Opis patentowy opublikowano: 31.01.1984 121296 Int. Cl.* C07J 5/00 C12P 33/08 C12R 1/645 Twórca wynalazku — Uprawniony z patentu: Schering Aktiengesellschaft, Bergkamen (Repub¬ lika Federalna Niemiec i Berlin Zachodni) Sposób wytwarzania nowych kortykoidów Przedmiotem wedlug wynalazku jest sposób wy¬ twarzania nowych kortykoidów.Wiadomo, ze w przypadku przeciwzapalnie czyn¬ nych 17 a-hydroksykortykoidów mozna podwyz¬ szyc ich skutecznosc miejscowa, jezeli zestryfikuje sie ich grupy 17-hydroksylowe [porównaj problemo¬ wy referat autorów: Thomas L. Popper i Arthur S.Watnick, w „Antiinflammatory Steroida in Anti- inflammatory Agents", tom 1, wyd. Academic Press, New York, San Francisco, London (1974), strony 268—271].Stwierdzono obecnie, ze skutecznosc miejscowa i/lub zróznicowanie miedzy zadanym miejscowym dzialaniem przeciwzapalnym, a niepozadanym dzia¬ laniem ukladowym mozna jeszcze zwiekszyc, jesli atom wodoru z grup 17 a-hydroksylowych tych kortykoidów podstawi sie nie przez ester, lecz przez grupe acetalu lub grupe tioacetalu.Sposobem wedlug wynalazku wytwarza sie wiec nowe kortykoidy o ogólnym wzorze 1, w którym wiazania oznaczaja wiazania pojedyncze lub podwójne, X oznacza atom wodoru, atom fluoru, atom chloru lub grupe metylowa, W oznacza grupe metylenowa, grupe etylidenowa lub grupe winyli- denowa, Ri oznacza grupe alkilowa o 1—6 atomach wegla, ewentualnie przedzielona atomem tlenu, R2 oznacza atom wodoru lub grupe alkilowa o 1—4 atomach wegla, albo Ri i R2 razem tworza grupe czterometylenowa, a R4 oznacza atom wodoru lub grupe hydroksylowa, 15 20 25 30 Nowe kortykoidy o ogólnym wzorze 1 moga jako podstawniki Ri zawierac prostolancuchowy lub roz¬ galeziony rodnik alkilowy o 1—6 atomach wegla.Takimi rodnikami alkilowymi sa np. rodniki mety¬ lowy, etylowy, propylowy, izopropylowy, butylowy, izobutylowy lub heksylowy. Rodnik alkilowy pod- stawnika Ri moze byc przedzielony takze atomem tlenu. Takimi rodnikami sa np. grupa 2-metoksy- etoksylowa, 3-metoksypropyloksylowa lub 2-eto- ksyetoksylowa.Kortykoidy o ogólnym wzorze 1 moga jako pod¬ stawniki R2 wykazywac grupy alkilowe o 1—4 ato¬ mach wegla, takie jak grupa: metylowa, etylowa, propylowa lub butylowa. Godnymi uwagi sa te kortykoidy o ogólnym wzorze 1, w którym R2 sta¬ nowi atom wodoru, gdyz nie moga one tworzyc zadnych mieszanin diastereoizomerów.Rozpoczecie dzialania i czas trwania dzialania nowych kortykoidów oraz ich rozpuszczalnosc w fizjologicznie dopuszczalnych rozpuszczalnikach sa, podobnie jak w przypadku znanych kortykoidów, zalezne od tego, czy i ewentualnie jakim kwasem jest zestryfikowana grupa hydroksylowa, zajmu¬ jaca polozenie-21.Sposób wytwarzania nowych 11 ^-hydrdksystero¬ idów o ogólnym wzorze 1, w którym , *X, W, Ri R2 i R4 maja wyzej podane znaczenie, polega wed¬ lug wynalazku na tym, ze 11-dezoksysteroid o ogól¬ nym wzorze 2, w którym X, W, Q, Ri i R2 maja wyzej podane znaczenie, a R4' oznacza atom wo- 121296121 296 3 tforu, grupe hydroksylowa lub grupe alkanokarbo- nyloksylowa o 1—6 atomach wegla, poddaje sie ftfcttentacji za pomoca hodowli grzyba z rodzaju CtffrftUatfa, korzystnie grzyba z gatunku Curvularia lun^|s^fe|tE2ymany zwiazek o wzorze Id, w któ¬ rym ..J^iyjLaeza wiazanie pojedyncze, ewentualnie odwodóniia%fce^*4)olpi;eniu-l,2.Dalazym aspektem wynikajacym ze sposobu wy¬ twarzania nowych* kottykoidów o ogólnym wzo¬ rze 1 jest sposób Wytwarzania cennych steroidów o ogólnym wzorze odpowiadajacym wzorowi 1, lecz w którym w polozenIu-17 wystepuje niepodstawio¬ na grupa hydroksylowa i w którym X, W i R4 maja wyzej* podane znaczenie, polegajacy na tym, ze jako substancje wyjsciowa stosuje sie nowy EstereOid o Ogólnym wzorze 1, w któ- czenie.Wiadomo, ze p: ksysUeWfc^ibHattti 3pys|kie-«3lnbole maja wyzej podane zna- eciwzapalnie czynne 11 /?-hydro- jak kortykoidy o nazwach han- ^rtison, Prednisolon, Dexametha- son, "8$tamethason, Triamcinolon, Fluocinolon lub Jftp^^drenolon) wytwarza sie za pomoca bardzo fesztoWraej wieloetapowej syntezy czastkowej z na- turafasc wystepujacych steroidów (ja'k Diosgenina), coraz trudniejszych do uzyskania w wystarczajacej ilosci. W wieloetapowej syntezie tych zwiazków mikrobiologiczne wprowadzenie grupy 11 ^-hydro¬ ksylowej do struktury steroidu jest z reguly naj¬ kosztowniejszym i powodujacym najwieksze straty etapem syntezy.W roku 1966 opracowano sposób, za pomoca któ¬ rego mozna wydajnosc 11 jff-hydroksylowania 11-de- zoksy-17 ^hydrctóyfeteroidów szeregu pregnanu znacznie podwyzafcyc, estryfikujac grupe 17 a-hyd- roksylowa, nastepnie hydroksylujac za pomoca grzyba 3? rodzaju Cur^ujaria i zmydlajac otrzyma¬ ny 11 /Miydroksy-17 a-acyloksysteroid (porównaj opis patentowy RFN nr 1618599).Acylowanie grupy 17-hydroksylowej jest jednak rzeczywiscie kosztowne, gdyz osiagane przy tym wydajnosci sa niezadowalajace.Trudna jest tez hydroliza tych 11 /?-hydroksy- 17 a-acyloksysteroidów, gdyz przewaznie tworza sie produkty uboczne, a tym samym otrzymane produkty wymagaja kosztownego i powodujacego straty oczyszczania, by odpowiadaly one kryterium czystosci wymaganym od substancji czynnych w lekarstwach.W omawianym sposobie wedlug wynalazku sto¬ suje sie natomiast wyjsciowe steroidy, które mozna wytwarzac z wysoka wydajnoscia z odpowiednich 17-hydroksysteroidów, a otrzymane produkty spo¬ sobu mozna szybko i i^pciowo hydrolizowac do odpowiednich 11 ^^T^H^wl^ydroksysteroidów.Steroidy stosowane T^ggposobie wedlug wyna¬ lazku nl°^vb^a^a3JS«iy jposób podstawione i/lub moga', zaw-fer?|^raiania podwójne.Obecnosc ^Sp^^ydroksylowych lub acyloksylo- wych, np. w |Mjili»jiiii "1, obecnosc atomów chlo¬ rowca, korzystnie a$Qmów fluoru, grup metylowych lub metylenowych, np. w polozeniu-6 i/lub -16, nie wywiera wplywu na przeprowadzalnosc sposobu wedlug wynalazku. W sposobie wedlug wynalazku stosuje sie korzystnie takie steroidy jako zwiazki 10 20 25 30 35 40 50 55 60 wyjsciowe, które w polozeniu-3 wykazuja grupe keto, a w polozeniu-4,5 wiazanie podwójne.Pomijajac stosowanie innych zwiazków wyjscio¬ wych przeprowadza sie sposób wedlug wynalazku w warunkach, które zazwyczaj stosuje sie do 11 (j- -hydrófcsylowania. steroidów za pomoca grzybów z ro&zaju Curvuiaria.Odpowiednimi^óhydroksylowania grzybami z ro¬ dzaju Curyularia sa np. Curvularia falcuta OM-102 H, Curvularia genticulata 1FO (6284), Curvularia lunata NRRL 2380, ATCC 12017 lub IFO (6286) albo Curvularia maculans IPO (0292).Nalezy wspomniec, ze równiez inne mikroorga¬ nizmy niz z rodzaju Curvularia nadaja sie do prze-, prowadzania sposobu, lecz to z reguly nie daje ko¬ rzysci w porównaniu ze sposobem wedlug wyna¬ lazku.W warunkach hodowli zwykle stosowanych dla tych mikroorganizmów hoduje sie w odpowiedniej pozywce wobec napowietrzania hodowle zanurzo¬ na. Do hodowli dodaje sie nastepnie substrat (roz¬ puszczony w odpowiednim rozpuszczalniku lub ko¬ rzystnie w postaci zemulgowanej) i poddaje fer¬ mentacji do chwili- gdy osiagniete zostanie maksy¬ malne przeksztalcenie substratu.Odpowiednimi rozpuszczalnikami dla substratu sa np. metanol, etanol, eter jednometylowy glikolu etylenowego, dwumetyloformamid, lub sulfotlenek dwumetylowy. Zemulgowanie substratu mozna przeprowadzic np. w ten sposób, ze przez dysze w warunkach burzliwosci wtryskuje sie go w pos¬ taci zmikronizowanej lub w postaci roztworu w rozpuszczalniku, mieszajacym sie z woda (takim jak metanol, etanol, aceton, eter jednometylowy glikolu etylenowego, dwumetyloformamid lub sul¬ fotlenek dwumetylowy), do wody, która zawiera znane pomocnicze substancje emulgujace. Odpo¬ wiednimi pomocniczymi substancjami emulgujacy¬ mi sa niejonowe emulgatory, takie jak addukty tlenku etylenu lub estry kwasu tluszczowego z gli¬ kolami polietylenowymi. Do odpowiednich emulga¬ torów zaliczaja sie takie handlowe zwilzacze, jak np. Tegin(R), TagatW, TweenTO i Span(R).Zemulgowanie substratu umozliwia czesto pod¬ wyzsza przemiane substratu, a tym samym pod¬ wyzszenie stezenia substratu. Oczywiscie mozliwe jest stosowanie w sposobie wedlug wynalazku takze innych metod podwyzszania przemiany sub¬ stratu, znanych fachowcom z dziedziny fermen¬ tacji.Optymalne stezenie substratu, czas dodawania substratu i czas trwania fermentacji jest zalezny od struktury stosowanego substratu i od gatunku stosowanego mikroorganizmu. Wielkosci te, jak to na ogól w mikrobiologicznych przemianach ste¬ roidów jest potrzebne, musza byc w poszczególnych przypadkach okreslane na drodze prób wstepnych, znanych fachowcom.Jako ewentualny srodek techntezay nastepujace kolejno odwodoraienie ;»asyconego w polozeniu-1 J4-steroidu o ogólnym wzorze 1 mozna przeprowa¬ dzac zarówno za pomoca mikrobiologicznych metod postepowania jak i za pomoca metod czysto che¬ micznych. I tak np. 44-steroidy oclwodornia sie w polozeniu-1 w znanych warunkach za pomoca121 296 5 6 hodowli bakterii z rodzaju Bacillus /np. Bacillus lentus lub Bacillus sphaericus/lub z rodzaju Arthro- bacter (np. Arthrobacter simplex.) Nadto mozliwe jest przeprowadzenie ^-odwodornienia w taki sposób, ze te AA steroidy ogrzewa sie w srodowisku obo¬ jetnych rozpuszczalników z praktykowanymi w tej reakcji utleniaczami, takimi jak dwutlenek selenu lub 2,3-dwuchloro-5,6-cwucyjanobenzochinon.Otrzymane produkty sposobu mozna latwo roz¬ szczepiac na odpowiednie 11 ^,17 a,21-trcjhydroksy- steroidy.To rozszczepianie przeprowadza sie w warun¬ kach, które konwencjonalnie stosuje sie w hydro¬ lizie lub alkoholizie acetali. I tak np. zwiazki te rozszczepia sie poddajac je reakcji w srodowisku nizszego alkoholu, takiego jak metanol lub etanol, albo w srodowisku zawierajacego wode rozpusz¬ czalnika organicznego, takiego jak eter jednomety- lowy glikolu etylenowego, czterowodorofuran, diok¬ san, dwumet loformamid, sulfotlenek dwumetylo- wy, szesciometylotrójamid kwasu fosforowego lub aceton, z kwasem mineralnym, takim jak kwas sjI- ny, siarkowy, fosforowy lub nadchlorowy, z kwa¬ sem sulfonowym, takim jak kwas p-toluenosulfo¬ nowy, z mocno kwasnym kwasem karboksylo¬ we m, takim jak kwas mrówkowy, octowy, trójflu- orooctowy lub kwasny jonit, albo z kwasem Lewis'a, takim jak trójfluorek boru, chlorek cynku, bromek cynku lub czterochlorek tytanu.Nowe kortykoidy o ogólnym wzorze 1, jak juz wspomniano, odznaczaja sie przy aplikowaniu miejscowym silna skutecznoscia przeciwzapalna i wykazuja bardzo korzystne zróznicowanie miedzy zadanym dzialaniem miejscowym, a niepozadanym ubocznym dzialaniem ukladowym.Czynnosc miejscowa mozna okreslac za pomoca testu zwezenia naczyn, omówionego nizej: Próbe te przeprowadza sie na grupach po 8 osob¬ ników badanych obu plci, którzy w ostatnich dwóch tygodniach nie otrzymali zadnego miejsco¬ wego leczenia kortykosteroidowego. Po usunieciu Stratum corneum az do Stratum lucidum na plecy osobnika badanego (20—40 oderwan blonki o naz¬ wie Tesafilm) nanosi sie po 0,1 g preparatu na pole o powierzchni 4 cm2 bez opatrunku tamuja¬ cego. Ten sam preparat aplikuje sie kazdorazowo na identyczny obszar skóry w kolejnosci wirowej.Zwezenie naczyn ocenia sie wizualnie po uply¬ wie 4 i 8 godzin przez badajacego wedlug naste¬ pujacych stopni dzialania: 1 — absolutne zblednie¬ cie, 2 = nieznaczny rumien resztkowy, 3 = sredni stopien rumienia, intensywnosc zaczerwienienia w zakresie srednim skóry odslonietej, nieleczonej i nie uszkodzonej, 4 = rumien z nieznacznymi roz¬ jasnieniami, 5 = brak zbledniecia lub wzmocnienia rumienia.Poszczególne oceny podano jako wyniki srednie.W kazdym szeregu prób jako substancje spraw¬ dzianowa stosuje sie 21-walerianian dwufluorokor- tolonu (tó jest 6 a,9a-dwufluoro-ll /?-hydroksy- -16 a-metylo - 21-waleryloksypregnadieno -1,4 - dion- -3,20 = DFV).Kazdorazowo okresla sie róznice A okreslonych w poszczególnych szeregach prób, srednich stopni dzialania DFV i substancji badanej. Dodatnie róz¬ nice A wskazuja na korzystniejsza, a ujemne róz¬ nice wskazuja na niekorzystniejsza ocene substancji badanej w porównaniu z substancja sprawdziano¬ wa DFV.W podanych nizej tablicach 1—3 wyszczególniono zaobserwowane wyniki prób, oznaczone podczas le¬ czenia osobników doswiadczalnych preparatem za¬ wierajacym 0,1 ppm (czesci na milion) substancji czynnej.Czynnosc ukladowa tych zwiazków mozna okres¬ lac za pomoca testu adjuwant-obrzek, omówionego nizej. Szczurom SPF o ciezarze 130—150 g w celu wywolania ogniska zapalnego wstrzykuje sie w prawa tylna lape 0,1 ml 0,5% zawiesiny Mycobac- terium butyricum (otrzymanej z amerykanskiej firmy Difko). Przed wstrzyknieciem mierzy sie objetosc lap szczurów. Po uplywie 24 godzin od wstrzykniecia ponownie mierzy sie objetosc lap w celu okreslenia rozmiaru obrzeku. Nastepnie aplikuje sie szczurom doustnie lub podskórnie róz¬ ne ilosci substancji badanej, rozpuszczonej w mie¬ szaninie 29% benzoesu benzylu i 71% oleju racz- nikowego. Po uplywie dalszych 24 godzin ponow¬ nie okresla sie objetosc lap.Zwierzeta sprawdzianowe traktuje sie w taki sam sposób, lecz z ta róznica, ze wstrzykuje sie im mieszanine benzoesanu benzylowego i oleju raczni- kowego, nie zawierajaca substancji badanej.Z otrzymanych objetosci lap okresla sie w znany sposób ilosc substancji badanej, która jest niezbed¬ na do tego, by uzyskac 50% zmniejszenie, objetosci wywolanego eksperymentalnie obrzeku lap.W podanych nizej tabelach 1—3 wyszczególniono otrzymane wyniki prób, przy czym kazdorazowo nowe substancje wytworzone sposobem wedlug wynalazku porównywano z analogicznymi, najbliz¬ szymi strukturalnie, znajdujacymi sie w handlo¬ wych preparatach, uprzednio znanymi kortykoida- mi. Ze wzgledu na zupelnie inny charakter zwiaz¬ ków wyjsciowych o wzorze 2 przeprowadzenie po¬ równania z nimi farmakologicznych wlasciwosci produktów o wzorze 1 nie bylo mozliwe. 10 15 20 25 30 35 40 45121 296 7 8 Tabela 1 Wyniki testu pochodnych hydrokortyzonu Nr 1 2 3 4 s 5. 6 7 Substancja 17 a-butyryloksy-11 /?,21-dwuhyd- roksy-pregneno-4-dion-3,20 (=Hydrocortison-17-butyrat) 11 #21-dwuhydroksy-17 a-meto- ksymetoksy-pregneno-4-dion-3,20 17 a-etoksymetoksy-11 /?,21-dwu- hydroksy-pregneno-4-dion-3,20 11 /?,21-dwuhydroksy-17 a-propo- ksymetaksy-pregneno-4-dion-3,20 11 /?,21-dwuhydroksy-17 a-izopro- poksymetoksy-pregneno-4- -dion-3,20 17 a-butoksymetoksy-11 /?,21-dwu- hydroksy-pregneno-4-dion-3,20 11 #21-dwuhydroksy-17 a-(2'-czte- rowodoropiranyloksy)-pregneno- -4-dion-3,20 Test zwezenia naczyn A po 4 godzinach -0,2 +0,3 0,0 +0,4 +0,9 +0,9 +0,8 A po 8 godzinach —0,3 +0,7 + 0,7 +0,4 +0,5 +0,6 + 0,6 Test adjuwant-obrzek (mg/kg zwierzecia) ED5o doustnie 54 67 EDso podskórnie 13 13 14,5 okolo 10 30(42Vo) 20 12 Tabela 2 Wyniki testu pochodnych prednisolonu Nr 8 ' 9 Substancja 11 #17 «,21-trójhydroksy-pregna- dieno-4-dion-3,20 (=Prednisolon) 11 #21-dwuhydroksy-17 a-metoksyme- toksy-pregnadieno-l,4-dion-3,20 Test zwezenia naczyn A po 4 godzinach -0,9 —0,2 A po 8 godzinach —0,8 -0,3 Test adjuwant-obrzek (mg/kg zwierzecia) ED5o doustnie 8,6 9,8 EDso podskórnie 2,6 Tabela 3 Wyniki testu 6-fluoro- i 6-metylokortykoidów Nr 24 25 26 27 Substancja 6 a-fluoro-11 /?,21-dwuhydroksy- 16 a-metylopregnadieno-1,4- dion-3,20 6 a-fluoro-11 /?,21-dwuhydroksy- 17 a-metoksymetoksy-pregneno- -4-dion-3,20 11 #17 a,21-trójhydroksy-6 a-mety- lo-pregnadieno-1,4-dion-3,20 (=6-Methylprednisolon) 11 #21-trójhydroksy-17 a-(l'-me- toksyetoksy)-6 a-metylo-pregne- no-4-dion-3,20 Test zwezenia naczyn A po 4 godzinach —1,1 +0,1 —0,8 +0,6 A po 8 godzinach —0,8 +0,1 —0,9 +0,6 Test adjuwant-obrzek 1 (mg/kg zwierzecia) EDso doustnie 22 EDso 1 podskórnie 3,5 4,09 121 296 10 Te nowe zwiazki w polaczeniu z nosnikami, praktykowanymi w farmacji galenowej, szczególnie nadaja sie do leczenia miejscowego wyprysków kontaktowych, wyprysków róznego rodzaju, neuro- dermatos, erytrodermii, oparzen, Pruritis vulvae et ani, Nosacea, Erythematodes cutaneus, luszczycy, Lichen ruber planus et verrucosus i podobnych schorzen skóry.Sporzadzanie tych leków nastepuje w znany spo¬ sób, droga przeprowadzania tych substancji czyn¬ nych razem z odpowiednimi dodatkami w zadane postacie aplikacyjne, takie jak roztwory, pudry plynne, mascie, kremy lub plastry. W tak sporza¬ dzonych lekarstwach stezenie substancji czynnej jest zalezne od postaci aplikacyjnej. W przypadku pudrów plynnych i masci stosuje sie korzystnie stezenie substancji czynnej 0,001—l°/o.Nadto nowe zwiazki ewentualnie w polaczeniu ze znanymi nosnikami i substancjami pomocniczy¬ mi nadaja sie swietnie do sporzadzania srodków inhalacyjnych, które mozna stosowac w terapii alergicznych schorzen dróg oddechowych, np. w te¬ rapii dychawicy oskrzelowej lub niezytu nosa.Dalej ten nowe kortykoidy takze w postaci kap¬ sulek, tabletek lub drazetek, zawierajacych ko¬ rzystnie 10—200 mg substancji czynnej i aplikowa¬ nych doustnie, albo w postaci zawiesin, zawieraja¬ cych korzystnie 100—500 mg substancji czynnej w dawce jednostkowej i aplikowanych doodbytni¬ czo, nadaja sie równiez do leczenia alergicznych schorzen jelit, takich jak Kolitis ulcerosa i Kolitis granulomatosa.Podane nizej przyklady objasniaja blizej wyna¬ lazek: Przyklad I. a) 21,63 g 3^,21-dwuacetoksy- -17 a-hydroksypregneno-5-onu-20 rozpuszcza sie w .150 ml bezwodnego chlorku metylenu i 100 ml bezwodnego acetalu dwumetylowego formaldehydu.Nastepnie roztwór chlodzi sie woda i wprowadza do niego mieszanine 21,6 g pieciotlenku fosforu i 43 g ziemi okrzemkowej, mieszajac calosc w ciagu 1 godziny w temperaturze pokojowej. Pózniej mie¬ szanine reakcyjna saczy sie, a pozostalosc przemy¬ wa sie chlorkiem metylenu, do przesaczu dodaje sie trójetyloamine az do uzyskania odczynu o wartosci pH=9 i zateza calosc pod próznia. Pozostalosc prze- krystalizowuje sie z ukladu metanol-chlorek mety¬ lenu, otrzymujac 22,68 g 3 /?,21-dwuacetoksy-17 a- -metoksymetoksy-pregneno-5-onu-20o temperaturze topnienia 182—184°C. b) 1 litr jalowego roztworu pozywkowego, zawie¬ rajacego 0,3% wyciagu z drozdzy, 0,3% namoku kukurydzianego i 0,2% cukru gronowego i wyka¬ zujacego odczyn pH—7,0, w kolbie stozkowej o po¬ jemnosci 2 litrów zaszczepia sie hodowle sucha Flavobacterium dehydrogenans ATCC 13930 i wy¬ trzasa w temperaturze 30°C w ciagu 2 dni przy 175 obrotach na minute. 85 ml takiej samej pozywki w kolbie stozkowej o pojemnosci 500 ml zaszczepia sie 10 ml tej ho¬ dowli mikroorganizmu Flavobacterium dehydroge¬ nans i wytrzasa w temperaturze 30°C w ciagu 7 godzin przy 175 obrotach na minute. Do hodowli tej dodaje sie 5 ml jalowego roztworu 0,5 g 3 ^,21-dwuacetoksy -17 a-metoksymetoksy-pregneno- -5-onu-20 w dwumetyloformamidzie i wytrzasa w temperaturze 30°C w ciagu dalszych 65 godzin przy 175 obrotach na minute. Po zaszlej fermentacji ho¬ dowle ekstrahuje sie dwukrotnie porcjami 100 ml chlorku etylenu, ekstrakt zateza sie pod próznia, pozostalosc oczyszcza sie na drodze chromatografii na tlenku glinowym i otrzymuje sie 402 mg 21-hyd- roksy-17 a-metoksymetoksy-pregneno-4-dionu-3,20 o temperaturze topnienia 152—153°C. c) Umieszczony w kolbie stozkowej o pojemnosci 2 litrów, jalowy roztwór pozywkowy w ilosci 1 litra, zawierajacy 2% glikozy i 2% namoku ku¬ kurydzianego i nastawiony na pH=6,5, zaszczepia sie za pomoca splukania suchej hodowli Curvu- laria lunata NRRL 2380 i wytrzasa w temperaturze 30°C w ciagu 60 godzin przy 175 obrotach na mi¬ nute.W kolbie stozkowej o pojemnosci 500 ml umiesz¬ czono 90 ml jalowej pozywki, zawierajacej 1,0% namoku kukurydzianego oraz 1,25% sproszkowanej soi i nastawionej na pH=6,2 zaszczepia sie 10 ml tej hodowli Curvularia lunata i wytrzasa w tem¬ peraturze 30°C w ciagu 7 godzin przy 175 obrotach na minute. Do hodowli tej dodaje sie 0,6 ml jalo¬ wego roztworu 30 mg 21-hydroksy-17 a-metoksy- metoksy-pregneno-4-dionu-3,20 w dwumetylofor¬ mamidzie i poddaje fermentacji w ciagu dalszych 65 godzin w podanych warunkach.Hodowle fermentacyjna poddaje sie obróbce ana¬ logicznie jak w przykladzie Ib), otrzymujac 27 mg 11/?,21 -dwuhydroksy-17a-metoksymetoksy-pregneno- -4-dionu-3,20 o temperaturze topnienia 180—182°C. d) 2,5 g 11 /?j21-dwuhydroksy-17 a-metoksyme- toksy-pregneno-4-dionu-3,20 rozpuszcza sie w 40 ml bezwodnego chlorku metylenu, chlodzi do tempera¬ tury 0°C i w ciagu 15 minut w atmosferze argonu, zadaje roztworem 2,25 ml czterochlorku tytanu w 10 ml chlorku metylenu. Calosc miesza sie w ciagu 90 minut w temperaturze pokojowej, po czym dodaje sie 150 ml chlorku metylenu i 100 ml na¬ syconego, wodnego roztworu wodoroweglanu sodo¬ wego, miesza sie w ciagu 15 minut, oddziela warstwe organiczna, przemywa ja do odczynu obojetnego, suszy nad siarczanem sodowym i zateza pod próz¬ nia. Pozostalosc przekrystalizowuje sie z chloro¬ formu, otrzymujac 2,19 g 11 /?,17 a,21-trójhydroksy- pregneno-4-dionu-3,20 o temperaturze rozkladu 215°C.Przyklad II. a) 50 g 3 /?,21-dwuacetoksy-17 a- hydroksypregneno-5-onu-20 zadaje sie 50 mg bez¬ wodnego kwasu p-toluenosulfonowego i 350 ml bezwodnego chlorku metylenu, chlodzi do tempe¬ ratury 0°C, a po dodaniu 10 g eteru metylowowiny- lowego miesza sie w ciagu 4 godzin w temperatu¬ rze 0°C. Nastepnie do calosci dodaje sie trójetylo¬ amine az do uzyskania odczynu o wartosci pH=9 i zateza pod próznia. Otrzymuje sie 58 g 3/?,21- -dwuacetoksy-17 a-(l,-metoksyetoksy) - pregneno - 5- -onu-20 w postaci mieszaniny diasteroizomerów o temperaturze topnienia 80—118°C (próbka prze- krystalizowana z metanolu wykazuje temperature topnienia 132—134°C). b) W warunkach przykladu Ib) roztwór 600 mg mieszaniny diastereoizomerów 3 ^,21-dwuacetoksy- -17a-(r-metoksyetoksy)-pregneno-5-onu-20 w 5 ml 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6011 121 296 12 dwumetyloformamidu poddaje sie reakcji z ho¬ dowla Flavobacterium dehydrogenans ATCC 13930, poddaje obróbce i otrzymuje 394 mg 21-hydroksy- -17 a- postaci mieszaniny diastereoizomerów o tempera¬ turze topnienia 166—178°C. c) Roztwór 100 mg mieszaniny diastereoizomerów 21 - hydroksy - 17 a-(l'-metoksyetoksy) - pregneno -4- -dionu-3,20 w 2 ml dwumetyloformamidu, w wa¬ runkach omówionych w przykladzie Ic) fermentuje sie za pomoca hodowli Curvularia lunata NRRL 2380 i poddaje obróbce, otrzymujac 105 mg 11 £21- -dwuhydroksy-17 a-(l'-metoksyetoksy) - pregneno-4- -dionu-3,20 w postaci oleistej mieszaniny diaste¬ reoizomerów.Mieszanine te zadaje sie 3 ml metanolu i 05 ml 2n wodnego roztworu kwasu solnego i wytrzasa w ciagu 5 godzin, w temperaturze pokojowej. Naste¬ pnie do mieszaniny dodaje sie 4 ml wody, zobo¬ jetnia ja nasyconym wodnym roztworem wodoro¬ weglanu sodowego, dwukrotnie ekstrahuje ja por¬ cjami po 8 ml chlorku etylenu, warstwe organiczna zateza sie pod próznia, pozostalosc oczyszcza sie na drodze chromatografii w kolumnie na tlenku gli¬ nowym i otrzymuje sie 69 mg 11 £17 a,21-trójhyd- roksypregneno-4-dionu-3,20 o temperaturze topnie- . nia 217—219°C.Przyklad III. a) 10,0 g 21-acetoksy-17 a-hyd- roksy-pregneno-4-dionu-3,20 zadaje sie 13 mg bez¬ wodnego kwasu p-toluenosulfonowego i 130 ml bezwodnego chlorku metylenu, chlodzi do tempe¬ ratury 0°C, a po dodaniu 2,3 g eteru metylowowi- nylowego miesza sie w ciagu 7 godzin w tempera¬ turze 0°C. Mieszanine reakcyjna poddaje sie ob¬ róbce analogicznej jak w przykladzie Ha) i otrzy¬ muje sie 11,6 g 21-acetoksy-17 a-(l'-metoksyetoksy)- pregneno-4-dionu-3,20 o temperaturze topnienia 135—150°C. b) Roztwór 0,1 g mieszaniny diastereoizomerów 21-acetoksy-17 a-(l'-metoksyetoksy)- pregneno-4-dio- nu-3,20 w 2 ml dwumetyloformamidu, w warun¬ kach analogicznych jak w przykladzie Ic), fermen¬ tuje sie za pomoca hodowli Curvularia lunata NRRL 2380 i poddaje obróbce. Tak otrzymany 11 £21 - dwuhydroksy-17 a-(F-metoksyetoksy) - preg- neno-4-dion-3,20 hydrolizuje sie w warunkach ana¬ logicznych jak w przykladzie lic) i otrzymuje sie 78 mg 11 £17 a,21-trójhydroksypregneno-4-dionu- ^3,20 o temperaturze topnienia 217—219°C.. Przyklad IV. a) 10,0 g 21-acetoksy-17 a-hyd- roksy-pregneno-4^dionu-3,20, w warunkach ana¬ logicznych jak w przykladzie Ilia), poddaje sie reakcji z 2,50 g eteru etylowowinylowego i obróbce, otrzymujac 12,5 g 21-acetoksy-17«-(l,-etoksyeto- ksy)-pregneno-4-dionu-3,20 w postaci oleistej mie¬ szaniny diastereoizomerów. b) Roztwór 0,1 g mieszaniny diastereoizomerów 21-acetoksy-17 a-(r-etoksyetoksy)-pregneno - 4 - dio- mu3,20 w 2 ml dwumetyloformamidzie, w warunkach analogicznych jak w przykladzie Ic), hydroksyluje sie za pomoca Curvularia lunata NRRL 2380 i pod¬ daje obróbce, otrzymujac 17 a-(r-etoksyetoksy)- -11 £21-dwuhydroksypregneno-4-dionu-3,20, który w warunkach analogicznych jak w przykladzie lic) hydrolizuje sie do 63 mg 11 £17a,21-trójhydroksy- pregneno-4-dionu-3,20 o temperaturze topnienia 216—217,5°C.Przyklad V. a) 10,0 g 21-acetoksy-17 a-hyd- roksypregneno-4-dionu-3,20, w warunkach analo- 5 gicznych jak w przykladzie Ilia), poddaje sie re¬ akcji z 4,0 g eteru izobutylowowinylowego i obrób¬ ce, otrzymujac 13,5 g 21-acetoksy-17«-(l'-izobutylo- ksyetoksy)-pregneno-4-dionu-3,20 w postaci oleistej mieszaniny diastereoizomerów. b) Roztwór 0,1 g mieszaniny diastereoizomerów 21-acetoksy - 17 a-(l'-izobutyloksyetoksy) - pregneno- -4-dionu-3,20 w 2 ml dwumetyloformamidu, w wa¬ runkach analogicznych jak w przykladzie Ic), hyd¬ roksyluje sie za pomoca ,Curvularia lunata NRRL 2380 i poddaje obróbce, otrzymujac 11 £21-dwuhydroksy- -17 a-(r-izobutyloksyetoksy)-pregneno- 4 - dioa - 3,20, który w warunkach analogicznych jak w przykla¬ dzie Ile) zmydla sie do 68 mg 11 £17 a,21-trójhyd- roksypregneno-4-dionu-3,20 o temperaturze top¬ nienia 214—216°C (z rozkladem). 20 Przyklad VL a) 1,95 g 21-acetoksy-17a-hyd- roksypregneno-4-dionu-3,20 zadaje sie 5 mg bez¬ wodnego kwasu p-toluenosulfonowego, 25 ml bez¬ wodnego chlorku metylenu i 3,5 ml dwuwodoro- piranu i miesza w ciagu 13 godzin w temperaturze pokojowej. Mieszanine reakcyjna poddaje sie ob¬ róbce analogicznej jak w przykladzie Ilia), otrzy¬ mujac 2,0 g 21-acetoksy-17 a-(2'-czterowodoropira- nyloksy)-pregneno-4-dionu-3,20 w postaci miesza¬ niny diastereoizomerów o temperaturze topnienia 30 185—200°C. b) Roztwór 0,1 g mieszaniny diastereoizomerów 21-acetoksy-17 a-(2'-czterowodoropiranyloksy)- preg- neno-4-dionu-3,20 w 2 ml dwumetyloformamidu, w warunkach analogicznych jak w przykladzie Ic), 35 hydroksyluje sie za pomoca Curvularia lunata NRRL 2380 i poddaje obróbce, otrzymujac 11 £21- -dwuhydroksy - 17 a - (2' - czterowodoropiranyloksy)- -pregneno-4-dionu-3,20, który w warunkach analo¬ gicznych jak w przykladzie lic) hydrolizuje sie do 40 72 mg 11 £17 a-21-trójhydroksypregneno-4-dionu- -3,20 o temperaturze topnienia 215°C (z rozkladem).Przyklad VII. a) 50 g 21-acetoksy-17 a-hyd- roksy-6 a-metylopregneno-4-dionu-3,20, w warun- runkach analogicznych jak w przykladzie Ilia), 45 poddaje sie reakcji z 13,9 g eteru metylowowinylo- wego i obróbce, otrzymujac 59 g 21-acetoksy-17 a- -(l'-metoksyetoksy)-6 a-metylopregneno-4-dionu-3,?P jako bezpostaciowa mase. b) Roztwór 200 mg 21-acetoksy-17 a-(l,-n\etoksy- etoksy)-6 a-metylopregneno-4-dionu-3,20 w 0,4 ml dwuetyloformamidu, w warunkach analogicznych jak w przykladzie Ic) hydrolizuje sie za pomoca Curvularia lunata NRRL 2380 i poddaje sie obrób¬ ce, otrzymujac 11 £21-dwuhydroksy-17 a-(l'-meto- 55 ltfsyetoksy)-6a-metylopregneno-4-dion-3,20, który w warunkach analogicznych jak w przykladzie lic) hydrolizuje sie do 15 mg 11 £17 a,21-trójhydroksy- -6 a-metylopregneno-4-dionu-3,20 o temperaturze 60 topnienia 189—192°C.Przyklad VIII. a) 2,0 g 21-acetoksy-17 a- -hydroksy-16 /?-metylopregneno-4-dionu-3,20 zadaje sie 5 mg kwasu p-toluenosulfonowego (bezwodnego) i 25 ml bezwodnego chlorku metylenu i chlodzi do w temperatury 0°C. Nastepnie do mieszaniny mie-13 121 296 14 szajac dodaje sie 0,5 g eteru metylowowinylowego, miesza w ciagu 5 godzin w temperaturze pokojo¬ wej, mieszanine, reakcyjna poddaje sie obróbce analogicznej jak w przykladzie Ilia) i otrzymuje sie 2,1 g 21-acetoksy-17 a-(r-metoksyetoksy)-16 ^-metylopregneno-4-dionu-3,20 w postaci oleistej mieszaniny diastereoizomerów. b) Roztwór 50 mg mieszaniny diastereoizomerów 21- acetoksy - 17 a-(l'- metoksyetoksy) - 16 /? - metylo- pregneno-4-dionu-3,20 w 1 ml dwumetyloformami- du, w warunkach analogicznych jak w przykla¬ dzie Ic), hydroksyluje sie za pomoca Curvularia lunata NRRL 2380 i poddaje obróbce, otrzymujac 11 #21 - dwuhydroksy - 17 a-(V-metoksyetoksy)- 16 /?- -metylopregneno-4-dion-3,20, który w warunkach analogicznych jak w przykladzie lic) hydrolizuje sie do 32 mg 11 #17 «,21-trójhydroksy-16/?-metylo- pregneno-4-dionu-3,20 o temperaturze topnienia 204^-207°C.Przyklad EX. a) 50 g 17 a-hydroksypregneno- -4-dionu-3,20, w warunkach analogicznych jak w przykladzie Ilia), poddaje sie reakcji z 15 g eteru metylowowinylowego i obróbce, otrzymujac 51,2 17 a-(l'-metoksyetoksy)-pregneno - 4 - dionu-3,20 o temperaturze topnienia 115—152°C. b) Roztwór 0,1 g 17 a-(r-metoksyetoksy)-preg- neno-4-dionu-3,20 w 1 ml dwumetyloformamidu, w warunkach analogicznych jak w przykladzie Ic), poddaje sie fermentacji za pomoca hodowli Cur- vularia lunata NRRL 2380 i obróbce. Tak otrzy¬ many 11 /?-hydroksy-17 a-(r-metoksyetoksy)-preg- neno-4-dion-3,20 (o temperaturze topnienia 85— —103°C) hydrolizuje sie w warunkach analogicz¬ nych jak w przykladzie lic), otrzymujac 63 mg 11 #17 a-dwuhydroksypregneno-4-dionu-3,20 o tem¬ peraturze topnienia 222—223,5°C.Przyklad X. a) 50 g 3#21-dwuacetoksy- -17 a-hydroksy-pregneno-5-onu-20 w 150 ml chlor¬ ku metylenu, w warunkach analogicznych jak w przykladzie la) poddaje sie reakcji z 380 g acetylu bis(2-metoksyetylowego) formaldehydu, 50 g pie¬ ciotlenku fosforu i 100 g ziemi okrzemkowej oraz obróbce, otrzymujac 45,8 g 3 #21-dwuacetoksy-me- toksy)-pregneno-5-onu-20 o temperaturze topnienia 160—161°a b) W warunkach analogicznych jak w przykla¬ dzie Ib) 0,5 g 3#21-dwuacetoksy-17 a-(2'-metoksy- etoksymetoksy)-pregneno-5-dionu-3,20 poddaje sie reakcji z hodowla Flavobacterium dehydrogenans ATOC 13930 oraz obróbce, otrzymujac 390 mg 21 - hydroksy - 17 a-(2'-metoksyetoksymetoksy)-preg- neno-4-dionu-3,20 w postaci szklistej masy. c) W warunkach analogicznych jak w przykla¬ dzie Ic) 30 mg 21-hydroksy-17 a-(2'-metOksyetoksy- -metoksy)-pregneno-4-dionu-3,20 poddaje sie re¬ akcji z hodowla Curvularia lunata NRRL 2380 oraz obróbce, otrzymujac 24 mg 11 #21-dwuhydroksy- -17 a-(2'-metoksyetoksy-metoksy)- pregneno - 4 - dio¬ nu-3,20 o temperaturze topnienial43^147°C. d) W warunkach analogicznych jak w przykla¬ dzie Id) 10 mg ll#21-dwuhydroksy-17a-(2'-me- toksyetoksy-metoksy)-pregneno-4-dionu-3,20 w 2 ml chlorku metylenu i 0,01 ml czterochlorku tytanu poddaje sie reakcji a pózniej obróbce, otrzymujac 8 mg 11 #17 a,21-trójhydroksy-pregneno-4-dionu- -3,20 o temperaturze topnienia 213°C.Przyklad XI. Umieszczony w kolbie stozko¬ wej o pojemnosci 2 litrów, jalowy roztwór pozyw- 5 kowy w ilosci 500 ml, zawierajacy 0,l°/o wyciagu z drozdzy, 0,5% namoku kukurydzianego i 0,1% glikozy i nastawiony na pH=7,0 zaszczepia sie za pomoca splukania suchej hodowli Arthrobacter simplex ATCC 6946 i wytrzasa w ciagu 48 godzin 10 w temperaturze 30°C przy 190 obrotach na minute. 90 ml poprzednio opisanej pozywki w kolbie stozkowej o pojemnosci 500 ml zaszczepia sie 10 ml tej hodowli mikroorganizmu Arthrobacter simplex i wytrzasa w ciagu 6 godzin w temperaturze 30°C 15 przy 165 obrotach na minute. Nastepnie do hodowli tej dodaje sie 1 ml jalowego roztworu 50 ml 11 #21- dwuhydroksy-17 a-metoksymetoksy-pregneno-4-dio- nu-3,20 w dwumetyloformamidzie i poddaje fer¬ mentacji w ciagu dalszych 42 godzin, 20 Hodowle fermentacyjna poddaje sie obróbce ana¬ logicznej jak w przykladzie Ib), otrzymujac 44,5 g 11 #21-dwuhydroksy - 17 a-metoksymetoksy-pregna- dieno-l,4-dionu-3,20 o temperaturze topnienia 229—231°C. 25 Przyklad XII. Umieszczony w kolbie stozko¬ wej o pojemnosci 2 litrów jalowy roztwór pozyw- kowy w ilosci 500 ml, zawierajacy l°/o wyciagu z drozdzy (produkt firmy Difco), 0,45% wodorofos- foranu dwusodowego, 0,34% wodorofosforanu pota- 30 sowego i 0,2% srodka o nazwie Tween 80, nasta¬ wiony na pH=6,7 zaszczepia sie za pomoca splu¬ kania suchej hodowli Nocardia globerula ATCG 9356 i wytrzasa w temperaturze 30°C w ciagu 72 godzin przy 190 obrotach na minute. 35 Umieszczony w kolbie stozkowej o pojemnosci 2 litrów, jalowy roztwór pozywkowy w ilosci 950 ml, zawierajacy 2,0% namoku kukurydzianego, 0,3% wodorofosforanu dwuamonowego i 0,25% srodka o nazwie Tween 80, nastawiony na pH=6,5 40 zaszczepia sie 50 ml tej hodowli Nocardia globe¬ rula i wytrzasa w temperaturze 30°C w ciagu 24 godzin przy 190 obrotach na minute. Nastepnie do hodowli tej dodaje sie 5 ml jalowego roztworu 0,25 g ll#21-dwuhydroksy-17a-(l,-metoksyetoksy)- 45 -6 a-metoksypregneno-4-dionu-3,20 w dwumetylo¬ formamidzie i poddaje fermentacji w ciagu dal¬ szych 72 godzin. Hodowle fermentacyjna poddaje sie obróbce analogicznej jak w przykladzie Ib), otrzymujac 0,21 g 11 #21-dwuhydroksy-17 a-(l'me- 50 toksyetoksy)-6 a-metylopregnadieno-l,4-dionu-3,20 o temperaturze topnienia 173°C.Przyklad XIII. a) Z 50 g 21-acetoksy-17 a- -hydroksy-pregneno-4-dionu-3,20 sporzadza sie za- 55 wiesine w 600 ml dwuetylowego acetalu formalde¬ hydu i 600 ml chlorku metylenu, chlodzac do tem¬ peratury od —30°C do —40°C. Do calosci mieszajac wprowadza sie mieszanine 75 g pieciotlenku fos¬ foru i 150 g ziemi okrzemkowej i miesza w ciagu 30 godzin w temperaturze —30°C. Roztwór saczy sie i zobojetnia trójetyloamina. Po oddestylowaniu rozpuszczalników ponownie oddestylowuje sie, z metanolem a pozostalosc przekrystalizowuje sie z metanolu. Otrzymuje sie 35,9 g 21-acetoksy-17 a- 05 -etoksymetoksy-pregneno-4-dionu-3,20, który po15 121 296 16 ponownym przekrystalizowaniu wykazuje tempera¬ ture topnienia 137—139°C. b) Umieszczony w kolbie stozkowej o pojemnosci 2 litrów, jalowy roztwór pozywkowy w ilosci 1 litra, zawierajacy 1% namoku kukurydzianego i 1,25% pudru sojowego, nastawiony na pH=6,2 zaszczepia sie za pomoca splukania suchej hodowli Curvularia lunata NRRL 2380 i wytrzasa w tempe¬ raturze 30°C w ciagu 72 godzin przy 175 obrotach na minute.Fermentator o pojemnosci 50 litrów, zawierajacy 29 litrów jalowej, poprzednio opisanej pozywki, zaszczepia sie 1 litrem tej hodowli Curvularia lu¬ nata i utrzymuje hodowle w ciagu 24 godzin w temperaturze 30°C przy napowietrzaniu 2 m3 po¬ wietrza na godzine.Umieszczony w fermentatorze o pojemnosci 50 litrów, jalowy, wyzej opisany roztwór pozywko- wy w ilosci 36 litrów zaszczepia sie 4 litrami tej wstepnej fermentacyjnej hodowli Curvularia lu¬ nata i utrzymuje hodowle w ciagu 10 godzin w temperaturze 30°C wobec napowietrzania 2 ms po¬ wietrza na godzine i miesza przy 200 obrotach na minute. Nastepnie do hodowli tej dodaje sie 10 g 21-acetóksy-17 a-etoksymetoksy- pregneno-4 - dionu- -3,20 w 2Ó0 ml jednometylowego eteru glikolu ety¬ lenowego. Po uplywie 10 godzin utrzymuje sie war¬ tosc pH=6,5—7,0. Po uplywie dalszych 4 godzin ponownie dodaje sie 10 g 21-acetoksy-17 a-etoksy- metoksy-pregneno-4-dionu-3,20 w 200 ml jednome¬ tylowego eteru glikolu etylenowego i poddaje fer¬ mentacji w podanych warunkach w ciagu dalszych 23 godzin.Hodowle fermentacyjna ekstrahuje sie trzykrot¬ nie porcjami po 10 litrów chlorku etylenu, po czym poddaje dalszej obróbce analogicznej jak w przy¬ kladzie Ib). Otrzymuje sie 13,8 g 11 /?,21-dwuhydro- ksy-17 a-etoksymetoksy - pregneno-4-dionu - 3,20 o temperaturze topnienia 153—154°C.Przyklad XIV. a) Z 25 g 21-acetoksy-17 a- -hydfoksy-pregneno-3,20 sporzadza sie zawiesine w 200 ml dwupropylowego acetalu formaldehydu i 320 ml chlorku metylenu, chlodzac do tempera¬ tury—20°C. Mieszajac wprowadza sie mieszanine 49,3 g pieciotlenku fosforu i 97 g ziemi okrzemko¬ wej i miesza w ciagu 22 godzin w temperaturze —20°C. Roztwór ten saczy sie i zobojetnia trójety- loamina. Chlorek metylenu oddestylowuje sie pod próznia a warstwe dwupropylowego acetalu for¬ maldehydu zlewajac oddziela sie od wydzielonego oleju. Po oddestylowaniu dalszych ilosci rozpusz¬ czalnika pod próznia, krystalizuje 19 g 21-acetoksy- -17 a-propoksy-pregneno-4-dknu-3,20 o temperatu¬ rze topnienia 145—147°C. b) 10 g 21-acetoksy-17 a-propoksymetoksy-preg- neno-4-dionu-3,20 razem z 1 g srodka o nazwie Tween 80 i trzykrotna iloscia wody miele sie w dynamicznym mlynie typu KDL (produkt firmy Bachofen, Bazylea). Te zmielone substancje wyja¬ lawia sie za pomoca le/o HA w ciagu co najmniej 4 godzin.Aiialogicznie jak w przykladzie XIIIb) utrzymuje sie w kolbach wstrzasanych i w fermentatorze Wstepnym hodowle Curvularia lunata 2380 i zasz¬ czepia sie nia fermentator glówny. Fermenta¬ tor ten równiez nastawia sie jak podano w przykladzie XIIIb) i utrzymuje hodowle w ciagu 10 godzin w warunkach równiez podanych w przykladzie XIIIb). Nastepnie do hodowli 5 tej dodaje sie mlewo 21-acetoksy-17 a-propoksyme- toksy-pregneno-4-dionu-3,20 i poddaje fermentacji w ciagu dalszych 44 godzin, przy czym utrzymuje sie wartosc pH = 6,4—6,7. Hodowle fermentacyjna poddaje sie obróbce analogicznej jak w przykla- 10 dzie XIIIb), otrzymujac 6,5 g 11 /?,21-dwuhydroksy- -17a-propoksymetoksy-pregneno-4-dionu-3,20 o tem¬ peraturze topnienia 134/135—136°C.Przyklad XV. a) Z 50 g 21-acetoksy-17-hyd- roksy-pregneno-4-dionu-3,20 sporzadza sie zawiesi¬ ne w 500 ml dwubutylowego acetalu formaldehydu i 500 ml chlorku metylenu, chlodzac do tempera¬ tury —35°C. Mieszajac wprowadza sie mieszanine 74 g pieciotlenku fosforu i 150 g ziemi okrzemko¬ wej i miesza w ciagu 30 godzin w temperaturze —35°C. Roztwór ten saczy sie i zobojetnia trójety- loamina. Chlorek metylenu oddestylowuje sie pod próznia a warstwe dwubutylowego acetalu formal¬ dehydu zlewajac oddziela sie od wydzielonego ole¬ ju. Po oddestylowaniu pod próznia dalszej ilosci rozpuszczalnika krystalizuje 38,7 g 21-acetoksy- -17 a-butoksymetoksy-pregneno-4-dionu-3,20 o tem¬ peraturze topnienia 123,5—124,5°C. b) 8 g 21-acetoksy-17 a-butoksymetoksy-pregne- no-4-dionu-3,20 razem z 0,8 g srodka o nazwie Tween 80 miele sie analogicznie jak w przykla- 30 dzie XIVb).Analogicznie jak w przykladzie XIIIb) mikroor¬ ganizm Curvularia lunata NRRL 2380 hoduje sie w kolbach wstrzasowych jako hodowle zaczynowa i fermentuje w fermentatorze wstepnym i w fer¬ mentatorze glównym. Po uplywie 9 godzin do fer- mentatora glównego wprowadza sie substrat i fer¬ mentuje w ciagu dalszych 50 godzin.Hodowle fermentacyjna poddaje sie obróbce ana¬ logicznej jak w przykladzie XIIIb), otrzymujac 3,7 g 11 /?,21 - dwuhydroksy - 17 a-butoksymetoksy- -pregneno-4-dionu-3,20 o temperaturze topnienia 79—81°C.Przyklad XVI. a) 10,60 g 21-acetoksy-6 a- -fluoro-17 a-hydroksypregneno - 4-dionu-3,20 roz¬ puszcza sie w 265 ml chlorku metylenu i 47,7 ml dwumetylowego acetalu formaldehydu. Miesza¬ nine 7,95 g pieciotlenku fosforu i 15,9 g ziemi okrzemkowej dodaje sie porcjami, a mieszanine miesza sie w atmosferze azotu w temperaturze po¬ kojowej. Roztwór ten saczy sie i zadaje 2,1 ml trójetyloaminy. Rozpuszczalnik oddestylowuje sie, a pozostalosc przekrystalizowuje sie z metanolu.Otrzymuje sie 7,6 g 21-acetoksy-6 a-fluoro-17 a- 55 -metoksymetoksy-pregneno-4-dionu-3,20 o tempera¬ turze topnienia 161—167°C. b) Analogicznie jak w przykladzie XIIb) utrzy¬ muje sie hodowle mikroorganizmu Curvularia lu¬ nata NRRL 2380 w kolbach wstrzasowych, w fer¬ go mentatorze wstepnym i w fermentatorze glównym.Po uplywie 9 godzin do glównego fermentatora do¬ daje sie 5 g 21-acetoksy-6 «-fluoro-17 a-metoksy- metoksy-pregneno^4-dionu-S,20 w 100 ml jednome¬ tylowego eteru glikolu etylenowego. Od tego mo¬ ge mentu utrzymuje sie wartosc pH-6,5—7,0. Po121 296 1T 18 uplywie 13 godzin ponownie dodaje sie 5 g 21-ace- toksy-6 a-fluoro-17 a- metoksymetoksy - pregneno-4- -dionu-3,20 w 100 ml jednometylowego eteru gli¬ kolu etylenowego i poddaje fermentacji w ciagu dalszych 26 godzin.Hodowle fermentacyjna poddaje sie obróbce ana¬ logicznej jak w przykladzie XIIIb), otrzymujac 4,2 g 11 /?,21-dwuhydroksy-6 a-fluoro-17 a-metoksy¬ metoksy-pregneno-4-dionu-3,20 o temperaturze top¬ nienia 190—192°C.Przyklad XVII. a) 43 g 3 £21-dwuacetoksy- -17 a-hydroksy-16 ^-metylopregneno-5-onu-20 roz¬ puszcza sie w 800 ml dwumetylowego acetalu for¬ maldehydu i chlodzi do temperatury —15°C. Por¬ cjami wprowadza sie mieszanine 43 g pieciotlenku fosforu i 80 g ziemi okrzemkowej i calosc miesza sie w ciagu 15 godzin w temperaturze okolo —15°C.Roztwór ten saczy sie, zobojetnia trójetyloamina a rozpuszczalnik oddestylowuje sie pod próznia.Pozostalosc przekrystalizowuje ma z metanolu, otrzymujac 31,5 g 3 #21-dwuacetoksy-17 a-metoksy- metoksy-16 ^-metylopregneno-5-onu-20 o temperatu¬ rze topnienia 117—118°C. b) Analogicznie jak w przykladzie Ib) hoduje sie i fermentuje mikroorganizm Flavobacterium de- hydrogenans ATCC 13930. Po uplywie 6 godzin do tej hodowli dodaje sie 4 ml jalowego roztworu 0,2 g 3/?,21-dwuacetoksy-17a-metoksymetoksy-16jff- -metylópregneno-5-onu-20 w dwumetyloformami- dzie i wytrzasa w ciagu dalszych 65 godzin.Po zakonczonej fermentacji hodowle te poddaje sie obróbce analogicznej jak w przykladzie Ib), otrzymujac 163 mg 21-hydroksy-17 a-metoksyme- toksy-16 /?-metylopregneno-4-dionu-3,20 o tempera¬ turze topnienia 126/128—129°C, c) Analogciznie jak w przykladzie Ic) hoduje sie i fermentuje mikroorganizm Curvularia lunata NRRL 2380. Po uplywie 6 godzin do hodowli tej dodaje sie 1 ml jalowego roztworu 50 mg 21-hydro- ksy - 17 a-metoksymetoksy - 16 fi- metylopregneno-4- -dionu-3,20 w dwumetyloformamidzie i poddaje fermentacji w ciagu dalszych 65 godzin.Hodowle fermentacyjna poddaje sie obróbce anar logicznej jak w przykladzie Ib), otrzymujac 34,5 mg 11 #21-dwuhydroksy -17 a-metoksymetoksy-16 /?-me- tylopregneno-4-dionu-3,20 o temperaturze topnienia 204/205—206°C.Przyklad XVIII, a) 29,1 g 21-acetoksy-6- -chloro - 17 a-hydroksypregnadieno - 4,6 - dionu - 3,20 rozpuszcza sie w 730 ml chlorku metylenu i 131,0 ml dwumetylowego acetalu formaldehydu. Mieszanine 22,12 g pieciotlenku fosforu i 44 g ziemi okrzemko¬ wej dodaje sie porcjami a calosc miesza sie w ciagu 2,5 godzin w atmosferze azotu. Roztwór ten saczy sie i zadaje 5,8 ml trójetyloaminy. Rozpusz¬ czalnik oddestylowuje sie a pozostalosc przekrysta¬ lizowuje sie z metanolu wobec dodatku wegla aktywnego i l°/« trójetyloaminy. Otrzymuje sie 15,6 g 21-acetoksy-6-chloro-17 a-metoksymetoksy- -pregnadieno-4,6-dionu-3,20 o temperaturze topnie¬ nia 183—186°C. c) Analogicznie jak w przykladzie XIIIb) utrzy¬ muje sie hodowle mikroorganizmu Curvularia lu¬ nata NRRL 2380 w kolbach wstrzasowych, w fer- mentatorze wstepnym i w fermentatorze glównym. 10 20 30 35 40 50 55 Po uplywie 9 godzin do fermentatora glównego dodaje sie 3 g 21-acetoksy-6-chloro—17a-metoksy- metoksy-pregnadieno-4,6-dionu-3,20 w 60 ml jed¬ nometylowego eteru glikolu etylenowego. Od mo¬ mentu tego utrzymuje sie wartosc pH=6,4—6,7 i prowadzi fermentacje w ciagu dalszych 20 go¬ dzin. Hodowle fermentacyjna poddaje sie obróbce analogicznej jak w przykladzie XIIIb), otrzymujac 1,8 g 11 /?,21-dwuhydroksy-6-chloro-17 a-metoksy- metoksy-pregnadieno-4,6-dionu-3,20 o temperaturze topnienia 234/235—236°C.Przyklad XIX. a) 38,85 g 21-acetoksy-17 a- -hydroksypregneno-4-dionu-3,20 miesza sie z 235 ml dwuizopropylowego acetalu formaldehydu i 500 ml chlorku metylenu i chlodzi do temperatury —20°C.Kontrolujac wprowadza sie mieszanine 75 g pie¬ ciotlenku fosforu oraz 150 g ziemi okrzemkowej i miesza w ciagu 20 godzin w temperaturze —20°C.Mieszanine te saczy sie, przemywa chlorkiem me¬ tylenu i za pomoca trójetyloaminy odczyn dopro¬ wadza sie do wartosci pH=9. Rozpuszczalnik od¬ destylowuje sie pod próznia, a pozostalosc rozpusz¬ cza .sie w chlorku metylenu. Roztwór ten prze¬ mywa sie nasyconym w polowie roztworem chlorku sodowego, suszy nad siarczanem sodowym, zadaje weglanem aktywnym, znad ziemi okrzemkowej odsacza pod zmniejszonym cisnieniem i zateza pod próznia. Pozostalosc chromatografuje sie na zelu krzemionkowym za pomoca mieszaniny toluen- octan-octan etylowy. Otrzymuje sie 35,8 g 21-«ce- toksy -17a-izopropoksymetoksy - pregneno-4 - dionu- -3,20, który po krystalizacji z pentanu wykazuje temperature topnienia 111—117°C. b) Analogicznie jak w przykladzie XIIIb) utrzy¬ muje sie hodowle mikroorganizmu Curvularia lu¬ nata NRRL 2380 w kolbach wstrzasowych, w fer¬ mentatorze wstepnym i fermentatorze glównym.Po uplywie 9 godzin do fermentatora glównego do¬ daje sie 12 g 21-acetoksy-17a-izopropoksymetoksy- -pregneno-4-dionu-3,20 w 240 ml jednometylowego eteru glikolu etylenowego. Od tego momentu utrzy¬ muje sie wartosc pH=6,5—7,0 i prowadzi fermen¬ tacje w ciagu dalszych 15 godzin. Hodowle fermen¬ tacyjna poddaje sie obróbce analogicznej jak w przykladzie XIIIb), otrzymujac 8,4 g 11 /?,21-dwu- hydroksy-17 a-izopropoksymetoksy-pregneno - 4-dio- nu-3,20 o temperaturze topnienia 71/73—78°C. c) Analogicznie jak w przykladzie XI utrzymuje sie hodowle mikroorganizmu Arthrobacter simplex ATCC 6946 w kolbach hodowlanych i fermenta¬ cyjnych. Po uplywie 5 godzin do kolby fermenta¬ cyjnej dodaje sie 1 ml jalowego roztworu 50 mg 11 /?,21-dwuhydroksy-17 a-izopropoksymetoksy-preg- neno-4-dionu-3,20 w jednometylowym eterze glikolu etylenowego i poddaje fermentacji w ciagu dal¬ szych 42 godzin. Hodowle fermentacyjna poddaje sie obróbce analogicznej jak w przykladzie Ib), otrzymujac 32 mg 11 /?,2l-dwuhydroksy-17 a-izopro- poksymetoksy-pregnadieno-l,4-dionu-3,20 o tempe¬ raturze topnienia 58/63—65°C.Przykl.ad XX. a) Analogicznie jak w przy¬ kladzie Ib) utrzymuje sie hodowle mikroorganizmu Flavobacterium dehydrogenans ATCC 13930 w kol¬ bach wstrzasowych, w fermentatorze wstepnym i w fermentatorze glównym. Po uplywie 23 godzin19 121 296 20 do fermentatora glównego dodaje sie 19,5 g 16-me- tyleno - 3 /?,21 - dwuacetoksy - 17 a- metoksymetoksy- -pregneno-5-onu-20 w 500 ml dwumetyloformami- du i prowadzi fermentacje w ciagu dalszych 28 go¬ dzin.Hodowle fermentacyjna poddaje sie obróbce ana¬ logicznej jak w przykladzie XIIIb), otrzymujac 15,5 g 16-metyleno-21-nydroksy-17 a-metoksymeto- ksy-17 a-metoksymetoksy-pregneno-4-dionu-3,20 o temperaturze topnienia 147/150—151°C. b) Analogicznie jak w przykladzie XIIIb) utrzy¬ muje sie hodowle mikroorganizmu Curvularia lu¬ nata NRRL 2380 w kolbach wstrzasowych, w fer- mentatorze wstepnym i w fermentatorze glównym.Po uplywie 9 godzin do glównego fermentatora dodaje sie 20 g 16-metyleno-21-hydroksy-17 a- me- toksymetoksy-pregneno-4-dionu-3,20 w 400 ml jed- nometylowego eteru glikolu etylenowego. Od tego momentu utrzymuje sie wartosc pH=6,4—6,7 i pro¬ wadzi fermentacje w ciagu dalszych 8 godzin.Hodowle fermentacyjna poddaje sie obróbce ana¬ logicznej jak w przykladzie XIIIb), otrzymujac 11 g 16 - metyleno-11 /?,21-dwuhydroksy-17 a-meto^syme- toksy-17a-metoksymetoksy-pregneno-4-dionu-3,20 o temperaturze topnienia 205/206—208°C.Przyklad XXI. Analogicznie jak w przykla¬ dzie XI utrzymuje sie hodowle mikroorganizmu Arthrobacter simplex ATCC 6946 w kolbach ho¬ dowlanych i fermentacyjnych. Po uplywie 5 godzin do kolby fermentacyjnej dodaje sie 1 ml jalowego roztworu 50 mg 11 /?,21-dwuhydroksy-17 cc-propo- ksymetoksy-preg£ieno-4-dionu-3,20 w jednometylo- wym eterze glikolu etylenowego i prowadzi fermen¬ tacje w ciagu dalszych 42 godzin. Hodowle fermen¬ tacyjna poddaje sie obróbce analogicznej ja^ w przykladzie Ib), otrzymujac 41 mg 11 /?,21-dwu- hydroksy - 17 a-propoksymetoksy - pregnadieno - 1,4- -dionu-3,20 o temperaturze topnienia 121/125 — —127°C. PL PL PL PL PL PL PL PL