PL124051B1 - Process for preparing novel demethylmaytansynoidic compounds - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych zwiazków demetylomaytanzynoidowych, od¬ powiadajacych zwiazkom maytanzynoidowym zde- metylowanym w pozycji 20.Prace nad mikrobiologiczna przemiana zwiazków maytanzynoidowych w rózne inne pochodne dopro¬ wadzily do stwierdzenia, ze pozywka hodowlana pewnych typów mikroorganizmów, w tym równiez przetwarzana pozywka hodowlana, dziala w taki sposób na zwiazek maytanzynoidowy, ze grupa me- toksylowa w pozycji 20 zwiazku maytanzynoidowe- go ulega przeksztalceniu w gruRe hydroksylowa, przy czym jezeli otrzymamy zwiazek zostanie pod¬ dany dalszemu decylowaniu, to otrzymuje sie od¬ powiedni zwiazek posiadajacy grupe hydroksylowa równiez w pozycji 3. Spostrzezenie to bylo podsta¬ wa do dalszych badan, które doprowadzily do do¬ konania wynalazku.Sposób wedlug wynalazku wytwarzania nowych zwiazków demetylomaytanzynoidowych o wzorze 1, w którym X oznacza atom chloru lub wodoru a Ri oznacza atom wodoru lub rodnik acylowy, polega na tym, ze na maytanzynoidowy zwiazek o wzo¬ rze 2, w którym X i Ri maja wyzej podane zna¬ czenie, dziala sie hodowla lub przetworzona brzecz¬ ka mikroorganizmu rodzaju Bacillus megaterium IFO 12108, Streptomyces flavotricini IFO 12770, Streptomyces platensis IFO 12901, Streptomyces li- bani IFO 13452 lub Actinomyces nigrescens IFO 12894, przy stezeniu zwiazku wyjsciowego w ukla- 10 15 20 30 dzie reakcyjnym zawartym w zakresie 1—400 jig/ml, w temperaturze 20—50°C i przy wartosci pH za¬ wartej w zakresie 5—10, a sposób wedlug wyna¬ lazku wytwarzania nowych zwiazków demetylomay¬ tanzynoidowych o wzorze 3, w którym X oznacza atom chloru lub wodoru, polega na tym, ze maytan¬ zynoidowy zwiazek o wzorze 4, w którym X ma wyzej podane znaczenie a Ri' oznacza rodnik acy¬ lowy, dziala sie hodowla lub przetworzona brzeczka mikroorganizmu Bacillus megaterium IFO 12108, Streptomyces flavotricini IFO 12770, Streptomyces platensis IFO 12901, Streptomyces liboni IFO 13452 lub Actinomyces nigrescens IFO 12894, przy steze¬ niu zwiazku wyjsciowego w ukladzie reakcyjnym zawartym w zakresie 1—400 p,g/ml. w temperaturze 20—50°C i przy wartosci pH zawartej w zakresie 5—10, a nastepnie, otrzymany zwiazek o wzorze 5, w którym X i Ri' maja wyzej podane znaczenie, poddaje sie reakcji deacylowania.We wzorach 1 i 2 podstawnik Rt a we wzorach 4 i 5 podstawnik Ri' oznaczaja rodnik acylowy po¬ chodzacy od kwasu karboksylowego, karbaminowe- go lub weglowego o ciezarze czasteczkowym nie wiekszym niz 300 lub rodnik acylowy o 1—20 ato¬ mach wegla. Termin „rodnik acylowy" obejmuje miedzy innymi, nasycone i nienasycone alifatyczne rodniki acylowe, nasycone i nienasycone alicyklicz- ne rodniki acylowe, aromatyczne rodniki acylowe, nasycone i nienasycone heterocykliczne rodniki acylowe, rodniki acylowe N-acylo-a-aminokwasów, 124 051124 051 3 4 rodniki acylowe typu karboksylowego i rodniki acylowe pochodzace od pólestrów kwasu weglo¬ wego.Takimi rodnikami acylowymi moga byc przykla- kladowo rodniki o wzorze —CO—R2 (w którym R2 oznacza atom wodoru lub ewentualnie podstawiony lub niepodstawiony rodnik alkilowy, alkenylowy, cykloalkilowy, cykloalkenylowy, arylowy lub gru¬ pe heterocykliczna, przy czym rodnik cykloalkilo¬ wy, cykloalkenylowy lub arylowy albo grupa he¬ terocykliczna moga byc ewentualnie przylaczone do karbonylowego atomu wegla poprzez lancuch alki- lenowy), grupyj^ wzorze 6 (w których Rs oznacza ajtóm^dcTorulub ewentualnie podstawiony lub nie- ppcJstawfony roclnifc Jdkilowy, cykloalkilowy, arylo¬ wy, indolilowy lub irfcidazolilowy, przy czym rodnik cjrkloajlcilpwy, arylowy, indolilowy lub imidazolilo- wy moze byc (ftWjEjnJuialnie przylaczony do a-atomu weglaHpóprzez lancuch alkilenowy, R4 oznacza atom wodoru lub ewentualnie podstawiony lub niepod¬ stawiony rodnik alkilowy, cykloalkilowy, arylowy lub benzylowy, R5 oznacza atom wodoru, grupe alkoksylowa, bornyloksylowa, izobornyloksylowa, benzoksylowa lub ewentualnie podstawiony lub niepodstawiony rodnik alkilowy, alkenylowy, cy¬ kloalkilowy, cykloalkenylowy;, arylowy lub grupe heterocykliczna, przy czym rodnik cykloalkilowy, cykloalkenylowy, arylowy lub grupa heterocyklicz¬ na moga byc ewentualnie przylaczone do atomu wegla przyleglego do atomu azotu poprzez lancuch alkilenowy), grupy o wzorze 7 (w których Rfl i R7 sa takie same lub rózne i oznaczaja atom wodoru lub ewentualnie podstawiony lub niepodstawiony rodnik weglowodorowy lltb grupe heterocykliczna lub R6 i R7 lacznie z atomem azotu, do którego sa przylaczone, rstanowia grupe heterocykliczna) lub grupy o wzorze —GOOR8 (w których R8 oznacza ewentualnie podstawiony lub niepodstawiony rod¬ nik weglowodorowy).Jezeli rodnik acylowy Ri lub Ri' jest rodnikiem a wzorze — znaczenie), to rodnikiem alkilowym R* moze byc rodnik o 1—18 atomach wegla (np. metylowy, ety¬ lowy, propylowy, izopropylowy, butylowy, izobuty- lowy, IIrzed.-butylówy, Illrzed.-butylowy, pentylo- wy, izopentylowy, 1-metylopropylowy, heksylowy, izoheksylowy, heptylowy, 3-heptylowy, oktylowy, nonylowy, decylowy, undecylowy, dodecylowy, tri- decylowy, tetradecylowy, pentadecylowy, heksade- cylbwy, heptadecylowy, aktadecylowy, 1,2-dwume- tylopropylowy, 1-etylopropylowy, 1,2,2-trójmetylo- propylowy, 1-propylobutylowy, 2-etyloheksylowy itp.) aczkolwiek korzystne sa rodniki alkilowe o 1^—6 atomach wegla.Korzystnymi przykladami rodników alkenylówych R2 sa rodniki o 2—18 atomach wegla (np. winylowy, allilowy, 1-metylowinylowy, 2-metylowinylowy, 1-oktenylowy, 1-decenylowy, ! l;3-peritadienylowy, oleilowy, itp.), z tym, ze szczególnie pozadane sa rodniki alkenylowe o 2—4 atomach wegla.Jako przyklady rodników cykloalkilowych R2 mozna wymienic rodniki o 3—10 atomach wegla (np. cyklopropylowy, cyklobutylowy, cyklopentyló- wy, cykloheksylowy, cykloheptylowy, cyklooktylo- wy, norbornylowy, adamantylowy itp.), ewentualnie sskondensowane z pierscieniem benzenowym jak np. rodnik 1- lub 2-indanylowy, benzocyklobuty- lowy itp.Jako przyklady rodników cykloalkenylowych R2 5 mozna wymienic rodniki o 3—10 atomach wegla (np. 1-cyklobutenylowy, 1-, 2- lub 3-cyklopeiiteny- lowy, l-,2- lub 3-cykloheksenylowy, 4-cyklohepteny- lowy, 1,4-cykloheksadienylowy, 2,4,6-cykloheptatrie- nylowy itp.). 10 Rodnikiem arylowym Rj moze byc np. rodnik fenylowy, a — lub p-naftylowy lub podobne, choc szczególnie pozadany jest rodnik fenylowy.Grupa heterocykliczna R2 moze byc przykladowo 4-, 5- lub 6-czlonowa grupa heterocykliczna z ato- & mem N, 0 i/lub S, nasycona lub nienasycona, ewentualnie skondensowana z pierscieniem benze¬ nowym. Jako przyklady 4-, 5- i 6-czlonowych grup heterocyklicznych z atomem R mozna wymienic rodnik azetydynylowy, pirydylowy (2-, 3- lub 4-pi- 20 rydylowy), 1,2,3,4-czterowodoropirydylowy, pipery¬ dylowy, chinolilowy, 1,2-dwuwodorochinolilowy, 3- lub 4-izochinolilowy, 1,2-dwuwodoroizochinolilowy, pirolilowy, pirolinylowy, pirolidynylowy, indolilowy itp. 5- lub 6-czlonowym rodnikiem heterocyklicz- 25 nym z atomem tlenu moze byc np. rodnik furylowy, piranylowy, dwuwodoropiranylowy, benzofurylowy lub benzopiranylowy, a 5- lub 6-czlonowym rodni¬ kiem heterocyklicznym z atomem siarki moze byc rodnik tienylowy, benzotienylowy lub podobne. 30 Powyzsze grupy heterocykliczne moga zawierac 2—4 heteroatomów, takich samych lub róznych, jak N, O i/lub S. Jako przyklady takich heterocyklicz¬ nych grup mozna wymienic rodnik imidazolilowy, pirazolilowy, pirazynylowy, pirydynylowy, piryda- 35 zynylowy, 2-imidazolilowy, imidazolidynylowy, ben- zoimidazolilowy, indazolilowy, chinoksalilowy, chi- nazolinylowy, cisnolinylowy, 1,4-dioksanylowy, 1,4-benzodioksanylowy, 1-2-lub 1,3-ditiolanyloy, 1,3- -ditianylowy, izoksazolilowy, oksazolilowy, morfoli- 40 nowy, benzoizoksazolilowy, benzoksazolilowy, izo- tiazolilowy, tiazolilowy, benzoizotiazolilowy, benzo- tiazolilowy, benzotiazynylowy, 1,2, 4-, 1,2,5- lub 1,3,4-oksadiazolilowy, 1,2,3-, 1,2,4-, 1,2,5- lub 1,3,4-tia- dazolilowy, 1,2,3-, 1,2,5- lub 1,3,4-triazolilowy, 45 1,3,5-triazynylowy, benzotriazolilowy, 1,2,3,4-tetrazo- lilowy itp.Mówiac ogólnie, jezeli powyzszymi grupami he¬ terocyklicznymi sa grupy silnie zasadowe majace ugrupowania NH, jak rodnik azetydynylowy, 1,2,3,4- 50 -czterowodoropirydylowy, piperydylowy, 1,2-dwu¬ wodorochinolilowy, 1,2-dwuwodoroizochinolilowy, pirolilowy, pirolidynylowy, pirazolilowy, 2-imidazo- linylowy, indazolilowy, morfolinylówy, 1,2,3-, 1,2,5- lub 1,3,4-triazolilowy, benzotriazolilowy, 1,2,3,4-te- 55 trazolilowy itp., to pozadane jest by w polozeniu N byl obecny odpowiedni podstawnik, opisany ponizej lub by do atomu N byl przylaczony rodnik akii- lenowy, równiez nizej opisany.Pierscieniowy rodnik R« (tj. ewentualnie podsta¬ wi wiony rodnik cykloalkilowy, cykloalkenylowy, ary¬ lowy lub heterocykliczny) moze byc ewentualnie przylaczony do karbonylowego atomu wegla rodni¬ ka —COR2 poprzez lancuch alkilenowy. Jezeli ród* nik pierscieniowy jest przylaczony do lancucha alkj- 65 lenowego, to R2 oznacza ewentualnie podstav124 051 5 6 rodnik cykloalkiloalkilowy, cykioalkenyloalkilowy, aralkilowy lub heterocykliczno-alkilowy.Lancuch alkilenowy moze byc prosty lub rozgale¬ ziony i zawierac 1—4 atomów wegla (jak np. mety¬ lenowy, etylenowy, metylometylenowy (etylidenowy), propylenowy, butylenowy, 1-, 2-, lub 3-metylopro- pylenowy, 1- lub 2-etyloetylenowy, propylometyle- nowy,l,l- lub 1,2-dwumetyloetylenowy, izopropylo- metylenowy itp.). Jako przyklady rodników cyklo- alkilowych mozna wymienic l-adamentylometylowy, cykloheksylometylowy, 3-cykloheksylopropylowy, 2-cyklopentylometylowy, 2-cyklopentyloetylowy, cy- klopropylometylowy, cyklobutyloetylowy, cyklopen- tylometylowy, 2-cykloheksyloetylowy, 2-metylo-2- -cykloheksylopropylowy itp.Jako przyklady rodników cykloalkenyloalkilowych mozna wymienic 1-, 2- lub 3-cyklopentenylomety- lowy, 1-, 2- lub 3-cykloheksenylometylowy, 4-cy- kloheptanylo-3-propynylowy, 1,4-cykloheksadienylo- wy itp...Typowymi przykladami rodników aralkilowych sa benzylowy, fenetylowy, 3-fenylopropylowy, a- -betylobenzylowy, 1- metylo-3-fenylopropyIowy, 4-fenylobutylowy itp.Jako przyklady rodników heterocykioalkilowych mozna wymienic 3-indolilometylówy, 3-(3-indolilo) propylowy, 2-pirydylometylowy, 3-pirydylometylo- wy, 4^pirydylometylowy, 3-(2-tienylo)propylowy, 2-benzotiazolilometylowy, 2-benzoksyzolilometylo- wy, 3-benzoizotiazolilometylowy, 3-benzóizoksazoli- lometylowy, furfurylowy, 2-tienylowy itp.Jezeli R2 jest grupa heterocykliczna zawierajaca atom N, w której atom N jest przylaczony do kar- bonylowego atomu wegla rodnika acylowego —COR2 to grupa hydrocykliczna zawsze jest przylaczona do grupy karbonylowej poprzez wyzej wzmiankowany lancuch alkilenowy. Jako przyklady takich rodni¬ ków heterocykliczno-alkilowych z lancuchem alki- lenowym przylaczonym do atomu N mozna wymie¬ nic 1-pirolilometylowy, 2-keto 1-pirolidynylomety- lowy, 1-imidazolilometylowy, 3,5-dwumetylo- 1-pi- razolilometylowy, 1-piperydyloetylowy (lub 1-pipe- rydynoetylowy), 4-morfolinyloametylowy (lub 4-morfolinometylowy), 1-tetrazolilometylowy, 2,5- -dwuketo-1-pirolidynylometylowy, l,3-dwuketo-2- -izoindolilometylowy, 2^tioketo-4-keto-3-triazolidy- mylometylowy, 3,5-dwujodo-4-keto-l,4-dwuwodoro- pirydylo- 1-metylo-l-piperazynylometylowy, 1-indo- liloetylowy itp.Alkilowy, alkenylowy, cykloalkilowy, cykloalke- nylowy, arylowy lub heterocykliczny rodnik R2 moze byc ewentualnie podstawiony grupami alko- skylowymi o 1—4 atomach wegla (jak metoksylowa, etoksylowa, propoksylowa, izopropoksylowa, buto- ksylowa, izobutoksylowa, IIrzed.-butoksylowa, Illrzed.-butoksylowa itp.), grupami alkanokarbony- lowymi o 2—4 atomach wegla (jak acetylowa, pro- pionylowa, butyrylowa, izobutyrylowa itp.) grupami alkoksykarbonylowymi o 2—1 atomach wegla (jak metoksykarbonylowa, etoksykarbonylowa, propo- ksykarbonylowa, izopropoksykarbonylOwa itp.). ato¬ mami chlorowców (jak chlor, brom i jod), grupa nitrowa, cyjanowa, trójfluorometylowa, dwu-Ci_4 alkiloaminowymi (jak dwumetyloaminowa, dwuety- loaminowa, dwupropyloaminowa^ dwuizopropylo- aminowa, dwubytuloaminowa itp.), grupami Ci_4al- kilotio (jak metylotio, etylotio, propylotio, izopro- pylotio, butylotio, izobutylotio, IIrzed.butylotio, Illrzed.butylotio itp.), grupa metylosulfinylowa, 5 metylo&ulfonylowa, ketonowa, tioketonowa C1-4 al- kanokarbonyloamidowa (jak formamidowa, acetami- dowa, propionyloamidowa, butyryloamidowa, izobu- tyryloamidowa itp.) i innymi. Jezeli Rj jest rodni¬ kiem pierscieniowym (np. cykloalkilowym, cykloal- 10 kenylowjrm, arylowym lub heterocyklicznym), to jako takie podstawniki mozna wymienic rodniki alkilowe o 1—4 atomach wegla (np. metylowy, etylowy, pro¬ pylowy, izopropylowy, butylowy, izobutylowy, IIrzed.-butylowy, Ill-rzed.-butylowy itp.). Podstaw- 15 niki moga byc takie same lub rózne i moga byc obecne w liczbie od 1—3.Podstawionym rodnikiem Ci_i8 alkilowym R2 moze byc np. metoksymetylowy, butoksymetylowy, mety- lotiometylowy, 2-metylotioetylowy, 2-etylotioetylo- 20 wy, 2-izopropylotioetylowy, 2-butylotioetylowy, 2-izobutylotioetylowy, acetoksymetylowy, 2-aceto- ksyetylowy, etóksykarbonylometylowy, 2-butoksy- karbonyloetylowy, fluorometylowy, chlorometylo- wy, 2-chloroetylowy, 3-chloropropylowy, 4-chloro- 25 butylowy, 3,3,3-trójchloropropylowy, trójfluorome- tylowy, bromometylowy, 4-bromobutylowy, 5-bro- mopentylowy, jodometylowyj 2-jodoetylowy, l,l-dwumetylo-2,2-dwuchloroetylowy, 2-chloro-l- -chlorometylo-1-metyloetylowy, cyjanometylowy, 30 2-metylosulfirlyloetylowy lub metylosulfonylomety- lowy. Rodnik 1-chlorowinylowy mozna wymienic jako przyklad podstawionego rodnika C2—Ci0 alke- nylowego R2.Jako przyklady podstawionych rodników cy- 35 kio—C»_io alkilowych R2 mozna wymienic 2,2-dwu- metylocyklopropylowy, 2-propylocyklopropylowy, 2-butylocyklopropylowy^ 4-izobutylocykloheksylowy, 2-bromocyklopropylowy, 2-chlorocyklobutylowy, 4-chlorocykloheksylowy, 2-jodocykloheksylowy, 40 2,2-dwufluorocyklobutylowy, 3-metoksycykloheksy- lowy, 2^-dwumetylo-3-acetylocyklobutylowy, 4-ace- tylocykloheksylowy, 2-cyjanocykloheksylowy, 2-cy- janocyklobutylowy, 4-cyjanocykloheksylowy, 4-dwu- metyloaminocykloheksylowy itp. 45 Jako przyklady podstawionego rodnika cy- klo -Ca-io alkenylowego R2 mozna wymienic 2-cyjo- no-2-cyklóheksenylowy, 3,3-dwumetylo-4-cyklobu- tenylowy, 4-etoksykarbonylo-l-cykloheksenylowy, 4-butoksykarbonylo-l-cykloheksenylowy itp. 50 Typowymi przykladami podstawionych rodników arylowych R2 sa 2-, 3- lub 4-metylofenylowy, 4-IIIrzed.-butylofenylowy, 2-, 3- lub 4-chlorofeny- lowy, 2-, 3- lub 4-bromofenylowy, 2-, 3- lub 4-jodo- fenylowy, 2-, 3- lub 4-flourofenylowy, 2- lub 55 4-metoksyfenylowy, 4-butoksyfenylowy, 4-metoksy- karbonylofenylowy, 3-acetylofenylowy, 2-, 3- lub 4-nitrofenylowy, 3- lub 4-cyjanofenylowy, 4-dwu- metyloaminofenylowy, 4-dwuetyloaminofenylowy, 4-acetoksyfenylowy, 4-butyryloksyfenylowy, 2,4-, 60 2,5-, 2,6-, 3,4- lub 3,5-dwuchlorofenylowy, 3,4-dwu- metoksyfenylowy, 2,4,5-trójmetoksyfenylowy, 3,4- -metylenodioksyfenylowy, 3-trójfluorometylofenylo- wy, 4-metoksytiofenylowy, 4-metylosulfonylofeny- lowy, 4-acetamidofenylowy itp. ^5 Ewentualnie podstawionymi lub niepodstawionymi124 051 7 8 4-, 5- lub 6-czlonowymi heterocyklicznymi grupami Rz moga byc przykladowo rodniki l-acetylo-2-aze- tydynylowy, l-metylo-2-pirolilowy, 3-metoksy-3-fu- rylowy, 3-metylo-2-furylowy, 5-metylo-2-furylowy, 5-nitro-2-furylowyy 3-metylo-2-tienylowy, 3-bromo- -4,5-dwumetylo-2-tienylowy, 2-metylo-4-tiazalilowy, l,2-dwumetylo-4-chloro-5Timidazolilowy, l-butylo-4- -pirazolilowy, 2,4-dwuchloro-4-izotiazolilowy, 5-me- tylo-l,2,3,4-tiadiazolilowy, 3,5-dwumetylo-4-izooksa- zolilowy, 2-metylo-5-dwuizopropyloamino-4-oksazo- lilowy, 5-metylo-l,2,5-oksadiazolilowy-3, 4-meto- ksy-l,2,5-ok3adiazolilowy-3, 5-metylo-l,3,4-oksadia- zolilowy-2, 3-metylo-l,2,3-t?iadiazolilowy-5, metylo-1, 3,4-tiadiazolilowy-2, 5-metyIo-l,23-tiadziazolilowy-4, l-metylo-l,2,3-triadiazolilowy-4, 2-etylo-l,2,3,4-tetra- zolilowy-5, 5-nitro-2-pirydynylówy, 6-etylo-4-piry- dynylowy, 5-etoksykarboriylo-3-pirydynylowy, 5- -chloro-3-pirydynylbwy, l-butyrylo-2-piperydynylo- wy, 2-keto-5-piranylowy, 7-metoksy-3,4-dwuwodoro- -2H-piranylowy-2, lracetylo-2-pirolidynylowy, 1- -propylo-5-keto-3-pirolidynylowy, 3-metylo-2,4-dwu- keto-5-5-tiazolinylowy, 4-, 5-, 6- lub 7-nitro-3-indo- lilowy, 5-fluoro-2-indólilowy, 2-metylo-5-metoksy-3- -indolilowy, l-metylo-2-iiidolilowy, 5-chloro-2-ben- zotienylowy, 3-metylo-2-benzofurylowy, 1-metylo- -2-benzoimidazolilowy, 6-nitro-2-benzotiazolilowy, 4-chloro-3-chinolilowy, 6-metoksy^2-chinolilowy, 2,4-dwumetoksy-3-chinolilowy, 2-metylo-l-keto-3- -izokarbostyrylowy, 7-metylo-3-kumarylowy, 4-me- tylo-2-chinazoliIowy, 3-propylo-2-4-dwuketo-5-imi- dazblinylowy, 7-metoksykarbonylo-2-keto-l,2-dwu- wodoro-3-chinazolilowy, 2-furylowy, 2-tienylowy, 3-izoksazolilowy, 4-midazolilowy, 1,2,5-triadiazolilo- wy, 2-, 3- lub 4-pirydylowy, 2-piryhlidynylowy, 2-s-triazynylowy, 1,2-ditiolanylowy, 3-indolilowy, 2-benzotienylowy, 2-benzofurylowy, 3-benzópirazo- lilowy, 2-benzoimidazolilowy, 2-benzoksazolilowy, 3-benzoizoksazolilowy, 3-benzoizotiazolilowy, 2-ben- zotiazolilowy, 2-benzo-l,4-oksazynylowy, 3-chinoli- lowy lub 1-izochinolilowy.Jako przyklady podstawionego cykloalkiloalkilo- wego rodnika R2 mozna wymienic 3-acetylo-2,2-dwu- metylo-1-cyklobutylometylowy, 3-acetoksy-2,2-dwu- metylo-1-cyklobutylometylowy, 2-(3-chloro-l-cyklo- butylo)etylowy, 2,3-dwumetylo-l-cyklopentylomety- lpwy, 2-izopropylo-l-cyklopentylometylowy, cis- lub trans-4-acetamido-l-cykloheksylometylowy, cis- lub trans-4-IIIrzed.-butylo-l-cykloheksylometylowy, cis- lub trans-2-(4-acetamido-l-cykloheksylo)etylowy itp.Jako przyklady podstawionego cykloalkanyloalki- lowego rodnika R2 mozna wymienic 2-(4-izopropylo- -l-cykloheksenylo)etylowy, l-etylo-2-(4-izopropylo- -l-cykloheksenylo)etylowy, 3-metoksy-4-metylo-3- -cykloheksenylometylowy itp.Podstawionym rodnikiem aralkilowym R2 moze byc przykladowo 4-bromobenzylowy, 2-, 3- lub 4-chlorobenzylowy, 2,5- lub 3,4-dwumetoksybenzy- lowy, 4-etoksybenzylowy, 4-fluorobenzylowy, 3- lub 4-metoksybenzylowy, 4-metoksyfenetylowy, 1-, lub 2-naftylometylowy, 2-, 3- lub 4-nitrobenzylowy, 2-nitrofenetylowy, benzylowy, 1-, 2- lub 3-fenylo- propylowy, 2-, 3- lub 4-metylobenzylowy, 3,4,5-trój- metoksybenzylowy lub a-metylofenetylowy.Jako przyklady podstawionego rodnika heterocy- kloalkilowego R2 mozna wymienic 5-etylo-3-indoli- lometylowy, 5-fluoro-3-indolilometylowy, 5-metoksy- -3-indolilometylowy, 5-metylo-3-indolilometylowy, 5-metoksy-39indolilometylowy, 5-metylo-3-indolilo- metylowy, l-metylo-5-tetrazolilometylowy, 2-(l-pi- perydynylo)etylowy itp.Jezeli rodnikiem acylowym Ri lub R/ jest grupa o wzorze 6 (w którym R», R4 i R5 maja wyzej po¬ dane znaczenia), to rodnikami alkilowymi, cykloal- kilowymi i arylowymi Rj, R4 i R6 moga byc przy¬ kladowo odpowiednie grupy wspomniane dla R2.Tak wiec jako przyklady rodników cykloalkiloalki- lowych mozna wymienic odpowiednie rodniki poda¬ ne dla R2.Jako przyklady alkenylowych, cykloalkenylowych i heterocyklicznych rodników R5 mozna wymienic rodniki wymienione dla R2.Jako przyklady grupy alkoksylowej R5 mozna wymienic grupy alkoksylowe o 1—7 atomach wegla (jak metoksylowa, etoksylowa, propoksylowa, izo- propoksylowa, butoksylowa, izobutoksylowa, Ilrzed.- -butoksylowa, Illrzed.-butoksylowa, pentoksylowa, heksylowa, heptoksylowa, itp.) choc korzystne sa grupy alkoksylowe o 1—4 atomach wegla.Cykloalkilowa, arylowa, indolilowa lub imidazo- lilowa grupa R» moze byc ewentualnie przylaczona do a-atomu wegla poprzez lancuch alkanylowy.Równiez przylaczenie rodnika cykloalkilowego, cy- kloalkenylowego, arylowego lub heterocyklicznego R5 moze byc ewentualnie do karbonylowego atomu wegla przyleglego do atomu azotu poprzez lancuch alkilenowy. Jako przyklady takich lancuchów alki- lenowych mozna wymienic lancuchy alkilenowe po¬ dane powyzej dla R2.Tak wiec w przypadku istnienia takiego lancucha alkilenowego R3 oznacza rodnik cykloalkilowy, aral- kilowy, indoliloalkilowy, imidazoliloalkilowy, cyklo- alkenyloalkilowy lub heterocykloalkilowy.Jako przyklady takich grup cykloalkiloalkilo- wych, cykloalkenyloalkilowych, aralkilowych i he- terocykloalkilowych mozna wymienic odpowiednie grupy podane dla R2.Grupa indoliloalkilowa moze byc przykladowo 4-indolilometylowa, 2-(3-indolilometylo)etylowa, 3- -(3-indolilo)propylowa lub 4-(3-indolilo)butylowa.Grupa imidazoliloalkilowa moze byc przykladowo 4-imidazolilometylowa, 2-(4-imidazolilo) etylowa, 3-(4-imidazolilo)propylowa i 4-(4-imidazolilo)butylo- wa.Grupy repezentowane przez R* i R4 jak równiez rodniki alkilowe, alkenylowe, cykloalkilowe, cyklo- alkenylowe, arylowe, heterocykliczne, cykloalkiloal- kilowe, cykloalkenyloalkilowe, aralkilowe i hetero- cyklo-alkilowe reprezentowane przez R5 moga ewentualnie byc podstawione, a takie podstawniki moga byc podobne do wymienionych jako podstaw¬ niki grup reprezentowanych przez R2.Jako przyklady takich podstawionych grup R«, R4 i R5 mozna wymienic odpowiednie podstawione grupy R2.Jako przyklady podstawionego rodnika indolilo- wego Rs mozna wymienic rodnik 5-bromo-2-indoli- lowy, 5-chloro-2-indolilowy, 5-fluoro-2-indolilowy, -5-metoksy-2-indolilowy, l-metylo-2-indolilowy, 5- -metylo-2-indolilowy itp. Podstawionym rodnikiem 10 1)5 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65124 051 imidazolilowym R8 moze byc przykladowo 1-metylo- -5-imjdazolilowy, 3-metylo-5-imidazolilowy lub 2- -metylo-4-4-imidazolilowy.Jako przyklady podstawionych rodników indoli- Joalkilowych R8 mozna wymienic 5-bromo-2-indoli- lometylowy, 5-bromo-2-indoliloetylowy, 5-chloro-2- -indolilometylowy, 5-chloro-2-indoliloetylowy, 5-flu- oro-2-indolilometylowy, 5-fluoro-2-indoliloetylowy, 5-metoksy-2-indolilometylowy, 5-metoksy-2-indolilo- etylowy, l-metylo-2-indolilometylowy, l-metylo-2- -indoliloetylowy, 5-metylo-2-indolilometylowy, 5- -metylo-2-indoliloetylowy itp.Jako przyklady podstawionych rodników imida- zoliloalkilowych R« mozna wymienic l-metylo-5- -imidazolilometylowy, l-metylo-5-imidazoliloetylo- wy, 3-metylo-5-imidazolilometylowy, 3-metylo-5- -imidazoliloetylowy, 2-metylo-4-imidazolilometylo- wy, 2-metylo-4-imidazoliloetylowy, l-metylo-4-imi- dazolilometylowy, l-metylo-4Himidazoliloetylowy itp.Jako przyklady podstawionego rodnika benzylo¬ wego R4 mozna wymienic 4-bromobenzylowy, 2-, 3- lub 4-chlorobenzylowy, 4-fluorobenzylowy, 4-me- toksybenzylowy, 4-etoksybenzylowy, 2-, 3- lub 4- -metylobenzylowy, 3,4-dwumetoksybenzylowy itp.Jako typowe przyklady wyzej opisanych rodni¬ ków N-acylo-a-aminoacylowych o wzorze 6 mozna wymienic rodnik N-acetylo-N-metyloglicylowy, N-benzoilo-N-metyloglicylowy, N-(4-chlorobenzoilo)- -N-metyloglicylowy, N-acetylo-N-benzyloalanylowy, N-acetylo-N-metyloleucylowy, N-acetylo-N-metylo- fenyloalanylowy, 2-(N-acetylo-N-metylo)amino-3- -metoksykarbonylopropionylowy, 2-(N-acetylo-N- -metylo)amino-3-metylomerkaptopropionylowy, 2- -(N-acetylo-N-metylo)amino-3-etylomerkaptopropio- nylowy, Na -acetylo-Na jN^dwumetylohistydynylo- wy, N-acetylo-N-metyloizoleucylowy, N-acetylo-N- •metyloleucylowy, N-acetylo-N-metylometionylowy, N-acetylo-N-metylofenyloalanylowy, N-acetylo-N- -metylotryptofanylowy, N-acetylo-N-metylo-4'-ace- toksytyrozynylowy, N-benzylo-N-metylowalilowy, N-acetylo-N-metylofenyloglycylowy, N-izonikotyno- lilo-N-metylo- a-aminobutyrylowy, (N-acetylo-N- -metylo)amino-3-cyjanopropionylowy, N-acetylo-N- -metylo- l(4,-dwumetyloamimo)fenyloalanylowy itp.Jezeli rodnikiem acylowym Ri jest grupa o wzo¬ rze 7 (w którym Re i R7 sa jak wyzej podano), to rodnikami weglowodorowymi R6 i R7 moga byc przykladowo rodniki alkilowe, alkenylowe, cyklo- alkilowe, cykloalkenylowe, cykloalkiloalkilowe, cykloalkenyloalkilowe, arylowe, aralkilowe, feny- locykloalkilowe, cykloalkilofenylowe, rodnik dwu- fenylowy itp.Jako przyklady rodników alkilowych, alkenylo- wych, cykloalkilowych, cykloalkenylowych, cyklo- alkiloalkilowych, cykloalkenyloalkilowych, arylo- wych i aralkilowych mozna wymienic odpowiednie rodniki podane dla R2.Jako przyklady rodników fenylocykloalkilowych mozna wymienic miedzy innymi rodniki cykloalki- lowe o 3 do 10 atomach wegla (zwlaszcza 3 do 7 atomach wegla), podstawione rodnikiem fenylowym np. 2-fenylocyklopropylowy, 4-fenylocykloheksylowy itp. Jako przyklady rodnika cykloalkilofenylowego mozna wymienic rodnik fenylowy podstawiony jed¬ nym z powyzszych rodników cykloalkilowych, np. 4-cyklopentylofenylowy, 4-cykloheksyloheksylofeny- lowy itp. Rodnkiem dwufenylowym moze byc np. 4-dwufenylowy. s Jako przyklady hetrocyklicznych grup R6 i R7 mozna wymienic 4-, 5- lub 6-czlonowe grupy hete¬ rocykliczne zawierajace atomy N, O i/lub S, nasy¬ cone lub nienasycone i ewentualnie skondensowane z pierscieniem benzenowym. Jako przyklady takich w grup heterocyklicznych mozna wymienic rodnik aze- tydynylowy, pirolilowy, furylowy, tienylowy; tiazo- lilowy, oksazolilowy, izoksazolilowy, pirazolilowy; imidazolilowy, pirydylowy, pirymidynylowy, pira- zynylowy, triazynylowy, chinalilowy, chinazolilowy, I15 chinoksalilowy, indolilowy, benzofuranylowy, benzo- tienylowy itp.R6 i R7 lacznie z atomem N, do którego sa przy¬ laczone, moga tworzyc heterocykliczny rodnik. Jako przyklady takiego rodnika mozna wymienic azety- 30 dynylowy, pirolidynylowy, piperazynylowy, morfo- linylowy itp.Rodniki weglowodorowe i grupy heterocykliczne R6 i R7 oraz heterocykliczne grupa o wzorze 7 moga ewentualnie byc podstawione. Jako przyklady pod- 35 stawhików mozna wymienic grupy alkoksylowe o 1^4 atomach wegla (jak metoksylowa, etoksylowa, propoksylowa, izopropoksylowa, butoksylowa, izo- butoksylowa, IIrzed.-butoksylowa, itp.) grupy Ci_h alkilotio (jak metylotio, etylotio, propylotio, izopro- 30 pylotio, butylotio itp.), grupe fenoksylowa, fenylo- tio, cykloheksoksylowa, atomy chlorowców (np. fluoru, chloru, bromu lub jodu), grupe cyjanowa, C2-5 alkoksykarbonylowa, etoksykarbonylowa, pro- poksykarbonylowa, izopropoksykarbonylowa, buto- 35 ksykarbonylowa, izobutoksykarbonylowa, Ilrzed.- -butoksykarbonylowa itp.), benzoksykarbonylowa, nitrowa, aminosulfonylowa, dwualkiloaminowe (np. dwumetyloaminowa, dwuetyloaminowa, dwuizopro- pyloaminowa, dwubutyloaminowa itp.) i inne. Pod- 40 stawniki te moga byc takie same lub rózne i moga byc obecne w liczbie od 1—3.Jako podstawniki pierscieniowych ukladów we¬ glowodorowych powyzszych rodników weglowodo¬ rowych i wyzej wymienionych grup heterocyklicz- 45 nych mozna wymienic ponadto rodniki alkilowe o 1—4 atomach wegla (które moga byc dalej podsta¬ wione rodnikami weglowodorowymi Re i R7), jak metylowy, etylowy, propylowy, izopropylowy, bu¬ tylowy, trójfluorometylowy, chlorometylowy, 2-cy- 50 janoetylowy, metoksymetylowy, etoksykarbonylo- metylowy, dwumetyloaminometylowy itp.Jako podstawniki rodników alkilowych R6 i R7 mozna wymienic grupy podane jako podstawniki tych rodników weglowodorowych grupy heterocyk- 55 liczne (które moga byc podstawione) podobne do wymienionych jako heterocykliczne grupy R6 i R7.Jako przyklady podstawionych rodników weglo¬ wodorowych Re i R7 mozna wymienic 2-metoksyety- Iowy, 3-metoksypropylowy, 2-metoksy-l-metyloety- 60 Iowy, 3-izopropoksypropylowy, 3-IIrzed.-butoksy- propylowy, 3-cykloheksypropylowy, 3-fenoksypro- pylowy, 2-chloroetylowy, 3-lchloropropylowy, 4- -chlorobutylowy, 2-propylotioetylowy, 2-fenylotio- etylowy, 2-cyjanoetylowy, 5-cyjanopentylowy, 65 4-cyjanocyklpheksylometylowy, metoksykarbonylo-124 051 11 12 metylowy, etoksykarbonylometylowy, 1- lub 2-me- toksykarbonyloetylowy, 1-metoksykarbonylopentylo- wy, 5-dwumetyloaminopentylowy, trójfluorometylo- wy, 2-, 3- lub 4-tolilowy, ksylilowy, 2,4,5- lub 2,4,6-trójmetylofenylowy, 2-, 3- lub 4-chlorofenylo- wy, 2,5-dwuchlorofenylowy, 2-, 3- lub 4-fluorofeny- lowy, 4-bromofenylowy, 4-jodofenylowy, 2- lub 3-trójfluorofenylowy, 2-, 3- lub 4-nitrofenylowy, 4-chloro-3-trójfluorometylofenylowy, 2-metytylo-4- -nitrofenylowy, 5-nitro-l-naftyIowy, 8-chloro-l-naf- tylowy, 4-metoksykarbonylofenylowy, 4-etoksykar- bonylofenylowy, 4-aminosulfonylofenylowy, 2-, 3- lub 4-metoksyfenylowy, 4-etoksyfenylowy, 2,5-dwu- metoksyfenylowy, l-metoksykarbonylo-2-fenetylo- wy, 1-metoksykarbonylo-l-fenylometylowy, 2-, 3- lub 4-metylobenzylowy, 2-, 3- lub 4-chlorobenzylo- wy, 2- lub 3-fluorobenzylowy, 3-jodobenzylowy, 2,4- lub 3,4-dwuchlorobenzylowy, 4-metoksybenzy- lowy, a-metylobenzylowy, 1,1-dwumetylofenetylowy, 4-metoksyfenetylowy, 2-, 3- lub 4-pikolilowy, 5-me- tylo-2-tienylowy, 5-metylofurfurylowy, 3-piperazy- nopropylowy, 2-morfolinoetylowy, 4-metylo-l-pipe- razynylopropylowy, 2(l-metylo-2-pirolidynylo)etylo- wy, 2-tiazolilometylowy, 2-metylo-4-oksazolilome- tylowy, 5-chloro-l-metylo-3-indoliloetylowy itp.Jako przyklady ewentualnie przedstawionych lub niepodstawionych heterocyklicznych grup R6 i R7 mozna wymienic rodnik l-metylo-2-azetydynylowy, l-metylo-2-pirolilowy, 5-metylo-2-furylowy, 5-ni- tro-2-furylowy, 3-metylo-2-tienylowy, 4,5-dwuchlo- ro-2-tienylowy, 2-metylo-4-tiazolilowy, l-metylo-4- -imidazolilowy, 2-metylo-4-chloro-5-imidazolilowy, 3,5-bismetylotio-4-izotiazolilowy, 3-metylo-5-izoksa- zolilowy, 2-metylo-4-oksazolilowy, l-metylo-3-pira- zolilowy, 2-, 3- lub 4-pirydylowy, 4,5,6-trójchloro-2- -pirymidynylowy, 3,5,6-trójchloro-2-pirazynylowy, 4,6-dwuchloro-2-s-triazynylowy, 3- lub 4-chinolilo- wy, 2-chinazolilowy, 2-chinoksazolilowy, 5-fluoro-l- -metylo-3-indolilowy, 2-benzofurylowy, 2-benzotie- nylowy itp. Podstawiona heterocykliczna grupe o wzorze 7 moze byc np.rodnik 2-, 3- lub 4-metylo-l- -piperydynylowy, 4-metylo-l^piperazynylowy, 2,6- -dwumetylomorfolino lub 2-propylo-l-piperydyny- lowy.Jako typowe przyklady grupy o wzorze 7, w któ¬ rym zarówno Re jak i R7 sa rózne od atomu wo¬ doru, mozna wymienic grupe dwumetyloaminowa, dwuetyloaminowa, dwupropyloaminowa, dwuizopro- pyloaminowa, dwuizobutyloaminowa, dwubenzylo- aminowa, dwufenetyloaminowa, dwufenylopropylo- aminowa, (N-metylo-N-benzylo)aminowa,. (N-etylo- -N-butylo)aminowa, (N-metylo-N-cyklopentylo)ami- nowa, (N-metylo-N-cykloheksylo)aminowa, (N-mety- lo-N-furfurylo)aminowa itp.Jezeli rodnik acylowy Ri jest grupa o wzorze —COOR8 (w którym R8 ma wyzej podane znaczenia), to weglowodorowym rodnikiem R8 moze byc np. ro¬ dnik alkilowy, cykloalkilowy, arylowy lub aralki- lowy.Jako przyklady rodnika alkilowego R8 mozna wy¬ mienic rodniki, alkilowe o 1 do 18 atomach wegla (jak metylowy, etylowy, propylowy, izopropylowy, butylowy, izobutylowy, IIrzed.-butylowy, Illrzed.- -butylowy, pentylowy, heksylowy, benzylowy, okty- lowy, nonylowy, decylowy, undecylowy, dodecylowy, tetradecylowy, heksadecylowy, oktadecylowy, 1-ety- lopropylowy, neopentylowy, 1-etylopentylowy, 1- lub 2-etyloheksylowy), choc korzystne sa miedzy innymi rodniki alkilowe o 1—8atomach wegla. 5 Jako przyklady rodników cykloalkilowych Rg mozna wymienic rodniki cykloalkilowe o 3—10 ato¬ mach wegla (jak cyklopropylowy, cyklobutylowy, cyklopentylowy, cykloheksylowy, cykloheptylowy, cyklooktylowy, lub adsamantylowy). 10 Jako przyklady rodników arylowych R7 mozna wymienic fenylowy lub «- lub 0-naftylowy.Jako przyklady rodników aralkilowych R8 moze byc ewentualnie podstawiony, a podstawnikami mo¬ ga byc grupy alkoksylowe o 1—4 atomach wegla *5 (jak metoksylowa, etoksylowa, propoksylowa, izo- propoksylowa, butoksylowa, izobutoksylowa, Ilrzed.- -butoksylowa), grupa fenoksylowa, benzoksylowa. atomy chlorowców (np. fluoru, chloru, bromu lub jodu) oraz grupa cyjanowa. Podstawniki moga byc 20 takie same lub rózne i moga byc obecne w liczbie od 1—3.Jako podstawniki pierscieniowych weglowodoro¬ wych ukladów rodników weglowodorowych (np. cy¬ kloalkilowych lub arylowych) mozna wymienic, 25 oprócz wyzej wspomnianych, rodniki alkilowe o 0- kolo 1—4 atomach wegla (jak metylowy, etylowy, propylowy, izopropylowy, lub butylowy) oraz chlo¬ rowcowane rodniki alkilowe o 1—4 atomach wegla (jak chlorometylowy, bromometylowy, dwuchloro- 80 metylowy, chlorodwufluorometylowy i trójfluorome- tylowy.Jako przyklady podstawionych rodników alkilo¬ wych R8 mozna wymienic miedzy innymi 2-meto- ksyetylowy, 2-etoksyetylowy, 2-butoksyetylowy 2- -etoksyetylowy, 2-butoksyetylowy 4-etoksybutylowy, chlorometylowy, 1- lub 2chloroetylowy, 2-bromoety- lowy, 2-fluoroetylowy, 3-chloropropylowy, 2,3-dwu- chloropropylowy, 2-chloroizopropylowy, 1-chlorome- tylo-2-chloroetylowy, 2,2,2-trójchloroetylowy, 2,2,2- trójfluoroetylowy i 1- lub 2-cyjanopropylowy.Jako przyklady podstawionego rodnika cykloalki- lowego R8 mozna wymienic miedzy innymi 1-mety- locyklobutylowy, 1-metylocyklopentylowy i 1-mety- ^ locykloheksylowy.Typowymi przykladami podstawionych rodników aralkilowych R8 sa miedzy innymi 2-, 3- lub 4-chlo- robenzylowy, 4-bromobenzylowy, 4-metoksybenzylo- wy, 2,5- lub 3,4-dwumetoksybenzylowy i 3-chloro-4- 50 -metylobenzylowy.Typowymi przykladami podstawionych rodników arylowych R8 sa miedzy innymi 2-, 3- lub 4-mety- lofenylowy, 2-, 3- lub 4-metoksyfenylowy, 4-etoksy¬ fenylowy, 2-, 3- lub 4-chlorofenylowy, 4-fluorofe- 55 nylowy, 2,4-dwuchlorofenylowy, 2-, 3- lub 4-chlo- rometylofenylowy, 4-trójfluorometylofenylowy, 4-bromofenylowy i 3-dwumetyloaminofenylowy.Mikroorganizmy oznaczone wyzej podanymi nu¬ merami IFO sa zdeponowane w Instytucie Fermen- 60 tacyjnym w Osaka, lista kultur 1978, wydanie szó¬ ste, wydanej przez Instytut Fermentacyjny w Osaka, Japonia. Sposród wyzej wymienionych, mikroorga¬ nizmy oznaczone numerami IFO 12108, IFO 12770, IFO 12901 i IFO 12894 znajduja sie równiez na 65 liscie kultur Instytutu Fermentacyjnego w Osaka124 051 13 14 z roku 1972, wydanie piate, a oznaczony numerem IFO 13452 na liscie kultur z roku 1975, suplement do wydania piatego. Mikroorganizmy z wyzej wy¬ mienionych list moga byc otrzymywane z tegoz In¬ stytutu.Jako pozywke w hodowli mikroorganizmu mozna stosowac jakakolwiek pozywke plynna lub stala, zawierajaca skladniki odzywcze zuzytkowane przez dany mikroorganizm. W operacjach na skale prze¬ myslowa korzystna jest pozywka plynna. Pozywke przygotowuje sie ze zródel wegla, które sa asymi- lowane przez mikroorganizm i ze zródel azotu, ma¬ terialów nieorganicznych, skladników sladowych itp. zuzytkowanych przez mikroorganizm.Jako tego rodzaju zródla wegla mozna stosowac glukoze, laktoze, sacharoze, maltoze dekstryne, skro¬ bie, gliceryne, mannit, sorbit, tluszcze i oleje (np. olej sojowy, olej smalcowy, olej kurzy itp.) oraz inne, a zródlem azotu moze byc ekstrakt miesny, ekstratkt drozdzowy, suszone drozdze, maka sojowa, namok kukurydziany, pepton, maka z nasienia ba¬ welny, odpadowa melasa, mocznik, sole amonowe (np. siarczan amonu, chlorek amonu, azotan, amo¬ nu, octan amonu itp.) i inne. Pozywka moze po¬ nadto zawierac odpowiednie ilosci soli, jak sodowe, potasowe, wapniowe, magnezowe itp., sole metali jak zelaza, manganu, cynku kobaltu, niklu itp. sole kwasu fosforowego i borowego oraz sole kwasów organicznych, jak octowy, propionowy itp.Pozywka moze zawierac równiez inne skladniki jak aminokwasy (np. kwas glutaminowy, kwas aspa¬ raginowy, alanina, glicyna, lizyna, metionina, pro- lina itp.) peptydy (np. dwupeptydy, trójpeptydy itp), witaminy (np. Bi, B2, kwas nikotynowy, B^, C, E itp.) kwasy nukleinowe (jak puryna, pirymidyna i ich pochodne itp.) i inne. Mozna oczywiscie do¬ dawac równiez nieorganicznych i organicznych kwa¬ sów, zasad, buforów itp. w celu korygowania pH pozywki oraz odpowiednich ilosci olejów, srodków powierzchniowo czynnych itp., jako srodków prze- ciwpiennych.Hodowle mozna prowadzic jakimkolwiek sposo¬ bem, stacjonarnie, na wstrzasarce lub przy miesza¬ niu w warunkach aerobowych. Oczywiscie, w ope¬ racjach przemyslowych korzystna jest podpowierz- chniowa hodowla aerobowa. Warunki hodowli za¬ leza od kondycji i skladu pozywki, mikroorganizmu, sposobu hodowli itd. Zwykle pozadane jest prowa¬ dzenie hodowli w 20—45°C i przy poczatkowym pH zblizonym do obojetnego. W srodkowym stadium hodowli pozadana jest temperatura 24—37°C, a po¬ zadana poczatkowa wartoscia pH jest 6,5—8,5. Fer¬ mentacja trwa od okolo 6—100 godzin, z tym ze szczególnie pozadany jest czas inkubacji 16—60 go¬ dzin.Termin „brzeczka fermentacyjna" oznacza w ni¬ niejszym opisie produkt otrzymany w wyzej opi¬ sanym procesie hodowli. Termin „przerobiona ma¬ teria brzeczki fermentacyjnej" oznacza komórki lub komórki roztarte, zawierajace enzymatyczny uklad demetylacyjny, uzyskiwany przez poddanie wyzej wzmiankowanej brzeczki fermentacyjnej obróbce fizycznej lub chemicznej jak saczenie, wirowanie, dzialanie ultradzwieków, obróbka w „prasie fran¬ cuskiej", rozcieranie z tlenkiem glinu lub obróbka enzymem bakteriolitycznym, srodkiem powierzchnio¬ wo czynnym lub organicznym rozpuszczalnikiem.Z powodzeniem mozna równiez stosowac deme¬ tylacyjny uklad enzymatyczny, oczyszczony konwen- 5 cjonalnym sposobem lub komórki bakteryjne lub demetylacyjny uklad enzymatyczny immobilizowa- ny konwencjonalnym sposobem.Jak wspomniano sposób wedlug wynalazku po¬ lega na kontaktowaniu wyjsciowego zwiazku o wzo- 10 rze 2 z brzeczka fermentacyjna lub przerobiona materia brzeczki fermentacyjnej. Stezenie zwiazku wyjsciowego w ukladzie reakcyjnym wynosi 1—4 [xg/ml, korzystnie 1—200 jig/ml, a zwalszcza 50— —200 pygml. Korzystna temperatura reakcji jest 15 20—50°C, a korzystnym zakresem pH 5—10.. Szcze¬ gólnie pozadana jest temperatura 24—40°C i pH 6—9. Czas reakcji wynosi od 10 do 100 godzin, ko¬ rzystnie 1—48 godzin, a zwlaszcza 8—28 godzin.Warunki reakcji obejmuja hodowle stacjonarna, na 20 wstrzasarce, aerobowa podpowierzchniowa lub przy mieszaniu.Korzystnie jest prowadzic reakcje w warunkach hodowli na wstrzasarce, przy napowietrzaniu lub przy mieszaniu. Jezeli to jest pozadane, mozna do 25 ukladu reakcyjnego dodawac stymulatora reakcji, stabilizatora enzymu lub innych czynników.Jako przyklady stymulatorów reakcji mozna wy¬ mienic koenzymy, jak dwunukleotyd nikotynamid- -adenina (NAD), fosforan dwunukleotydu nikotyna- 20 mid-adenina (NAD), fosforan dwunukleotydu niko- tynaninadenina (NADP), monomukleotyd flawina (FAN), dwunukleotyd flawina-adenina (FAD) itp., ich prekursory (jak adenina, adenozyna, kwas ade¬ nylowy, nikotynamid, flawina, ryboflawina itp.) sole 35 metali (jak chlorek magnezu, chlorek manganu, chlo¬ rek zelazawy, chlorek zelazowy, chlorek cynku itp), srodki powierzchniowo czynne (jak Triton L-100, produkcji Rohm and Haas Company, USU, Brij-58, produkcji Kao-Atlas Co., Japonia) itp.), 3',5'-cyklicz- 40 ny kwas adenylowy itd. Stabilizatorem enzymu moze byc np. cysteina, 2-merkaptoetanol, ditiotrei- tol, sacharoza lub gliceryna.Tak otrzymane nowe zwiazki o wzorze 1 mozna wykrywac chromatografia cienkowarstwowa (dalej 45 oznaczano skrótowo TLC). Mieszanine reakcyjna ekstrahuje sie octanem etylu, ekstrakt zateza do 1/100 objetosci poczatkowej, a TLC przeprowadza na koncentracie, stosujac plyty powleczone zelem krzemionkowym (Kieselgel 60 F254, Merck, RFN, 0,25 50 mm, 20X20 cm), i uklad chloroform-metanol 9 :1.Zadany zwiazek wykrywa sie przez naswietlanie promieniowaniem nadfioletowym o dlugosci fali 2537 nm.Produkt (zwiazek o wzorze 1) mozna wyodrebniac 55 z mieszaniny reakcyjnej sposobami zwykle stoso¬ wanymi do odzyskiwania metabolitów drobnoustro¬ jów, wykorzystujac slabe kwasowe i lipofilne wlas¬ ciwosci zwiazków tej klasy. Przykladowo, mozna stosowac sposoby wykorzystujace róznice rozpusz- *° czalnosci zwiazku o wzorze 1 i zanieczyszczen, róz¬ nice powinowactwa adsorpcyjnego do rozmaitych ad¬ sorbentów, jak wegiel aktywny, makroporowate niejonowe zywice, zel krzemionkowy, tlenek glinu itp. zwiazku o wzorze 1 i zanieczyszczen oraz usu- 05 wanie zanieczyszczen za pomoca zywic jonitowych.124 051 15 16 Powyzsze sposoby mozna stosowac pojedynczo, lacznie lub kolejno. W sposobach polegajacych na róznicy rozpuszczalnosci stosuje sie odpowiedni roz¬ puszczalnik, jak nie mieszajacy sie z woda rozpu¬ szczalnik organiczny, np. ester kwasu tluszczowego (octan etylu, octan amylu itp.) alkohol (np. butanol), keton (np. keton metyloizobutylowy), chlorowcowa¬ ne weglowodory (np. chloroform) itp. Ekstrakcje prowadzi sie z roztworu slabo kwasnego. Korzy¬ stnie, zwiazek o wzorze 1 ekstrahuje sie octanem etylu z przesaczu brzeczki fermentacyjnej dopro¬ wadzonego do pH 6. Ekstrakt przemywa sie woda i odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem. Do po¬ zostalosci dodaje sie niepolarny rozpuszczalnik i wy¬ traca surowy produkt (i), zawierajacy zwiazek czyn¬ ny. Jako niepolarny rozpuszczalnik mozna stosowac eter naftowy.Poniewaz TLC tego surowego produktu daje licz¬ ne plamy poza odpowiadajaca nowemu zwiazkowi demetylomaytanzynoidowemu o wzorze 1, przepro¬ wadza sie etapowe oczyszczanie nastepujacym spo¬ sobem. Zwykle uzyteczne do tego celu sa rozmaite techniki chromatograficzne, a sposród adsorbentów zwykle nosniki, jak zel krzemionkowy, tlenek gli¬ nu i makroporowate niejonowe zywice adsorbento- we. Jednakze sposród powyzszych adsorbentów naj¬ korzystniejszy do oczyszczania surowego produktu (i) jest zel krzemionkowy. Rozwijanie zapoczatko¬ wuje sie eterem naftowym i heksanem, a elucje nowego zwiazku demetylomaytanzynoidowego o wzo¬ rze 1 przeprowadza rozpuszczalnikiem z domieszka jednego lub wiecej rozpuszczalników polarnych, jak octan etylu, aceton, etanol lub metanol.Przykladowo, przeprowadza sie chromatografie kolumnowa stosujac jako nosnik zel krzemionkowy (Merck, RFN 0,05 do 0,2 mm), a eluujac mieszanina octanu etylu z heksanem o zmiennym stosunku skladników. Wyciek sprawdza sie za pomoca TLC, a frakcje zawierajace zwiazek demetylomaytanzy¬ noidowy o wzorze 1 laczy, zateza pod zmniejszonym cisnieniem i zadaje eterem naftowym lub heksanem, wytracajac surowy produkt (ii). Poniewaz produkt nadal zawiera zanieczyszczenia, oczyszcza sie go dalej jak nizej opisano. Przykladowo, drugie oczy¬ szczanie przeprowadza sie na drugiej kolumnie z ze¬ lem krzemionkowym, stosujac inny uklad rozpusz¬ czalników.Rozwijanie rozpoczyna sie chlorowcowanym we¬ glowodorem, jak dwuchlorometan Lub chloroform, a elucje prowadzi rozpuszczalnikiem zmieszanym z rozpuszczalnikiem polarnym, jak alkohol (np. eta¬ nol, metanol itp.) lub keton (np. aceton, keton me- tyloetylowy itp.), odzyskujac nowy zwiazek deme¬ tylomaytanzynoidowy o wzorze 1. Kolejnosc stoso¬ wania ukladów rozpuszczalników w obu chroma¬ tografiach kolumnowych mozna odwrócic. Mozliwe jest równiez stosowanie innych odpowiednich kom¬ binacji zwyklych, dostepnych rozpuszczalników or¬ ganicznych.Jezeli do oczyszczania surowego produktu (ii) sto¬ suje sie makroporowata zywice adsorbentowa, to nowy zwiazek demetylomaytanzynoidowy o wzorze 1 mozna wydzielic w drodze elucji mieszanina niz¬ szego alkoholu, nizszego ketonu lub estru z woda.Jako przyklady nizszych alkoholi mozna wymienic miedzy innymi metanol, etanol, propanol i butanoL Nizszym ketonem moze byc np. aceton lub keton metyloetylowy. Estrem moze byc np. octan etylu.W przykladowym sposobie postepowania, surowy produkt rozpuszcza sie w mieszaninie 1 : 1 wody z alkoholem i adsorbuje na kolumnie z nosnikiem Diaion HP-10 (Mitsubishi Chemical Industries Ltd.).Kolumne przemywa sie ta sama mieszanina, a na¬ stepnie eluuje 90% (objetosc w objetosci) metano¬ lem, otrzymujac zadany nowy demetylomaytanzy¬ noidowy zwiazek o wzorze 1.Tak otrzymany demetylomaytanzynoidowy zwia¬ zek wydziela sie z roztworu przez odparowanie pod zmniejszonym cisnieniem i przekrystalizowuje z oc¬ tanu etylu. Alternatywnie, po zatezeniu roztworu do koncentratu dodaje sie eteru naftowego i odzyskuje wytracony proszek.Przez deacylowanie demetylomaytanzynoidowego zwiazku o wzorze 5, w którym Ri' oznacza rodnik acylowy, otrzymuje sie demetylomaytanzynoidowy zwiazek o wzorze 3. Poniewaz rodnik acylowy znaj¬ duje sie w polozeniu 0 w stosunku do grupy kar- bonylowej, z powodzeniem mozna zastosowac kon¬ wencjonalna reakcje redukcyjnego odszczepienia, np. za pomoca kompleksowego wodorku metalu (jak wodorek litowoglinowy, LiAlH4) w niskiej tempe¬ raturze (np. —20° do 0°C). Takie warunki reakcji nie oddzialuja na inne grupy funkcyjne, jak kar- bonylowa, epoksydowa, podwójne wiazanie miedzy atomami wegla itp. Deacylowany zwiazek o wzo¬ rze 1 mozna wyodrebnic i oczyscic wyzej podanymi sposobami.Jezeli w rodniku acylowym demetylomaytanzy- nowego zwiazku o wzorze 1 wystepuje stereoizo- meria (np. postac D- i D-rodnika Ri), to zwiazek ten moze wystepowac w postaci czystych izomerów lub ich mieszaniny. Izomeria wystepuje zwykle juz w wyjsciowym zwiazku o wzorze 2, który to zwia¬ zek mozna rozdzielic, jak dalej opisano szczególowo, na skladowe izomery, stosujac w tym celu ogólnie znane, konwencjonalne sposoby, jak chromatografia na zelu krzemionkowym lub wysokocisnieniowa chromatografia cieczowa.W sposobie wedlug wynalazku, w wielu przypad¬ kach izomeria zwiazku o wzorze 1 jest taka sama, jak izomeria zwiazku o wzorze 2.Jezeli jako substrat reakcji stosuje sie mieszanine izomerów zwiazku o wzorze 2, to równiez produkt — zwiazek o wzorze 1 otrzymuje sie w postaci mie¬ szaniny izomerów. Izomery te zwykle mozna roz¬ dzielic ogólnie znanymi sposobami, np. chromato¬ grafia na zelu krzemionkowym.Wytwarzane sposobem wedlug wynalazku zwiaz¬ ki o wzorze 1 mozna stosowac jako czynniki prze- ciwgrzybicze, przeciwpierwotniakowe i przeciwno- wotworowe. Toksycznosc zwiazków o wzorze 1 jest niska.Zwiazek o wzorze 1 mozna równiez stosowac jako produkt przejsciowy w produkcji uzytecznych le¬ ków.Próbe czynnosci biologicznej przeprowadzono na zwiazkach otrzymanych w dalej opisanych przykla¬ dach.Czynnosc biologiczna.A) Czynnosc przeciwdrobnoustrojowa. Stosujac 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 $0124 051 17 18 jako pozywke agar tryptykazowo-sojowy (Baltimo- Te Biologicals Limited, USA), oznaczono minimalne stezenie hamujace zwiazku o wzorze 1 wobec nizej podanych mikroorganizmów. Badania przeprowa¬ dzono metoda krazków bibuly. Stosowano krazki z bibuly typu cienkiego, wytwarzane przez Toyo Seisakusho, Japonia, o rsednicy 8 mm, które przed nalozeniem na plyte z pozywka zakazona odpowied¬ nim mikroorganizmem nakraplano 0,02 ml roztworu demetylomaytanzynoidowego zwiazku z o wzorze 1 o stezeniu 300 fig/ml. Zwiazek nie wykazal czynnosci wobec Escherichia coli, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus substilis, Bacillus cereus, Klebsiel- la pneumoniae, Serratia macescens i Mycobacterium avium.Badania czynnosci przeciwgrzybiczej zwiazku o wzorze 1 przeprowadzono na plytach agarowych (3,5 g wodorofosforami dwusodowego, 0,5 g fosfora¬ nu monopotasowego, 5 g ekstraktu z drozdzy (Difco), 10 g glukozy, 15 g agaru, 1000 ml wody destylo¬ wanej, pH 7,0) metoda krazków bibuly, stosujac jako organizm testowy Hamigera avellanea IFO 7721.Mierzono szerokosc stref zahamowania wzrostu wo¬ kól krazków nakroplonych 0,02 ml roztworu deme¬ tylomaytanzynoidowego zwiazku o wzorze 1, o ste¬ zeniu 100 jjig/ml.Badania wykazaly, ze demetylomaytanzynoidowy zwiazek o wzorze 1 hamuje wzrost testowego mikro¬ organizmu. Wielkosc stref zahamowania wzrostu jest przedstawiona w tablicy 1.Z kolei badano czynnosc demetylomaytanzynoido¬ wego zwiazku o wzorze 1 wobec Tetrahymena py- riformis W, na pozywce o skladzie: 20 g peptonu tryptozowego (Difco Co.), 1 g ekstraktu z drozdzy, 2 g glukozy, 1000 ml destylowanej wody, 10 ml IM buforu fosforanowego (pH 7,0). Mikroorganizm in- kubowano w 28°C w ciagu 44 do 48 godzin, a czyn¬ nosc hamowania wzrostu oznaczano metoda seryj¬ nych rozcienczen. Z uzyskanych danych wynika, ze demetylomaytanzynowy zwiazek o wzorze 1 jest czynny wobec organizmu testowego. Strefy hamo¬ wania wzrostu i minimalne stezenia hamujace zwiazku przedstawiono w tabeli 1.B) Czynnosc przeciwnowotworowa. W próbie przeprowadzonej na myszach, którym dootrzewno- wo transplantowano komórki nowotworowe P-388, przy dootrzewnowym podawaniu raz dziennie w ciagu kolejnych 9 dni demetylomaytanzynowy zwia¬ zek o wzorze 1 wyraznie przedluzal czas zycia.C) Toksycznosc ostra. Przy dozylnym podawaniu myszom demetylomaytanzynoidowy zwiazek o wzo¬ rze 1 nie wywolywal zadnej smiertelnosci w dawce 1000 jig/kg.Poniewaz demetylomaytanzynoidowe zwiazki o wzorze 1 silnie hamuja wzrost grzybów i pierwot¬ niaków, sa one uzyteczne jako czynniki przeciw- grzybicze i przeciwpierwotniakowe, a poniewaz przedluzaja zycie ssaków z nowotworami, oczekuje sie, ze beda uzyteczne jako czynniki przeciwnowo- tworowe.Jako czynnik przeciwgrzybiczy i przeciwpierwot- niakowy, demetylomaytanzynoidowy zwiazek o wzO' rze 1 moze byc stosowany do badania flory bak¬ teryjnej próbek gleby, osadów czynnych i plynów Tabela 1 Badany zwiazek i 20-demetoksy-20-hy- droksymaytanzynol 20-demetoksy-20-hy- droksymaytanacyna propionian 20-deme- toksy-20-hydroksy maytanzynolu 3-izomaslan 20-deme- toksy-20-hydrok3y- maytanzynolu (PDM-3) 3-maslan 20-deme- toksy-20-hydroksy- maytanzynolu (PDM-3') 3-izowalerianian 20-de- metoksy-20-hydroksy- maytanzynolu 3-pentanokarboksylan 20-demetoksy-20-hy- droksymaytanzynolu 3-fenylooctan 20-de- metoksy-20-hydroksy- maytanzynolu 3-cykloheksanokarbo- ksylan 20-demetoksy- 20-hydroksymaytan- zynolu 3-p-chlorobenzoesan 20-demetoksy-20-hy- droksymaytanzynolu 3-pikolinian 20-deme- toksy-20-hydroksy- maytanzynolu 3-N-fenylokarbami- nian 20-demetoksy-20- hydroksymaytanzynolu 20-demetoksy-20-hy- droksymaytanzyna (L) 20-demetoksy-20-hy- droksymaytanzyna (D) 20-demetoksy-20-hy- droksymaytanprina (L) 20-demetoksy-20-hy- droksymaytanprina (L) 20-demetoksy-20-hy- droksymaytanwalina (L) 3-izomaslan 20-deme- toksy-20-hydroksy- dechloromaytanzynolu 3-fenylooctan 20-de- metoksy-20-hydroksy- maytanzynolu Czynnosc przeciw- grzybicza (0 mm) Hamigera avellanea IFO 7721 2 <8 10 15 21 21 24 21 23 20 10 10 <8 19 <8 23 24 24 16 15 Czynnosc przeciw- pierwot- niakowa MIC (0 ng/ml) Tetrahy¬ mena py- riformis W ~"3 40 10 2 do 4 2 2 1 1 do 2 1 do 2 1 do 2 4 4 S 2 do 4 16 1 do 2 1 do 2 2 4 do 8 4 do 8 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60124 051 19 20 ustrojowych zwierzat. Tak wiec w celu wyodreb¬ nienia z próbki gleby uzytecznych bakterii lub dla oznaczenia czynnosci bakterii niezaleznie od czyn¬ nosci grzybów (w pracy i analizie ukladów z osa¬ dem czynnym do obróbki scieków), mozna zastoso¬ wac zwiazek o wzorze 1 dla zapewnienia wybiór¬ czego wzrostu flory bakteryjnej, nie pozwalajac na wzrost obecnych w próbkach grzybów. Przyklado¬ wo, badana próbke dodaje sie do plynnej lub stalej pozywki, nastepnie dodaje sie 0,1 ml roztworu de- metylomaytanzynoidowego zwiazku o wzorze 1 w 1% wodnym metanolu, o stezeniu 10 do 100 [xg/ml, i przeprowadza inkubacje.Poniewaz zwiazek o wzorze 1 wykazuje czynnosc przedluzania zycia np. myszy, moze byc równiez stosowany jako przeciwnowotworowy czynnik do leczenia nowotworów u ssaków (np. myszy, szczura, psa i kota).Jako czynnik nowotworowy, zwiazek o wzorze 1 moze byc podawany doustnie lub innymi drogami.W przypadku podawania droga inna niz doustnie, korzystne sa iniekcje. Stosowac mozna np. iniekcje podskórna, dootrzewnowa, dozylna lub domiesniowa.Dawka moze wynosic od okolo 12,5 do 1000 [xg, ko¬ rzystnie od okolo 50 do okolo 800 [xg na kg wagi ciala, aczkolwiek mozna ja zwiekszac lub zmniejszac w zaleznosci od kondycji i gatunku zwierzecia i in¬ nych czynników. Roztwory iniekcyjne mozna spo¬ rzadzac np. przez rozpuszczenie okolo 500 ^g do okolo 10 mg zwiazku o wzorze 1 w okolo 0,5 ml alkoholu (np. metanolu lub etanolu) i dodanie fizjo¬ logicznego roztworu soli do objetosci 10 ml. Jezeli dawka jest mala, to powyzszy roztwór mozna dalej rozcienczyc fizjologicznym roztworem soli.Stwierdzono, ze rozpuszczalnosc demetylomaytan- zynoidowego zwiazku o wzorze 1 w wodzie jest wyraznie wyzsza.W niniejszym opisie zwiazek o wzorze 1, w któ¬ rym Ri = —COCH(CH3)2, a X = Cl (tj. 3-izomaslan 20-demetoksy-20-hydroksymaytanzynolu) oznacza sie symbolem PDM-3, zwiazek o wzorze 1, w którym Ri = —CO(CH2)2CH3, a X = Cl (tj. 3-maslan 20-de- metoksy-20-hydroksymaytanzynolu) symbolem PDM- -3', a zwiazek o wzorze 1, w którym Ri = —COCH2 CH(CH3)2, a X = Cl (tj. 3-izowalerianian 20-deme- toksy-20-hydroksymaytanzynolu) symbolem PDM-4.Wyjsciowy zwiazek o wzorze 2, w którym Ri = = —COCH(CH3)2, a X = Cl nazywa sie ansamyto- cyna P-3, zwiazek o wzorze 2, w którym Ri = = —CO(CH2)2CH3, a X = Cl ansamytocyna P-3', a zwiazek o wzorze 2, w którym Ri = —COCH2CH (CH8)2, a X = Cl ansamytocyna P-4.Zwiazkiem wyjsciowym moze byc jedna ze zna¬ nych maytanzyn, ansamitocyn lub inny. Maytanzy- ny sa opisane np. w opisie patentowym Stanów Zjedn. Ameryki nr 3 896 111. Maytanacyne i propio- nian maytanzynolu mozna równiez otrzymac w spo¬ sób opisany w Jurnal of the American Chemical Society 97, 5294 (1975) lub z hodowli Nocardia sp.No. C-15003 (FERM-P No. 3992, IFO 13726, ATCC- -31281) w pozywce, wyodrebniajac metabolit z brzeczki fermentacyjnej (patrz japonskie zglosze¬ nie patentowe-wylozenie nr 121998/1978, zgloszenie patentowe w RFN, wylozone jako Offenlegungs¬ schrift 2 746 253). Ansamytocyne P-3, ansamytocyne P-3' i ansamytocyne P-4 mozna otrzymywac z ho¬ dowli wyzej wzmiankowego mikroorganizmu No¬ cardia sp. No. C-15003 (patrz japonskie zgloszenie patentowe-wylozenie nr 130693/1978; zgloszenie pa¬ tentowe,w RFN, wylozone jako Offenlegungsschrift 2 746 209).Zwiazek o wzorze 2 mozna równiez otrzymac acy- lujac maytanzynol lub dechloromaytanzynol kwa¬ sem karboksylowym o wzorze RiOH (gdzie Ri ma wyzej podane znaczenie) lub reaktywna pochodna tego kwasu.Maytanzynol, który jest stosowany do wytwarza¬ nia zwiazku o wzorze 2, jest zwiazkiem znanym jako skladnik roslin (Kupchan i inni, J. Am. Chem.Soc. 97, 5294, 1975) i moze byc równiez otrzymany przez redukcyjne rozszczepienie zwiazków maytan- zynowych.Ponadto, maytanzynol mozna otrzymac przez fer¬ mentacje Nocardia sp. No. C-15003 (FERM-p No. 3992, IFO^ 13726, ATCC-31281) w pozywce, otrzymu¬ jac maytanacyne, propionian maytanzynolu lub an- samytocyny o wzorze 8, w którym R9 oznacza rod¬ nik acetylowy, propionylowy, izobutyrylowy, n-bu- tyrylowy lub izowalerylowy i poddajac metabolity reakcji redukcyjnego rozszczepienia estru za pomo¬ ca wodorku metalu, np. LiAlH4 (patrz Nature vol. 270, 721, 1977 lub japonskie zgloszenie patentowe- -wylozenie nr 130693/1978; zgloszenie patentowe w RFN, wylozone jako Offenlegungsschrift 2 746 209).Dechloromaytanzynol mozna otrzymac przez re¬ dukcje zwiazku o wzorze 2, w którym X oznacza atom chloru, za pomoca wodorku metalu. Jako wo¬ dorek metalu korzystnie stosuje sie zwiazek kom¬ pleksowy, jak wodorek litowoglinowy (LiAlH4), zwykle w ilosci okolo 1 do 25 moli, korzystnie 4 do 10 moli na mol zwiazku wyjsciowego o wzorze 2 (X = Cl). Redukcje przeprowadza sie w rozpusz¬ czalniku, takim jak eter (np. eter dwuetylowy, czte- rowodorofuran itp.). Zwykle reakcje mozna przepro¬ wadzic w okolo —70 do okolo +80°C, korzystnie okolo -40 do kolo +20°C.W wielu przypadkach ubocznym produktem re¬ akcji jest zwiazek, w którym zostala odszczepiona grupa acylowa w polozeniu 3, tj. maytanzynol. Po przeprowadzeniu redukcji niszczy sie nadmiar czyn¬ nika redukujacego, np. dodajac wody, kwasu octo¬ wego lub octanu etylu i po zakwaszeniu mieszaniny reakcyjnej przeprowadza ekstrakcje odpowied¬ nim rozpuszczalnikiem (np. octanem etylu). Otrzy¬ many surowy produkt oczyszcza sie, np. chromato¬ grafia na zelu krzemionkowym lub wysokocisnie¬ niowa chromatografia cieczowa, otrzymujac poza¬ dany dechloromaytanzynol.Wyjsciowy zwiazek maytanzynoidowy o wzorze 4, w którym Rt oznacza rodnik acylowy mozna otrzy¬ mac, jak wyzej wpomniano, dzialajac na maytan¬ zynol lub dechloromaytanzynol kwasem karboksy¬ lowym o wzorze R^ OH (gdzie Ra ma wyzej po¬ dane znaczenie) lub reaktywna pochodna tego kwa¬ su. Acylowanie mozna przeprowadzic np. dzialajac na maytanzynol lub dechloromaytanzynol kwasem karboksylowym o wzorze R^ OH w obecnosci kar- bodwuimidu.Kwas karboksylowy o wzorze Rx OH mozna sto¬ lo 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60124 051 21 22 sowac w ilosci okolo 1 do 500 równowazników mor lowych na mol maytanzynolu lub dechloromaytan- zynolu. W wielu przypadkach korzystnie jest sto¬ sowac kwas w ilosci okolo 1 do 30 równowazników molowych. Karbodwuimid moze byc stosowany w ilosci okolo 1 do 700 równowazników molowych na mol maytanzynolu lub dechloromaytanzynolu, a w wielu przypadkach korzystna jest ilosc 1 do 50 równowazników na mol. Karbodwuimid jest zwiaz¬ kiem zawierajacym wiazanie karbodwuimidowe (—N=C=N—), które w trakcie reakcji acylowania ulega transformacji w wiazanie mocznikowe (—NH—CO—NH—). Karbodwuimid mozna przed¬ stawic wzorem Rio—N=C=N—Rn w którym Ri0 i Rn oznaczaja organiczne rodniki umozliwiajace przemiane wiazania karbodwuimidowego w wiaza¬ nie mocznikowe.Jako organiczne rodniki R1€ i Ru mozna wymie¬ nic rodniki cykloalkilowe, ewentualnie podstawione grupami dwualkiloaminowymi (rodniki alkilowe Cli_6, to samo dotyczy dalszych), nizsze rodniki al¬ kilowe, ewentualnie podstawione grupami dwualki¬ loaminowymi lub morfolinowymi oraz rodnik feny- lowy, ewentualnie podstawiony rodnikami alkilo¬ wymi. Korzystnym karbodwuimidem jest dwucyklo- heksylokarbodwuimid, a poza tym mozna wymienic dwufenylokarbodwuimid, dwu-o-tolilokarbodwu- imid, dwu-p-tolilokarbodwuimid, dwu-IIIrz.-buty- lokarbodwuimid, l-cykloheksylo-3-(2-morfolinoety- lo}karbodwuimid, l-cykloheksylo-3-(4-dwuetyloami- nocykloheksylo)karbodwuimid, l-etylo-3-(2-dwuety- loaminopropylo)karbodwuimid i l-etylo-3-(3-dwu- metyloaminopropylo)karbodwuimid.Reakcje acylowania mozna przeprowadzic w o- becnosci odpowiedniego rozpuszczalnika. Jako przy¬ klady takich rozpuszczalników mozna wymienic estry (np. octan etylu), etery (np. eter dwuetylowy, dioksan, czterowodorofuran itp.), chlorowcowane we¬ glowodory (np. chlorek metylenu, chloroform itp.), nitryle (np. acetonitryl), aromatyczne weglowodory (np. benzen), nitrometan, pirydyne, dwumetylofor- mamid, dwumetylosulfotlenek sulforan i rózne mie¬ szaniny powyzszych rozpuszczalników.Acylowanie przeprowadza sie w temperaturze o 0°C (chlodzenie lodem) do temperatury wrzenia ukladu reakcyjnego pod chlodnica zwrotna.Korzystne jest prowadzenie acylowania w obec¬ nosci katalizatora promotujaego acylowanie may¬ tanzynolu lub dechloromaytanzynolu. Katalizatorem moze byc przykladowo katalizator zasadowy lub katalizator kwasowy. Jako przyklady katalizatorów zasadowych mozna wymienic trzeciorzedowe aminy, jak trzeciorzedowe aminy alifatyczne (np. trójety- loamina) i aminy aromatyczne (jak pirydyna, a-, |3- lub y-pikolina, 2,6-lutydyna, 4-dwumetyloaminopi- rydyna, 4-pirolidynopirydyna, dwumetyloanilina, itp.), halogenki metali alkalicznych (np. fluorek po¬ tasu, bezwodny jodek potasu itp.), sole kwasów organicznych (np. octan sodu itp.) itd.Jako przyklady katalizatorów kwasowych mozna wymienic kwasy Lewisa (np. bezwodny chlorek cynku, bezwodny chlorek glinu (A1C1«), bezwodny chlorek zelazowy, czterochlorek tytanu (TiCL*), chlo¬ rek cynowy (SnSU), pieciochlorek antymonu, chlo¬ rek kobaltu, chlorek miedziowy, etanolan trójfluorku boru itp.), mocne kwasy nieorganiczne (np. kwas siarkowy, kwas nadchlorowy, chlorowodór, bromo- wodór itp.), mocne kwasy organiczne (np. kwas ben- zenosulfonowy, p-toluenosulfonowy, trójfluoroocto- 5 wy, trójchlorooctowy itp.), kwasne zywice jonitowe (np. sulfonowana zywica polistyrenowa) itp.Jezeli acylowanie przeprowadza sie za pomoca kwasu —COR2, gdzie R2 ma wyzej podane znacze¬ nie, to zwykle korzystnie Jest stosowac jako. kata- io lizator 4-dwumetyloaminopirydyne lub 4-pirolidyno- pirydyne lub podobny zwiazek, natomiast w przy¬ padku acylowania kwasem, w którym rodnikiem acylowym jest grupa o wzorze 6, gdzie Rs, R4 i R5 maja wyzej podane znaczenia, to korzystnym kata- 15 lizatorem jest bezwodny chlorek cynku.Katalizator mozna stosowac w ilosci katalistycz- nej, która bedzie wystarczajaca do promotowania acylowania maytanzynolu lub dechloromaytanzynolu kwasem karboksylowym. Normalnie katalizator 20 stosuje sie w ilosci okolo 0,001 do 10 równowazni¬ ków molowych, a korzystnie okolo 0,01 do 1 równo¬ waznika molowego na mol kwasu karboksylowego.Stosowanie takiego katalizatora czesto prowadzi do znacznego wzrostu wydajnosci maytanzynoidowego 26 zwiazku o wzorze 2. Katalizator przyczynia sie równiez do zmniejszenia ilosci kwasu karboksylo- wego koniecznego w reakcji acylowania, czesto dó okolo 1 do 10 równowazników molowych na mol maytanzynolu lub dechloromaytanzynolu. 30 Jezeli wystepuje izomeria w kwasie karboksylo¬ wym, np. w kwasie z rodnikiem N-acylo-a-amino- acylowym o wzorze 6, to takie kwasy mozna stoso¬ wac w postaci czystych izomerów optycznych lub w postaci mieszaniny o róznym udziale skladników. 35 Jezeli do 3-wodorotlenowej funkcji maytanzynolu lub dechloromaytanzynolu nalezy wprowadzic opty¬ cznie czynny rodnik acylowy, to czasami korzystnie jest stosowac odpowiedni izomer optyczny kwasu karboksylowego. W innych przypadkach stosujac 40 optycznie czynny kwas karboksylowy otrzymuje sie maytanzynoidowy zwiazek o wzorze 2 w postaci mieszaniny izomerów DiL Reakcje acylowania mozna przeprowadzic stosu¬ jac pochodna kwasu karboksylowego, na tyle reak- 45 tywna, by byla ona zdolna do zacylowania maytan- zynol lub dochloromaytanzynol w polozeniu 3, np. bezwodnik kwasowy. Rozpuszczalnik i katalizator moga byc takie same, jak wspomniane w zwiazku z reakcja acylowania w obecnosci karbodwuimidu. 5° Temperatura reakcji wynosi zwykle okolo —20 do 100°C, korzystnie okolo 20 do 40°C, choc w celu jej przyspieszenia mozna temperature podwyzszyc.Zwiazek wyjsciowy o wzorze 2, w którym Ri oznacza rodnik o wzorze 7 (gdzie Re i R7 maja wy- 55 zej podane znaczenia) mozna wytworzyc przykla¬ dowo przez karbamylowanie maytanzynolu lub de^ chloromaytanzynolu.Karbamylowanie mozna przeprowadzic np. dzia¬ lajac na maytanzynol lub dechloromaytanzynol ha- 60 logenkiem kwasu karbaminowego o wzorze 9 (gdzie R6 i R7 maja wyzej podane znaczenia), w obecnosci zasady. Z we wzorze. 9 moze oznaczac atom chloru lub bromu. Jako przyklady zasady mozna wymienic metale alkaliczne (np. lit, sód itp.) •65 i alkilometale (jak n-butylolit, IIrz.butylolit, jfeny-r124 051 23 24 lolit, naftylolit, metylosulfinyloacetylenek sodu itp.).Szczególne korzystny jest n-butylolit.Reakcje przeprowadza sie w rozpuszczalniku. Jako przyklady rozpuszczalników mozna wymienic etery (jak czterowódorofuran, eter dwuetylowy, eter dwu- metylowy itp.), aromatyczne weglowodory (jak to¬ luen, ksylen itp.) i odpowiednie mieszaniny takich rozpuszczalników. Najuniwersalniejszym rozpusz¬ czalnikiem jest czterowódorofuran. W celu przepro¬ wadzenia reakcji, maytanzynol lub dechloromaytan- zynol rozpuszcza sie w takim rozpuszczalniku i po dodaniu jednego z wymienionych zwiazków metalu alkalicznego dodaje sie halogenku kwasu karbami- nowego o wzorze 9. Zwiazek metalu alkalicznego stosuje sie w ilosci 3 do 10, a lepiej 4 do 6 równo¬ wazników molowych na mol maytanzynolu lub de- chloromaytanzynolu. Halogenek kwasu karbamino- wego stosuje sie w ilosci 2 do 10, korzystnie 3 do 5,5 równowazników.Reakcje mozna przeprowadzic w temperaturze w zakresie —78 do +50°C. Temperatura korzystna jest zwykle -30 do +40°C.Po zakonczeniu reakcji produkt mozna wyodreb¬ niac konwencjonalnymi sposobami, ewentualnie po zobojetnieniu mieszaniny reakcyjnej rozcienczonym kwasem lub odparowaniu rozpuszczalnika. W pew¬ nych przypadkach reakcje mozna przeprowadzic z inna niz halogenek, reaktywna pochodna kwasu karbaminowego.Alternatywny sposób karbamylowania obejmuje dzialanie na maytanzynol lub dechloromaytanzynol zwiazkiem o wzorze R$—N=C=0 (w którym Re ma wyzej podane znaczenie). W reakcji otrzymuje sie zwiazek o wzorze 2 z rodnikiem 3-acylowym o wzo¬ rze 7, w którym R7 oznacza atom wodoru. Reakcje korzystnie przeprowadza sie w roztworze. Rozpusz¬ czalnikiem moze byc praktycznie jakikolwiek roz¬ puszczalnik wolny od czynengo wodoru (np. wo¬ doru grup —OH lub —NH—), oddzialujacego ze zwiazkiem R6—N=C=0. Przykladami takich roz¬ puszczalników sa etery (jak eter dwuetylowy, dwu- metoksyetan, dioksan, czterowódorofuran itp.) chlorowcowane weglowodory (jak dwuchlorometan, chloroform, czterochlorek wegla, 1,2-dwuchloroetan itp.), weglowodory aromatyczne (jak benzen, toluen, ksylen, chlorobenzen itp.), nitryle (jak acetonitryl, propionitryl itp.) i estry (jak octan etylu itp.) oraz odpowiednie mieszaniny takich rozpuszczalników.Pozadane jest, by uzyty rozpuszczalnik byl bez¬ wodny.Zwiazek o wzorze R6—N=C=0 stosuje sie w ilosci mniej wiecej równowaznej ilosci maytanzy¬ nolu lub dechloromaytanzynolu, z niewielkim nad¬ miarem na zrównowazenie jego zuzycia w reakcji z woda zawarta w rozpuszczalniku oraz, w pew¬ nych przypadkach, na dimeryzacje lub inne reakcje, którym ulega ten reaktywny zwiazek. Zwykle za¬ leca sie stosowac zwiazek o wzorze R6—N=C=0 w ilosci 2 do 20, korzystnie 2 do 5 równowazników.Reakcje mozna prowadzic w —20 do +80, korzy¬ stnie 5 do 40DC.W przypadku silnie reaktywnego zwiazku o wzo¬ rze R6~N=C=0 (zwykle zwiazku z podstawnikiem nitrowym lub wielochlórowcowym), mozna go po prostu zmieszac z drugim reagentem. Jednakze zwy¬ kle pozadane jest uzycie katalizatora. Jako przy¬ klady katalizatorów mozna wymienic katalizatory zwykle stosowane do karbamylowania alkoholi lub fenoli za pomoca estrów kwasu izocyjanowego, np. zasady, jak trzeciorzedowe aminy (trójetyloamina pirydyna itp.), alkoholany metali alkalicznych (Illrz. butylan potasu, metylan sodu itp.), octany metali alkalicznych (octan litu, sodu, potasu, rubidu lub cezu), sole metali (np. chlorki i sole kwasów kar- boksylowych olowiu, bizmutu, cyny, kobaltu, cyn¬ ku, kadmu, manganu, tytanu, zelaza, miedzi itp.), kompleksy metali i zwiazki metaloorganiczne (np. pentadien-2,4-owe kompleksy metali, ferroceny, tle¬ nek dwubutylocyny, tlenek dwuoktylacyny, dwulau- rynian dwubutylocyny).Sposród powyzszych, szczególnie uzytecznym ka¬ talizatorem jest bezwodny chlorek cynku, z punktu widzenia wybiórczosci, szybkosci reakcji itp. Kata¬ lizator stosuje sie w ilosci wystarczajacej do przy¬ spieszenia reakcji. Zwykle wystarczajaca iloscia jest 0,1 do okolo 3 moli na mol zwiazku o wzorze R6-N=C=0.Jezeli jako wyzej wspomniany katalizator stosuje sie chlorek miedziawy, to moga powstawac zwiazki o wzorze 10, w którym X i H« maja wyzej podane znaczenia. Zwiazki o wzorze 10 mozna jednakze latwo przeprowadzic w zwiazki o wzorze 2, majace w polozeniu 9 atom wodoru zamiast rodnika o wzo¬ rze 11, przez dzialanie kwasem. Uzytecznymi do tego celu kwasami sa kwasy nieorganiczne (jak solny, siarkowy, fosforowy itp.), mocne kwasy or¬ ganiczne (jak benzenosulfonowy, toluenosulfonowy, metanosulfonowy, trójfluorooctowy, trójchlorooctowy itp). itd. Korzystny jest kwas trójfluorooctowy. Re¬ akcje korzystnie przeprowadza sie w roztworze, w rozpuszczalniku jak stosowany w karbamylowaniu za pomoca zwiazku o wzorze R6—N=C=0. Reakcja zwykle przebiega szybko w —20 do +40°C. Czasa¬ mi reakcje mozna przeprowadzic jedynie przepu¬ szczajac mieszanine karbamylacyjna, zawierajaca zwiazek o wzorze 10, przez kolumne z zelem krze¬ mionkowym.Zwiazek wyjsciowy o wzorze 2, w którym Ri oznacza rodnik —COOR8 (gdzie R8 ma wyzej po¬ dane znaczenie) mozna otrzymac dzialajac na may- tanzytol lub dechloromaytanzytol estrem kwasu chloroweglowego o wzorze Z'—COOR8 (gdzie R8 ma wyzej podane znaczenie), a Z' oznacza atom chlo¬ rowca), w obecnosci zasady. Jako przyklady chlo¬ rowca mozna wymienic chlor i brom.Reakcje przeprowadza sie w rozpuszczalniku, sposród podanych dla reakcji karbamylowania.Jako zasade mozna stosowac podane zasady kar¬ bamylowania. Zasade stosuje sie w ilosci okolo 3 do 20 równowazników molowych, korzystnie okolo 4 do 10 równowazników molowych na mol maytan¬ zynolu lub dechloromaytanzynolu. Ester kwasu chlo- rowcoweglowego stosuje sie w ilosci okolo 3 do 20, korzystnie 5 do 10 równowazników molowych. Re¬ akcje mozna przeprowadzic w —78 do +50°C, zwy¬ kle -30 do +40, a korzystnie -20 do +30°C.Zwiazki maytanzynoidowe o wzorze^ 2, wytwarza¬ ne wyzej opisanymi sposobami, mozna wyodrebniac z mieszaniny reakcyjnej konwencjonalnymi sposo¬ bami, np. przez odparowanie, ekstrakcje rozpusz- 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60124 051 25 26 czalnikiem, chromatografie, rekrystalizacje itp. Je¬ zeli zwiazki o wzorze 2 otrzymuje sie w postaci mieszaniny izomerów (np. izomerów D i L), to zwykle mozna je rozdzielic ogólnie znanymi spo¬ sobami, np. chromatografia kolumnowa na zelu krzemionkowym.Wynalazek jest ilustrowany ponizszymi przykla¬ dami, które nie ograniczaja jego zakresu. W opisie przykladów „procent (%)" jest oparty na stosunku „ciezar/objetosc", jezeli nie zaznaczono inaczej. „De- metylo" jest stosowane jako skrótowe okreslenie „20-demetok5y-20-hydroksy".Przyklad I. W 5 ml suchego dwuchlorome^ tanu rozpuszczono 99,6 mg (0,176 mmola), maytan¬ zynolu, a do roztworu dodano 377,2 mg (1,76 mmola) bezwodnika kwasu pentanokarboksylowego-1 (bez¬ wodnika kapronowego) i 43,5 mg (0,366 mmola) p- -dwumetyloaminopirydyny (DMAP). Calosc miesza¬ no w temperaturze pokojowej (okolo 23°C) w ciagu 6 godzin, po czym dodano dalsza porcje 30,5 mg (0,25 mmola) DMAP. Mieszanie kontynuowano w temperaturze pokojowej w ciagu dalszych 18 godzin.Do mieszaniny reakcyjnej dodano 5 ml 1NHC1 i 5 ml wody, oddzielono warstwe organiczna, prze¬ myto ja 10% wodnym roztworem wodoroweglanu sodu (10 ml) i wysuszono nad bezwodnym siarcza¬ nem sodu.Oddestylowano rozpuszczalnik, a pozostalosc pod¬ dano chromatografii na kolumnie z zelem krze* mionkowym (75 g), stosujac jako czynnik eluujacy kolejno octan etylu (okolo 250 ml) i octan etylu/octan etylu nasycony woda 2 :1 (objetosciowo, okolo 900 ml). Wyciek zbierano 16 g frakcjami. Frakcje nr 13 do 30 polaczono i odparowano, otrzymujac 3,0 mg surowego produktu, który rozpuszczono w octanie etylu, a po dodaniu eteru odsaczono wytracony proszek bialej barwy. Powyzszym sposobem otrzy¬ mano 34,5 mg 3-kapronianu maytanzynolu o tem¬ peraturze topnienia 159—162°C (z rozkladem).Przyklad II. W 1,0 ml dwuchlorometanu roz¬ puszczono 23,5 mg maytanzynolu i w okolo 22°C dodano 70,5 mg (okolo 10 mmoli) bezwodnika oc- towo-mrówkowego (sporzadzonego przez oziebienie 2 ml bezwodnika octowego, dodanie 1 ml 99% kwa¬ su mrówkowego, przy mieszaniu w ciagu okolo 10 minut w —5 do 0°C, grzanie mieszaniny w ciagu 15 minut w 50°C i oziebienie do 0°C) oraz 11,7 mg DMAP. Calosc mieszano w ciagu nocy w tempe¬ raturze pokojowej (okolo 22°C).Do powyzszej mieszaniny reakcyjnej dodano 10 kropli metanolu i po mieszaniu w ciagu 3 godzin, pod zmniejszonym cisnieniem odparowano miesza¬ nine do sucha. Pozostalosc naniesiono na plyte do preparatywnej TLC powleczona zelem krzemionko¬ wym, która dwukrotnie rozwinieto w octanie etylu wysyconym woda. Zdrapano pasmo zelu w odle¬ glosci okolo 6,0 do 8,0 cm od linii startowej i wy¬ ekstrahowano zel 10% metanolem w dwuchlorome- tanie. Pod zmniejszonym cisnieniem oddestylowano rozpuszczalnik, otrzymujac 8,35 mg 3-mrówczanu maytanzynolu w postaci bezbarwnej, szklistej po¬ zostalosci.Przyklad III. Sposobem podobnym do opi¬ sanego w przykladach I i II, mozna otrzymac na¬ stepujace zwiazki: (A) Z maytanzynolu i bezwodnika kwasu hepta- nokarboksylowego-1 (bezwodnika kaprylowego) — 3-kaprylan maytanzynolu, w postaci ciala stalego barwy bialo-piaskowej i temperaturze topnienia 151—160°C (z rozkladem).\P (B) Z maytanzynolu i kwasu nonanokarboksylo- wego-1 (kaprynowego) — 3-kaprynian maytanzyno¬ lu, w postaci ciala stalego barwy bialo-piaskowej, o temperaturze topnienia 130—134°C (z rozkladem).(C) Z maytanzynolu i kwasu heksanokarboksylo- *° wego — 3-heksanokarboksylan maytanzynolu, tem¬ peratura topnienia 158—160°C (z rozkladem).(D) Z maytanzynolu i kwasu dodekanokarboksy- lowego — 3-dodekanokarboksylan maytanzynolu, temperatura topnienia 110—116°C (z rozkladem) 15 (E) Z maytanzynolu i kwasu pentadekanokarbo- ksylowego (palmitynowego) — 3-palmitynian may¬ tanzynolu, w postaci bialej barwy proszku o tem¬ peraturze topnienia 105—116°C (z rozkladem) (F) Z maytanzynolu i bezwodnika walerowego — 20 3-walerianian maytanzynolu, temperatura topnienia 165—168°C.Przyklad IV. Do roztworu maytanzynolu (103,2 mg, 0,1183 mmola) i kwasu cykloheksanokar- boksylowego (140 mg, 1,094 mmola) w 5 ml suchego 25 dwuchlorometanu dodano, przy mieszaniu, DDC (267, 1,296 mmola) i kontynuowano mieszanie w temperaturze pokojowej do rozpoczecia wydzielania sie osadu. Dodano DMAP (50,8 mg 0,416 mmola) i prowadzono mieszanie w ciagu nocy w temperaturze 30 pokojowej. Odsaczono osad, a przesacz przemyto 0,5 N HC1 (okolo 10 ml) i nastepnie nasyconym wod¬ nym roztworem wodoroweglanu sodu (okolo 10 ml), po czym wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodu. Oddestylowano rozpuszczalnik, a pozostalosc ss poddano chromatografii na kolumnie z zelem krze¬ mionkowym (75 g). Elucje prowadzono octanem ety¬ lu, zbierajac 16 g frakcje. Frakcje nr 14 do 30 po¬ laczono i odparowano, uzyskujac 59 mg surowego produktu, który rozpuszczono w octanie etylu, a do 40 roztworu dodano eteru dwuetylowego. Otrzymano 24,3 mg 3-cykloheksanokarboksylanu maytanzynolu w postaci krysztalów o temperaturze topnienia 202 —206°C (z rozkladem.) Przyklad V. Sposobem jak opisany w przy- 45 kladzie IV mozna otrzymac nastepujace zwiazki: (A) Z maytanzynolu i kwasu cyklopropanokar- boksylowego — 3-cyklopropanokarboksylan may¬ tanzynolu, temperatura topnienia 182—187°C (z roz¬ kladem) 50 (B) z maytanzynolu i kwasu fenylooctowego — 3- -fenylooctan maytanzynolu, temperatura topnienia 180—182°C (z rozkladem) (C) z maytanzynolu i kwasu benzoesowego — 3- -benzoesan maytanzynolu, temperatura topnienia 55 174—177°C (z rozkladem) (D) z maytanzynolu i kwasu j-cholrobenzoesowego — 3-p-chlorobenzoesan maytanzynolu, temperatura topnienia 178—183°C (E) z maytanzynolu i kwasu furanokarboksylowe- 60 go-2 — 3-furanokarboksylan-2 maytanzynolu, tem¬ peratura topnienia 180—189°C (z rozkladem) (F) z maytanzynolu i kwasu fenylppropionowego — 3-fenylopropionian maytanzynolu, temperatura topnienia 160—163°C (z rozkladem) 65 (G) z maytanzynolu i kwasu nikotynowego — 3-124 051 27 28 -nikotynian maytanzynolu, temperatura topnienia 184^187°C (z rozkladem) (H) z maytanzynolu i kwasu pikolinowego — 3- -pikolinian maytanzynolu, temperatura topnienia 190—193°C (z rozkladem) (I) z maytanzynolu i kwasu izonikotynowego — 3-izonikotyniari maytanzynolu, w postaci bialej bar-^ wy krysztalów o temperaturze topnienia 185—187°C (z rozkladem) (J) z maytanzynolu i N-acetylo-L-proliny — 3- -(N-acetylo)-Li-prolinian maytanzynolu, bialej bar¬ wy krysztaly o temperaturze topnienia 195—198°C (z rozkladem) i szklisty produkt o widmie UV n MeOH max )nm: 233' 244' 253 282 { 292 (K)z maytanzynolu i kwasu tiofenokarboksylowe- go-2 — 3-tiofenokorboksylan maytanzynolu, w po¬ staci szklistego ciala stalego o temperaturze topnie¬ nia 161—163°C (z rozkladem).Przyklad VI. W 800 ml suchego czterowodo- rofuranu (THF) rozpuszczono 15,0 g mieszaniny an¬ tybiotyków ansamytocyny (ansamytocyna P—2= 12%, ansamytocyna P—3= 71%, ansamytocyna P—4= 17%). W strumieniu suchego azotu roztwór oziebiono do — 50°C.w lazni suchy lód-etanol, dodano w jed¬ nej porcji 13,0 g wodorku litowoglinowego (LAH) i calosc mieszano w ciagu 2 godzin w —50 do —22°C. Mieszanine oziebiono do —28°C i dodano dalsze 3 g LAH, mieszano w ciagu 80 minut w —28 do — 22°C i ponownie oziebiono do —50°C. Z. kolei w ciagu 30 minut .wkroplono 750 ml 2N HC1.Mieszanine reakcyjna ekstrahowano trzykrotnie 2,& litra, 1,6 litra i 0,8 litra octanu etylu, ekstrakty polaczono, przemyto nasyconym roztworem wod¬ nym chlorku sodu (2X100 ml) i wysuszono (250 g MgS04). Pod zmniejszonym cisnieniem oddestylo¬ wano rozpuszczalnik, a pozostalosc (13,6 g) poddano chromatografii na kolumnie, z zelem krzemionko¬ wym (1,2 kg), prowadzac elucje mieszanina octan etylu/woda 98,5:1,5 (objetosciowo). Eluat zbierano 400 g frakcjami. Frakcje nr 35 do 52 polaczono, oddestylowano z nich rozpuszczalnik, a pozostalosc wysuszono pod zmniejszonym cisnieniem,- otrzymu¬ jac 7,25 g maytanzynolu.Nastepnie, postepujac tak samo, z frakcji nr 53 do 68 otrzymano 1,55 g mniej wiecej równomolowej mieszaniny maytanzynolu i dechloromaytanzynolu.Z frakcji nr 69 do 86 uzyskano 0,78 g dechloromay¬ tanzynolu. Rekrystalizacja z mieszaniny chloro- formheksan dala 0,71 g dechloromaytazynolu w po¬ staci bialej barwy proszku o temperaturze topnie¬ nia 174—179°C (z rozkladem).Przyklad VII. W 15 ml suchego dwuchloro- metanu rozpuszczono 100,0 mg (0,189 mmola) dechlo¬ romaytanzynolu, a do roztworu dodano kolejno 69 mg (0,476 mmola) N-acetylo-N-metylo-L-alaniny, 117 mg (0,568 mmola) DCC i 39 mg (0,287 mmola) bezwodnego chlorku cynku. Calosc mieszano w cia¬ gu 30 minut w temperaturze pokojowej (okolo 23°C), po czym dodano 55 mg (0,379 mmola) N-acetylo-N- -me-L-alaniny, 98 mg (0,476 mmola) DCC i 31 mg (0,228 mmola) bezwodnego chlorku cynku i kon¬ tynuowano mieszanie w temperaturze pokojowej w ciagu dalszych 2 godzin.Odsaczono skladniki nierozpuszczone, przesacz od¬ parowano do sucha, a pozostalosc rozpuszczono w 5 ml octanu etylu i poddano chromatografii na ko¬ lumnie z zelem krzemionkowym (srednica zewne¬ trzna 25 mm X 500 mm). Elucje przeprowadzono mie¬ si szanina octan etylen/octan etylu nasycony woda 2 :1 (objetosciowo), a nastepnie octanem etylu na¬ syconym woda, zbierajac 15 g frakcje. Frakcje nr 55 do 103 polaczono i odparowano z nich rozpusz¬ czalnik, otrzymujac 53 mg surowego dechloromay- ao tanzynolu. Produkt rozpuszczono w octanie etylu, dodano eteru dwuetylowego i oziebiono roztwón Uzyskano 24 mg L-dechloromaytanzyny w postaci bezbarwnych krysztalów o temperaturze topnienia 184—186°C (z rozkladem). 15 Frakcje chromatograficzne nr 168 do 221 polaczo¬ no i odparowano rozpuszczalnik, otrzymujac 65 mg D-dechloromaytanzyny. Produkt rozpuszczono w chloroformie, do roztworu dodano eteru dwuetylo¬ wego i odsaczono wytracone krysztaly. Uzyskano 21 20 . mg bezbarwnych mikrokrysztalów D-dechloromay¬ tanzyny o temperaturze topnienia 175—178°C (z roz¬ kladem).Przyklad VIII. Sposobem podobnym do opi¬ sanego w przykladzie VII mozna otrzymac naste- 25 pujace zwiazki: (A) z dechloromaytanzynolu i bezwodnika izoma- slowego — 3-izomaslan dechloromaytanzynolu, w w postaci bialej barwy graniastoslupów o tempera¬ turze topnienia 250—252°C (z rozkladem) 30 (B) z dechloromaytanzynolu i kwasu nikotynowego — 3-nikotynian dechloromaytanzynolu o tempera¬ turze topnienia 170—173°C (z rozkladem) (C) z dechloromaytanzynolu i kwasu cykloheksa- nokarboksylowego — 3-cykloheksanokarboksylan & dechloromaytanzynolu o temperaturze topnienia 217—220°C (z rozkladem) (D) z dechloromaytanzynolu i kwasu fenyloocto¬ wego — 3-fenylooctan dechloromaytanzynolu o tem¬ peraturze topnienia 165—170°C (z rozkladem) 40 Przyklad IX. W 30 ml suchego dwuchlorome- tanu rozpuszczono 150,0 mg (0,265 mmola) maytan¬ zynolu, a do roztworu dodano 24,0 mg (0,663 mmola) N-acetylo-N-metylo-L-leucyny i 174,2 mg (0,846 mmola) DCC. Calosc chwile mieszano w tempera- 45 turze pokojowej, po czym dodano 46 mg (0,338 mmola) bezwodnego chlorku cynku. Mieszano w ciagu dalszych 30 minut w temperaturze pokojowej, dodano dalszej porcji 46 mg bezwodnego chlorku cynku i kontynuowano mieszanie w tej samej tem- 50 peraturze w ciagu okolo 45 minut.Dodano 104,3 mg (0,558 mmola) N-acetylo-N-me¬ tylo-L-leucyny, 141 mg (0,686 mmola) DCC i 46 mg bezwodnego chlorku cynku i w tej samej tempe¬ raturze mieszano w ciagu dalszych 2,5 godzin. Mie- 55 szanine reakcyjna przemyto woda, a warstwe or¬ ganiczna wysuszono nad Na2S04 i odparowano z niej rozpuszczalnik. Pozostalosc poddano chromatografii na kolumnie z zelem krzemionkowym (75 g), pro¬ wadzac elucje kolejno octanem etylu (600 ml) i oc- 60 tanem etylu nasyconym woda, zbierajac eluat w 17 g frakcjach. Frakcje nr 14 do 34 polaczono, od^ destylowano z nich rozpuszczalnik, a pozostalosc (100 mg) poddano ponownej chromatografii na zelu krzemionkowym (35 g) (uklad rozpuszczalników: $5 chloroform/metanol 60 :1 (objetosciowo), zbierajac124 051 29 30 25 g frakcje. Frakcje nr 16 do 30 polaczono, odpa¬ rowano z nich rozpuszczalnik, a pozostalosc roz¬ puszczono w octanie etylu. Po oziebieniu odsaczo¬ no wytracone krysztaly. Sposobem tym otrzymano 89 mg zwiazku A.Frakcje z pierwszej chromatografii nr 35 do 56 polaczono, odparowano z nich rozpuszczalnik, a po¬ zostalosc poddano ponownej chromatografii na zelu krzemionkowym (40 g) (uklad rozpuszczalników: chloroform/metanol 60 :1 (objetosciowo), okolo 200 ml i chloroform/metanol 40:1 (1 litr)), zbierajac 25 g frakcje. Frakcje nr 17 do 35 polaczono, od-« parowano z nich rozpuszczalnik, a pozostalosc roz¬ puszczono w octanie etylu. Po dodaniu eteru ety¬ lowego, odsaczono wytracony osad. Otrzymano 52 mg zwiazku B.Zarówno A jak i D sa zwiazkami zadanymi. Na podstawie danych fizycznych stwierdzono, ze A jest estrem 3-(N-acetylo-N-metylo)-L-leucyny maytan- zynolu, temperatura topnienia 172—175°C (z roz¬ kladem), a B estrem 3-(N-acetylo-N-metylo)-D-leu- cyny maytanzynolu, temperatura topnienia 157— —159°C, z rozkladem.Przyklad X. Sposobem jak opisany w przy¬ kladzie IX mozna otrzymac nastepujace zwiazki: (A) z maytanzynolu i N-acetylo-N-benzylo-D-ala- niny dwa estry 3-(N-acetylo-N-benzylo)alanylowe, rózniace sie konfiguracja podstawnika 2': o tempe¬ raturze topnienia 174—177°C (z rozkladem) i o tem¬ peraturze topnienia 163—166°C (z rozkladem).(B) z maytanzynolu i N-acetylo-N-metylo-L-feny- loalaniny — dwa estry 3-(N-acetylo-N-metylo)feny- loalanylowe, rózniace sie konfiguracja podstawnika 2': o temperaturze topnienia 189—193°C (z rozkla¬ dem) i o temperaturze topnienia 212—214°C (z roz¬ kladem) (C) z maytanzynolu i N-IIIrz. butoksykarbonylo- -N-metylo-L-alaniny — ester 3-(N-IIIrz. butoksy- karbonylo-N-metylo-L-alanylowy) maytanzynolu (widmo UV XMeOH nm: 234, 244, 254, 282, 290) i max ester 3-(N-IIIrz. butoksykarbonylo-N-metylo-D-ala- nylowy)maytanzynolu (widmo UV X e nm: r max 234, 241, (przegiecie), 253,5, 282, 290).(D) z maytanzynolu i N-acetylosarkozyny — 3- -(N-acetylosarkozynian maytanzynolu jako szklisty produkt.Widmo NMR (CDC18) 5 ppm: 0,87 (3H,s), 1,28 (3H, d, J=5Hz), 1,68 (3H, s), 2,14 (3H,s), 2,19 (1H, dd, J=3Hz i 14Hz), 2,55 (1H, dd, J=llHz i 14 Hz), 2,76 (1H, d, J=9Hz), 3,07 (2H, s), 3,13 (3H, s), 3,18 (H, s), 3,35 (3H, s), 3,47 (1H, d, J=9Hz), 3,52 (1H, d, J= =13Hz), 3,98 (3H, s), 4,18 (1H, m), 4,92 (1H, dd, J= =3Hz i 11Hz), 5,74 (1H, dd, J=9Hz i 15Hz), 6,18 (1H, d, J=llHz), 6,44 (1H, dd, J=llHz i 15Hz), 6,53 (1H, s), 6,82 (2H, s) itd.(E) z maytanzynolu i N-acetyloglicyny — 3-(N- -acetylo)glicynian maytazynolu o temperaturze top¬ nienia 189—192°C (z rozkladem).Przyklad XI. W 80 ml dwuchlorometanu roz¬ puszczono maytanzynol (300 mg, 0,5315 mmola) i N- -acetylo^N-metylo-L-alanine (1,585 g, 10,62 mmola), a do roztworu dodano 3,285 g dwucykloheksylokar- bodwuimidu i 72,5 mg (0,532 mmola) bezwodnego chlorku cynku. Calosc mieszano w ciagu 6 godzin w 20°C, po czym pozostawiono w ciagu 11 godzin w spoczynku, w tej temperaturze. Z kolei dodano 5 N-acetylo-iN-metylo-L-alaniny (530 mg), dwucyklo- heksyklokarbodwuimidu (1095 mg) i bezwodnego chlorku cynku (150 mg). Po uplywie 2 godzin mie¬ szanine reakcyjna przesaczono, a przesacz przemyto okolo 150 ml wody i wysuszono nad bezwodnym 10 siarczanem sodu. Odsaczono skladniki nierozpusz- czone, a przesacz poddano chromatografii na ko¬ lumnie z zelem krzemionkowym (60 g), prowadzac elucje mieszanina chloroform/metanol 40 :1- (obje¬ tosciowo). Po odrzuceniu frakcji wstepnej, pozostaly 15 eluat zbierano w 25 g frakcjach.Frakcje nr 14 do 25 polaczono, zatezono i po¬ nownie chromatografowano ria zelu krzemionkowym (65 g), prowadzac elucje mieszanina octan etylu/ /octan etylu wysycony woda 2:1 (objetosciowo), 20 odrzucono frakcje wstepna, a nastepnie eluat zbie¬ rano 16 g frakcjami. Z frakcji nr 25 do 60 otrzy¬ mano 149,3 mg zwiazku A. Frakcje nr 23 i 24 oraz 61 do 100 polaczono i odparowano do sucha, otrzy¬ mujac 20,5 mg produktu, który poddano prepara- 26 tywnej chromatografii cienkowarstwowej na zelu krzemionkowym (Kieselgel 60F2M, Art. 5717, Merck).Chrodmatogram rozwijano 10% alkoholem izopropy- lowym w chloroformie, otrzymujac dodatkowa por¬ cje 6,3 mg zwiazku A. Frakcje 101 i' 105 równiez 30 polaczono i odparowano, otrzymujac 320 mg pro¬ duktu, który poddano ponownej chromatografii na kolumnie z zelem krzemionkowym (75 g) (uklad roz¬ puszczalników: chloroform/metanol 40 :1 (objetos¬ ciowo)), otrzymujac 95,7 mg zwiazku B, który jest 35 izomerem zwiazku A.Sumaryczna wydajnosc zwiazku A wyniosla 155,6 mg, a zwiazku B 95,7 mg.Zwiazek A zidentyfikowano jako maytanzyne (postac L) otrzymana z roslin, przez porównanie 40 ponizszych danych z danymi maytanzyny otrzyma¬ nej z roslin, przedstawionymi w Journal of Organie Chemistry 42, nr 14, 2349—2357 (1977). Widmo UV (X max, EtOH) nm: 289, 281, 254, 242 (przegiecie), 233. Widmo masowe (m/e): 691, 630, 485, 470, 450, 45 128, 100, 58. [a]^-136°±30° (c=0,55, CHC18).Zwiazek A rozpuszczono w mieszaninie octanu etylu i eteru dwuetylowego i pozostawiono w spo¬ czynku, co spowodowalo wytracenie krysztalów.Krysztaly te przekrystalizowano jednokrotnie z oc- 50 tanu etylu-eteru dwuetylowego i dwukrotnie z dwu- chlorometanu-eteru dwuetylowego. Sposobem tym uzyskano zwiazek A w postaci bezbarwnych plytek o temperaturze topnienia 191—195°C (z rozkla¬ dem). 55 Zwiazek B zidentyfikowano jako izomer maytan- zyny i przyjeto, ze jest on D-maytanzyna, przez po¬ równanie nastepujacych danych z danymi maytan- zyny.Widmo UV (X max, EtOH) nm: 289, 281, 253, 240 60 (przegiecie), 233. Widmo masowe (m/e): 691, 630, 485, 470, 450, 128, 100, 58. [ Roztwór zwiazku B w chloroformie zadano ete¬ rem dwuetylowym, otrzymujac krysztaly, które dwu¬ krotnie przekrystalizowano z tego samego ukladu 86 rozpuszczalników. Powyzszym sposobem otrzymano124 051 31 32 zwiazek B w postaci krysztalów o temperaturze topnienia 155—178°C (ze stopniowym rozkladem).Przyklad XII. Sposobem jak w przykladzie XI mozna otrzymac nastepujace zwiazki: (A) z maytanzynólu i N-metylo-N-propionylo-L- -alaniny — maytanprine typu naturalnego (forma L), bezbarwne krysztaly o temperaturze topnienia 185—189°C (slaby rozklad) i D-maytanprine, bez¬ barwne igly o temperaturze topnienia 192—197°C (z rozkladem).(B) z maytanzynólu i N-izObutyrylo-N-metylo-L- alaniny — maytanbutyne typu naturalnego (forma L); bezbarwne igly o temperaturze topnienia 185— —187°C (z rozkladem) i D-maytanbutyne, bezbarw¬ ne igly, temperatura topnienia 195—198°C (z roz¬ kladem) (C) z maytanzynólu i N-izowalerylo-N-metylo-L- -alaniny — maytanwaline typu naturalnego (forma L) i D-maytanwaline.Widmo NMR maytanwaliny typu naturalnego (CDC1,) 6: 0,79 (3H,s), 0,91 (3H, d, J=6Hz), 0,95 (3H, d, J=6Hz), 1,27 (3H, d, J=6Hz), 1,30 (3H, d, J=7Hz), 1,64 (3H, s), 2,13 (2H, d, J=7Hz), 2,15 (IH, dd, J= = 14Hz i 3Hz), 2,60 (IH, dd, J=14Hz i 11Hz), 2,83 (3H, s), 3,00 (IH, d, J=9Hz), 3,07 (IH, d, J=13Hz), 3,17 (3H, s), 3,34 (3H, s), 3,47 (IH, d, J=9Hz), 3,59 (IH, szeroki), 3,65 (IH, d, J=13Hz), 3,95 (3H, s), 4,27 (IH, m), 4,74 (IH, dd, J=12Hz i 3Hz), 5,35 IH, q, J=7Hz), 5,64 (IH, dd, J=15Hz i 9Hz), 6,28 (IH, szeroki s), 6,39 (IH, dd, J=15Hz i 11Hz), 6,67 (IH; d, J=2Hz), 6,69 (IH, d, J=llHz), 6,79 (IH, d, J= =2Hz), 0,7—2,0 (3H).Widmo masowe (m/e): 733, 673, 485, 470, 450, 170 D-maytanwalina. Widmo NMR (CDC1,) 6; 0,89 (3H, s), 0,93 (3H, d, J=6Hz), 0,96 (3H, d, J=6Hz), 1,26 (3H, d, J=4Hz), 1,49 (3H, d, J=7Hz), 1,69 (3H, s), 2,66 (IH, dd, J=15Hz i 12Hz), 3,02 (3H, s), 3,12 (3H, 3), 3,18 (IH, d, J=13Hz), 3,32 (3H, s), 3,42 (IH, d, J=9Hz), 3,50 (IH, d, J=13Hz), 3,96 (3H, s), 4,29 (IH, m), 4,92 (IH, dd, J^llHz i 3Hz), 5,00 (lH, q, J=7Hz), 5,05 (IH, szeroki), 5,78 (IH, dd, J=15Hz i 9Hz), 6,17 (IH, d, J=llHz), 6,24 (IH, s), 6,43 (IH, dd, J=15Hz i 11Hz), 6,77 (IH, d, J=l,5Hz), 6,83 (IH, d, J=l,5Hz), 0,8—2,5 (7H).Wdimo masowe (m/e): 733, 672, 485, 470, 450, 170 Przyklad XIII. (a) W 600 ml metanolu zawieszono 53,5 g (0,52 mole) N-metylo-L-alaniny i przy oziebianiu w lo¬ dzie i mieszaniu rozpuszczono w niej 76 g suchego chlorowodoru. W miare postepu reakcji zawiesina materialu wyjsciowego ulegla rozpuszczeniu i po mieszaniu w ciagu nocy w temperaturze pokojowej otrzymano jednorodny roztwór. Dodano 85 g (0,8 mola) ortomrówczanu metylu i pozostawiono mie¬ szanine reakcyjna w ciagu dalszych 24 godzin w temperaturze pokojowej. Odsaczono niewielkie ilos¬ ci nierozpuszczonego materialu, a przesacz odpa¬ rowano pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac chlorowodorek estru metylowego N-metylo-L-ala¬ niny w postaci produktu stalego.Widmo NMR (w DMSO-de) Ó: 1,50 (3H, d, J= = 7Hz), 2,60 (3H, m, po dodaniu DgO s), 3,75 (3H, s), 4,12 (IH, m po dodaniu D20 q, J=7Hz), 9,83 (2H, szeroki).. (b) W 300 ml chloroformu rozpuszczono 33,7 g (0,22 mola) chlorowodorku estru metylowego N-me¬ tylo-L-alaniny, a do roztworu dodano 65 ml bez¬ wodnika octowego i U0 ml trójetyloaminy. Miesza¬ nine pozostawiono w, ciagu! 24 godzin w temperaturze 5 pokojowej, po czym dodatkiem wody rozlozono nad¬ miar bezwodnika octowego i zobojetniono miesza¬ nine wodoroweglanem sodu. Oddzielono warstwe chloroformowa, a warstwe wodna ekstrahowano oc¬ tanem etylu (120 ml X 5). Ekstrakty polaczono io z warstwa chloroformowa i odparowano pod zmniej¬ szonym cisnieniem. Pozostaly brazowej barwy olej rozpuszczono w chloroformie, przemyto wodnym roztworem wodoroweglanu sodu i odparowano pod zmniejszonym cisnieniem. Otrzymano 31,8 g estru 15 metylowego N-acetylo-N-metylo-L-alaniny w posta¬ ci brazowej barwy oleju.Widmo NMR (CDC1«) 8: 1,38 (3H, d, J=7Hz, 2,12 (3H, s), 2,97 (3H, s), 3,70 (3H, s), 5,23 IH, q, J= =7Hz). 20 Otrzymany ester rozpuszczono w mieszaninie 100 ml metanolu i 170 ml IN wodnego roztworu wo¬ dorotlenku sodu. Roztwór pozostawiono w ciagu 2 godzin w temperaturze pokojowej, po czym pod zmniejszonym cisnieniem odpedzono metanol. Za- * sadowy roztwór wodny ekstrahowano chloroformem.Stezonym kwasem solnym doprowadzono warstwe wodna do pH 1 i przy chlodzeniu lodem ekstra¬ howano octanem etylu (5X140 ml). Ekstrakt wysu¬ szono nad bezwodnym siarczanem sodu i odparo- 30 wano pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac produkt staly bialej barwy. Przekrystalizowanie z mieszaniny octan etylu-heksan dalo 8,1 g bezbarw¬ nych igiel N-acetylo-N-metylo-L-alaniny. [a] ^ -58,5° (c-1, DMF), [a]2^ = -74,3° (c = 1, H20), temperatura topnienia 121—122°C.Powyzszym sposobem mozna otrzymac nastepuja¬ ce zwiazki: (A) z chlorowodorku estru metylowego N-metylo- -L-alaniny i bezwodnika propionowego — N-metylo- -N-propionylo-L-alanine, bezbarwne graniastoslupy o temperaturze topnienia 108—110°C (B) z chlorowodrku estru metylowego N-metylo- -L-alaniny i bezwodnika izomaslowego — N-izobu- ^ tyrylo-N-metylo-L-alanine, bezbarwne graniastoslu¬ py o temperaturze topnienia 117—118°C (C) z chlorowodorku estru metylowego N-metylo- -L-alaniny i chlorku izowalerylu — N-metylo~N- izowalerylo-L-alanine, bezbarwne luski o tempera- 5Q turze topnienia 88—89°C.Przyklad XIV. (a) Wytwarzanie izocyjanianu p-metoksykarbony- loetylu W 600 ml suchego toluenu rozpuszczono 26,4 g 55 bursztynianu monometylu, a do roztworu dodano 55 g azydku dwufenylofosforylu i 22 g trójetylo~ aminy. Calosc mieszano w ciagu 3 godzin w tem¬ peraturze pokojowej, po czym przemyto woda i wy¬ suszono. Mieszanine odparowano do okolo 1/3 ob- 6« jetosci poczatkowej, po czym w ciagu 2 godzin ogrzewano do wrzenia pod chlodnica zwrotna. Po calkowitym odparowaniu rozpuszczalnika, pozosta¬ losc przedestylowano pod zmniejszonym cisnieniem^ otrzymujac 13,6 g zwiazku tytulowego o tempera- 05 turze wrzenia 64—66°C) 1,066 kPa.124 051 33 34 (b) Wytwarzanie izocyjanianu 5-dwumetyloamino- pentylu W 136 ml etanolu rozpuszczono 23,5 g 6-N,N-dwii^ metyloaminokapronianu metylu i 10,2 g wodzianu hydrazyny, a roztwór utrzymywano w ciagu nocy we wrzeniu pod chlodnica zwrotna. Do mieszaniny reakcyjnej dodano madmiaru etanolowego roztworu kwasu szczawiowego. Wytracony bialej barwy osad odsaczono i rozpuszczono na goraco w 300 ml 50% wodnego etanolu. Po oziebieniu odsaczono niewiel¬ ka ilosc nierozpuszczonej substancji, a przesacz od¬ parowano do sucha, otrzymujac 23,3 g bialej barwy proszku.Calosc powyzszej proszkowej pozostalosci zawie¬ szono w 136 ml wody i przy oziebianiu zadano 12,3 g azotynu sodu. 5N wodorotlenkiem sodu do¬ prowadzono mieszanine reakcyjna do pH 10,5 i eks¬ trahowano trzema porcjami po 150 ml benzenu. Eks¬ trakty benzenowe polaczono, przemyto woda, wysu¬ szono i w ciagu godziny utrzymywano we wrzeniu pod chlodnica zwrotna. Dokladnie odparowano roz¬ puszczalnik, a pozostalosc przedestylowano pod zmniejszonym cisnieniem. Otrzymano 6,1 g zwiazku tytulowego o temperaturze wrzenia 110—115°C) 2,613 kPa.Przyklad XV. W 10 ml suchego dwuchloro¬ metanu rozpuszczono 56 mg (0,099 mola) maytanzy¬ nolu, a do roztworu dodano 24 mg (0,202 mmola) izocyjanianu fenylu. W temperaturze pokojowej (18—23°C) dodano 30 mg (0,221 mmola) bezwodnego chlorku i cynku i w tej temperaturze mieszano calosc w ciagu 3 godzin. Mieszanine reakcyjna prze¬ myto woda, wysuszono (Na2S04) i odparowano. Po¬ zostalosc podano chromatografii na zelu krzemion¬ kowym (uklad rozpuszcalników: octan etylu/octan etylu wysycony woda 4:1 (objetosciowo) do 3:1 (objetosciowo), zbierajac eluat w 17 g frakcjach.Frakcje nr 9 do 17 polaczono i oddestylowano z nich rozpuszczalnik. Otrzymano 58 mg 3-N-fenylo- karbaminianu maytanzynolu o temperaturze topnie¬ nia 187—189°C (krystalizacja z octanu etyluheksa- nu).Przyklad XVI. W 10 ml dwuchlorometanu roz¬ puszczono 54 mg (0,0956 mmola) maytanzynolu, a do roztworu dodano 50 mg (0,877 mmola) izocyjanianu metylu i 30 mg chlorku miedziawego. Calosc mie¬ szano w ciagu 4 godzin w temperaturze pokojowej, po czym przesaczono i odparowano. Pozostalosc pod¬ dano chromatografii na kolumnie (srednicy 25 mm i wysokosci 45 cm) z zelem krzemionkowym, pro¬ wadzac elucje mieszanina chloroform/metanol 40 :1 (objetosciowo). Eluat zbierano w 25 g frakcjach.Frakcje nr 34 do 44 polaczono i odparowano do sucha, otrzymujac 44 mg bialej barwy, szklistego produktu, który rozpuszczono w chloroformie i wy¬ tracono z roztworem heksanem. Otrzymano 28 mg 3-(N-metylo)karbaminianu-9-(2,4-dwumetylo)allofa- nianu maytanzynolu w postaci bialej barwy prosz¬ ku o temperaturze topnienia 149—151°C (z rozkla¬ dem), 10 mg 3-(N-metylo)karbaminianu-9-(2,4-dwumety- lo)allofanianu maytanzynolu rozpuszczono w 0,2 ml dwuchlorometanu, a do roztworu dodano 2 krople kwasu trójfluorooctowego. Calosc mieszano w ciagu 5 minut w temperaturze pokojowej, po czym doda¬ no dalszej ilosci dwuchlorometanu i przemyto wod¬ nym roztworem wodoroweglanu sodu. Oddestylowa¬ no rozpuszczalnik, a pozostalosc poddano chroma¬ tografii na 12 g zelu krzemionkowego, otrzymujac 5 5,2 mg 3-(N-metylo)karbaminianu maytanzynolu.Przyklad XVII. Sposobem jak opisane w przy¬ kladach XIV do XVII mozna otrzymac nastepujace zwiazki: (A) z maytanzynolu i izocyjanianu metylu — 3- io -(N-metylo)karbaminian maytanzynolu, temperatura topnienia 196—200°C (z rozkladem) (B) z maytanzynolu i izocyjanianu butylu — 3- -(N-butylo)karbaminian maytanzynolu, temperatura topnienia 162—165°C 15 (C) z maytanzynolu i izocyjanianu oktadecylu — 3-(N-oktadecylo)-karbaminian maytanzynolu, tem¬ peratura topnienia 105—109°C (D) z maytanzynolu i izocjanianu cykloheksylu — 3-(N-cykloheksylo)karbaminian maytanzynolu, tem- 20 peratura topnienia 175—178°C (E) z maytanzynolu i izocyjanianu a-naftylu — 3-(N-ct-naftylo)karbaminian maytanzynolu, tempera¬ tura topnienia 172—175°C (F) z maytanzynolu i izocyjanianu p-etoksyfenylu 25 — 3-(N-p-etoksyfenylo)karbaminian maytanzynolu, temperatura topnienia 221—223°C (G) z dechloromaytanzynolu i izocyjanianu fenylu — 3-(N-fenylo)karbaminian dechloromatanzynolu, w postaci bezbarwnego, szklistego produktu. Widmo 30 NMR (CDCy ppm: 0,87 (3H, s), 1,26 (3H, d, J= =6Hz), 170 (3H, s), 2,03 (3H, s), 2,23 (IH, dd, J= =2,5Hz i 14Hz), 2,69 (IH, dd, J=llHz i 14Hz), 2,87 (IH, d, J=9Hz), 3,23 (3H, s), 3,30 (3H, s), 3,42 (IH, d, J =9Hz), 3,49 (IH, d, J=14Hz), 3,85 (3H, s), 4,30 (IH, 35 m), 4,78 (IH, dd, J=2,5 Hz i 11Hz), 5,37 (IH, dd, J=9Hz i 15Hz), 6,10 (IH, d, J=10,5Hz), 6,39 (IH, s), 6,43 (IH, dd, J=10,5Hz i 15Hz), 6,57—7,56 (okolo 9H, m) itd.(H) z maytanzynolu i izocyjanianu izoproylu — 40 3-N-izopropylokarbaminian maytanzynolu; widmo masowe (m/e): 588 (M+-61) (I) z maytanzynolu i izocyjanianu 3-pirydylu — 3-(N-m-pirydylo)karbaminian maytanzynolu; widmo masowe (m/e): 623 (M+-61) 45 (J) z maytanzynolu i izocyjanianu 5-dwumetylo- aminopentylu — 3-(N-5-dwumetyloaminopentylo)- karbaminian maytanzynolu; widmo masowe (m/e): 659 (m+-61) (K) z maytanzynolu i izocyjanianu p-metoksykar- 50 bonyloetylu — 3-(N-f3-metoksykarbonyloetylo) kar- baminian maytanzynolu; widmo masowe (m/e): 632 (M+-61) (L) z maytanzynolu i chlorku N,N-dwumetylokar- bamylu — 3-N,N-dwumetylokarbaminian maytanzy- 55 nolu; Rf = 0,39 (chloroform/metanol 95 : 5) widmo masowe (m/e): 574 (M+—61).Przyklad XVIII. Roztwór 57 mg maytanzy¬ nolu w 2,0 ml suchego czterowodorofuranu zadano 5 równowaznikami molowymi n-butylolitu (15% roz- $° twór w heksanie), w — 20°C, w strumieniu azotu.Dodano 61 mg chloromrówczanu izopropylu i mie¬ szano calosc w ciagu 15 minut w tej samej tem¬ peraturze. Z kolei mieszanine podgrzano do 0°C i zadano 0,5 ml nasyconego wodnego roztworu 65 chlorku sodu i 2,0 ml czterowodorofuranu. Oddzie-124 051 35 36 lono warstwe organiczna, przemyto ja i odparowa¬ no rozpuszczalnik. Pozostalosc poddano chromato¬ grafii na kolumnie z zelem krzemionkowym, otrzy¬ mujac 5 mg 3-izopropyloweglanu maytanzynolu.Chromatografia cienkowarstwowa na zelu krze^ mionkowym (plyta Art. 5642, Merck, RFN), uklad rozwijajacy chloroform/metanol 95 : 5 ; (objetoscio¬ wo).Spektrografia masowa (m/e): 650 (M+), 589 (M+-61).Przyklad XIX. Roztwór dechloromaytanzyno- lu (53 mg) w 2,0 ml suchego czterowodorofuranu za¬ dano, jak w przykladzie XVIII, 10 równowaznikami molowymi n-butylolitu. Dodano 10 równowazników molowych chloromrówczanu benzylu, w postaci 30% roztworu w benzenie, mieszano w ciagu 15 minut w tej samej temperaturze, po czym doprowadzono mieszanine do 0° C i zadano ja 0,5 ml nasyconego roztworu wodnego wodoroweglanu sodu. Oddzielo¬ no warstwe organiczna, wysuszono i odparowano rozpuszczalnik. Pozostalosc poddano chromatografii jak w przykladzie XVIII, otrzymujac 23 mg 3-ben^ zyloweglanu dechloromaytanzynolu.Wartosc Rf (warunki chromatografii jak w przy¬ kladzie XVIII): 0,54.Widmo masowe: (m/e) 603 (M+^61).Przyklad XX. Sposobem jak opisano w przy¬ kladach XV i XIX mozna otrzymac nastepujace zwiazki: (A) z maytanzynolu i chloromrówczanu n-oktylu — 3-n-oktyloweglan maytanzynolu. Chromatografia cienkowarstwowa na zelu krzemionkowym (E.Merck, HPTLC), Rf = 0,61 (chloroform-metanol 95 :5). Widmo masowe (m/e): 659 (M+—61).(B) z maytanzynolu i chloromrówczanu fenylu — 3-fenyloweglan maytanzynolu. Chromatografia cienkowarstwowa na zelu krzemionkowym (E.Merck, HPTCL), Rf = 0,45 (chloroform-metanol 95:5). Widmo masowe (m/e): 623 (M+—61).Przyklad XXI. Hodowany na skosie agaro¬ wym, zawierajacym ekstrakt z drozdzy i ekstrakt slodowy szczep Nocardia sp. C-15003 (IFO 13726; FERM-P 3992; ATCC-31281), wytwarzajacy maytan- zynol, maytanacyne i propionian maytanzynolu, za¬ stosowano do zaszczepienia 200 ml stozkowych kolb zawierajacych po 40 ml pozywki posiewowej (2% glukozy, 3% skrobi rozpuszczalnej, 1% surowej maki sojowej, 1% namoku kukurydzianego, 0,5% polipep- tonu, 0,3% NaCl, 0,5% CaCOs, pH 7,0). Zainokulo- wana pozywke inkubowano w 28°C na wstrzasarce obrotowej, w ciagu 48 godzin, otrzymujac inokulum. 0,5 ml porcje tak otrzymanego inokulum przenie¬ siono do 200 ml kolby stozkowej zawierajacej 40 ml pozywki fermentacyjnej zlozonej z 5% dekstryny, 3% namoku kukurydzianego, 0,1% polipeptonu i 0,5% CaCOs (pH 7,0) i hodowano na wstrzasarce obroto¬ wej w 28°C w ciagu 90 godzin, otrzymujac hodowle posiewowa.Jak oznaczono metoda seryjnych rozcienczen, sto¬ sujac jako organizm testowy Tetrahymena pyrifor- mis W, a jako standard propionian maytanzynolu, aktywnosc produkcyjna hodowli wynosila 25 \iglml.Polipepton: produkt Daigo Nutritive Chemicals Ltd., Japonia.Przyklad XXII. 10 ml porcje hodowli posie¬ wowej, otrzymanej w przykladzie XXI, przeniesiono do kolby Sakaguchi o pojemnosci 2 litry, zawiera¬ jacej 500 ml pozywki posiewowej i inkubowano w ciagu 48 godzin, w 28°C, na wstrzasarce obrotowej. 5 500 ml porcje otrzymanej hodowli przeniesiono do 50 litrowego tanku z nierdzewnej stali zawieraja¬ cego 30 litrów pozywki hodowli posiewowej i in¬ kubowano w ciagu 48 godzin w 28°C, przy napo¬ wietrzaniu 30 litrów na minute i mieszaniu z szyb- l* koscia 280 obrotów na minute (1/2DT), pod cisnie¬ niem wewnetrznym 1 kg/cm2. Otrzymano hodowle posiewowa, która posiano 200 litrowy tank z nie¬ rdzewnej stali zawierajacy 100 litrów pozywki fer¬ mentacyjnej podobnej do stosowanej w przykladzie ii5 XXI, w ilosci 10%. Inokulowana pozywke inkubo¬ wano w ciagu 90 godzin w 28°C, przy napowietrza¬ niu 100 litrów na minute i mieszaniu z szybkoscia 200 obrotów na minute (1/2DT), pod cisnieniem wew¬ netrznym 1 kg/cm2. Z oznaczenia sposobem jak opi- 20 sany w przykladzie XXI, aktywnosc produkcyjna pozywki wyniosla 25 jig/ml.Do 90 litrów wyzej otrzymanej hodowli dodano 2 kg sorbentu Hyflo Super Cel (Johnes and Man- ville Products, USA) i po dokladnym zmieszaniu 25 przesaczono na prasie filtracyjnej, otrzymujac 85 litrów przesaczu i 32 kg wilgotnych komórek. Prze¬ sacz (85 litrów) ekstrahowano, przy mieszaniu, 30 1 octanu etylu.Powyzsza procedure powtórzono, ekstrakty pola- 30 czono, przemyto dwiema 30 litrowymi porcjami wody, wysuszono dodaniem 500 g bezwodnego siar¬ czanu sodu i pod zmniejszonym cisnieniem odparo¬ wano do objetosci 200 ml. Do koncentratu dodano eteru naftowego, a wytracony osad odsaczono (53 g). 35 Powyzszy surowy produkt I mieszano z 100 ml octanu etylu i odsaczono skladniki nie rozpuszczo¬ ne. Przesacz mieszano z 10 g zelu krzemionkowego (E. Merck AG, RFN, 0,05—0,2 mm), po czym pod zmniejszonym cisnieniem odpedzono octan etylu. 40 Pozostalosc naniesiono na szczyt kolumny z zelem krzemionkowym (400 ml). Elucje prowadzono ko¬ lejno 500 ml n-heksanu, 500 ml miezsaniny heksan/ /octan etylu (3 : 1), 500 ml mieszaniny heksan/octan etylu (1 :1), 500 ml mieszaniny heksan/octan etylu 45 (i : 3), 500 ml octanu etylu, 1 litrem mieszaniny oc¬ tan etylu/metanol (50 :1) i 1 litrem mieszaniny octan etylu/metanol (25 : 1), zbierajac eluat frakcjami ob¬ jetosci 100 ml.Z kazdej frakcji pobierano 1 ml porcje, które 5° odparowywano do sucha i rozpuszczano w 0,1 ml octanu etylu. Roztwór nanoszono na plyty szklane powleczone zelem krzemionkowym (E. Merck, AG, RFN, Kieselgel 60 F^, 0,25 mm, 20X20), 2,5 cm od dolnej krawedzi i rozwijano do wysokosci okolo 17 55 cm w ukladzie octan etylu/metanol (19 :1). Po roz¬ winieciu prowadzono detekcje promieniowaniem nadfioletowym (2537 A). Zebrano frakcje aktywne nr 25—30, Rf 0,58—0,63 i nr 38^10, Rf 0,25—0,30 i zatezono je do objetosci po 20 ml. Do koncentra- 60 tów dodano po 150 ml eteru naftowego, otrzymujac surowy produkt II i 2 g surowego maytanzynolu.W 10 ml octanu etylu rozpuszczono 0,5 g otrzy¬ manego powyzej surowego produktu II, a roztwór dokladnie zmieszano z 4 g zelu krzemionkowego •65 (E. Merck AG, RFN, 0,05—0,2 mm). Octan etylu124 051 37 38 oddestylowano pod zmniejszonym cisnieniem, a po¬ zostalosc naniesiono na szczyt kolumny z 300 ml zelu krzemionkowego. Kolumne przemyto 500 ml chloroformu, a nastepnie eluowano kolejno 500 ml mieszaniny chloroform/metanol (50 :1) 500 ml mie¬ szaniny chloroform/metanol (20: 1) i 500 ml mie¬ szaniny chloroform/metanol (10 :1). Eluat zbierano frakcjami po 25 ml.Po 0,5 ml porcje kazdej frakcji odparowywano pod zmniejszonym cisnieniem, pozostalosc rozpusz¬ czano w 0,05 ml octanu etylu i nanoszono na plyte do chromatografii cienkowarstwowej (uklad rozwi¬ jajacy: chloroform/metanol 9 :1). Frakcje nr 40 i 41, absorbujace przy 2537 A, o Rf 0,48—0,50, zebrano i pod zmniejszonym cisnieniem odparowano do su¬ cha. Do pozostalosci dodano 0,5 ml octanu etylu i pozostawiono ja w spoczynku, uzyskujac 50 mg mieszanych krysztalów maytanacyny i propionianu maytanyzolu. 50 mg powyzszych mieszanych krysztalów may¬ tanacyny i propionianu maytanzynolu rozpuszczono w 5 ml metanolu, a do roztworu dodano 100 mg 10 15 20 chlorku sodu i 5 ml wody. Kolumne o srednicy 1,8 cm upakowano 200 ml Diaion HP-10 (Mitsubishi Chemical Industries, Ltd., Japonia) i przemyto 600 ml 50% wodnego metanolu, zawierajacego 5% NaCL Wyzej sporzadzony roztwór próbki przepuszczono przez kolumne, prowadzac elucje gradientowa za pomoca 1,5 litra 60% wodnego metanolu zawiera¬ jacego 5% NaCl i 1,5 litra 95% wodnego metanokh Eluat zbierano frakcjami po 15 ml, a kazda z nich analizowano chromatografia cienkowarstwowa.Frakcje 130 do 135 zawieraly maytanacyne, a frak*- cje 138—142 propionian maytanzynolu.Obie grupy frakcji odparowano i rozpuszczono przez dodanie po 30 ml wody i 50 ml octanu etylu.Roztwór wstrzasano w rozdzielaczu, po czym od¬ dzielono warstwe wodna, a warstwe octanu etylu przemyto dwiema 30 ml porcjami wody, wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodu, zatezono i pozo¬ stawiono w spoczynku. W powyzszy sposób z kazdej grupy frakcji otrzymano krysztaly, które odsaczono i wysuszono, otrzymujac 13 mg maytanacyny i 25 mg propionianu maytanzynolu.Temperatura topnienia (0°) Skrecalnosc wlasciwa Analiza elementarna znaleziono (%) Sklad elementarny obliczono (%) Widmo absorpcji w nadfiolecie Widmo absorpcji w podczerwieni Widmo masowe m/e Charakter kwasny, obojetny, zasadowy Reakcje barwne Tabela 2 Maytanacyna C80H89ClN2O9 235—236 [a]2^-121o±10o C 59,62 H 6,93 N 4,28 Cl 5,74 C 59,85 H 6,48 N 4,61 Cl 5,84 233(30330) 240(przegiecie 28240) 252(27850) 280(5680) 288(5660) 1740, 1730 1670, 1580 545, 485, 470, 450 substancja lipofilna i obojetna Dragendorfa: i dodatnia Beilsteina: dodatnia Propionian maytanzynolu Ci1H4iClN209 | 188—190 [ C 59,93 H 6,82 N 4,32 Cl 5,57 C 59,94 H 6,65 N 4,51 Cl 5,71 233(30240) 240(przegiecie 28400) 252(27650) 280(5740) 288(5710) 1740, 1730 1670, 1580 559, 485, 470, 450 substancja lipofilna i obojetna Dragendorfa: dodatnia Beilsteina: dodatnia Maytanzynol C28H,7C1N*08 172,5—174 | [a]^313o±10° 1 C 59,28 H 6,38 N 5,02 Cl 6,15 1 C 59,52 H 6,60 N 4,96 Cl 6,27 1 232(32750) 244(przegiecie 30850) 252(31650) 281(5750) 288(5700) 1 1715, 1670 1580 | 503, 485, 470, 450 substancja lipofilna i obojetna Dragendorfa: dodatnia Beilsteina: I dodatnia124 051 39 40 0,2 g otrzymanego powyzej maytanzynolu rozpu¬ szczono w 3 ml octanu etylu, a roztwór dokladnie wymieszano z 0,5 g zelu krzemionkowego (E. Merck AG, RFN, 0,05—0,2 mm). Pod zmniejszonym cisnie¬ niem odpedzono octan etylu, a pozostalosc nanie¬ siono na kolumne z 80 ml zelu krzemionkowego.Kolumne wpierw przemyto 150 ml chloroformu, a nastepnie eluowano kolejno 150 ml mieszaniny chlo¬ roform/metanol (50:1), 150 ml mieszaniny chloro¬ form/metanol (20:1) i 300 ml mieszaniny chloro¬ form/metanol (10:1). Eluat zbierano frakcjami po lOml.Z kazdej frakcji pobierano po 0,5 ml, pod zmniej¬ szonym cisnieniem odparowywano do sucha, roz¬ puszczano w 0,05 ml octanu etylu i analizowano chromatografia cienkowarstwowa (uklad rozwijaja¬ cy: chloroform/metanol 9.1). Frakcje absorbujace przy 2537 A, o Rf 0,35—0,38, zebrano i pod zmniej¬ szonym cisnieniem odparowano do sucha. Do pozo¬ stalosci dodano 0,5 ml octanu etylu i pozostawiono mieszaniny w spoczynku, otrzymujac 20 mg kryszta¬ lów maytanzynolu.Wlasciwosci fizyko-chemiczne tak otrzymanego maytanzynolu, maytanacyny i propionianu maytan¬ zynolu przedstawiono w tabeli 2.Przyklad XXIII. Hodowany na skosie agaro¬ wym, zawierajacym ekstrakt z drozdzy i ekstrakt slodowy szczep Nocardia sp. C-15003 (IFO 13726; FERM-P 3992; ATCC-31281) inokulowano do 200 ml stozkowych kolb zawierajacych po 40 ml pozywki posiewowej (2% glukozy, 3% skrobi rozpuszczalnej, 1% surowej maki sojowej, 1% namoku kukurydzia¬ nego, 0,5% polipeptonu, 0,3% NaCl, 0,5% CaCO*, pH €,7). Zainokulowana pozywke inkubowano w 28°C na wstrzasarce obrotowej, w ciagu 48 godzin, otrzy¬ mujac inokulum. 0,5 ml porcje tak otrzymanego inokulum przeniesiono do 200 ml kolby stozkowej zawierajacej 40 ml pozywki fermentacyjnej zlozo¬ nej z 5% dekstryny, 3% namoku kukurydzianego, 0,1% polipeptonu i 0,5% CaCOs (pH 7,0) i hodowano na wstrzasarce obrotowej w 28°C w ciagu 90 godzin, otrzymujac hodowle posiewowa.Jak oznaczono metoda seryjnych rozcienczen, sto¬ sujac jako organizm testowy Tetrahymena pyrifor- mis W, a jako standard ansamytocyne P-3, aktyw¬ nosc produkcyjna hodowli wynosila 25 [xg/ml.Przyklad XXIV. 10 ml porcje hodowli posie¬ wowej, otrzymanej w przykladzie XXIII, przenie¬ siono do kolby Sakaguchi o pojemnosci 2 litry, za¬ wierajacej 50 ml pozywki posiewowej i inkubowano w ciagu 48 godzin, w 28°C, na wstrzasarce obroto¬ wej. 500 ml porcje otrzymanej hodowli przenie¬ siono do 50 litrowego tanku z nierdzewnej stali zawierajacego 30 litrów pozywki hodowli posiewo¬ wej i inkubowano w ciagu 48 godzin w 28°C, przy napowietrzaniu 30 litrów na minute i mieszaniu z szybkoscia 280 obrotów na minute (1/2DT), pod cisnieniem wewnetrznym 1 kg/cm2. Otrzymano ho¬ dowle posiewowa, która posiano 200 litrowy tank w nierdzewnej stali zawierajacy 100 litrów pozywki fermentacyjnej podobnej do stosowanej w przykla¬ dzie XXIII, w ilosci 10%. Inokulowana pozywke inkubowano w ciagu 90 godzin w 28°C, przy napo¬ wietrzaniu 100 litrów na minute i mieszaniu z szyb¬ koscia 200 obrotów na minute (1/2DT), pod cisnie¬ niem wewnetrznym 1 kg/cm2. Z oznaczenia sposo¬ bem jak opisany w przykladzie XXIII, aktywnosc produkcyjna pozywki wyniosla 25 |xg/ml.Przyklad XXV. Do 95 litrów wyzej otrzyma- 5 nej (w przykladzie XXIV) hodowli dodano 2 kg sorbentu Hyflo Super Cel (Johnes and Manville Products, USA) i po dokladnym zmieszaniu przesa¬ czono na prasie filtracyjnej, otrzymujac 85 litrów przesaczu i 32 kg wilgotnych komórek, Przesacz io (85 litrów) ekstrahowano, przy mieszaniu, 30 litrami octanu etylu. Powyzsza procedure powtórzono, eks¬ trakty polaczono, przemyto dwiema 30 litrowymi porcjami wody, wysuszono dodaniem 500 g bezwod¬ nego siarczanu sodu i pod zmniejszonym cisnieniem Uj5 odparowano do 200 ml. Do koncentratu dodano eteru naftowego, a wytracony osad odsaczono (53g).Powyzszy surowy produkt mieszano z 10 g zelu krzemionkowego (E. Merck AG, RFN, 0,05—0,2 mm), po czym pod zmniejszonym cisnieniem odpedzono 20 octan etylu. Pozostalosc naniesiono na szczyt ko¬ lumny z zelem krzemionkowym (400 ml). Elucje prowadzono kolejno 500 ml heksanu, 500 ml mie¬ szaniny heksan/octan etylu (3:1), 500 ml mieszaniny heksan/octan etylu (1:1), 500 ml mieszaniny hek- 25 san/octan etylu (1:3), 500 ml octanu etylu, 1 litrem mieszaniny octan etylu) metanol (50:1), zbierajac eluat frakcjami po 100 ml.Z kazdej frakcji pobierano 1 ml porcje, które odparowywano do sucha i rozpuszczano w 0,1 ml 30 octanu etylu. Roztwór nanoszono na plyty szklane powleczone zelem krzemionkowym (E. Merck, AG, RFN, Kieselgel 60 F254, 0,25 mm, 20X20), 2,5 cm od dolnej krawedzi i rozwijano do wysokosci okolo 17 cm w ukladzie octan etylu/metanol (19:1). Po 35 rozwinieciu prowadzono detekcje promieniowaniem naobfioletowym 2537 A. Aktywne frakcje nr 23 do 28 o Rf 0,6—0,65 polaczono i pod zmniejszonym cisnieniem odparowano do okolo 20 ml. Do kon¬ centratu dodano 150 ml eteru naftowego, otrzymujac 40 15 g surowego produktu II.Przyklad XXVI. Przy mieszaniu, 32 kg ko¬ mórek otrzmanych w przykladzie XXV ekstraho¬ wano 50 litrami 70% wodnego acetonu, w ciagu 3 godzin, po czym przesaczono na prasie filtracyj- *5 nej. Operacje ekstrakcji 50 litrami 70% wodnego acetonu i saczenia powtórzono. Przesacze polaczono i pod zmniejszonym cisnieniem odpedzono z nich aceton. Otrzymany roztwór wodny przepuszczono przez kolumne z 5 litrami Diaion HP-10 (Mitsubi- 50 shi Chemical Industries, Ltd., Japonia). Kolumne przemyto 20 litrami wody i 50% wodnym meta¬ nolem, a nastepnie eluowano 15 litrami 90% wod¬ nego metanolu. Eluat pod zmniejszonym cisnieniem zatezono do objteosci 3 litry i wstrzasnieto z 3 li- 55 trami wody i 3 litrami octanu etylu.Powyzszy zabieg powtórzono. Warstwy octanu etylu polaczono, przemyto woda, wysuszono doda¬ niem bezwodnego siarczanu sodu i pod zmniejszo¬ nym cisnieniem odparowano do 200 ml. Po dodaniu 60 eteru naftowego odsaczono wytracony osad (28 g).Powyzszy produkt oczyszczono na kolumnie z zelem krzemionkowym, otrzymujac 8,0 g surowego pro¬ duktu II.Przyklad XXVII. 1,5 g surowego produktuII «5 otrzymanego w przykladzie XXV rozpuszczono w124 051 41 42 10 ml octanu etylu, a roztwór dokladnie wymiesza¬ no z 4 g zelu krzemionkowego (E. Merck AG, RFN, 0,05—0,2 mm). Pod zmniejszonym cisnieniem odpe¬ dzono octan etylu. Pozostalosc naniesiono na ko¬ lumne z 300 ml zelu krzemionkowego. Kolumne przemyto 500 ml chloroformu, a nastepnie eluowa- no kolejno 500 ml mieszaniny chloroform/metanol (50:1) 500 ml mieszaniny chloroform/metanol (20:1) i 500 ml mieszaniny chloroform/metanol (10.1). Elu- aty zbierano 25 ml frakcjami. 0,5 ml porcje kazdej frakcji odparowywano pod zmniejszonym cisnieniem. Do koncentratu dodawano 10 po 0,05 ml octanu etylu, a mieszanine poddawano chromatografii cienkowarstwowej na zelu krzemion¬ kowym (uklad rozwijajacy: chloroform-metanol 9:1).Frakcje absorbujace przy 2537 A, o Rf 0,50—0,60, polaczono i pod zmniejszonym cisnieniem odparo¬ wano do sucha. Do pozostalosci dodano 2 ml octanu etylu i pozostawiono mieszanine w spoczynku, otrzy¬ mujac 150 mg krysztalów mieszaniny ansamitocyny P-3, P-3' i P-4.Powyzszy material rozpuszczono w 15 ml meta¬ nolu, a do roztworu dodano 300 ml chlorku sodu i 15 ml wody. Kolumne o srednicy 1,8 cm zalado- Temperatura topnienia (°C) Skrecalnosc wlasciwa [a]^ Analiza elementarna znaleziono, % Analiza elementarna obliczono, % Widmo absorpcji w nadfiolecie nm (e) (w metanolu) 1 Widmo absorpcji w podczerwieni 1 (cm-1), KBr Widmo magnetycznego rezonansu jadrowego 100 MHz w CDC1, 8 ppm | Widmo masowe m/e | Rozpuszczalnosc Reakcje barwne: Tafcela 3 Ansamitocyna P-3 CjaH^ClNsO* = 635,169 1 190—192 -136°±10° (c=0,375, CHC13) C 60,06 H 7,04 N 4,33 Cl 5,37 C 60,51 H 6,82 N 4,41 Cl 5,58 233 (30250) 240 (przegiecie 28450 252 (27640) 280 (5750) 288 (5700) 1740, 1730, 1670, 1580, 1445, 1385, 1340, 1255, 1180, 1150, 1100, 1080, 1038 1.27 (d) (3H) 1.28 (d) (3H) 573, 485, 470, 450 P-3' ObH^CINsOs = 635,169 2 - 182—185 -134°±10° (c=0,ll, CHCls) C 60,09 H 7,02 N 4,34 Cl 5,99 C 60,51 H 6,82 N 4,41 Cl 5,58 233 (30155) 240 (przegiecie 28250) 252 (27600) 280 (5750) 288 (5700) 1740, 1730, 1670, 1580, 1445, 1385, 1340, 1255, 1180, 1150, 1100, 1080, 1038 1,06 (t) (3H) 573, 485, 470, 450 P-4 CMH45C1N209 =649,196 3 177—180 -142°±10° (c=0,522, CHC1?) C 60,65 H 7,05 N 4,25 Cl 5,23 C 61,05 H 6,99 N 4,32 Cl 5,46 233 (29900) 240 (przegiecie 28240) 252 (27590) 280 (5712) 280 (5680) 1740, 1730, 1670, 1580, 1445, 1385, 1340, 1255, 1180, 1150, 1100, 1080, 1038 | 1,03 (d) (6H) 587, 485, 470, 450 1 nierozpuszczalna w eterze naftowym, n-heksanie i wodzie slabo rozpuszczalna w benzenie i eterze rozpuszczalna w chloroformie, octanie etylu, acetonie, etanolu, metanolu, pirydynie, czterowodorofuranie i dwumety- tylosulfotlenku Dragendorfa: dodatnia Beilsteina: dodatnia124 051 43 44 wano nosnikiem Diaion HP-10 (Mitsubishi Chemical Industries, Ltd.), który zrównowazono 600 ml 50% wodnego metanolu zawierajacego 5% NaCl. Przez kolumne przepuszczono sporzadzony roztwór, a na¬ stepnie przeprowadzono elucje gradientowa za po¬ moca 1,5 litra 60% wodnego metanolu zawierajacego 5% NaCl i 1,5 litra 95% wodnego metanolu. Eluat zbierano frakcjami po 15 ml, a kazda frakcje ana¬ lizowano chromatografie cienkowarstwowa na zelu krzemionkowym. Frakcje 145 do 153 zawieraly an¬ samitocyne P-3, frakcje 167—180 ansamitocyne P-3' i P-4, a frakcje 185—19i0 ansamitocyne P-4.Kazda grupe frakcji odparowano, a pozostalosc rozpuszczono w 50 ml wody i 100 ml octanu etylu.Roztwór wstrzasano w rozdzielaczu i po oddzieleniu warstwy wodnej warstwe octanu etylu przemyto dwiema 50 ml porcjami wody, wysuszono nad bez¬ wodnym siarczanem sodu, zatezono i pozostawiono w spoczynku. W powyzszy sposób z kazdej grupy frakcji uzyskano krysztaly, które odsaczono i wy¬ suszono. Wydajnosc poszczególnych produktów byla nastepujaca: ansamitocyna P-3 70 mg, ansamitocy- na P-3', P-4 18 mg, ansamitocyna P-4 15 mg.Mieszane krysztaly ansamitocyny P-3' i P-4 (18 mg) rozpuszczono w 0,3 ml octanu etylu i naniesio¬ no linia na plyte szklana powleczona zelem krze¬ mionkowym (E. Merck, AG, RFN, Kieselgel 60 F^, 0,25 mm, 20X20), w odleglosci 2,5 cm od dolnej krawedzi, a chromatogram rozwinieto w ukladzie octan etylu/metanol (19:1). Po rozwinieciu do wyso¬ kosci okolo 18 cm, absorbujace pasma o Rf 0,68 (P-4) i Rf 0,65 (P-3') zeskrobano i oddzielnie dwukrotnie ekstrahowano octanem etylu zawierajacym niewiel¬ ka ilosc wody. Otrzymane ekstrakty przemyto woda, wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodu, zate¬ zono pod zmniejszonym cisnieniem i pozostawiono w spoczynku.Z frakcji o Rf 0,68 i Rf 0,65 uzyskano odpowiednio 10 mg krysztalów ansymitocyny P-4 i 3 mg kryszta¬ lów ansamitocyny P-3'.Fizyczne i chemiczne wlasciwosci ansamitocyn P-3, P-3' i P-4, otrzymanych jak wyzej, przedsta¬ wiono w tabeli 3.Przyklad XXVIII. W 1 ml czterowodorofuranu rozpuszczono 15 mg mieszaniny ansamitocyn P-3, P-3' i P-4, otrzymanej w przykladzie XXVII i po oziebieniu.roztworu do —5°C dodano do niego 12 mg wodorku litowoglinowego. Mieszanine pozostawiono w spoczynku w ciagu 2 godzin. Z kolei dodano 0,5 ml 1% wodnego roztworu H2S04 i ekstrahowano mie¬ szanine reakcyjna 2 ml octanu etylu. Ekstrakt prze¬ myto woda, wysuszono dodaniem bezwodnego siar¬ czanu sodu i odparowano pod zmniejszonym cis¬ nieniem. Koncentrat poddano preparatywnej chro¬ matografii cienkowarstwowej na zelu krzemionko¬ wym (rozpuszczalnik, octan etylu) metanol 19:1), strefe o Rf 0,25—0,3 zdrapano i ekstrahowano octa¬ nem etylu zawierajacym mala objetosc wody. Eks¬ trakt przemyto woda, wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodu i odparowano pod zmniejszonym cisnieniem, co spowodowalo wydzielenie krysztalów.Krysztaly odsaczono i wysuszono, otrzymujac 10 mg maytanzynolu o temperaturze topnienia 174°C.Analiza elementarna dla C^HayCl^Os'. wartosci znalezione: C 59,65; H 6,58; N 5,02; Cl 6,51, wartosci obliczone: C 59,52; H 6,60; N 4,96; Cl 6,27.IR: 1715, 1670, 1580 cm-1 UV (nm): 232 (32750), 244 (przegiecie 30850), 252 (31650), 281 (5750), 288 (5700) 5 Wlasciwosci produktu odpowiadaja wlasciwosciom maytanzynolu otrzymanego w przykladzie XXII.Przyklad XXIX. W 0,7 ml pirydyny rozpu¬ szczono 100 mg maytanzynolu, a do oziebionego lo¬ dem roztworu dodano 0,35 ml bezwodnika octowego. 10 Mieszanine pozostawiono w ciagu 18 godzin w tem¬ peraturze pokojowej (23—25°C), po czym wylano do 5 ml zimnej wody i mieszano. Wytracony osad odsaczono i wysuszono, otrzymujac 85 mg proszko¬ wej substancji. Powyzsza substancje rozpuszczono 15 w 1 ml mieszaniny chloroform/metanol 10:1 (obje¬ tosciowo), a roztwór wymieszano z 0,2 g zelu krze¬ mionkowego. Mieszanine naniesiono na kolumne z zelem krzemionkowym (80 ml), która eluowano octa¬ nem etylu wysyconym woda. Eluat zbierano frak- 20 cjami objetosci 10 ml.Frakcje 37—44 polaczono i odparowano pod zmniejszonym cisnieniem, a do pozostalosci dodano malej objetosci octanu etylu (okolo 0,5 ml), w celu ponownego rozpuszczenia krysztalów, po czym po- 25 zostawiono w spoczynku w temperaturze pokojowej.Wytracone krysztaly odsaczono, otrzymujac 36,0 mg maytanacyny o temperaturze topnienia 231°C. Na podstawie widma masowego, widma IR, widma UV i chromatografii cienkowarstwowej stwierdzono 30 identycznosc produktu z maytanacyna otrzymana w przykladzie XXII.Przyklad XXX. Bacillus megaterium IFO 12108 inokulowano do pozywki hodowlanej (pH 7,5) zawierajacej 2% dekstryny, 0,5% peptonu, 0,5% eks- 35 traktu drozdzowego i 0,5% ekstraktu miesnego, a zainokulowana pozywke inkubowano na wstrzasarce w 30°C, w ciagu 16 godzin. Do 2,75 litra powyzszej hodowli dodano 110 mg ansamitocyny P-4 i pro¬ wadzono reakcje, przy wstrzasaniu, w 30°C, w ciagu 40 51 godzin. Chromatografia cienkowarstwowa wyka¬ zala calkowity zanik ansamitocyny P-4 i pojawie¬ nie sie w mieszaninie reakcyjnej PDM-4.Przyklad XXX. Do 2,75 litra brzeczki otrzy¬ manej w przykladzie XXX dodano 1,3 litra octanu 45 etylu i przeprowadzono ekstrakcje, przy mieszaniu.Mieszanine przesaczono pod zmniejszonym cisnie¬ niem przez saczek pokryty 30 g Hyflo Super Cel (Johns Manville Products Co.,USA). Procedure te powtórzono. Warstwy octanu etylu polaczono, prze- 50 myto 800 ml 1/200 N HC1 i 400 ml 0,5% wodnego roztworu wodoroweglanu sodu, a nastepnie 400 ml wody (dwukrotnie). Z kolei roztwór wysuszono za pomoca 10 g bezwodnego siarczanu sodu i pod zmniejszonym cisnieniem zatezono do 2 ml. Do kon- 55 centratu dodano 50 ml eteru naftowego i odsaczono wytracony osad (126 mg).Powyzszy surowy produkt (a) PDM-4 rozpuszczo¬ no w malej objetosci chloroformu i naniesiono na kolumne (srednica 1 cm) z 5 g zelu krzemionkowego &0 (E. Merck, AG, RFN, 0,05—0,2 mm). Elucje prowa¬ dzono kolejno 100 ml chloroformu, 100 ml miesza¬ niny chloroform/metanol (40:1) i 200 ml mieszaniny chloroform/metanol (20:1), zbierajac eluat frakcja¬ mi po 10 ml, Kazda frakcje nanoszono na plyte 65 szklana powleczona zelem krzemionkowym (E. Merck,124 051 45 46 AG, RFN, Kieselgel 60 F^m, 0,25 mm, 20X20), w od¬ leglosci 2,5 cm od dolnej krawedzi i w ukladzie octan etylu/metanol (19:1) rozwijano chromatogram do wysokosci okolo 17 cm. Frakcje (nr 13 do 17), w których wykryto material absorbujacy przy 2537 A o Rf 0,64 polaczono i pod zmniejszonym cisnieniem zatezono do objetosci okolo 1 ml. Do koncentratu dodano 30 ml eteru naftowego, uzyskujac 79 suro¬ wego produktu (b) PDM-4.Przyklad XXXII. W malej objetosci chloro¬ formu rozpuszczono 79 mg surowego produktu (b) PDM-4 otrzymanego w przykladzie XXXI, a roz¬ twór naniesiono liniowo na 4 plyty szklane powle¬ czono zelem krzemionkowym (E. Merck AG, RFN, Kieselgel F^, 2 mm, 20X20), w odleglosci 2,5 cm od dolnej krawedzi. Po rozwinieciu chromatogra- mów w ukladzie octan etylu/metanol (19:1), absor¬ bujaca strefe o Rf 0,64 zeskrobano i dwukrotnie ekstrahowano octanem etylu zawierajacym mala ilosc wody. Ekstrakty przemyto woda, wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodu i odparowano pod zmniejszonym cisnieniem, a nastepnie zadano ete¬ rem naftowym. Otrzymano 68 mg PDM-4 w postaci bialej barwy proszku.Przyklad XXXIII. Do 5,5 litra brzeczki jak otrzymana w przykladzie XXX (hodowla Bacillus megaterium IFO 12108) dodano 220 mg maytanzy¬ nolu i przeprowadzono reakcje przy wstrzasaniu w 30°C, w ciagu 30 godzin. Chromatografia cienko¬ warstwowa wykazala spadek stezenia maytanzynolu i pojawienie sie w ukladzie reakcyjnym dernetylo- maytanzynolu.Przyklad XXXIV. Brzeczke otrzymana w przykladzie XXXIII oczyszczono jak w przykladzie XXXI i poddano TLC jak w przykladzie XXXI.Zebrano frakcje o Rf 0,25, otrzymujac z nich 61 mg surowego demetylomaytanzynolu, który dalej oczy¬ szczono jak w przykladzie XXXII, otrzymujac 33 m demetylomaytanzynolu w postaci bialej barwy pro¬ szku.Przyklad XXXV. Do 12,5 litra brzeczki Ba¬ cillus megaterium IFO 12108, otrzymanej w przy¬ kladzie XXX, dodano 500 mg propionianu maytan¬ zynolu i przy wstrzasaniu prowadzono reakcje w 30°C w ciagu 28 godzin. TLC wykazala calkowity zanik propionianu maytanzynolu i pojawienie sie w brzeczce demetylomaytanzynolu.Przyklad XXXVI. Za pomoca 12 litrów octanu etylu oczyszczono 12,5 litra brzeczki otrzymanej w przykladzie XXXV, sposobem opisanym w przykla¬ dzie XXXI i przeprowadzono TLC jak opisano w przykladzie XXXI. Zebrano frakcje o Rf 0,58, pod zmniejszonym cisnieniem odparowano je do sucha i pozostawiono w spoczynku z 5 ml octanu etylu.Otrzymano 235 mg krysztalów propionianu deme¬ tylomaytanzynolu.Przyklad XXXVII. Do 1 litra brzeczki jak otrzymana w przykladzie XXX (hodowla Bacillus megaterium IFO 12108) dodano mieszanine (10 mg) maytanzynolu, maytanacyny, propionianu maytan¬ zynolu, ansamitocyny P-3 i ansamitocyny P-4 i przy wstrzasaniu prowadzono reakcje w 30°C w ciagu 24 godzin. TLC wykazala spadek stezenia skladni¬ ków powyzszej mieszaniny i pojawienie sie ich ana¬ logów demetylowych. Na chromatogramie rozwinie¬ tym w ukladzie octan etylu/metanol (19:1) wykryto demetylomaytanzynol o Rf 0,25 do 0,30, demetylo- maytanacyne o Rf 0,54, propionian demetylomaytan¬ zynolu o Rf 0,58, PDM-3 o Rf 0,61 i PDM-4 o Rf 5 0,64. Na chromatografie rozwijanym w ukladzie chloroform/metanol (9:1) demetylomaytanzynol wy¬ krywa sie przy Rf 0,30, demetylomaytanacyne przy Rf 0,38, propionian demetylomaytanzynolu przy Rf 0,40, PDM-3 przy Rf 0,42, a PDM-4 przy Rf 0,44. io Przyklad XXXVIII. Streptomyces flavotricini IFO 12770 inokulowano do pozywki hodowlanej (pH 7,2) zawierajacej 1% dekstryny, 1% glukozy, 1% gli¬ ceryny, 0,5% peptonu, 0,5% ekstraktu z drozdzy, 0,5% ekstraktu miesnego, 0,3% chlorku sodu i 0,5% we- 15 glanu wapnia. Inkubacje prowadzono w 28°C na wstrzasarce, w ciagu 48 godzin. Do 2 litrów uzyska¬ nej hodowli dodano 20 mg ansamitocyny P-3 i przy wstrzasaniu prowadzono reakcje w 28°C w ciagu 48 godzin. Brzeczka oczyszczono jak w przykladach 2S XXXI i XXXII, otrzymujac 12 mg PDM-3 w posta¬ ci bialej barwy proszku.Przyklad XXXIX. Do 2 litrów brzeczki ho¬ dowlanej Streptomyces flavotricini IFO 12770, otrzy¬ manej jak w przykladzie IX, dodano 20 mg mayta- 25 nacyny i przy wstrzasaniu prowadzono reakcje w 28°C w ciagu 28 godzin. Brzeczke oczyszczono i po¬ zostawiono z mala iloscia octanu etylu, jak w przy¬ kladach XXXI i XXXII, otrzymujac 6 mg kryszta¬ lów demetylomaytanacyny. 30 Przyklad XL. Do 1 litra brzeczki hodowlanej Actinomyces nigrescens IFO 12894, otrzymanej jak w przykladzie XXXIX dodano 10 mg propionianu maytanzynolu. Reakcje prowadzono w 28°C, przy wstrzasaniu, w ciagu 48 godzin. TLC wykazala cal- 35 kowity zanik propionianu maytanzynolu i pojawie¬ nie sie w brzeczce propionianu demetylomaytanzy¬ nolu.Przyklad XLI. Do 1 litra brzeczki hodowlanej Streptomyces platensis IFO 12901, otrzymanej jak 40 w przykladzie XXXIX, dodano 10 mg propionianu maytanzynolu. Reakcje prowadzono w 28°C, przy wstrzasaniu, w ciagu 48 godzin. TLC wykazala cal¬ kowity zanik propionianu maytanzynolu i pojawie¬ nie sie w brzeczce propionianu demetylomaytan- 45 zynolu.Przyklad XLII. W 30 ml czterowodorofuranu rozpuszczono 80 mg krysztalów propionianu deme¬ tylomaytanzynolu, otrzymanych w przykladzie XXXVI. Roztwór oziebiono do —5°C i dodano 80 mg 50 wodorku litowoglinowego. Calosc mieszano w lazni z lodem w ciagu 30 minut, po czym dodano 10 ml 1/200 N kwasu solnego i ekstrahowano mieszanine 50 ml octanu etylu. Ekstrakt przemyto woda, wy¬ suszono bezwodnym siarczanem sodu i odparowano 55 pod zmniejszonym cisnieniem.Preparatywna TLC (zel krzemionkowy) produktu przeprowadzono na koncentracie, za pomoca mie¬ szaniny octan etylu/metanol (19:1), rozwijajac chro¬ matogram na dlugosci 17 cm. Absorbujaca w UV 60 strefe o Rf 0,25 do 0,40 zeskrobano i wyekstraho¬ wano octanem etylu zawierajacym mala ilosc wody.Ekstrakt przemyto woda, wysuszono nad bezwod¬ nym siarczanem sodu i odparowano pod zmniej¬ szonym cisnieniem. Otrzymano 41 mg demetylo- 65 maytanzynolu o wlasciwosciach fizykochemicznych124 051 47 48 identycznych z wlasnosciami produktu otrzymane¬ go w przykladzie XXXIV.Przyklad XLIII. W 20 ml czterowodorofuranu rozpuszczono 50 mg proszku PDM-3, otrzymanego w przykladzie XXXVIII. Po oziebieniu roztworu do —5°C dodano 50 mg wodorku litowoglinowego. Mie¬ szanine reakcyjna przerobiono i oczyszczono jak w przykladzie XLII, otrzymujac 27 mg demetylomay¬ tanzynolu w postaci bialej barwy proszku. Wlasci¬ wosci fizykochemiczne produktu okazaly sie iden¬ tyczne z wlasciwosciami demetylomaytanzynolu otrzymanego w przykladzie XXXIV.Przyklad XLIV. Proszek PDM-4 (50 mg), otrzymany w przykladzie XXXII, przerobiono i o- czyszczono jak w przykladzie XLII, otrzymujac 23 mg demetylomaytanzynolu, o wlasciwosciach fi¬ zykochemicznych identycznych z wlasciwosciami demetylomaytanzynolu otrzymanego w przykladzie XXXIV.Przyklad XLV. Krysztaly demetylomaytana- cyny (50 mg), otrzymane w przykladzie XXXIX, przerobiono i oczyszczono jak w przykladzie XLII.Wlasciwosci fizykochemiczne produktu okazaly sie 10 15 20 identyczne z wlasciwosciami demetylomaytanzynolu otrzymanego w przykladzie XXXIV.Przyklad XLVI. W 20 ml czterowodorofuranu rozpuszczono 30 mg mieszaniny demetylomaytana- cyny, propionianu demetylomaytanzynolu, PDM-3 i PDM-4, otrzymanej w przykladzie XXXVII, a po oziebieniu roztworu do — 5°C dodano 30 mg wodor¬ ku litowoglinowego. Mieszanine reakcyjna przero¬ biono i oczyszczono jak w przykladzie XLII, otrzy¬ mujac 12 mg demetylomaytanzynolu. Produkt oka¬ zal sie, z porównania wlasciwosci fizykochemicz¬ nych, identyczny z demetylomaytanzynolem otrzy¬ manym w przykladzie XXXIV.Przyklad XLVII. Do 1 litra hodowli Strepto- myces libani IFO 13452, prowadzonej jak w przy¬ kladzie XXXVIII, dodano 10 mg ansamitocyny P-3.Reakcje prowadzono w 28°C, przy wstrzasaniu, w ciagu 48 godzin. TLC wykazal calkowity zanik ansamitocyny P-3 i pojawienie sie PDM-3.Wlasciwosci zwiazków otrzymanych w przedsta¬ wionych przykladach podano w tabeli 4f Przyklad XLVIII. Bacillus megaterium IFO 12108 inokulowano do pozywki hodowlanej (pH 7,5) J Wzór suma- ] ryczny, I Ciezar cza¬ steczkowy Temperatu- j ra topnienia (°C) Skrecalnosc wlasciwa (a)2D2(CHCU) (MeOH) j Analiza J elementarna 1 znaleziono (%) c H N Cl . obliczono C 1 H N Cl Widmo absorpcji w nadfiole¬ cie nm («) \ (MeOH) Demetylo- maytanzynol i CsyHssClNjOg^ 551,050 194—196 -201°±10° (c=0,215) -209°±10° (c=0,50) 58,53 6,69 4,81 6,28 58,85 6,40 5,08 6,43 232 (31200) 242 (33400) 251 (34000) 280 ( 6890) 288 ( 6840) Tal Demetylo- maytanacyna 2 C29Ha7ClN209= 593,088 224—226 4 -115°±10° (c=0,12) -98°±10° (c=0,505) 58,66 6,43 4,67 5,79 58,73 6,29 4,72 5,98 232 (29700) 242 (30700) 251 (31000) 280 ( 6110) 288 ( 6050) De la 4 Propionian demetylo¬ maytanzynolu 3 C*oH39ClNs09= 607,115 193—195 -104°±10° (c=0,22) -112°±10° (c=0,54) 59,23 6,68 4,55 5,69 59,35 6,48 4,61 5,84 232 (30000) 242 (30900) 251 (31200) 280 ( 6380) 288 ( 6320) PDM-3 ~4 CwH4iClN209= 621,142 165—168 -132°±10° (c=0,20 -120°±10° (c=0,52) 59,61 6,92 4,36 5,47 59,94 6,65 4,51 5,71 232 (28900) 242 (29200) 251 (29200) 280 ( 6150) 288 ( 5970) PDM-4 5 CffiH48ClN209= 635,169 185—188 -110°±10° (c=0,22) -112°±10° (c=0,51) 60,17 7,08 ' 4,27 5,33 60,51 6,82 4,41 5,58 232 (30000) 242 (30400) 251 (30500) 280 ( 6360) 288 ( 6290)49 124 051 50 cd. tabeli 4 Widmo absorpcji w podczer¬ wieni cm-1 (KBr) Widmo magnetycz¬ nego rezo¬ nansu ja¬ drowego ppm (100 MHz) (rozpusz¬ czalnik) Widmo masowe m/s Rozpusz¬ czalnosc Reakcje | barwne 1 1726, 1697 1640, 1587 1435, 1390 1345, 1305 1276, 1175 1155, 1107 1080, 1005 3,06, (3H, s) 3,26, (3H, s) (de-DMSO) 489,471 2 1737, 1697 1660, 1594 1443, 1397 1378, 1335 1280, 1234 1180, 1158 1100, 1083 1030 2,14 (3H, s) 3,06 (3H, s) 3,27 (3H, s) (de-DMSO) 531, 471 456, 436 3 1737, 1715 1642, 1594 1442, 1397 1344, 1320 1280, 1238 1175, 1100 1085, 1020 1,07 (3H, t) 3,04 (3 H, s) 3,27 (3H, s) (de-DMSO) 545, 471 456, 436 4 1740, 1710 1642, 1593 1443, 1397 1355, 1320 1283, 1238 1185, 1155 1110, 1085 1018 1,27 (3H, d) 1,29 (3H, d) 3,19 (3H, s) 3,38 (3H, s) (CDCs) 559, 471 456, 436 5 1 1738, 1715 1662, 1585 1442, 1395 1377, 1300 1283, 1183 1167, 1110 1085, 1018 1,03 (6H, d) 3,17 (3H, s) 3,39 (3H, s) (CDC8) 573, 471 456, 436 | dobrze rozpuszczalne w pirydynie i dwumetylosulfotlenku; rozpuszczalne w chlorofor¬ mie, octanie etylu, czterowodorofuranie, acetonie, etanolu i metanolu; slabo rozpuszczal¬ ne w benzynie i eterze; bardzo slabo rozpuszczalne w wodzie; praktycznie nierozpusz¬ czalne w eterze naftowym i n-heksanie | Dragendorfia: dodatnia Beilsteina: dodatnia | zawierajacej 2% dekstryny, 0,5% peptonu, 0,5% eks¬ traktu drozdzowego i 0,5% ekstraktu miesnego i w ciagu 16 godzin prowadzono hodowle w 28°C, na wstrzasarce. Do 1,5 litra powyzszej hodowli doda¬ no 30 mg 3-pikolinianu maytanzynolu i prowadzo¬ no reakcje w 28°C, przy wstrzasaniu, w ciagu 29 godzin. TLC wykazala calkowity zanik 3-pikolinia¬ nu maytanzynolu i pojawienie sie w brzeczce 3-pi¬ kolinianu demetylomaytanzynolu.Przyklad IL. 1,5 litra brzeczki otrzymanej w przykladzie XLVIII ekstrahowano, przy mieszaniu, 750 ml octanu etylu, po czym pod zmniejszonym cisnieniem przesaczono mieszanine przez 15 g Hyflo Super Cel (Johns-Manville Products, Corp., USA).Powyzsza procedure powtórzono, a polaczone eks¬ trakty dwukrotnie przemyto 300 ml porcjami wody, wysuszono nad 10 g bezwodnego siarczanu sodu i odparowano pod zmniejszonym cisnieniem.Otrzymano produkt (a), który rozpuszczono w ma¬ lej objetosci chloroformu i naniesiono na kolumne (srednicy 1 cm) z 5 g zelu krzemionkowego (Merck, RFN, 0,05—0,2 mm). Elucje prowadzono 150 ml chlo¬ roformu i mieszaniny chloroform-metanol (20 :1), zbierajac eluat frakcjami po 10 ml. Kazda z frak¬ cji nanoszono na plyte szklana powleczona zelem krzemionkowym (Kieselgel 60 F254, Merck, RFN, 0,25 mm, 20X20) w odleglosci 2,5 cm od dolnej kra¬ wedzi i rozwijano chromatogram do wysokosci oko¬ lo 17 cm w ukladzie chloroform-metanol (9:1).Frakcje nr 12 do 16, zawierajace substancje absor¬ bujaca przy 2537 A, o Rf 0,40, polaczono i odparo¬ wano pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac 18 mg surowego produktu (b). Produkt ten rozpusz¬ czono w malej objetosci chloroformu, a roztwór 35 :40 50 55 naniesiono liniowo na 4 plyty szklane powleczone zelem krzemionkowym, w odleglosci 2,5 cm od dol¬ nej krawedzi, po czym rozwinieto chromatogramy w octanie etylu wysycanym woda.Absorbujace w UV strefy o Rf 0,30 zeskrobano i ekstrahowano octanem etylu z mala zawartoscia wody. Ekstrakt przemyto woda, wysuszono nad bez¬ wodnym siarczanem sodu i pod zmniejszonym cis¬ nieniem odparowano. Koncentrat zadano eterem naftowym, otrzymujac 6 mg 3-pikolinianu deme¬ tylomaytanzynolu w postaci bialej barwy proszku.Widmo UV (X^xH nm: 232' 243' 252' 280' 289 Widmo masowe (m/e): 655, 594, 471, 456, 436.Przyklad L. Do 2 litrów brzeczki hodowlanej Bacillus megaterium IFO 12108, otrzymanej jak w przykladzie XLVIII, dodano 37 mg 3-(N-fenylo)kar~ baminianu maytanzynolu i przy mieszaniu, w 28°C, prowadzono reakcje w ciagu 48 godzin. TLC wy¬ kazala calkowity zanik w brzeczce 3-(N-fenylo)kar- baminianu maytanzynolu i pojawienie sie 3-(N-fe- nylo)karbaminianu demetylomaytanzynolu.Przyklad LI. Brzeczke otrzymana w przykla¬ dzie L oczyszczono jak w przykladzie IL i podano TLC jak w przykladzie IL. Zebrano frakcje przy Rf 0,40, otrzymujac 27 mg surowego produktu (b) 3-(N-fenylo)karbaminianu demetylomaytanzynolu.Produkt oczyszczono jak w przykladzie L, otrzy¬ mujac 12 mg 3-(N-fenylo)karbaminianu demetylo¬ maytanzynolu w postaci bialej barwy proszku.Widmo UV (X^H) nm: 233, 252,^80, 288 Widmo masowe (m/e): 608, 471, 456, 436.Przyklad LII. Do 2 litrów brzeczki hodowla¬ nej Bacillus megaterium IFO 12108, otrzymanej jak124 051 51 52 w przykladzie VLVIII, dodano 37 mg 3-fenylooctanu dechloromaytanzynolu i przy wstrzasaniu prowa¬ dzono reakcje w 28°C, w ciagu 48 godzin. TLC wy¬ kazala zanik 3-fenylooctanu dechloromaytanzynolu i pojawienie sie w brzeczce 3-fenylooctanu deme- tylodechloromaytanzynolu.Przyklad LIII. Brzeczke otrzymana w przy¬ kladzie LII oczyszczono jak w przykladzie IL i pod¬ dano chromatografii cienkowarstwowej jak w przy¬ kladzie IL. Frakcje absorbujace przy Rf 0,43 zebra¬ no, otrzymujac 30 mg surowego produktu (b) 3-fe¬ nylooctanu demetylodechloromaytanzynolu. Powyz¬ szy surowy produkt (b) oczyszczono dalej jak w przykladzie IL, otrzymujac 14 mg 3-fenylooctanu demetylodechloromaytanzynolu w postaci bialej bar¬ wy proszku.Widmo UV (1^H) nm: 230, 240, 249, 277, 285 Widmo masowe (m/e): 634 (M+), 573, 437, 422.Przyklad LIV. Do 1 litra brzeczki hodowlanej Bacillus megaterium IFO 12108, jak otrzymana w przykladzie XLVIII, dodano 18 mg 3-kapronianu maytanzynolu i przy wstrzasaniu w 30°C prowa¬ dzono reakcje w ciagu 48 godzin. TLC wykazala calkowity zanik 3-kapronianu maytanzynolu i po¬ jawienie sie 3-kapronianu demetylomaytanzynolu.Przyklad LV.Brzeczke hodowlana otrzymana w przykladzie LIV oczyszczono jak w przykladzie IL i poddano TLC jak w przykladzie IL. Zebrano frakcje o Rf 0,48, otrzymujac 9 mg surowego pro¬ duktu (b) 3-kapronianu demetylomaytanzynolu. Po¬ wyzszy produkt oczyszczono dalej jak w przykla¬ dzie IL, otrzymujac 4 mg 3-kapronianu demetylo¬ maytanzynolu w postaci bialej barwy proszku.Widmo UV ttml°H) nm: 233 240 252 280 289 Widmo masowe (m/e): 587, 471, 456, 436.Przyklad LVI. Do 1 litra brzeczki hodowlanej Bacillus megaterium IFO 12108, jak otrzymana w przykladzie XLVIII, dodano 19,5 mg 3-p-chloroben¬ zoesanu maytanzynolu i przy wstrzasaniu prowa¬ dzono reakcje w 30°C w ciagu 27 godzin. TLC wy¬ kazala calkowity zanik 3-p-chlorobenzoesanu may¬ tanzynolu i pojawienie sie 3-p-chlorobenzoesanu demetylomaytanzynolu.Przyklad LVII. Brzeczke hodowlana otrzyma¬ na w przykladzie LVI oczyszczono jak w przykla¬ dzie IL i poddano chromatografii cienkowarstwowej jak w przykladzie IL. Frakcje przy Rf 0,43 zebra¬ no, otrzymujac 12 mg surowego produktu (b) 3-p- -chlorobenzoesanu demetylomaytanzynolu. Powyzszy produkt oczyszczono dalej jak w przykladzie IL, otrzymujac 6 mg 3-p-chlorobenzoesanu demetylo¬ maytanzynolu w postaci bialej barwy proszku.Widmo UV (\™t°H) nm: 240 252' 280 289 Widmo masowe (m/e): 627, 471, 456, 436.Przyklad LVIII. Streptomyces flavotricini IFO 12770 hodowano jak w przykladzie XXXVIII, a do 750 ml hodowli dodano 15,9 mg 3-cykloheksanokar- boksylanu maytanzynolu. Przy wstrzasaniu prowa¬ dzono reakcje w 28°C w ciagu 48 godzin. TLC wy¬ kazala calkowity zanik 3-cykloheksanokarboksyla- nu maytanzynolu i pojawienie sie w brzeczce 3-cy- kloheksanobarftoksylanu demetylomatanzynolu.Przyklad LIX. Brzeczke hodowlana otrzyma¬ na w przykladzie LVIII oczyszczono jak w przy¬ kladzie IL i poddano TLC jak w przykladzie IL.Frakcje przy Rf 0,45 zebrano, otrzymujac z nich surowy produkt (b) 3-cykloheksanokarboksylanu de¬ metylomaytanzynolu, który dalej oczyszczono jak w przykladzie IL, otrzymujac 3-cykloheksanokar- 5 boksylan demetylomaytanzynolu w postaci bialej barwy proszku.Widmo UV ttml£H) nm: 233 240' 252 280 289 Widmo masowe (m/e): 599, 471, 456, 436.Przyklad LX. Streptomyces platensis IFO 10 12901 hodowano jak w przykladzie XXXVIII, a do 4 litrów hodowli dodano 40 mg 3-fenylooctanu may¬ tanzynolu. Przy wstrzasaniu prowadzono reakcje w 28°C, w ciagu 48 godzin. TLC wykazala spadek ste¬ zenia 3-fenylooctanu maytanzynolu i pojawienie sie 15 w brzeczce 3-fenylooctanu demetylomaytanzynolu.Przyklad LXI. Brzeczke hodowlana otrzymana w przykladzie LX oczyszczono jak w przykladzie IL i poddano TLC jak w przykladzie IL. Zebrano frakcje przy Rf 0,43, otrzymujac 22 mg surowego 20 3-fenylooctanu demetylomaytanzynolu (b). Powyzszy surowy produkt oczyszczono dalej jak w przykla¬ dzie IL, otrzymujac 8 mg 3-fenylooctanu demety¬ lomaytanzynolu w postaci bialej barwy proszku.Widmo UV ttm!xH) nm: 233 240 252 280 289 25 Widmo masowe (m/e): 607, 471, 456, 436.Przyklad LXII. Bacillus megaterium IFO 12108 hodowano jak w przykladzie XXXVIII, a do 2,8 litra otrzymanej hodowli dodano 140 mg 3-izo- maslanu dechloromaytanzynolu. Przy wstrzasaniu 30 prowadzono reakcje w 28°C, w ciagu 50 godzin. TLC wykazala zanik 3-izomaslanu dechloromaytanzynolu i pojawienie sie w brzeczce 3-izomaslanu demety¬ lodechloromaytanzynolu.Przyklad LXIII. Brzeczke otrzymana w przy- 35 kladzie LXII oczyszczono jak w przykladzie XXXIX i poddano TLC jak w przykladzie IL. Zebrano frakcje przy Rf 0,42, otrzymujac 113 mg surowego 3-izomaslanu demetylodechloromaytanzynolu (b). Su¬ rowy produkt (b) przemyto mala objetoscia eteru 40 dwuetylowego, rozpuszczono w octanie etylu, a roz¬ twór pozostawiono w spoczynku. Otrzymano 76 mg krysztalów 3-izomaslanu demetylodechloromaytan¬ zynolu o temperaturze topnienia 213—215°C.Skrecalnosc wlasciwa: -116,6° (c = 0,47, CHC18) 45 Analiza elementarna dla CsiH^^O^ znaleziono: C 63,27, H 7,33, N 4,61; obliczono: C 63,46, H 7,22, N 4,78 Widmo UV (d°H) nm (e): 230 (27200), 240 (29700).. 248 (29700), 277 (4100), 285 (3700). 50 Widmo masowe (m/e): 525, 437, 422.Przyklad LXIV. Streptomyces platensis IFO- -12901 hodowano jak w przykladzie XXXVIII, a do 4,4 litra hodowli dodano 440 mg L-maytanzyny.Przy wstrzasaniu prowadzono reakcje w 28°C w 55 ciagu 48 godzin, TLC wykazala calkowity zanik maytanzyny i pojawienie sie L-demetylomaytanzy- ny.Przyklad LXV. Do 4,4 litra brzeczki otrzyma¬ nej w przykladzie LXIV dodano 2,2 litra octanu 60 etylu, a otrzymany ekstrakt przesaczono pod zmniej¬ szonym cisnieniem przez cedzidlo z 40 g Hyflo Su¬ per Cel (Johns Manville Products Co., USA). Pro¬ cedure te powtórzono, a polaczone ekstrakty prze¬ myto 1,2 litra 1/200 N kwasu solnego i 1 litrem 65 0,5% wodnego roztworu wodoroweglanu sodu, po124 051 53 54 czym wysuszono nad 20 g bezwodnego siarczanu sodu i pod zmniejszonym cisnieniem odparowano do objetosci 2 ml.Do pozostalosci dodano 50 ml eteru naftowego, a wytracony osad odsaczono (252 mg). Surowa L- -demetylomaytanzyne (a) rozpuszczono w malej ob¬ jetosci chloroformu i naniesiono na kolumne (srednicy 1,2 cm) z 10 g zelu krzemionkowego (merck, RFN, 0,05—0,2 mm). Elucje prowadzono ko¬ lejno 100 ml chloroformu, 200 ml mieszaniny chlo¬ roform) metanol (20 :1) i 200 ml mieszaniny chlo¬ roform/metanol (10 :1). Eluat zbierano 2 ml frakcja¬ mi a, kazda z nich nanoszono na plyte szklana po¬ wleczona zelem krzemionkowym (Merck, RFN, Kie- selgel 60 F** 0,25 mm 20X20), w odleglosci 2,5 cm od dolnej krawedzi. Chromatogramy rozwijano do wysokosci okolo 17 cm, w ukladzie octan etylu/me¬ tanol (19 :1), wykrywajac strefe absorbujaca w UV (2537 A). Absorbujace frakcje nr 13 do 17, o Rf 0,23, zebrano i pod zmniejszonym cisnieniem odparowa¬ no do okolo 1 ml. Do koncentratu dodano 30 ml eteru naftowego, otrzymujac 183 mg surowej L-de- metylomaytanzyny (b).Przyklad LXVI. W malej objetosci chlorofor¬ mu rozpuszczono 183 mg surowej L-demetylomay- tanzyny (b) otrzymanej w przykladzie LXV, a roz¬ twór naniesiono liniowo na 6 plyt szklanych powle¬ czonych zelem krzemionkowym (Merck, RFN, Kie- selgel F254, 2 mm, 20X20), w odleglosci 2,5 cm od dolnej krawedzi. Chromatogramy rozwinieto w u- kladzie octan etylu/metanol (19 :1). Strefe absorbu¬ jaca o Rf 0,23 zeskrobano i dwukrotnie ekstraho¬ wano octanem etylu zawierajacym mala ilosc wody.Ekstrakt przemyto woda, wysuszono nad bezwod¬ nym siarczanem sodu i pod zmniejszonym cisnie¬ niem odparowano. Do koncentratu dodano heksanu i pozostawiono mieszanine w spoczynku, otrzymu¬ jac 147 mg krysztalów L-demetylomaytanzyny.Przyklad LXVII. Streptomyces platensis IFO 12901 hodowano jak w przykladzie XXXVIII, a do 2,6. litra hodowli dodano 260 mg D-maytanzyny.Mieszanine inkubowano w 28°C, przy wstrzasaniu, w ciagu 31 godzin. TLC wykazala zanik D-maytan¬ zyny i pojawienie sie w brzeczce D-demetylomay- tanzyny.Przyklad LXVIII. Brzeczke otrzymana w przykladzie LXVII oczyszczono jak w przykladzie LXV i poddano TLC jak w przykladzie LXV. Ze¬ brano frakcje absorbujace o Rf 0,08, otrzymujac 106 mg surowej D-demetylomaytanzyny. Surowy pro¬ dukt oczyszczono dalej jak w przykladzie LXVI, otrzymujac 63 mg D-demetylomaytanzyny w posta¬ ci bialej barwy proszku.Przyklad LXIX. Actinomyces nigrescens IFO 12894 hodowano jak w przykladzie XXXVIII, a do 2,2 litra hodowli dodano 217 mg maytanpriny (DL).Mieszanine inkubowano w 28°C, przy wstrzasaniu, w ciagu 48 godzin. TLC wykazala zanik maytan¬ priny (D,L) i pojawienie sie w brzeczce demetylo- maytanpriny (D,L).Przyklad LXX. Brzeczke otrzymana w przy¬ kladzie LXIX oczyszczono jak w przykladzie LXV, otrzymujac 153 mg surowej demetylomaytanpriny (D,L). Nastepnie powyzszy produkt, podobnie jak w przykladzie LXVI, naniesiono liniowo ha 5 plyt szklanych powleczonych zelem krzemionkowym, w odleglosci 2,5 cm od dolnej krawedzi. Podobnie roz¬ winieto chromatogramy, w ukladzie octan etylu/me¬ tanol (19 :1), a absorbujace strefy o Rf 0,28 zeskro- 5 bano i dwukrotnie ekstrahowano octanem etylu za¬ wierajacym mala ilosc wody. Ekstrakty przemyto woda, wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodu, odparowano pod zmniejszonym cisnieniem i zadano eterem naftowym. Otrzymano 47 mg L-demetylo- 1( maytanpriny, bialej barwy proszku, z frakcji Rf 0,40 i 38 mg D-demetylomaytanpriny, bialego proszku, z frakcji Rf 0,28.Przyklad LXXI. Actinomyces nigrescens IFO 12894 hodowano jak w przykladzie XXXVII, a do 15 3,5 litra hodowli dodano 315 mg maytanbutyny (D,L).Mieszanine wstrzasano w 28°C w ciagu 48 godzin.TLC wykazala zanik maytanbutyny (D,L) i poja¬ wienie sie w brzeczce demetylomaytanbutyny.Przyklad LXXII. Brzeczke otrzymana w przy- 20 kladzie LXXI oczyszczono jak w przykladzie LXV, otrzymujac 189 mg surowej demetylomaytanbutyny (D,L). Surowy produkt poddano preparatywnej TLC, rozwijajac chromatogramy w ukladzie octan etylu/ /metanol (19 : 1). Absorbujace strefy o Rf 0,47 i 0,31 25 zeskrobano i przerobiono jak w przykladzie LXVI.Otrzymano 85 mg L-demetylomaytanbutyny, bialej barwy proszku, z frakcji Rf 0,47 i 78-mg D-deme- tylomaytanbutyny, bialej barwy proszku, z frakcji Rf 0,31. 30 Przyklad LXXIII. Actinomyces nigrescens IFO 12894 hodowano jak w przykladzie XXXVIII, a do 5,3 litra hodowli dodano 530 mg maytanwaliny (D,L). Mieszanine inkubowano, przy wstrzasaniu, w 28°C, w ciagu 48 godzin. TLC wykazala zanik may- 35 tanwaliny (D,L) i pojawienie sie w brzeczce deme- tylomaytanwaliny.Przyklad LXXIV. Brzeczke otrzymana w przykladzie LXXIII oczyszczono jak w przykladzie LXV, otrzymujac 223 mg surowej demetylomaytan- 40 waliny (D,L). Przeprowadzono preparatywna TLC jak w przykladzie LXVI, rozwijajac chromatogra¬ my w ukladzie octan etylu-metanol. Absorbujace strefy o Rf 0,55 i Rf 0,40 zeskrobano i przerobiono jak w przykladzie LXVI. otrzymano 95 mg L-de- 45 metylomaytanwaliny, bialej barwy proszku, ze stre¬ fy o Rf 0,55 i 88 mg D-dem^tylomaytanwaliny, bia¬ lej barwy proszku, ze strefy o Rf 0,40.Przyklad LXXV. Streptomyces flavotricini IFO 12770 hodowano jak w przykladzie XXXVIII, 50 a do 4 litrów hodowli dodano 40 mg L-maytanzy- ny. Mieszanine inkubowano w 28°C, przy mieszaniu, w ciagu 48 godzin, a otrzymana brzeczke oczysz¬ czono jak w przykladach LXVI i LXVII. Otrzy¬ mano 5 mg D-demetylomaytanzyny w postaci bialej 55 barwy proszku.Przyklad LXXVI. Streptomyces flavotricini IFO 12770 hodowano jak w przykladzie XXXVIII, a do 4 ltirów brzeczki hodowlanej dodano 40 mg D-maytanzyny. Mieszanine inkubowano w 28°C, 60 przy mieszaniu, w ciagu 48 godzin, a nastepnie przerobiono jak w przykladach LXVI i LXVII. Do brzeczki dodano malej ilosci octanu etylu i pozo¬ stawiono mieszanine w spoczynku. Tym sposobem otrzymano 6 mg krysztalów D-demetylomaytanzyny. 65 Przyklad LXXVII. Actinomyces nigrescens124 051 55 56 Tabela 5 Temperatura top¬ nienia Skrecalnosc wlas¬ ciwa Wzór sumaryczny Widmo masowe, m/e UV C£Hnm NMR, glówne sy¬ gnaly (rodniki metylowe) 1 Chromatografia cienkowarstwowa octan etylu nasy¬ cony H20 octan etylu — metanol (19 :1) Demetylo- maytanzyna (L) 194—196°C -117,9° (e^56) C38H44CIN3O10 616, 471, 456, 436, 128 288, 281, 252, 243, 232 0,82, 3H, s 1,29, 3H, d, J = 6 1,33, 3H, d J = 7 1,66, 3H, s 2,14, 3H, s 2,89, 3H, s 3,23, 3H, s 3,39, 3H, s 0,12 0,23 Demetylo- maytanzyna (D) CssHuCINsOjo 616, 471, 456, 436, 128 288, 281, 252, 243, 232 0,87, 3H, s 1,28, 3H, d, J = 6 1,52, 3H, d, J = * 1,72, 3H, s 2,19, 3H, s 3,06, 3H, s 3,18, 3H, s 3,38, 3H, s 0,04 0,08 Demetylo- maytanprina (L) C34H46ClN3O10 630, 471, 456, 436, 142 288, 281, 252, 243, 232 0,83, 3H, s 1,13, 3H, t, J = 7 1,29, 3H, d, J = 6 1,33, 3H, d, •* = 7 1,65, 3H, s 2,87, 3H, s 3,23, 3H, s 3,38, 3H, s 0,21 0,40 | Demetylo- maytanprina OwI^eClNsOio 630, 471, 456, 436, 142 288, 281, 252, 243, 232 0,89, 3H, s 1,16, 3H, d, J = 7 1,28, 3H, d, J = 6 1,52, 3H, d, J = 7 1,72, 3H, s 3,04, 3H, s 3,18, 3H, s 3,37, 3H, s 0,15 0,28 | c.d. tabeli 5 Wzór sumaryczny Widmo masowe, m/e TTTT 1 MeOH___ UV * max nm NMR, glówne sygna- J ly (rodniki mety¬ lowe) Chromatografia cienkowarstwowa octan etylu nasy¬ cony HaO octan etylu — metanol (19 :1) | Demetylo- maytanbutyna (L) CasH^ClNsOio 644, 471, 456, 436, 156, 288, 281, 252, 243, 232 0,83, 3H, s 1,12, 6H, d, J = 7 1,29, 3H, d, J = 6 1,33, 3H, d, J = 7 1,67, 3H, s 2,86, 3H, s 3,21, 3H, s 3,41, 3H, s 0,25 0,47 Demetylo- maytanbutyna (D) , C85H48ClN301o 644, 471, 456, 436, 156 288, 281, 252, 243, 232 0,89, 3H, s 1,18, 6H, d, J = 7 1,29, 3H, d, J = 6 1,52, 3H, d, J = 7 1,72, 3H, s 3,08, 3H, s 3,21, 3H, s 3,37, 3H, s 0,16 0,31 Demetylo- maytanwalina (D C36H5oClN«010 658, 471, 456, 436 170 288, 281, 252, 243, 232 0,82, 3H, s 0,94, 3H, d, J = 6 0,98, 3H, d, J = 6 1,29, 3H, d, J = 6 1,33, 3H, d, J = 7 1,67, 3H, s 2,89, 3H, s 3,22, 3H, s 3,39, 3H, s 0,30 0,55 Demetylo- maytanwalina (D) C36H5oClNsOio 658, 471, 456, 436, 170 288, 281, 252, 243, 232 | 0,92, 3H, s 0,96, 3H, d, J = 6 0,99, 3H, d, J = 6 1,29, 3H, d, J = 6 1,52, 3H, d, J = 7 1,72, 3H, s 3,04, 3H, s 3,17, 3H, s 3,37, 3H, s | 0,20 0,40 |124 051 57 58 IFO 12894 hodowano jak w przykladzie XXXVIII, a do 1 litra hodowli dodano 10 mg L-maytanzyny.Mieszanine inkubowano w 28°C, przy wstrzasaniu, w ciagu 48 godzin. TLC wykazala spadek stezenia L-maytanzyny i pojawienie sie L-demetylomaytan- zyny.Przyklad LXXVIII. Streptomyces libani IFO 13452 hodowano jak w przykladzie XXXVIII, a do 1 litra hodowli dodano 10 mg L-maytanzyny. Mie¬ szanine inkubowano w 28°C, przy mieszaniu, w cia¬ gu 48 godzin. TLC wykazala spadek stezenia L-may¬ tanzyny i pojawienie sie w brzeczce L-demetylo- maytanzyny.Fizyko-chemiczne wlasciwosci zwiazków otrzyma¬ nych w przedstawionych przykladach przedstawio¬ no w tabeli 5.Przyklad LXXIX. Stosujac szczep Bacillus megaterium IFO 12108, sposobami podobnymi do opisanych w przykladach XXX do XXXVII, LVIII do LVII i LXII do LXIII otrzymano ponizsze Zwiazek wyjsciowy (wzór 2) | 1 maytanzynol maytanacyna propionian maytan- zynolu ansamitocyna P-3 ansamitocyna P-3' ansamitocyna P-4 3-walerianian may- tanzynolu 3-kapronian may- tanzynolu 3-enantan maytan- zynolu 3-kaprylan maytan¬ zynolu 3-fenylooctan may- tanzynolu 3-fenylopropionian maytanzynolu 3-benzoesan may¬ tanzynolu 3-cykloheksanokar- boksylan maytan¬ zynolu 3-p-chlorobenzoesan maytanzynolu Produkt (wzór 1) 2 demetylomaytan- zynol demetylomaytana- cyna propionian demety- lomaytanzynolu PDM-3 PDM-3' PDM-4 3-walerianian de- metylomaytan- zynolu 3-kapronian deme- tylomaytanzynolu 3-enantan demety- lomaytanzynolu 3-kaprylan demety- lomaytanzynolu 3-fenylooctan de- metylomaytanzyno- lu | 3-fenylopropionian demetylomaytanzy- nolu 3-benzoesan deme- tylomaytanzynolu 3-cykloheksanokar- boksylan demetylo- maytanzynolu 3-p-chlorobenzoesan demetylomaytanzy- nolu | War¬ tosc Rf i 1 3 1 0,30 0,38 | 0,40 | 0,42 | 0,43 J 0,44 | 0,45 1 0,48 1 0,49 1 0,50 1 0,43 0,45 | 0,42 | 0,45 | 0,43 | 10 15 25 35 40 45 50 55 60 65 1 1 3-nikotynian maytanzynolu 3-izonikotynian maytanzynolu 3-pikolinian maytanzynolu 3-furanokarbok- sylan-2 maytan¬ zynolu dechloromaytan- zynol 3-izomaslan de- chloromaytan- zynolu 3-fenylooctan dechloromay- tanzynolu 3-nikotynian dechloromay- tanzynolu 3-cykloheksano- karboksylan de- chloromaytan- zynolu D-maytanwalina 3-(N-metylo)karba- minian maytanzy¬ nolu 3-(N-butylo)karba- minian maytanzy¬ nolu 3-(N-fenylo)karba- minian maytanzy¬ nolu 3-(N-cykloheksylo) karbaminian may¬ tanzynolu 3-(3-pirydylo)karb- aminian maytanzy¬ nolu 3-izopropyloweglan maytanzynolu 3-benzyloweglan dechloromaytanzy- | nolu | 1 2 3-nikotynian deme- tylomaytanzynolu 3-izonikotynian demetylomaytanzy- nolu 3-pikolinian deme- tylomaytanzynolu 3-furanokarbpksy- lan-2 demetylomay- tanzynolu demetylodechloro- maytanzynol 3-izomaslan deme- tylodechloromay- tanzynolu 3-fenylooctan deme- tylodechloromay- tanzynolu 3-nikotynian deme- tylodechloromay- tanzynolu 3-cykloheksanokar- boksylan demetylo- dechloromaytanzy- nolu demetylo-D-maytan- walina 3-(N-metylo)karb- aminian demetylo- maytanzynolu 3-(N-butylo)karb- aminian demetylo- maytanzynolu 3-(N-fenylo)karb- aminian demetylo- maytanzynolu 3-(N-cykloheksylo)- karbaminian deme- tylomaytanzynolu 3-(3-pirydylokarb- aminian demetylo- maytanzynolu 3-izopropyloweglan demetylomaytanzy- nolu 3-benzyloweglan 1 dechlorodemetylo- maytanzynolu | 1 3 0,31 0,30 1 0,40 0,38 | 0,28 [ 0,42 | 0,43 | 0,31 j 0,45 0,47 1 0,27 | 0,39 | 0,40 1 0,39 | 0,22 | 0,43 0,44 zwiazki. W tabeli zestawiono zwiazki wyjsciowe, produkty i wartosci Rf produktów (uklad rozwija¬ jacy: CHClj/MeOH 9 :1, plyta: zel krzemionkowy (Merck, RFN, 6OF254, grubosc 0,25 mm) Przyklad LXXX. Stosujac szczep Streptomy-124 051 59 60 ces flavotricini IFO 12770, sposobami podobnymi do opisanych w przykladach XXXVIII, LVIII, LIX i LXXV otrzymano ponizsze zwiazki. W tablicy ze- Zwiazek wyjsciowy (wzór 2) 1 1 1 maytanzynol maytanacyna 1 propionian maytan- | zynolu | ansamitocyna P-3 | ansamitocyna P-3' | ansamitocyna P-4 3-walerianian maytanzynolu 3-kapronian may¬ tanzynolu 1 3-enantan maytan¬ zynolu 3-kaprynian may- j tanzynolu 3-fenylooctan | maytanzynolu j 3-fenylopropionian , t maytanzynolu . 3-benzoesan maytanzynolu 3-cykloheksanokar- boksylan maytan¬ zynolu 3-p-chloroben- zoesan maytanzynolu 3^nikotynian maytanzynolu 3-izonikotynian maytanzynolu 3-pikolinian maytanzynolu 3-furanokarboksy- lan-2maytanzynolu 3-cyklopropanokar- boksylan maytanzynolu 3-izomaslan de- chloromaytanzy- nolu 1 Produkt (wzór 1) 2 1 demetylomaytan- zynol 1 demetylomaytan- acyna 1 propionian deme- tylomaytanzynolu | PDM-3 PDM-3' PDM-4 3-walerianian de- metylomaytanzy- riolu 3-kapronian deme- ' tylomaytanzynolu 3-enantan demetylo- maytanzynolu 3-kaprynian deme- tylomaytanzynolu 3-fenylooctan de- metylomaytanzy- nolu 3-fenylopropionian demetylomaytan- zynolu 3-benzoesan de- metylomaytanzy- nolu 3-cykloheksanokar- boksylan demety- lomaytanzynolu 3-p-chlorobenzoesan demetylomaytan- zynolu 3-nikotynian deme- tylomaytanzynolu 3-izonikotynian demetylomaytan- zynolu 3-pikolinian deme- tylomaytanzynolu 3-furanokarboksy- lan-2 demetylo- maytanzynolu 3-cyklopropanokar- boksylan demetylo- maytanzynolu 3-izomaslan deme- tylodechloro- inaytanzynolu | War¬ tosc Rf 1 3 1 0,30 0,38 | 0,40 | 0,42 0,43 | 0,44 0,45 0,48 | 0,48 0,50 | 0,43 | 0,45 0,42 0,45 0,43 | .0,31 0,30 0,40 0,38 0,39 1 0,42 | 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 1 1 3-fenylooctan dech- loromaytanzynolu 3-nikotynian dech- loromaytanzynolu 3-cykloheksanokar- boksylan dechloro- maytanzynolu 3-(N-acetylo-N- -benzylo)alanylowy ester maytanzynolu (temperatura top¬ nienia 174—7°C, z rozkladem) 3-(N-acetylo-N- -metylo)-L-leucylo- wy ester maytan¬ zynolu 3-(N-acetylo-N- -metylo)fenyloala- nylowy ester . | maytanzynolu 1 (temperatura top¬ nienia 189—193°C, z rozkladem) L-maytanzyna D-maytanzyna L-maytanpuryna D-maytanpurjrna L-maytanbutyna D-maytanbutyna D-maytanwalina dechloro-D-may- tanzyna 3-(N-metylo)karba- minianmaytan- zynolu 3-(N-butylo)karba- minian maytan¬ zynolu 3-N-fenylo)karba- minian maytan¬ zynolu 3-(N-cykloheksylo) karbaminian maytanzynolu | 1 2 3-fenylooctan de- metylodechloro- maytanzynolu 3-nikotynian deme- tylodechloro- maytanzynolu 3-cykloheksanokar- boksylan demetylo- l dechloromaytan- zynolu 3-N-acetylo-N-ben- zylo)alanylowy ester demetylomay- tanzynolu 3-(N-acetylo-N- metylo)-L-leucylo- wy ester demetylo- maytanzynolu 3-(N-acetylo-N- metylo)fenyloala- nylowy ester de^ metylomaytanzy- demetylo-L-mayta- zyna demetylo-D-may- tanzyna demetylo-L-may- tanpuryna demetylo-D-may- tanpuryna demetylo-L-may- tanbutyna demetylo-D-may- tanbutyna demetylo-D-may- tanwalina demetylodechloro- -D-maytanzyna 3-(N-metylo)karba- minian demetylo- maytanzynolu 3-(N-butylo)karba- mianian demetylo- maytanzynolu 3-(N-fenylo)karba- minian demetylo- maytanzynolu 3-(N-cykloheksylo- karbaminian deme- tylomaytanzynolu | 1 3 0,43 0,31 0,45 0,46 0,43 0,45 | 0,39 0,39 | 0,43 | 0,44 | 0,44 | 0,46 | 0,47 | 0,39 | 0,27 | 0,39 | 0,40 | 0,39 |124 051 61 62 .1 1 3-(3-pirydylo)kar- baminian maytan¬ zynolu 3-izopropyloweglan maytanzynolu 3-benzyloweglan dechloromaytan- zynolu 2 3-(3-pirydylo)kar- baminian demety- lomaytanzynolu 3-izopropyloweglan demetylomaytan- zynolu 3-benzyloweglan demetylodechloro- maytanzynolu 3 1 0,22 0,43 0,44 stawiono zwiazki wyjsciowe, produkty i wartosci Rf produktów (uklad rozwijajacy: CHCyMeOH 9:1, plyta: zel krzemionkowy (Merck, RFN, 60 F254, gru¬ bosc 0,25 mm).Przyklad LXXXI. Stosujac szczep Strepto- myces platensis IFO 12901, sposobami podobnymi do opisanych w przykladach XLI, LX, LXI i LXIV do LXVIII otrzymano ponizsze zwiazki. W tabeli Zwiazek wyjsciowy (wzór 2) 1 maytanacyna propionian maytan¬ zynolu : ansamitocyna P-3 ansamitocyna P-3' ansamitocyna P-4 3-walerianian may¬ tanzynolu 3-enantan maytan¬ zynolu 3-kapronian may¬ tanzynolu 3-kaprylan maytan¬ zynolu 3-fenylooctan maytanzynolu 1 3-fenylopropionian maytanzynolu 3-benzoesan maytanzynolu 3-cykloheksanokar- boksylan maytan¬ zynolu 3-p-chlorobenzoesan maytanzynolu 3-izonikotynlan maytanzynolu | Produkt (wzór 1) 1 2 demetylomaytana- cyna propionian demety- lomaytanzynolu PDM-3 PDM-3' ?DM-4 3-walerianian de- metylomaytan- zynolu 3-enantan demety- lomaytanzynolu 3-kapronian deme- tylomaytanzynolu. 3-kaprylan demety- lomaytanzynolu 3-fenylooctan de- metylomaytanzy- nólu 3-fenylopropio¬ nian demetylo- maytanzynolu 3-benzoesan deme- tylomaytanzynolu 3-cykloeksanokar- boksylan demetylo- maytanzynolu 3-p-chlorobenzo¬ esan demetylo- maytanzynolu 3-nikotynian deme- tylomaytanzynolu War¬ tosc Rf 3 1 0,38 1 0,40 | ['0,42 J 0,43 0,44' | .0,45 | 0,49 | 0,48 | 0,50 | 0,43 | 0,45 | 0,42 [ 0,45 | 0,43 | •0*31--| 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 1 1 3-izonikotynian maytanzynolu 3-pikolinian maytanzynolu 3-cyklopropanokar- boksylan maytan¬ zynolu 3-izomaslan dechlo- romaytanzynolu 3-fenylooctan dechloromatyan- zynolu 3-nikotynian dech- loromaytanzynolu 3-cykloheksanokar- boksylan dechloro- maytanzynolu ester 3-(N-acetylo- -N-benzylo)-alany- lowy maytanzynolu (temperatura topnie¬ nia 174—177°C, z rozkladem) ester 3-(N-acetylo-, -N-benzylo)-alariy- lowy maytanzynolu ; (temperatura top¬ nienia 163—166°C, z rozkladem) ' ester 3-(N-acetylo- -N-metylo)-L-leu- cylowy maytan¬ zynolu ester 3-(N-acetylo- N-metylo)-fenylo- alanylowy maytan^ zynolu (temperatu¬ ra topnienia 189— 193°C, z rozkladem) ester 3-(N-acetylo- -N-metylo)-fenylo- alanylowy maytan¬ zynolu (temperatu- , ra topnienia 212— 214°C, z rozkladem) 1 L-maytanzyna D-maytanzyna L-maytanprina 2 3-izonikotynian demetylomaytan- zynolu 3-pikolinian deme- tylomaytanzynolu 3-cyklopropanokar- boksylan demetylo- maytanzynolu 3-izomaslan deme- tylodechloromay- tanzynolu 3-fenylooctan de- metylodechloro- maytanzynolu 3-nikotynian deme- tylodechloromay- tanzynolu 3-cykloheksanokar- boksylan demetylo- dechloromaytan- zynolu [ ester 3-(N-acetylo- -N-benzylo)alany- lowy demetylo- maytanzynoiu ester 3-(N-acetylo- -N-benzylo)alany- lowy demetylo- maytanzynolu ester 3-(N^acetylo-; -N-benzyio)-L-leu- cylowy demetylo- maytanzynolu ester 3-(N-acetylo- -N-metylo)fenylo- alanylowy demety- lomaytanzynolu ester 3-(N-acetylo- -N-metylo)fenylo- alanylowy demety- lomaytanzynolu demetylo-L-may- tanzyna demetylo-D-may- tanzyna demetylo-L-may- tanprina D-maytanprina 1 demetylo-D-may- 1 1 tanprina 1 3 1 | 0,30 | 0,40 | 0,39 | | 0,42 | 0,43 1 0,31 1 0,45 0,46 0,45 | 0,43 1 0,45 1 0,42 | 0,39 | 0,39 1 0,43 | 0,44 J124 051 63 64 1 | 2 3 L-maytanbutyna D-maytanbutyna L-maytanwalina D-maytanwalina dechloro-D-may- tanzyna 3-(N-butylo)karba- minian maytan- zynolu 3-(N-fenylo)karba- minian maytan- zynolu 3-(N-cykloheksylo) karbaminian maytanzynolu 3-(3-pirydylo)kar- baminian maytanzynolu 3-izopropyloweglan maytanzynolu demetylo-L-may- tanbutyna demetylo-D-may- tanbutyna demetylo-L-may- tanwalina demetylo-D-may- tanwalina demetylodechloro- -D-maytanzyna 3-(N-butylo)karba- minian demetylo¬ maytanzynolu 3-(N-fenylo)karba- minian demetylo¬ maytanzynolu 3-(N-cykloheksylo) karbaminian deme¬ tylomaytanzynolu 3-(3-pirydylo)kar- baminian demety¬ lomaytanzynolu 3-izopropyloweglan demetylomaytan¬ zynolu 0,44 0,46 0,45 0,47 0,39 0,39 0,40 | 0,39 | 0,22 | 0,43 | zestawiono zwiazki wyjsciowe, produkty i wartosci RF produktów (uklad rozwijajacy: CHCWMeOH 9 :1, plyta: zel krzemionkowy (Merck, RFN, 60 F^m, grubosc 0,25 mm).Przyklad LXXXII. W 20 ml czterowodorofu- ranu rozpuszczono 50 mg krysztalów 3-izomaslanu demetylodechloromaytanzynolu, otrzymanych w przykladzie LXIII. Roztwór oziebiono do —5°C i do¬ dano 50 mg wodorku litowoglinowego. Mieszanine reakcyjna przerobiono jak w przykladzie XLII.Przeprowadzono preparatywna TLC na zelu krze¬ mionkowym w ukladzie octan etylu/metanol (19 :1), rozwijajac chromatogram do wysokosci 17 cm; ze¬ skrobano absorbujaca strefe przy Rf 0,20—0,25 i ekstrahowano ja octanem etylu zawierajacym mala ilosc wody. Ekstrakt przemyto woda, wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodu i odparowano pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac 43 mg deme¬ tylodechloromaytanzynolu w postaci proszku. Pro¬ szek rozpuszczono w malej ilosci octanu etylu i po¬ zostawiono w spoczynku, po czym odsaczono wy¬ tracone krysztaly i wysuszono je. Wydajnosc 33 mg, temperatura topnienia 198—201°C (z rozkladem).Analiza elementarna dla C27H86N2O8; znaleziono: C 62,48; H 7,25; N 5,19; O 24,89; obliczono: C 62,77; H 7,02; N 5,42; O 24,77.Widomo masowe (m/e): 455, 437 Widmo UV (XMeOH) nm: 230, 240, 248, 277, 285. max Przyklad LXXXIII. W 20 ml czterowodoro- furanu rozpuszczono 50 mg krysztalów L-demetylo- maytanzyny, otrzymanych w przykladzie LXVI.Roztwór oziebiono do — 5°C i dodano 50 mg wo¬ dorku litowoglinowego. Mieszanine rakcyjna umie¬ szczono w lazni wodnej i mieszano w ciagu 30 mi¬ nut. Po dodaniu 10 ml octanu etylu i 10 ml 1/200 N HC1 mieszanine ekstrahowano 50 ml octanu etylu. 5 Ekstrakt przemyto woda, wysuszono przez dodanie bezwodnego siarczanu sodu i pod zmniejszonym cis¬ nieniem odparowano. Pozostalosc poddano prepa¬ ratywnej TLC na zelu krzemionkowym, w ukladzie octan etylu/metanol (19:1), rozwijajac chromato- 10 gram do wysokosci 17 cm. Strefe absorbujaca przy Rf 0,25 zeskrobano i ekstrahowano octanem etylu zawierajacym mala ilosc wody. Ekstrakt przemyto woda, wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodu i odparowano pod zmniejszonym cisnieniem, otrzy- 15 mujac 41 mg demetylomaytanzynolu. Fizykochemi¬ czne wlasciwosci produktu byly identyczne z z wla¬ sciwosciami demetylomaytanzynolu otrzymanego w przykladzie XXXIV, temperatura topnienia 195°C.Analiza elementarna dla C^H^ON^; 20 znaleziono: C 58,67; H 6,54; N 4,83; Cl 6,19; obliczono: C 58,85; H 6,40; N 5,08; Cl 6,43.Widmo masowe (m/e): 489, 471.Widmo UV (nm): 232, 242, 251, 280, 288.Przyklad LXXXIV. W 14 ml czterowodoro- 25 furanu rozpuszczono 35 mg proszku D-demetylo- maytanzyny, otrzymanego w przykladzie LXXIII.Roztwór oziebiono do —5°C i dodano 35 mg wodor¬ ku litowoglinowego. Mieszanine przerobiono, a pro¬ dukt oczyszczono jak w przykladzie LXXXIII, 30 otrzymujac 19 mg demetylomaytanzynolu w postaci bialej barwy proszku. Fizykochemiczne wlasciwosci produktu okazaly sie identyczne z wlasciwosciami demetylomaytanzynolu otrzymanego w przykladzie LXXXIII. Temperatura topnienia 196°C. 35 Przyklad LXXXV. W 14 ml czterowodoro- furanu rozpuszczono 30 mg 3-(N-fenylo)karbaminia- nu demetylomaytanzynolu otrzymanego w przykla¬ dzie LI. Roztwór oziebiono ponizej —5°C i dodano 30 mg wodorku litowoglinowego. Po przerobieniu 40 mieszaniny i oczyszczeniu produktu jak w przykla¬ dzie LXXXIII uzyskano 17 mg demetylomaytan¬ zynolu w postaci bialej barwy proszku. Fizyko-che¬ miczne wlasciwosci produktu okazaly sie identyczne z wlasciwosciami demetylomaytanzynolu otrzyma- 45 nego w przykladzie LXXXIII. Temperatura topnie¬ nia 194°C.Zastrzezenia patentowe 50 1. Sposób wytwarzania nowych zwiazków deme- tylomaytanzynoidowych o wzorze 1, w którym X oznacza atom chloru a Ri oznacza atom wodoru, rodnik formylowy, acetylowy, propionylowy, izobu- tyrylowy, butyrylowy, izowalerylowy lub walery- 55 Iowy, znamienny tym, ze na maytanzynoidowy zwiazek o wzorze 2, w którym X i Ri maja wyzej podane znaczenie, dziala sie hodowla lub przetwo¬ rzona brzeczka mikroorganizmu rodzaju Bacillus megaterium IFO 12108, Streptomyces flavotricini M IFO 12770, Streptomyces platensis IFO 12901, Strep¬ tomyces libani IFO 13452 lub Actinomyces nigres- cens IFO 12894, przy stezeniu zwiazku wyjsciowego w ukladzie reakcyjnym zawartym w zakresie 1—400 [xg/ml, w temperaturze 20—50°C i przy wartosci pH 55 zawartej w zakresie 5—10.124 051 65 66 2. Sposób wytwarzania nowych zwiazków deme- tylomaytanzynoidowych o wzorze 1, w którym X oznacza atom chloru lub wodoru a RA oznacza atom wodoru lub rodnik acylowy pod warunkiem, ze je¬ zeli X oznacza atom chloru, to Ri oznacza rodnik 5 acylowy o wiekszej liczbie atomów wegla niz 5, znamienny tym, ze na maytanzynoidowy zwiazek o wzorze 2, w którym X i Ri maja wyzej podane znaczenie, dziala sie hodowla lub przetworzona brzeczka mikroorganizmu rodzaju Bacillus megate- 10 rium IFO 12108, Streptomyces flavotricini IFO 12770, Streptomyces platensis IFO 12901, Streptomyces li- bani IFO 13452 lub Actinomyces nigrescens IFO 12894, przy stezeniu zwiazku wyjsciowego w ukla¬ dzie reakcyjnym zawartym w zakresie 1—400 [Ag/ml, 15 w temperaturze 20—50°C i przy wartosci pH za¬ wartej w zakresie 5—10. 3. Sposób wytwarzania nowych zwiazków deme- tylomaytanzynoidowych o wzorze 3, w którym X oznacza atom chloru, znamienny tym, ze na may- 20 tanzynoidowy zwiazek o wzorze 4, w którym X ma wyzej podane znaczenie a R', oznacza rodnik for- mylowy, acetylowy, propionylowy, izobutyrylowy, butyrylowy, izowalerylowy lub walerylowy, dziala sie hodowla lub przetworzona brzeczka mikroorga- 25 nizmu Bacillus megaterium IFO 12108, Streptomyces flavotricini IFO- 12770, Streptomyces platensis IFO 12901, Streptomyces liboni IFO 13452 lub Actino¬ myces nigrescens IFO 12894, przy stezeniu zwiazku wyjsciowego w ukladzie reakcyjnym zawartym w zakresie 1—400 |*g/ml, w temperaturze 20—50°C i przy wartosci pH zawartej w zakresie 5—10, a na¬ stepnie otrzymany zwiazek o wzorze 5, w którym X i R/ maja wyzej podane znaczenie, poddaje sie reakcji deacylowania. 4. Sposób wedlug zastrz. 3, znamienny tym, ze reakcje deacylowania przeprowadza sie za pomoca kompleksowego wodorku metalu. 5. Sposób wedlug zastrz. 4, znamienny tym, ze jako kompleksowy wodorek metalu stosuje sie wo¬ dorek litowoglinowy. 6. Sposób wytwarzania nowych zwiazków deme- tylomaytanzynoidowych o wzorze 3, w którym X oznacza atom chloru lub wodoru, znamienny tym, ze na maytanzynoidowy zwiazek o wzorze 4, w któ¬ rym X ma wyzej podane znaczenie a R/ oznacza rodnik acylowy pod warunkiem, ze jezeli X ozna¬ cza atom chloru, to Ri' oznacza rodnik acylowy o wiekszej liczbie atomów wegla niz 5, dziala sie hodowla lub przetWorzorU| brzeczka mikroorganizmu Bacillus megaterium IFO 12lte, Streptomyces fla- votricini IFO 12770, Streptomyces platensis IFO 12901, Streptomyces liboni IFO 13452 lub Actino¬ myces nigrescens IFO 12894, przy stezeniu zwiazku wyjsciowego w \ ukladzie reakcyjnym zawartym w zakresie 1—400 pg/ml, w* temperaturze 20—50°C i przy wartoici pK zawartej w zakresie 5—10, a na¬ stepnie otrzymany zwiazek o wzorze 5, w którym X i R/ maja wyzej pSOdane znaczenie, poddaje sie reakcji deacylowania. 7. Sposób wedlug zastrz. 6, znamienny tym, ze reakcje deacylowania przeprowadza sie za pomoca kompleksowego wodorku metalu. 8. Sposób wedlug za*fr~zV 7, znamienny tym, ze jako kompleksowy wodorek metalu Stosuje sie wo¬ dorek litowoglinowy.Wzór 3 T ^ CH3 CH£ OH Wzór 4124 051 x ch3 0 o-r; -CO-CH-H sCO-R.- CO-N /* Wzór 6 X Wiór 7 CHA QH3 0 0-Rq ^^y CH, CH3 CH30 ^H Wiór Q R, ;ncoz Wzór 9 XfH 0C0NHR6 kH3 0 0C0NC0NHR{ Wzór 10 -C0N-C0NHR6 Wzór!! ZGK 1359/1110/84 — 80 egz.Cena zl 100,— PL PL PL PL PL

Claims (8)

1. Zastrzezenia patentowe 50 1. Sposób wytwarzania nowych zwiazków deme- tylomaytanzynoidowych o wzorze 1, w którym X oznacza atom chloru a Ri oznacza atom wodoru, rodnik formylowy, acetylowy, propionylowy, izobu- tyrylowy, butyrylowy, izowalerylowy lub walery- 55 Iowy, znamienny tym, ze na maytanzynoidowy zwiazek o wzorze 2, w którym X i Ri maja wyzej podane znaczenie, dziala sie hodowla lub przetwo¬ rzona brzeczka mikroorganizmu rodzaju Bacillus megaterium IFO 12108, Streptomyces flavotricini 1. M IFO 12770, Streptomyces platensis IFO 12901, Strep¬ tomyces libani IFO 13452 lub Actinomyces nigres- cens IFO 12894, przy stezeniu zwiazku wyjsciowego w ukladzie reakcyjnym zawartym w zakresie 1—400 [xg/ml, w temperaturze 20—50°C i przy wartosci pH 55 zawartej w zakresie 5—10.124 051 65 66

2. Sposób wytwarzania nowych zwiazków deme- tylomaytanzynoidowych o wzorze 1, w którym X oznacza atom chloru lub wodoru a RA oznacza atom wodoru lub rodnik acylowy pod warunkiem, ze je¬ zeli X oznacza atom chloru, to Ri oznacza rodnik 5 acylowy o wiekszej liczbie atomów wegla niz 5, znamienny tym, ze na maytanzynoidowy zwiazek o wzorze 2, w którym X i Ri maja wyzej podane znaczenie, dziala sie hodowla lub przetworzona brzeczka mikroorganizmu rodzaju Bacillus megate- 10 rium IFO 12108, Streptomyces flavotricini IFO 12770, Streptomyces platensis IFO 12901, Streptomyces li- bani IFO 13452 lub Actinomyces nigrescens IFO 12894, przy stezeniu zwiazku wyjsciowego w ukla¬ dzie reakcyjnym zawartym w zakresie 1—400 [Ag/ml, 15 w temperaturze 20—50°C i przy wartosci pH za¬ wartej w zakresie 5—10.

3. Sposób wytwarzania nowych zwiazków deme- tylomaytanzynoidowych o wzorze 3, w którym X oznacza atom chloru, znamienny tym, ze na may- 20 tanzynoidowy zwiazek o wzorze 4, w którym X ma wyzej podane znaczenie a R', oznacza rodnik for- mylowy, acetylowy, propionylowy, izobutyrylowy, butyrylowy, izowalerylowy lub walerylowy, dziala sie hodowla lub przetworzona brzeczka mikroorga- 25 nizmu Bacillus megaterium IFO 12108, Streptomyces flavotricini IFO- 12770, Streptomyces platensis IFO 12901, Streptomyces liboni IFO 13452 lub Actino¬ myces nigrescens IFO 12894, przy stezeniu zwiazku wyjsciowego w ukladzie reakcyjnym zawartym w zakresie 1—400 |*g/ml, w temperaturze 20—50°C i przy wartosci pH zawartej w zakresie 5—10, a na¬ stepnie otrzymany zwiazek o wzorze 5, w którym X i R/ maja wyzej podane znaczenie, poddaje sie reakcji deacylowania.

4. Sposób wedlug zastrz. 3, znamienny tym, ze reakcje deacylowania przeprowadza sie za pomoca kompleksowego wodorku metalu.

5. Sposób wedlug zastrz. 4, znamienny tym, ze jako kompleksowy wodorek metalu stosuje sie wo¬ dorek litowoglinowy.

6. Sposób wytwarzania nowych zwiazków deme- tylomaytanzynoidowych o wzorze 3, w którym X oznacza atom chloru lub wodoru, znamienny tym, ze na maytanzynoidowy zwiazek o wzorze 4, w któ¬ rym X ma wyzej podane znaczenie a R/ oznacza rodnik acylowy pod warunkiem, ze jezeli X ozna¬ cza atom chloru, to Ri' oznacza rodnik acylowy o wiekszej liczbie atomów wegla niz 5, dziala sie hodowla lub przetWorzorU| brzeczka mikroorganizmu Bacillus megaterium IFO 12lte, Streptomyces fla- votricini IFO 12770, Streptomyces platensis IFO 12901, Streptomyces liboni IFO 13452 lub Actino¬ myces nigrescens IFO 12894, przy stezeniu zwiazku wyjsciowego w \ ukladzie reakcyjnym zawartym w zakresie 1—400 pg/ml, w* temperaturze 20—50°C i przy wartoici pK zawartej w zakresie 5—10, a na¬ stepnie otrzymany zwiazek o wzorze 5, w którym X i R/ maja wyzej pSOdane znaczenie, poddaje sie reakcji deacylowania.

7. Sposób wedlug zastrz. 6, znamienny tym, ze reakcje deacylowania przeprowadza sie za pomoca kompleksowego wodorku metalu.

8. Sposób wedlug za*fr~zV 7, znamienny tym, ze jako kompleksowy wodorek metalu Stosuje sie wo¬ dorek litowoglinowy. Wzór 3 T ^ CH3 CH£ OH Wzór 4124 051 x ch3 0 o-r; -CO-CH-H sCO-R. - CO-N /* Wzór 6 X Wiór 7 CHA QH3 0 0-Rq ^^y CH, CH3 CH30 ^H Wiór Q R, ;ncoz Wzór 9 XfH 0C0NHR6 kH3 0 0C0NC0NHR{ Wzór 10 -C0N-C0NHR6 Wzór!! ZGK 1359/1110/84 — 80 egz. Cena zl 100,— PL PL PL PL PL