PL109224B1 - Method of determining enzymatic substrates or enzymaticactivity - Google Patents

Description

Opis patentowy opublikowano: 30.05.1981 Int. CL* G01N 33/16 GOIN 31/14 G01N 31/22 G01N 21/22 CZYTELNIA] Twórca wynalazku Uprawniony z patentu: Boehringer Mannheim GmbH*, Mannheim (Republika Federalna Niemiec) Sposób oznaczania substratów enzymatycznych albo aktywnosci enzymów Przedmiotem omawianego wynalazku jest sposób ozna¬ czania substratów enzymatycznych albo aktywnosci en¬ zymów przy zastosowaniu reakcji redoksy jako reakcji pomiarowej.Reakcje redoksy do oznaczania stezen enzymów wzgled¬ nie substratów enzymatycznych maja duze znaczenie w chemii klinicznej i farmaceutycznej, w biochemii i w chemii srodków spozywczych. Ocene tych reakcji pro¬ wadzi sie za pomoca pomiarów fotometrycznych. Jezeli w ukladzie badanym obok interesujacych skladników reakcji redoksy znajduja sie jeszcze dalsze substancje redukujace, wówczas nalezy liczyc sie z zaklóceniami.W próbie badanej szczególnie czesto znajduje sie kwas askorbinowy. Jako silny srodek redukujacy fest on po¬ wodem zaklócen, jezeli badaniu podlegaja srodki farma¬ ceutyczne albo plyny fizjologiczne, jak surowica albo mocz, soki roslinne zawierajace kwas askorbinowy albo inne srodki spozywcze, które zawieraja kwas askorbino¬ wy albo do których dodano go. Wiadomo na przyklad, ze kwas askorbinowy zaklóca nastepujace reakcje: A. Reakcje, w których nadtlenek wodoru i donator wodoru poddaje sie reakcji z peroksydaza, zaklócane sa przez reakq'e. kwas askorbinowy+Hj02peroksydaza kwas dehydroaskor- binowy+H20.B. Reakcje, w których sole tetrazoliowe redukuje sie srodkami redukujacymi do formazanów, zaklócane sa przez reakcje 10 15 20 25 30 kwas askorbinowy-f-sól tetrazoliowa rbrmazan+kwas dehydroaskorbinowy C. Reakcje, w których fenole sprzegane sa oksydacyj¬ nie z nukleofilowymi odczynnikami, zaklócane sa w ten sposób, ze kwas askorbinowy w jeszcze nie wyjasniony sposób prowadzi do reakcji ubocznych, tak ze powstaja niejednorodne produkty sprzegniecia, które pod wzgle¬ dem absorpcji w swietle normalnym i nadfiolecie odbie¬ gaja od utworzonych w normalny sposób produktów sprzegniecia.Zwykle metody utleniania z reguly nie nadaja sie do usuniecia kwasu askorbinowego z badanego materialu.Srodki utleniajace atakuja równiez substraty enzymatycz¬ ne oraz enzymy i niszcza je. Produkty ich redukcji, czesto dwu- albo trójwartosciowe jony metali, hamuja czesto enzymy, które wykorzystuje sie do reakcji wskaznikowej.Rozklad kwasu askorbinowego tlenem wymaga silnie alkalicznego srodowiska, na przyklad 25% roztworu wo¬ dorotlenku sodowego. To prowadzi równiez do rozkladu substratów enzymatycznych i enzymów.Zadaniem omawianego wynalazku jest opracowanie nie zaklócanego kwasem askorbinowym, sposobu ozna¬ czania substratów enzymatycznych albo aktywnosci enzy¬ mów z zastosowaniem reakcji redoksy jako reakcji po¬ miarowej.Sposobem wedlug wynalazku zadanie to rozwiazano w ten sposób, ze do mieszaniny reakcyjnej dodaje sie oksydaze askorbinianowa. 109 224109 224 3 Oksydaza askorbinianowa katalizuje reakcje: kwas askorbinowy+1/2 02 oksydaza kwas dehydroas- ? askorbinianowa korbinowy+H20.Wedhig danych literaturowych na temat oksydazy askorbinianowej nalezalo oczekiwac, ze enzymu tego nie bedzie mozna stosowac w sposobie wedhig wynalazku.Wszystkie uzyskane dotychczas preparaty enzymatyczne produkuja mianowicie w reakcji ubocznej nadtlenek wo¬ doru. Jednoczesnie oksydaza askorbinianowa ulega bar¬ dzo szybkiej dezaktywaqi, która przypisywana jest two¬ rzonemu jednoczesnie nadtlenkowi wodoru, na przyklad Biochemical Copper Proceedings Symposium Harriman New York 1965, strona 305—337. To samo odnosi sie ¦¦iwliki, UlLfTlSaiStlw o bardzo wysokiej czystosci, które I A^^iwtrawirowaniuj i przy elektroforezie nie wykazuja i zadnych zanieczyszczen, na przyklad Biochem. 4, 1362 I—^37<^J^j^5)*~Qdk|ktywacja reakcji sprowadza sie do I tworzenia nadllenkrfVpdoru,na przyklad Biochem. Biophys Wla W, 427—439 (1962).Wedlug obliczen autorów ostatniego artykulu 1 U oksy¬ dazy askorbinianowej w 1 mmolu/litr roztworu kwasu askorbinowego moze wytwarzac 0,7 10-* mmoli/litr nad¬ tlenku wodoru. Takie stezenia kwasu askorbinowego czesto wystepuja w badanych roztworach. Utworzony nadtlenek wodoru stoi oczywiscie do dyspozycji enzyma¬ tycznych reakqi, jak na przyklad katalazy.W ukladzie donator wodoru+Ha02 peroksydaza barwnik+2H20 do fotometrycznego oznaczania nadtlenku wodoru przy molowym wspólczynniku ekstynkcji okolo 20 cm3/umol otrzymuje sie róznice ekstynkcji 0,14. Poniewaz zakres pomiarowy normalnych reakqi fotometrycznych wynosi okolo 0,01—1,00, zostaje tu wywolany niedopuszczalny blad. W podobny sposób zaklócane sa reakcje, w których zamiast nadtlenku wodoru stosuje sie organiczne wodo- ronadtlenki, a zamiast peroksydazy hemoglobine albo inne katalizatory utleniania. Ale pomijajac ten blad wy¬ wolany przez nadtlenek wodoru wiadomo z wyzej przy¬ toczonych na ostatnim miejscu danychliteraturowych, ze reakcja kwasu askorbinowego ustaje juz na dlugo przed calkowitym jego usunieciem.Szczególnie ciazacy we wszystkich tych reakcjach re- doksy, w których powstaje nadtlenek wodoru byl fakt, ze ten nadtlenek wodoru z jednej strony .musial jeszcze przyspieszac dezaktywacje enzymu, a z drugiej strony nowe powstawanie nadtlenku wodoru przez sama oksy¬ daze askorbinianowa prowadzi do zupelnie niejasnych zjawisk. Zaskakujace jest wiec, ze wbrew oczekiwa¬ niom przez dodatek oksydazy askorbinianowej mozliwe jest calkowite usuniecie zaklócen spowodowanych obec¬ noscia askorbinianów bez wystepowania innych zaklócen, które zniweczylyby korzysc usuwania askorbinianów.Sposób wedlug wynalazku stosuje sie zwlaszcza w en¬ zymatycznych reakq'ach, szczególnie takich, w których tworzy sie nadtlenek wodoru, a wiec w reakq'ach, które katalizowane sa przez oksydazy, jak oksydaze glukozo¬ wa, urikaze, oksydaze cholesterolowa i podobne, dalej w reakcjach, w których redukuje sie sole tetrazoliowe, i w reakcjach, w których fenole sprzega sie oksydacyjnie z nukleofilowymi odczynnikami. Dodawana ilosc oksy¬ dazy askorbinianowej zalezy od oczekiwanej ilosci kwasu askorbinowego w badanej próbie. Z reguly dodaje sie 0,002—100 U/ml oksydazy askorbinianowej, korzystnie 4 0,001—30 U/ml badanej próby. Wartosc pH reakcji dos¬ tosowuje sie w pierwszym rzedzie da wartosci pH, jaka jest wymagana dla tego albo innych bioracych udzial enzymów, przy czym dla sposobu wedlug wynalazku jako 5 odpowiednia okazala sie wartosc pH 4,0—8,5. Zwlaszcza korzystne jest stosowanie w ramach wynalazku oksydazy askorbinianowej z Zucchini (Cucurbita pepo medullo- za), z tym, ze odpowiednia jest równiez oksydaza askor¬ binianowa innego pochodzenia. 10 Sposób wedlug wynalazku posiada szczególnie zna¬ czenie w dziedzinie szybkiej diagnostyki.Korzystnymi metodami sposobu wedlug wynalazku jest oznaczanie glukozy przy uzyciu peroksydazy i oksydazy glukozowej i o-dwuanizydyny albo 2,2'-azyno-dwu-(3- 15 -etylobenzotiazolinosulfonianu-6, oznaczanie glukozy we¬ dlug metody heksokinaza) dehydrogenaza glukozo-6-fos- foranowa, oznaczanie kwasu moczowego za pomoca fe¬ nolu, aminoantypiryny, peroksydazy i urikazy, oznaczanie tyrozyny albo pirokatechiny za pomoca 4-metylo-6-pota- 20 sosulfonylobenzotiazolonohydrazonu-2 i tyrozynazy wzgled¬ nie oksydazy dwufenolowej.Przyklady objasniaja blizej wynalazek.Przyklad I. Oznaczanie glukozy za pomoca o-dwu¬ anizydyny, peroksydazy i oksydazy glukozowej przy uzy- 25 ciu fotometru; dlugosc fali 432 nm; temperatura po¬ miaru: 25°C.Kiuweta Nr | 1 Bufor fosforanowy pH 7,0 1 mol o-dwuanizydyna 5 mg/ml Peroksydaza, 180 U/ml Roztwór glukozy, 1 mg/ml Roztwór kwasu askorbinowego 10 mmoli Woda Oksydaza askorbi¬ nianowa 500 /U | /ml 1 inkubacja — w tem tanie E± i nastepnie oksydaza glukozo¬ wa 70 U/ml inkubacja — przez odczytanie Ea, AE < | AE 1 2 2,5 0,1 0,05 0,03 — 0,12 — iperatur dzialan 0,1 30 mii )bliczon | 0,541 2 3 2,5 0,1 0,05 0,03 0,1 0,02 — 3 4 2,5 0,1 0,05 0,03 0,01 0,11 — ze 25 °C, 1 mir ie 0,1 0,1 aut w temperal e z E2—Et | 0,010| 0,316 4 5 2,5 0,1 0,05 0,03 0,1 — 0,02 5 | 6 | 2,5 0,1 0,05 0,03 0,01 0,09 0,02 1 nita; odczy- 0,1 0,1 turze 25°C; 0,540| 0,543 55 Kiuweta 1 odpowiada pomiarowi nie zaklóconemu, bez kwasu askorbinowego.Kiuweta 2 i 3 wykazuja, ze 1 wzglednie 0,1 umola soli kwasu askorbinowego hamuje próbe praktycznie calko¬ wicie wzglednie do 41,5%. Kiuwety 4 i 5 wykazuja cal- 60 kowite usuniecie zaklócenia tych stezen soli kwasu askor¬ binowego przez dodanie po 10 U oksydazy askorbinia¬ nowej.Przyklad II. Oznaczanie glukozy za pomoca 2,2'- -azynodwu- (3-etylobenzotiazolinosulfonianu-6), peroksyda- 65 zy i oksydazy glukozowej. Pomiaru dokonano w foto-109 224 metrze, przy dlugosci fali pomiaru 25 °C. 432 nm i przy temperaturze Kiuweta Nr 1 Bufor fosforanowy pH 5,6 0,1 mola 2,2'-azyno-dwu- - (3-etylobenzotia- zolinosulfonian-6 50 mmoli Peroksydaza 250 U/ml Roztwór glukozy 0,1 mg/ml Roztwór kwasu askorbinowego 1 mmol Woda Oksydaza askorbi- nianowa 500 U/ /ml inkubacja — przez czytanie E± i dzialaj oksydaza glukozo- | wa 70 U/ml inkubacja przez 30 czytanie E2, oblicze | AE 1 2 2,75 0,05 0,02 0,1 — 0,12 — 2 3 2,75 0,05 0,02 0,1 0,1 0,02 — 1 minute w tern nie | 0,1 | 0,1 minut w temi nie AE z E2—E 0,505| 0,000 3 4 2,75 0,05 0,02 0,1 0,1 0,11 — 4 5 2,75 0,05 0,02 0,1 0,1 — 0,02 5 | 6 | 2,75 0,05 0,02 0,1 0,1 0,09 0,02 peraturze 25 °C, od- | 0,1 0,1 0,1 | eraturze 25 °C, od- | :* - i | 0,40 0,502| 0,504| Kiuweta 1 odpowiada niezaklóconemu pomiarowi, bez soli kwasu askorbinowego. Kiuwety 2 i 3 wykazuja, ze 0,1 wzglednie 0,01 umola soli kwasu askorbinowego ha¬ muje próbe calkowicie wzglednie do 21%. Kiuwety 4 i 5 wykazuja calkowite usuniecie zaklócenia tych stezen soli kwasu askorbinowego przez dodanie po 10 U oksydazy askorbinianowej.Przyklad III. Oznaczanie kwasu moczowego za pomoca fenolu, aminoantypirydyny, peroksydazy i uri- kazy w automacie analitycznym (Autoanalyser).Zasada próby: kwas moczowy+02+H20 urikaza alantoina+H202 ? 2H202+2,4-dwuchlorofenol+4-aminoantypiryna peroksydaza barwnik chinoidowy+2H20 ? Wytwarzanie roztworów: 1. Odczynnik-oksydaza askorbinianowa.W 600 ml wody dwukrotnie destylowanej rozpuszcza sie zawartosc butelki 1. Dodaje sie 0,3 ml srodka emulgu¬ jacego o nazwie handlowej Brij-35. Otrzymany odczyn¬ nik przechowuje sie w ciemnej butelce i trwalosc jego wynosi 4 tygodnie przy przechowywaniu w temperatu¬ rze okolo 4°C, a 1 tydzien w temperaturze okolo 25 °C. 2. Odczynnik — Urikaza.W 800 ml wody destylowanej dwukrotnie rozpuszcza sie zawartosc butelki 2. Dodaje sie 2,0 ml preparatu Brij- -35. Otrzymany odczynnik przechowywany w ciemnej butelce trwaly jest przez 4 tygodnie w temperaturze okolo 4°C, a przez 1 tydzien przy przechowywaniu w tempe¬ raturze okolo 25 °C. 10 15 Stezenia roztworów: Butelka 1. 50 mmóli buforu fosforanowego, pH 5,6 oksydaza askorbinianowa — w ilosci równej albo wiekszej 5 niz uwidoczniona na wykresie 2.Butelka 2. 31 mmoli 2-amino-2-hydroksymetylopropa- nodiol-1,3 (kwas cytrynowy, pH 8,9, urikaza 0,08 U/ml. peroksydaza 0,015 U/ml. 3,0 mmole 2,4-dwuchlorofenolu, 4,0 mmole 4-aminoantypirydyny W celu przeprowadzenia oznaczenia zestawia sie uklad przewodów automatu wedlug schematu przedstawionego na rysunku fig. 1.Na rysunku fig. 2 przedstawione sa w graficznym ujeciu wyniki doswiadczenia.Przyklad IV. Oznaczanie glukozy za pomoca ukladu heksokinaza/dehydrogenaza glukozo-6-fosforano- wa, fosforanu dwunukleotydu nikotynamino-adeninowego, chlorku 3- (4-jodofenylo)-2- (4-nitrofenylo)-5-fenylo-2H- -tetrazoliowego i diaforazy, w fotometrze przy dlugosci fali 492 nm i temperaturze inkubacji 25 °C. 25 30 35 Kiuweta Nr Bufor fosforanowy, pH 7,5 0,1 mola Fosforan dwunukleotydu nikotynamido-adeninowego/chlo¬ rek 3- (4-jodofenylo)-2- (4-nitro- fenylo)-5-fenylo-2H-tetrazoliowy po 1 mg/ml Diaforaza 5 U/ml Roztwór glukozy 0,05 mg/ml Roztwór soli kwasu askorbinowe¬ go 10 mmoli Oksydaza askorbinianowa 35 U/ml | Woda inkubacja — przez 3 minuty w ten czytanie E± i traktowanie roztworem heksokinaza / dehydro¬ genaza glukozo-6-fosforanowa | po 56 U/ml 1 inkubacja przez 15 minut, odczyta z E2—E± \ AE 1 • 1,7 0,1 0,1 0,1 — — 0,04 iperatui 0,05 nie Ea, ( 0,234 2 1,7 0,1 0,1 0,1 0,01 — 0,03 3 | 1,7 0,1 0,1 0,1 0,01 0,03 — rze25°C, od- 0,05 Dbliczen 0,307 0,05 ieAE | 0,230 40 45 50 Kiuweta 1 odpowiada pomiarowi niezaklóconemu. Kiu- 55 weta 2 wykazuje, ze 0,01 umola soli kwasu askorbino¬ wego powoduje, ze próba wypada o 34% za wysoka. Kiu¬ weta 3 wykazuje natomiast, ze 1 U oksydazy askorbinia¬ nowej calkowicie usuwa zaklócenie pomiaru. 60 Przyklad V. Oznaczanie glutaminianu za pomo¬ ca dehydrogenazy glukozowej, dwunukleotydu nikoty¬ namido-adeninowego, chlorku 3- (4-jodofenylo)-2- (4-ni- trofenylo)-5-fenylo-2H-tetrazoliowego i diaforazy przy uzyciu fotometru. Dlugosc fali: 492 nm, temperatura €5 pomiaru: 25°C.109 224 1 Kiuweta Nr Bufor fosforano¬ wy, pH 5#; 0,01 mmola Roztwór glutami¬ nianu 0,2 mg/ml Roztwór soli kwasu askorbinowego 5 mmoli Oksydaza askorbi- 1 nianowa 100 U/ /ml | 1 | 2 1,30 0,1 — — 1,20 0,1 0,1 — | 3 | 4 1,29 0,1 1 0,01 — 1,18 0,1 0,1 0,02 1 5 1,27 0,1 0,01 0,02 inkubacja przez 3 minuty w temperaturze 25 °C, potem | 1 odmierzenie pipeta 0,2 mola trójeta- nolóaminy, 0,05 mola buforu+fos- foranu potasowe¬ go, ptt 8,s z 1,5% Tritonu-X-100 roztworu dwunu- kleotydu nikotyn- 1 amido-adeninowe- 1 gó 5 mg/ml j roztworu diaforazy 10 U/ml I dehydrogenazy 1 glukozowej 1000 j U/ml odczytanie Et i 1 dzialanie 1 roztworem chlor- I ku 3-(4-jodofeny- lo)-2-(4-nitrofe- nyló)-5-fenylo-2H- 1 -tetrazoliowego 2 mg/ml inkubacja przez 15 czytanie E2, obliczei AE 1 do poszczególnych kiuwet 1,0 0,2 0,05 0,05 1,0 0,2 0,05 0,05 1,0 0,2 0,05 0,05 1,0 0,2 0,05 0,05 1,0 0,2 0,05 0,05 1 0,05 0,05 | 0,05 0,05 0,05 1 minut w temperaturze 25 °C, od- lie AE z E2—E± 0,184] 1,560| 0,380] 0,18ó| 0,182| KiuWeta 1 odpowiada pomiarowi niezaklóconemu.Kiuwety 2 i 3 wskazuja, ze 0,5 Wzglednie 0,05 umola soli kwasu askorbinowego powoduje, ze próba wypada o 700 wzglednie o 100% za wysoka. Kiuwcty 4 i 5 wska¬ zuja na to, ze 2 U oksydazy askorbinianowej usuwa cal¬ kowicie to zaklócenie.Przyklad VI. Oznaczanie tyrozyny w fotometrze za pomoca 3-metylo-6-potasosulfonylobenzotiazolonohy- drazonu-2 i tyrozynazy. Dlugosc fali pomiarowej: 492 nmj temperatura pomiaru: 25°C. 1 Kiuweta Nr 1 Bufor fosforanowy, ptt 5,2; 0,25 mola 3-metyIo-6-potasosulfonyloben- zotiazolonohydrazon-2 0,1 mola Roztwór kwasu askorbinowego 10 mmoli Woda 1 2,77 0,05 — 0,12 2 2,77 0,05 0,1 0,02 3 | i I 2,77 0,05 0,1 — 1 10 15 20 25 30 40 45 50 55 60 65 1 Kiuweta Nr Oksydaza askorbiriianowa 500 U/ml Tyrozynaza 60 U/ml 1 0,05 2 | 3 | 0,05 0,02 0,05 1 inkubacja przez 1 minute w temperaturze 25°C5 od-1 czytanie Ex i dzialanie | tyrozyne 2 mmole | 0,05 | 0,05 | 0,05 | inkubacja przez 1 godzine w temperaturze 25 °C, 1 odczytanie E2, obliczenie A E z E2-Ei AE | 1,113] 0,728] 1,100| Kiuweta 1 odpowiada pomiarowi niezaklóconemu, kiuweta 2 wykazuje, ze umol soli kwasu askorbinowego obniza teoretyczna wartosc o 35%, natomiast kiuweta 3 wska¬ zuje, ze przez dodanie 10 U oksydazy askorbinianowej zaklócenie zostaje usuniete calkowicie.Przyklad VII. Oznaczanie pirokatechiny za po¬ moca 3-metylo-6-potasosulfonylobenzotiazolonohydrazonu- -2 i oksydazy dwufenylowej. 1 Kiuweta Nr Bufor fosfoanowy, pH 5,2; 0,25 mola 3-metylo-6-potasosulfonyloben- zotiazolonohydrazon-2 0,1 Pirokatechina 0,5 mola Roztwór soli kwasu askorbino¬ wego 20 mmoli Oksydaza askorbinianowa 500 U/ml 1 2,80 0,05 0,10 — — 2 2,70 0,05 0,10 0,1 — 3 2,68 0,05 0,10 0,1 0,02 1 inkubacja przez 1 minute w temperaturze 25 °C, od- | czytanie Ela dzialanie oksydaza dwufenolowa 200 U/ml | 0,05 | 0,05 | 0,05 | inkubacja przez 17 minut w temperaturze 25 °C, od- | czytanie E2, obliczenie AE z E2—E AE | i | 0,890| 0,485| 0,89ó| Kiuweta 1 odpowiada pomiarowi niezaklóconemu, kiu¬ weta 2 wykazuje obnizenie wyniku o 47% spowodowane przez 2 umole soli kwasu askorbinowego, zas kiuweta 3 wykazuje calkowite usuniecie tego zaklócenia przez do¬ datek 10 U oksydazy askorbinianowej. PL PL PL PL PL

Claims (1)

1.