnioskowac, ze po¬ chodne metaliczne doksorubicyny zawierajace metal w sto¬ sunku 2:1 lub wiekszym w odniesieniu do antybiotyku, nie wywieraja dzialania hamujacego na zalezna od Na i K ATP-aze i tym samym nie wykazuja dzialania toksycznego w stosunku do serca. Podobne doswiadczenia wykazaly, ze takze pochodne metaliczne daunorubicyny nie sa inhi¬ bitorami Na-K ATP-azy. Nalezy sie spodziewac, ze inne opisywane kompleksy zachowuja sie podobnie.W tablicy 3 przedstawiono porównanie dzialania dokso¬ rubicyny i jej kompleksu z zelazem (2,5:1) na synteze DNA komórek bialaczki 1210 u myszy.Wyniki doswiadczen przedstawione w tablicy 3 wykazuja, ze pochodne zelazowe sa takimi samymi inhibitorami syntezy DNA jak macierzysty antybiotyk i maja tym samym aktywnosc przeciwnowotworowa. Aktywnosc ta jest wy¬ nikiem hamowania syntezy DNA czym charakteryzuja sie pochodne metaliczne.Tablica 2 Aktywnosc w % zaleznej od Na i K ATP-azy w zaleznosci od zwiekszajacego sie stezenia antybiotyków antracyklinowych Lek Doksorubicyna .Kompleks zelazo trójwartosciowe- doksorubicyna 1:1 2:1 3:1 Stezenie | 0 100 100 100 100 io-13 65 80 100 100 io-11 40 60 100 100 io-9 25 60 100 100 io-7 25 60 100 100 10"5moli 25 60 100 100 |108 660 Tablica 3 Hamowanie syntezy DNA przy zwiekszajacym sie stezeniu antybiotyku antracyklinowego (%) 1 Lek Doksorubicyna Kompleks zelazo-doksoru- bicyna (2,5:1) Stezenie 0 0 0 3 60 50 5 68 70 7,5 75 80 10 mi- kromoli 90 90 W tablicy 4 podano wyniki porównania toksycznosci doksorubicyny i jej kompleksu z zelazem trójwartosciowym.Doswiadczenia przeprowadzano stosujac próbki kompleksu wytwarzane przy zastosowaniu róznych ilosci zelaza, wiekszych niz 2:1 w stosunku do antybiotyku. W kazdym przypadku uzyskiwano podobne rezultaty. Leki podawano dootrzewnowo 10 myszom, rejestrujac ilosc zwierzat, które przezyly po uplywie 8 dni.Doswiadczenie to wykazuje, ze kompleks zelazo-dokso- rubicyna jest znacznie mniej toksyczny niz sama dokso¬ rubicyna. Na podstawie danych z tablicy 4 obliczono graficznie, ze srednia smiertelna dawka badanego komplek¬ su wynosi 47 mg/kg.Tablica 5 ilustruje aktywnosc terapeutyczna kompleksu zelaza trójwartosciowego z doksorubicyna w bialaczce P338 u myszy. Kompleks wytwarzano stosujac rózne ilosci metalu w stosunku do antybiotyku, przy czym sto- 10 15 20 25 30 10 sunek ten byl równy lub wiekszy niz 2:1. W kazdym przy¬ padku uzyskiwano podobne wyniki. Sredni stopien prze¬ zycia okreslano stosujac grupe skladajaca sie z 10 my¬ szy zakazonych 100 000 komórak bialaczki, którym w pierwszym dniu po zakazeniu podawano wzrastajace dawki doksorubicyny i jej kompleksu z jonem zelazowym.Dane z tablicy 5 wykazuja, ze kompleks zelazo-doksoru- bicyna charakteryzuje sie dzialaniem terapeutycznym w bialaczce myszy, równym dzialaniu doksorubicyny, ale moze byc on stosowany w wiekszych dawkach, gdyz jest mniej toksyczny. Optymalnej dawki leczniczej dokso¬ rubicyny dla ludzi nie mozna wyznaczyc z powodu jej toksycznosci. Kompleks zelazo- trójwartosciowe-dokso- rubicyna jest oczywiscie korzystniejszy jako malo toksyczny.W tablicy 6 przedstawiono zmiany obrazu elektrokar¬ diograficznego natychmiast po podaniu dozylnym kró¬ likom wzrastajacych dawek doksorubicyny i jej kompleksu trójzelazowego (3:1).Doswiadczenie to wykazalo brak znaczacych zmian obrazu elektrokardiograficznego po podaniu kompleksu, natomiast obserwuje sie bardzo duze zmiany po podaniu doksorubicyny. Wystepuje wiec korelacja tych wyników z brakiem dzialania trujacego dla serca kompleksu zelazo- -doksorubicyna.W tablicy 7 przedstawiono dane widmowe z obszaru widzialnego i podczerwieni dla trójzelazowego kompleksu doksorubicyny (3:1).Jak widac z tablicy 7 kompleksy charakteryzuja sie inna absorpcja niz wolne zwiazki przy róznych dlugosciach fali oraz kompleksy maja inne maksima absorpcji.Tablica 4 Lek Doksorubicyna Kompleks zelazo-doksorubicyna Ilosc myszy, które przezyly podanie róznych ilosci antybiotyków antracyklinowych (w %) 10 100 100 20 60 100 30 0 100 40 0 70 50 0 40 60 mg/kg | 0 30 Tablica 5 Sredni okres przezycia myszy zakazonych bialaczka Lek Doksorubicyna | Kompleks zelazo-doksorubicyna Wielkosc dawki w mg/kg (dootrzewnowo) 0 11 11 4 50 50 8 48 48 12 ' 42 42 24 6 35 36 4 dni 23 dni Tablica 6 Zmiany obrazu elektrokardiograficznego Lek Doksorubicyna Doksorubicyna trójzelazowa Wielkosc dawki 5 | 10 | 15 | 20 | 30mg/k& plaski zalamek T bez zmian ujemny zalamek T bez zmian ujemny zalamek T i szeroki zespól QRS bez zmian ujemny zalamek T i szeroki zespól QRS arytmia brak istotnych zmian ujemny zalamek T i szeroki zespól QRS wolny rytm brak istotnych zmian108 660 li 12 Tablica 7 Absorpcja lub procent przepuszczalnosci przy róznych dlugosciach fali Zwiazek Doksorubicyna Kompleks zelazo-doksorubicyna Dlugosc fali 1 . 1730 cm-1 30% 10% 1620 cm-1 50% 23% 1590 cm-1 0% 20% 1585 cm-1 30% 0% 1570 cm-1 0% 37% 600^ nm 0% 0,080 480 nm 0,180 0,100 280 nm 0,200 | 0,360 | W tablicy 8 przedstawiono porównanie toksycznosci hematologicznej doksorubicyny i kompleksu zelazo-dokso¬ rubicyna (3:1).Tablica 8 Toksycznosc hematologiczna pochodnych antracyklino- wych Liczba leukocytów w nm3 Lek Doksorubicyna Kompleks zelazo- -doksorubicyna Dawka mg/kg 10 20 10 15 20 30 40 50 60 Dni 0 | 7 4 700 4 700 4 700 4 700 4 700 4 700 4 700 4 700 4 700 3 300 2 400 | 5 100 4 400 4 400 3 600 3 800 2 800 1800 | Jak widac z powyzszych danych, toksycznosc hematolo¬ giczna obserwowana przy podaniu 20 mg/kg doksorubicyny wystepuje w przypadku kompleksu dopiero przy stezeniu wiekszym niz 50 mg/kg.Reasumujac, wyniki badan biochemicznych i farmakolo¬ gicznych przedstawione w tablicach 1—7 wykazuja, ze doksorubicyna i daunomycyna tworza zwiazki chalatowe ze wszystkimi metalami podanymi w tablicy 1 i, ze szczegól¬ nie trwale sa pochodne chelatowe z jonami Fe111, Cu11 i Co11. Ponadto, chelaty z metalami wytwarzane przy zastosowaniu 2 lub wiecej równowazników metalu na 1 równowaznik antybiotyku sa nieaktywne w stosunku do zaleznej od sodu i potasu ATP-azy, mniej toksyczne dla myszy i królików i aktywne terapeutycznie w bialaczce myszy. Chociaz wiekszosc badan dotyczy kompleksu zelaza trójwartosciowego z doksorubicyna o róznym wza¬ jemnym stosunku obu skladników (2:1 lub wiecej) podo¬ bne wyniki uzyskuje sie z innymi kompleksami obu anty¬ biotyków z róznymi metalami, stosowanymi w róznych ilosciach.Tablica 9 Reprezentatywne sole metali stosowane w sposobie wedlug wynalazku FeS04 CuS04 NiCl2 CoCl2 A12(S04)3 MgCl2 ZnS04 Cd(N03)2 Pb(CCOCH3)2 Pb(N03)2 15 20 25 35 40 50 60 65 Przykladowo zamiast doksorubicyny mozna stosowac chlorowodorek daunorubicyny. Mozna równiez stosowac inne polarne rozpuszczalniki zamiast wody, np. mozna wytwarzac pochodne metaliczne mieszajac kationy metalu i glikozyd w alkoholu i mieszajac roztwór bez dostepu powietrza. Podobnie, zamiast FeCl3, mozna stosowac wiele innych zwiazków metali wymienionych w tablicy 9.Nowe metaliczne pochodne antracykliny o wzorze 3 zawierajace jeden, dwa, trzy lub cztery atomy metalu i ich mieszaniny otrzymuje sie sposobem wedlug wynalazku ze zwiazku o wzorze 4 w nastepujacych reakcjach.Zwiazek o wzorze 3, w którym Rt. oznacza —OH a Me oznacza Fe111, czyli kompleks zelazowy doksorubicyny zwany chelamycyna wytwarza sie stosujac do reakcji sól zelaza w takim stosunku molowym aby otrzymac pochodna jedno-, dwu-, trój- lub czterozelazowa albo ich mieszanine.Zwiazek o wzorze 3, w którym R± oznacza—OH a Me oznacza Cu11, czyli kompleks miedziowy doksorubicyny wytwarza sie stosujac do reakcji sól miedzi w takim sto¬ sunku molowym, aby otrzymac podchodna jedno-, dwu-, trój- lub czteromiedziowa albo ich mieszanine.Zwiazek o wzorze 3, w którym RA oznacza —OH a Me oznacza Co, czyli kompleks kobaltowy doksorubicyny wytwarza sie stosujac do reakcji sól kobaltu w takim sto¬ sunku molowym aby otrzymac pochodna jedno-, dwu-, trój- lub czterokobaltowa albo ich mieszanine.Zwiazek o wzorze 3, w którym Rt oznacza —H a Me oznacza Fe11, czyli kompleks zelazowy daunorubicyny wytwarza sie stosujac do reakcji sól zelazawa w takim sto¬ sunku molowym aby otrzymac pochodna jedno-, dwu-, trój- lub czterozelazawa albo ich mieszanine.Zwiazki otrzymane wedlug wynalazku stosuje sie w terapii w ilosciach skutecznych przeciwrakowo, na ogól w pola¬ czeniu z dopuszczalnymi w farmacji nosnikami. Np. kompleks trójzelazowy doksorubicyny lub daunorubicyny mozna podawac w dawkach 40—250 mg/m2 powierzchni ciala w okresie 1—3 tygodni. Ogólnie biorac nowe zwiazki mozna stosowac w takich chorobach nowotworowych, w których stosuje sie odpowiednie macierzyste glikozydy oraz dodatkowo w chorobach, w których nowe pochodne moga byc aktywne dzieki zmienionej przenikalnosci, np. w przypadku nowotworów mózgu.Przyklad I. Kompleks trójzelazowy doksorubicyny (3:1). Roztwór wodny 0,01 mikromola doksorubicyny i 0,03 mikromola chlorku zelazowego miesza sie w tempera¬ turze pokojowej, rejestrujac w sposób ciagly wartosc pH.Zaczyna sie tworzyc kompleks i wartosc pH doprowadza sie powoli do 7,3 za pomoca stezonego roztworu wodoro¬ tlenku sodowego. Nastepnie mieszanine rozciencza sie woda do stezenia 1 mg/ml i dodaje bufor tris-hydroksy- metyloaminometanowy o wartosci pH = 7,3, do stezenia 12 milimoli. Natychmiast po tym roztwór przepuszcza sie przez jalowy filtr o srednicy porów 0,22 mikrona, dozuje przesacz do malych kolbek, zamraza przez zanurzenie108 660 13 w cieklym azocie i liofilizuje. Porcje po 10 mg liofilizatu zamyka sie w warunkach jalowych w ampulkach. Preparat bezposrednio przed uzyciem rozpuszcza sie w 10 ml wody.W podobny sposób poddaje sie reakcji z chlorkiem zelazowym inne glikozydy antracyklinowe i otrzymuje odpowiednie chelaty zelazowe.Przyklad II. Kompleks zelazowy doksorubicyny (3,5:1). Powtarza sie postepowanie z przykladu I, stosujac 330 mikromoli chlorku zelazowego i prowadzac proces w temperaturze 42°C.Przyklad III. Kompleks zelazowy doksorubicyny (2,5:1). Powtarza sie postepowanie z przykladu I, stosujac 250 mikromoli chlorku zelazowego i doprowadzajac pH do wartosci 6,9.Przyklad IV. Kompleks zelazowy doksorubicyny (2:1). Powtarza sie postepowanie przykladu III, stosujac 200 mikromoli chlorku zelazowego i otrzymujac pochodna metaliczna o stosunku 2:1 zelaza do antybiotyków.PrzykladV. Kompleks zelazowy doksorubicyny (1:1). Powtarza sie postepowanie z przykladu I, ale sto¬ suje sie 100 mikromoli wodorotlenku zelazowego.Przyklad VI. Kompleks miedziowy doksorubicyny.Powtarza sie postepowanie z przykladu I stosujac siarczan miedziowy zamiast chlorku zelazowego.Przyklad VII. Kompleks kobaltowy doksorubicyny.Powtarza sie postepowanie z przykladu I stosujac chlorek kobaltowy zamiast chlorku zelazowego.Zastrzezeni a patent o we 1. Sposób wytwarzania nowych metalicznych pochbdnycji t antracykliny o wzorze 3, w którym Rt oznacza —OH lub*' —H, R2 oznacza atom wodoru a co najmniej jeden z podsta¬ wników —Me stanowi jon Felu, Cull, Nin, Co11, Feli, ZnH, Cd", Pbn, Alm lub HgH, natomiast w przypadku gdy Me oznacza atom wodoru ugrupowanie —O—Me—O— 14 przybiera postac grup =0 i —OH, znamienny tym, ze zwiazeko wzorze4, w którym R2 ma wyzej podane znaczenie, poddaje sie reakcji z chlorkiem, siarczanem, azotanem lub inna sola metalu okreslonego symbolem Me o wyzej po- 5 danym znaczeniu, w roztworze wodnym w temperaturze 15—50°C, przy wartosci pH odpowiadajacej odczynawi obojetnemu, lekko kwasnemu lub zasadowemu, zachowujac stosunek molowy metalu do antybiotyku 1:1, 2:1, 3:1, 4:1 z tym, ze metal stosuje sie w nadmiarze lub w innym sto¬ lo sunku wyzszym od 1:1. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w przy¬ padku wytwarzania zwiazku o wzorze 3 w którym Rt oznacza —OH a Me oznacza Fein, czyli kompleksu ze¬ lazowego doksorubicyny zwanego chelamycyna, stosuje 15 sie sól zelaza w takim stosunku molowym aby otrzymac pochodna jedno-, dwu-, trój- lub czterozelazowa albo ich mieszanine. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w przy¬ padku wytwarzania zwiazku o wzorze 3, w którym Rx 20 oznacza —OH a Me oznacza Cuii, czyli kompleksu mie- v dziowego doksorubicyny, stosuje sie sól miedzi w takim stosunku molowym aby, otrzymac pochodna jedno-, dwu-, trój-*. lub czteromiedziowa albo ich mieszanine. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w przy- 25 padku wytwarzania zwiazku o wzorze 3, w którym Rt oznacza —OH a Me oznacza Co11, czyli kompleksu kobal¬ towego doksorubicyny, stosuje sie sól kobaltu w takim stosunku molowym aby otrzymac pochodna jedno-, dwu, trój-, lub czterokobaltowa albo ich mieszanine. 30 5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w przy¬ padku wytwarzania zwiazku o wzorze 3, w którym Rt oznacza—H a Me oznacza Fe11, czyli kompleksu zelaza- -wego daunorubicyny, stosuje sie sól zelazawa w takim 'stosunku molowym aby otrzymac pochodna jedno-, dwu-, 35 ftrój- lub czterozelazawa albo ich mieszanine.108 660 O OH 0 HO n NH OCH5 O OH H R Wzór'2 Wzór 1 J^L* ocliV ° i Me-NR; Wzór, 0—OH '^-OfcR, OH 0CH3a -OHH V ¦CH—°N HO, Wzór 4 NH; LZG Z-d 3, Z. 66/1400/81, n. 90+20 egz.Cena 45 zl PL PL PL PL PL PL PL PL