PL109646B1 - Method of making weakened infectious virus graft causing stomach and bowels inflamation - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania oslabionego szczepu wirusa zakaznego zapalenia zoladka i jelit (TGE), stosowanego do wytwarzania szczepionki, która moze byc stosowana do ochrony swin, a zwlaszcza prosiat przed ta choroba.TGE jest wysoce zakazna choroba swin, wyste¬ pujaca prawie na calym swiecie i powodujaca zna¬ czne straty w hodowli. TGE jest prawie zawsze smiertelne dla prosiat zakazonych w pierwszych tygodniach zycia. Poniewaz uodpornienie czynne prosiat w tym wieku nie jest mozliwe, od pewne¬ go czasu czynione sa próby nadawania prosietom odpornosci biernej, poprzez maciore.Z nielicznych doniesien wiadomo, ze prosietom mozna nadac odpornosc bierna poprzez siare zwie¬ rzecia macierzystego (belgijski opis patentowy nr 669 881). Ostatnie doniesienia mówia, ze odpornosc bierna u prosiat mozna wywolac doustnym zakaze¬ niem maciory zjadliwym wirusem TGE, jednakze próby osiagniecia tego celu przy uzyciu wiruso¬ wych szczepów, oslabionych pasazami, w hodowli komórkowej zawiodly lub daly jedynie ograniczo¬ ny stopien ochrony (Infection and Immunity, 1976 str. 1642^1646). Jest to spowodowane tym, ze przy takich seryjnych pasazach znacznie zmniejsza sie nie tylko zjadliwosc wirusa, lecz równiez jego zdol¬ nosc nadawania odpornosci.Poniewaz zakazenie macior wirusem zjadliwym jest zwiazane z duzym ryzykiem, taki sposób 2 ochrony prosiat przeciw TGE jest niepozadany i niedopuszczalny.Nieoczekiwanie stwierdzono, co stanowi przed¬ miot wynalazku, ze mozliwe jest, uzyskanie osla¬ bionego, niezjadliwego, majacego zdolnosc nadawa¬ nia odpornosci wirusa TGE, przez poddanie zjadli¬ wego wirusa TGE bardzo duzej liczbie kolejnych pasazy seryjnych na hodowlach tkankowych tar¬ czycy.W szczególnosci stwierdzono, ze oslabiony, nie- chorobotwórczy, majacy zdolnosc nadawania od¬ pornosci szczep wirusa TGE otrzymuje sie, pod¬ dajac wirusa zjadliwego 250—350, korzystnie okolo 300 seryjnych pasazom na hodowlach tkankowych tarczycy swinskiej.Wiadomo, ze odpornosc prosiat przeciw wirusowi TGE, uzyskana poprzez siare swini zakazonej wi¬ rusem zjadliwym zalezy od wytwarzania przeciw¬ ciala IgA (immunoglobuliny A) w gruczolach mle¬ cznych [Amor. J. Vet. Res. 36 (1975), 267—271].Ponadto wykazano, ze wystarczajaca ilosc prze¬ ciwcial IgA jest u maciory wytwarzana jedynie wówczas, gdy wirus namnaza sie na calej lub prawie calej dlugosci jelita cienkiego [E. H. Bohl i inni, Infect. fmmun. 11,(1975), 23—32 i E. H. Bohl i inni, Infect. Immun, 6 (1972), 289—301].Poniewaz ilosc przeciwcial IgA zmniejsza sie po¬ woli [F.J. Bourne i inni, Immunol. 24, (1973), 157— —162], na podstawie oznaczenia ilosci przeciwcial f# IgA, wydzielanych w siarze, mozna ocenic, czy w 10 15 25 109 646^ttru/: ^ 109 646 danym przypadku jest mozliwe dobre uodpornienie bierne.Wirus, oslabiony sposobem wedlug wynalazku, po doustnym podaniu maciorze namnaza sie na calej dlugosci jelita zwierzecia, co powoduje, ze prosieta od tej maciory staja sie w pelni uodpor¬ nione przeciwcialami IgA, zawartymi w siarze, na zakazenie wywolane zjadliwym wirusem TGE.Szczególnie zaskakujace jest stwierdzenie, ze po tak duzej, liczbie pasazy wirus zachowuje zdolnosc nadawania zwierzetom odpornosci.Miana przeciwciala IgA próbek siary oznaczone w próbach zobojetniania osocza, sa przedstawione w ponizszej tablicy 1. Próbki odwirowywano, roz¬ cienczano fizjologicznym roztworem NaCl (1:10) i ogrzewano w ciagu 30 minut w 40°C. Z kolei za pomoca mieszaniny 1:1 1 N HC1 i 2 M kwasu octowego doprowadzano próbki do pH = 4,6—4,65 i mieszano je w ciagu 20 minut. Po odwirowaniu (12 000g, 4°C) w ciagu nocy dializowano je wobec 0,1 M tris- (hydroksymetylo) aminometanu + 0,2 M NaCl, doprowadzonego do pH = 8,0 za pomoca 1 N HCL, zatezano do polowy objetosci w 52/3 poli¬ merze Carbowax (ciezar czasteczkowy 20 000) i na¬ noszono na kolumne (2,5 X 100 cm) z nosnikiem Sephadex- G—200. Elucje prowadzono buforem tris-NaCl, pH = 8,0.Tablica 1 Miano przeciwciala IgA 1 liczba pasazy 2 120 300 350 miano w sferze 1 : 50 1 :30 1 :25 1 : 2,5 Jak wynika z powyzszych danych, po podaniu maciorom wirusa TGE, oslabionego sposobem we¬ dlug wynalazku, po 300 pasazach, miano przeciw¬ cial IgA w siarze jest stosunkowo wysokie.Oslabienie wirusa sposobem wedlug wynalazku przeprowadzono jak nastepuje.Wyjsciowego wirusa zjadliwego wyizolowano z zakazonej swini w „Institut fur Mikrobiologie und Infectionskrankheiten der Tiere" w Monachium Ten bardzo zjadliwy szczep wirusa, dalej oznacza¬ ny symbolem B-l, izolowano bezposrednio na tkan¬ ke swinskiej tarczycy.Kultury tkankowe tarczycy swinskiej sporzadza¬ no z traczyc, uzyskanych w monachijskiej rzezni.Tarczyce, po usunieciu blony i powierzchniowej sterylizacji (dwukrotnie 952/s alkoholem) pocieto na kawalki wielkosci 1—2 mm i trzykrotnie przemyto w PBS (solanka buforowana fosforanem). Do tak spreparowanego materialu dodano 37% roztworu trypsyna-PBS (bez Ca2+ i Mg2+) i przeprowadzono frakcjowana obróbke trypsyna w 37°C. Dwie pier¬ wsze frakcje trypsyny odrzucono (po obróbce w ciagu godziny), a frakcje 3 i 4 (obróbka w ciagu 1,5 godziny) przesaczono i przechowywano w 4°C Aktywnosc trypsynowa inhibitowano dodaniem osocza.Po zakonczeniu powyzszej obróbki, trypsynowa zawiesine komórkowa wirowano w ciagu 10 minut (500 g). Supernatant odrzucono, a osad zawieszono w PBS i ponownie wirowano. Z kolei osad komó- 5 rek przeniesiono do 10 ml pozywki hodowlanej.Jako pozywke zastosowano roztwór soli Earle'a.Zastosowac mozna w tym celu równiez inne po¬ zywki. Pozywka wzrostowa zawierala 10°/o osocza cielecia, a pozywka zachowawcza 5°/o. Ponadto po¬ lo zywka zawierala w 1 litrze 50 ml hydrolizatu lak- talbuminy i ewentualnie antybiotyk lub kilka an¬ tybiotyków. Hodowle prowadzono w normalnych naczyniach do hodowli tkankowej, np. w plaskich butlach ze szkla lub z tworzywa sztucznego. Po- 15 zywke hodowlana wymieniano po 2—3 dniach. Po 4—6 dniach w 37°C pierwotne hodowle komórkowe byly zwykle pokryte warstwa komórek.Do pasazy szczepu BI wirusa TGE i oznaczania zakaznosci wirusa w róznych czesciach jelita cien¬ ko kiego zastosowano wtórne hodowle komórkowe tarczycy swinskiej. Wtórne hodowle komórkowe uzyskano przez posiew pierwotnych hodowli ko¬ mórkowych w stosunku 1:2.Oslabienie wirusa przeprowadzono za pomoca 25 250—350 seryjnych pasazy na wtórnych komórkach tarczycy swinskiej, w 37°C. Pasaze prowadzono zwyklym sposobem. Na podstawie efektu cytopa- togenicznego i miareczkowania wirusa stwierdzono, ze miano wirusa osiaga zwykle wartosc maksy- 80 malna po inkubacji w ciagu 24—28 godzin.Przedmiot wynalazku jest ilustrowany ponizej na¬ stepujacymi przykladami.Przyklad I. Tarczyce swinska otrzymano ze zwyklych zarznietych swin w rzezni monachijskiej. 35 Transportowanie przeprowadzono za pomoca PBS (solanka buforowana fosforanem), zawierajaca 200 mg nebacetyny i 4 mg amfoterycyny w litrze.Po wyodrebnieniu przeprowadzono sterylizacje r powierzchni (dwukrotnie 95°/o alkoholem), tarczyce 40 cieto na kawalki 1—2 mm i przemywano trzykrot¬ nie PBS.Trypsynowy roztwór PBS w ilosci 0,37% (który byl wolny od Ca2+ i Mg+) dodano do otrzymanych w ten sposób kawalków materialu tkankowego 45 i poddano dzialaniu frakcjonowanej trypsyny w temperaturze 37°C. Pobierano pierwsza frakcje trypsynowa (otrzymana po 1 godzinie dzialania trypsyny), a nastepnie 3—4 frakcje (kazda otrzy¬ mana po 1,5 godziny dzialania trypsyny). 50 Zawiesine komórki-trypsyna osaczono i frakcje przechowywano w temperaturze 4°C. Aktywnosc trypsyny okreslono po dodaniu serum.Na zakonczenie zawiesine komórki—trypsyna odwirowano w czasie 10 minut, otrzymujac 500 g 55 materialu tkankowego. Supernatant oddzielano, a osad powtórnie, rozpuszczano w PBS i odwiro¬ wywano powtórnie. Osad komórkowy wprowadza¬ no do 10 mi roztworu i otrzymane komórki ocenia¬ no za pomoca 1% roztworu blekitu trypanu. «o Stosowano wyjsciowe komórki kulturowe w ste¬ zeniu 500 000 komórek w 1 ml roztworu. Pierwsze dwa dni kultury nie mialy tendencji do rozklada¬ nia na sciankach szklistej warstwy komórek. Sro¬ dowisko zmieniano po 2—3 dniach, chociaz czesto 65 nie bylo to konieczne. Zazwyczaj po 4—6 dniach109 646 6 kultury komórkowe tarczycy swinskiej byly pokry¬ te tkanka nablonkowa. Jezeli nie, kultury odrzu¬ cano.Kultury komórkowe dla subkulturowania wy¬ dzielano ze szklistego nalotu za pomoca roztworu solanka—trypsyna—wersenian, zawierajacego: 100 ml solanki (wolnej od Ca2+ i Mg2+) m 50 ml 1,25% roztworu trypsyny 25 ml 1% roztworu wersenianu 10 ml 8,8% roztworu NaHCOs oraz wode do 1000 ml.Material komórkowy przemywano i zalewano wymienionym roztworem. Po 15 minutach komórki latwo wyodrebniano^ Po odwirowaniu (okolo 500 g w czasie 3 minut) komórki wprowadzano do bute¬ lek i rozdzielano w stosunku 1:2.Przyklad II. Wplyw seryjnego pasazu na tka¬ nke tarczycy swinskiej na zjadliwosc wirusa zba¬ dano na nowonarodzonych prosietach. Do prób brano po 2 prosieta z miotu, podajac im po 2 ml zawiesiny wirusa z pasazu nr 2 (2 X 104 PPU/ml), 120 (2 X 106 PFU/ml), 250 (8 X 106 PFU/ml), 300 (4X X 106 PFU/ml) i 350 (4 X 106 PFU/ml). PFU/ml oznacza liczbe jednostek plytkotwórczyeh w ml.W wieku 1—2 dni zwierzeta doswiadczalne od¬ laczono od macior, które nie mialy preciwcial ne¬ utralizujacych wirusa TGE i karmiono je z butel¬ ki. W drugim dniu zycia prosieta zakazono doust¬ nie podaniem 2 ml jednej z powyzszych zawiesin 10 15 20 25 seryjnie pasazowanego wirusa. Dziesieciu prosie¬ tom kontrolnym dano po 2 ml pozywki hodowla¬ nej.Kliniczny przebieg choroby sprawdzano 2 razy dziennie. Prosietom, które przezyly, pobrano 10 dnia krew na oznaczenie przeciwcial. Oznaczenia przeprowadzono metoda mikromiareczkowania [K.H. Witte, Aren. ges. Virusforsch. 33 (1971), 171—, —176].Otrzymane wyniki przedstawiono w tablicy 2.Pierwsze objawy biegunki obserwowano po uply¬ wie czasu inkubacji. Wymioty wystapily tylko u prosiat, które otrzymaly wirusa z drugiego pasazu.Dla tego pasazu czas inkubacji wynosil 16—18 go¬ dzin. Przy wyzszych poziomach pasazowania na¬ stepowalo wydluzenie czasu inkubacji wzrastajace do 80 godzin przy pasazu nr 300.Po zakazeniu wirusem z pasazu nr Z, 120 i 250, zwierzeta dostaly biegunki, która trwala kilka dni.Prosieta, które otrzymaly wirusa z pasazu nr 300 mialy stolec o rozrzedzonej konsystencji jedynie* w ciagu kilku dni, natomiast te, które otrzymaly wirusa z pasazu nr 300, nie wykazaly zadnych ob¬ jawów choroby.Prosieta, zakazone szczepem wirusa z pasazu nr % padly w 1—2 dni po zakazeniu. Zadne z pro¬ siat (6) nie przezylo zakazenia wirusem po 120 pa¬ sazach. Z czterech prosiat, zakazonych wirusem po 250 pasazach, przezylo jedno. Przezyly wszyst- Tablica 2 Liczba pasazy 2 120 250 300 350 1 Nr prosiecia 13 14 15 16 17 18 19 20 85 86 87 88 51 92 53 54 76 77 78 79 80 81 82 83 Kliniczne objawy w dniu 1 || 2 — — — MMMM — — MMMM 3 | 4 | 5 X + + + + + + + + + + — — — X + + + + + + + + + + + 4- + + + + + — — + + + + + + + + -' + + , + + + + + + + + + + - + + + + + A — 6 X + + + + + + + + X +¦+ + +'+ X . + + + (+) (+) (+) (+) — 7 . + + X X + + X + + + — — 8 ^ + + + X X — 9 X 1 10 - 1 1 1 1 1 :128 8 16 . 4 .64 *»- | + do +++ biegunka slaba do silnej x martwe — brak objawów109 646 * kie prosieta, zakazone wirusem po 300 i 350 pasazach.Z powyzszych danych wynika, ze do 250 pasazy nastepuje jedynie niewielkie oslabienie zjadliwosci.Zakazenie takim wirusem zwykle powoduje wysta¬ pienie powaznych objawów chorobowych i^|mierc.Przyklad III. Przyklad ten ma na celu okre¬ slenie, w jakim odcinku jelita cienkiego nastepuje namnazanie wirusa, oslabionego sposobem wedlug wynalazku, w zaleznosci od liczby pasazy. W tym celu nowonarodzonym prosietom podano zawiesiny wirusa ^po liczbie pasazy jak w doswiadczeniu A i w identyczny jak w tym doswiadczeniu spo¬ sób. Natychmiast po zaobserwowaniu pierwszych objawów typowego zakazenia wirusem TGE, pro¬ sieta, które byly przetrzymywane w izolacji i za¬ kazane indywidualnie, zostaly usmiercone. Pobrano z nich lacznie 10 próbek jelita cienkiego, w rów¬ nych odstepach po 25—35 cm, poczawszy od dwu¬ nastnicy. Próbek tych uzyto do oznaczenia miana wirusa, rozprzestrzenionego w róznych czesciach jelita cienkiego. Miano oznaczono po homogenizacji próbki w mozdzierzu i wirowaniu 10°/o zawiesiny w PBS.Z odwirowanej cieczy sporzadzono 10-kiotiie rozcienczenia i kazdym z nich, w ilosci po 0,2 ml, 10 IB inkubowano po 4 probówki hodowlane z komórka¬ mi tarczycy swinskiej. Po inkubacji w ciagu 7 dni w 37°C odczytano efekt cytopatogenetyczny i ozna¬ czono miano metoda Karbera [Naunyn-Schmiede- bergs Arch. Exp. Pathol. Pharmokol. 162 (1931) 480—482].Otrzymane wyniki przedstawiono w tablicy 3.Jak wynika z danych przedstawionych w tabli¬ cy 3, zjadliwy wirus z pasazu nr 2 namnazal sie na calej dlugosci jelita cienkiego, z wyjatkiem dwu¬ nastnicy. To samo dotyczy wirusa z pasazu nr 120 i 250. Dla wirusa z pasazu nr 2 miano wynosilo od 0,5 do 1,0 log 10 TCID58/0,2 ml, natomiast dla wi¬ rusa po pasazu nr 120 od 2,0 do 4,0 i 4,5 log 10 TCID50/0,2 ml. Podobne miana znaleziono dla pasazy nr 250 i 300. Natomiast w przypadku pasazu nr 350 namnazanie wirusa moglo byc wykazanie jedynie w srodkoWej czesci jelita ciekiego..Przyklad IV. Przyklad ten wykazal, ze wi¬ rus po 300 pasazach, otrzymany sposobem wedlug wynalazku, podany ciezarnej maciorze, skutecznie chroni prosieta przed zakazeniem zjadliwym wi¬ rusem TGE ze szczepu Millera.Doswiadczenie prowadzono z dwoma grupami, obejmujacymi lacznie 13 macior. W momencie Tablica 3 Liczba pasazy i 2 120 «. 250 ^ Czas inkubacji 2 16 godzin (dosw. 1) 18 godzin (dosw. 2) 30 godzin (dosw. 1) b 34 godziny (dosw. 2) 40 godzin (dosw. 1) 52 godziny (dosw. 2) Miano wirusa w od¬ cinku jelita nr 3 1 : nieoznaczalne 2 :0,5 3 :0,5 4 :0,5 5 :1,0 6 : 0,5 7 : 0,5 8:0,5 9 :0,5 10 :0,5 1 :2,0 2 :2,5 3 :2,5 4 :3,5 5 :3,0 6 :4,5 . 7:3,0 8 : 2,5 9 :3,0 10 :2,5 1 : nieoznaczalne 2 :1,5 3:1,5 4 :2,0 5 :3,0 6 : 2,0 7 : 2,5 8 : 3,5 9 :2,5 10 :2,5 Liczba pasazy i 300 350 Czas inkubacji 2 76 godzin (dosw. 1) 80 godzin (dosw. 2) brak objawów kontrola nie zakazona brak objawów Miano wirusa w od¬ cinku jelita nr 5 1 : 1,5 2 : 1,0 3 : 3,0 4 : 3,0 5 : 4,0 6 : 3,5 7 : 2,5 8 :3,5 9 : 3,5 10 : 4,5 1 : nieoznaczalne 2 : nieoznaczalne 3 : nieoznaczalne 4: nieoznaczalne 5 :2,5 6 : 3,0 7 :0,5 8 : nieoznaczalne 9 : nieoznaczalne 10 -.nieoznaczalne 1—10 : nieoznaczalne9 109 M« 10 rozpoczecia doswiadczenia wszystkie maciory byly wolne od przeciwcial wirusa TGE.Grupa I obejmowala 8 macior uodpornionych doustnie dwukrotnie w okolo 5 tygodni oraz 2 ty¬ godnie przed przewidywanym porodem. Uodpornie¬ nie przeprowadzono doustnie przez podawanie 4 ml zawierajacego wirusa materialu, znajdujacego sie w kapsulce kwasoodpornej.Grupa II obejmowala 4 maciory, które otrzymy¬ waly polowe dawki doustnej (2 ml) w kapsulce oraz polowe donosowo. Material, zawierajacy wi¬ rus, byl nieszkodliwy wobec macior. Jedna ma¬ ciore stosowano jako kontrolna, przy czym maciora ta nie otrzymala wirusa.Tablica 4 Miano neutralizujace osocza maciory i prosiat po biernym uodpornieniu pasazem nr 300 szczepu TGE BI i liczba prosiat zyjacych 15 dni po narodzeniu Maciora nr | 1 Grupa I 15 22 23 25 26 39 42 44 | Grupa II 17 29 33 35 1 45 kontrolna Miano1) 1 dzien po narodzeniu 2 A 8 B < 1 A 16 B < 1 A 32 B < 1 A 32 B < 1 A 4 B < 1 A 16 B< 1 A 2 B < 1 A 64 B < 1 A 16 B < 1 A 32 B < 1 A 128 B< 1 A 16 B < 1 A< 1 B<1 Miano1) dzien po narodzeniu prosiecia 3 3 16 8—32 16 2—8 32 16—128 64 16—128 4 1—4 16 2—32 2 2 64 16—256 16 16—32 32 16—64 256 256—512 16 16—32 < 1 < 1 7 4 . 32 16—32 8 2—16 64 8—128 64 16—64 4 2—4 32 8—32 16 2—32 256 128—256 64 4^-32 128 2—64 128 128—256 64 4^16 ¦<1 14 5 64 8—16 156 2—16 128 16—64 64 4—32 64 8—64 256 32—128 256 4—256 16 8—16 32 4—32 256 128—256 128 16—128 64 8—32 128 Prosieta narodzone/ /zywe po zaka¬ zeniu 6 | 4/4 11/7 10/10 11/11 6/5 8/7 6/4 7/7 5/5 7/6 9/9 3/3 6/0 Uwagi: Miano 1 oznacza calkowite zobojetnienie przez nierozcienczone serum.A —serum maciory B —serum prosiecia Zjadliwego wirusa testowego szczepu Millera wi¬ rusa TGE otrzymano, wprowadzajac 10% zawiesine w PBS drobno roztartego jelita cienkiego z wirusem po trzech pasazach przez prosieta. Po odwirowaniu 5 . podzieleniu na porcje objetosci po 2 ml i zamroze¬ niu do temperatury —70°C, powyzszy material sto¬ sowano do zakazania wszystkich prosiat, pochodza¬ cych: z 13 macior w trzecim dniu zycia. W tym celu podawano kazdemu prosieciu po 1 ml zawie- 10 siny, która byla rozcienczone tak, ze zawierala 100—1000 PID. PID oznacza dawke zakazajaca pro¬ siecia.Otrzymane wyniki przedstawiono w tablicy 4.11 Po zakazeniu wirusem zlosliwym szczepu Millera 55 z 63 prosiat, tj. 87% z grupy I przezylo to za¬ kazenie. W grupie II 23 z 24 prosiat przezylo.Jednakze wszystkie 6 prosiat z grupy kontrolnej padlo w ciagu 7 dni po narodzeniu.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania oslabionego wirusa za¬ kaznego zapalenia zoladka i jelit, znamienny tym, 0 646 12 ze zjadliwy szczep tego wirusa TGE izoluje sie bez¬ posrednio na tkanke tarczycy swinskiej i poddaje 250—300 pasazom w temperaturze 37°C. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze 5 jako zjadliwy szczep wirusa stosuje sie szczep BI. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w kazdym pasazu wirus inkubuje sie w temperatu¬ rze 37°C, w ciagu 1—2 dni, oddziela ciecz zawiera¬ jaca wirus i poddaje ja nastepnym pasazom na 10 komórkach tarczycy swinskiej.WZGraf. Z-d 2, zam. 20/81, nakt. 90.Cena 45 zl. PL PL PL

Claims (3)

1.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania oslabionego wirusa za¬ kaznego zapalenia zoladka i jelit, znamienny tym, 0 646 12 ze zjadliwy szczep tego wirusa TGE izoluje sie bez¬ posrednio na tkanke tarczycy swinskiej i poddaje 250—300 pasazom w temperaturze 37°C.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze 5 jako zjadliwy szczep wirusa stosuje sie szczep BI.

3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w kazdym pasazu wirus inkubuje sie w temperatu¬ rze 37°C, w ciagu 1—2 dni, oddziela ciecz zawiera¬ jaca wirus i poddaje ja nastepnym pasazom na 10 komórkach tarczycy swinskiej. WZGraf. Z-d 2, zam. 20/81, nakt. 90. Cena 45 zl. PL PL PL