Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania dehydrogenazy aldehydu 3-fosfogliceryno- wego, której nazwa systematyczna brzmi: E.C. 1.2.1.12, Oksydbreduktaza aldehyd 3- fosfoglicerynowy: NAD, fosforylujaca. Preparat ten jest enzymem stosowanym do celów diagnostycznych w analityce klinicznej.Dehydrogenaza aldehydu 3- fosfoglicerynowegojest produkowanadla celów komercjalnychz miesni królika i drozdzy.Z publikacji: Gy.Jecsai: XIII. Isolation of D-glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase from Heart Muscle, Acta Physiol. Acad. Sci Hung. XVII, 161, 1960; znany jest sposób otrzymywania dehydrogenazy aldehydu 3-fosfoglicerynowego z miesnia sen^wego wolu przez ekstrakcje woda ochlodzonej miazgi i frakcjonowanie siarczanem amonu oraz poddawanie dzialaniu zmiennej temperatury podczas krystalizacji. Rozdrobnione miesnie zalewa sie dwukrot¬ nie woda i ekstrakty laczy, a nastepnie wysala siarczanem amonu do 0,7 nasycenia i saczy przez bibule. Do supernatantu dodaje sie 0,1 objetosci nasyconego siarczanu amonu i pozostawia przez tydzien, zmieniajac cyklicznie temperature otoczenia od 277 do 293 K, przy pH = 6,7. Uzyskuje sie w ten sposób krysztaly, które rozpuszcza sie i wytraca ponownie siarczanem amonu i znowu poddaje dzialaniu zmiennej temperatury, jak poprzednio. Nie podano aktywnosci specyficznej otrzymanego tym sposobem enzymu. Ze wzgledu na dlugi czas preparacji mozna przyjac, ze wytworzony enzym ma niska aktywnosc specyficzna, zas tak przeprowadzone frakcjonowanie wskazuje na znaczne zanieczyszczenia innymi enzymami.Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania dehydrogenazy aldehydu 3-fosfoglicerynowego, z miesnia sercowego wolu, przez ekstrakcje oraz frakcjonowanie bialek siarczanem amonu i rozdzie¬ lanie bialek przy pomocy chromatografii kolumnowej z zastosowaniem buforu ze wzrastajacym stezeniem chlorku sodowego.Istota wynalazku polega na tym, ze ekstrakcje przeprowadza sie buforem zlozonym z trójhyd- roksymetyloaminometanu, kwasu solnego i soli sodowej kwasu wersenowego przy pH = 7,5, po czym supernatant frakcjonuje sie i otrzymana frakcje w zakresie 0,62-0,8 nasycenia siarczanu amonu wprowadza sie na kolumne chromatograficzna wypelniona fosfoceluloza i usuwa bialka balastowe wyzej wymienionym buforem zawierajacym chlorek sodowy najkorzystniej o stezeniu 60 mM, a nastepnie uwalnia sie enzym wlasciwy wymienionym buforem ze wzrastajacym stezeniem chlorku sodowego, do stezenia koncowego co najmniej 400 mM i stabilizuje sie go przez dodanie dwunukleotydu nikotynamidoadeninowego. Wyizolowany wlasciwy enzym oczyszcza sie przez naniesienie na kolumne chromatograficzna wypelniona karboksymetyloceluloza, usuwa bialkat \ ! 2 133371 \ balastowe buforem zlozonym z betamerkaptoetanolu i soli sodowej kwasu wersenowego o pH = 7,0, natomiast wlasciwy enzym uwalnia sie tym samym buforem ze wzrastajacym stezeniem chlorku sodowego do stezenia koncowego co najmniej 300 mM, stabilizuje przez dodanie dwijnu- kleotydu nikotynamidoadeninowego i wysala siarczanemamonu. j Sposób wedlug wynalazku charakteryzuje sie tym, ze otrzymana droga ekstrakcji i frakcjono¬ wania bialek zageszczana frakcje zawierajaca dehydrogenaze aldehydu 3-fosfoglicerynowego Uczy sie z fosfoceluloza w warunkach zapewniajacych wiazanie z nia wlasciwego enzymu, dzieki czemu mozliwe staje sie maksymalne usuniecie innych bialek. Zwiazany z fosfoceluloza wlasciwy eni;ym po uwolnieniu i wytraceniu oczyszcza sie przez chromatografie z zastosowaniem karboksymetyio- -celulozy w warunkach zapewniajacych wiazanie z nia wlasciwego enzymu i usuwa reszte bialek balastowych, a potem uwalnia sie wlasciwy enzym. Dzieki tak przeprowadzonym procesom: ekstrakcja-frakcjonowanie-rozdzielanie dwukrotne z zastosowaniem róznych buforów uzyskuje sie dehydrogenaze aldehydu 3-fosfoglicerynowego o aktywnosci apecyficznej nie mniejszej niz 130 jednostek na 1 mg bialka, przy przyjeciu za jednostke enzymatyczna wytwarzanie 1 mikromola produktu w ciagu 1 minuty w temperaturze 298 K wobec 1,3 difosfoglicerynianu jako substratu, wedlug: Biochemica Information, Boehringer, Mannheim, str. 105 oraz oznaczenie bialka spektro- fotometrycznie przy 280 nm przyjmujace E 1%/1 cm = 10. Trwalosczawiesiny enzymu w roztworze siarczanu amonu wynosi 12 miesiecy przy przechowywaniu w temperaturze 277 K.Tak otrzymany enzym jest praktycznie wolny od aktywnosci nieswoistej; nie wykazuje aktyw¬ nosci izomerazy fosfotriozowej, aktywnosci dehydrogenazy fosfoglicerolu, natomiast aktywnosc dehydrogenazy mleczanowej nie przekracza 0,01%, aktywnosc kinazy 3-fosfoglicerynianowej nie przekracza 0,02% i fosfogliceromutazy 0,05% w przeliczeniu na aktywnosc dehydrogenazy alde¬ hydu 3-fosfoglicerynowego. Ze wzgledu na wysoka aktywnosc specyficzna i trwalosc, otrzymany enzym moze byc uwazany za odpowiednik enzymu miesniowego produkowanego przez firme Boehringer. Oczyszczanie na karboksymetylocelulozie gwarantuje uzyskanie enzymu o wysokiej aktywnosci, praktycznie wolnego od aktywnosci nieswoistych. Zastosowanie w celu stabilizacji enzymu dwunukleotydu nikotynamidoadeninowego zapewnia trwalosc enzymu w okresie przynaj¬ mniej jednego roku.Przyklad. Do 500 g surowca w postaci oczyszczonych z tluszczu i tkanki lacznej rozdrobnio¬ nych i zamrozonych miesni sercowych wolu dodaje sie 1000 ml buforu zlozonego z trojhydroksy- metyloaminometanu o stezeniu 50 mM, kwasu solnego i soli sodowej kwasu wersenowego o stezeniu 1 mM i pH = 7,5 i miesza mechanicznie przez 30 minut w temperaturze 277-279 K.Wszystkie dalsze operacje wykonuje sie w tej temperaturze. Homogenat wiruje sie, supernatant poddaje sie frakcjonowaniu siarczanem amonu w zakresach 0-0, 62-0,8 nasycenia, utrzymujac pH = 7,5. Uzyskana frakcje bialkowa zawarta pomiedzy 0,62-0,8 nasycenia siarczanem amonu w postaci osadu rozpuszcza sie w 150 ml wyzej wymienionego buforu o pH = 7,5, odsala sie na sicie molekularnym i wprowadza na kolumne chromatograficzna wypelniona fosfoceluloza wyrówno- wazona tym samym buforem. Kolumne plucze sie 5 objetosciami tego buforu z chlorkiem sodo¬ wym o stezeniu 60 mM, az do uzyskania absorbancji wyplywu mierzonej przy 280 nm mniejszej niz 0,05, co jest miara usuniecia bialek balastowych.Nastepnie nanosi sie znów wymieniony bufor ze wzrastajacym stezeniem chlorku sodowego do stezenia koncowego 400 mM chlorku sodowego, co powoduje uwolnienie wlasciwego enzymu.Aktywne frakcje majace powyzej 70 jednostek na 1 mg laczy sie i dodaje 20 krotny nadmiar dwunukleotydu nikotynamidoadeninowego w stosunku molowym i wysala siarczanem amonu do stezenia koncowego 0,75 nasycenia i pH = 7,5. W celu oczyszczenia enzymu zawiesine wiruje sie, osad rozpuszcza w buforze zlozonym z betamerkaptoetanolu o stezeniu 5 mM i soli sodowej kwasu wersenowego o stezeniu 5mM i pH=7,0, dializuje do tego buforu i wprowadza na kolumne chromatograficzna wypelniona karbofcsymetyloceluloza uprzednio wyrównowazona tym samym buforem. Kolumne plucze sie 5 objetosciami tego samego buforu, az do uzyskania absorbancji wyplywu mierzonej przy 280 nm mniejszej niz 0,05, co jest miara usuniecia bialek balastowych.Wlasciwy enzym uwalnia sie przez na naniesienie wymienionego buforu ze wzrastajacym stezeniem chlorku sodowego do stezenia koncowego 300 mM. Aktywne frakcje zawierajace powyzej 100 jednostek na 1 mg laczy sie, dodaje 20-krotny nadmiar dwunukleotydu nikotynamidoadeninowego w stosunku molowym i wysala siarczanem amonu do stezenia koncowego 0,75 nasycenia i pH = 7,5. Otrzymuje sie 0,075 g dehydrogenazy aldehydu 3-fosfoglicerynowego.133 371 3 Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania dehydrogenazy aldehydu 3-fosfoglicerynowego, z miesnia sercowego wolu, przez ekstrakcje oraz frakcjonowanie bialek siarczanem amonu i rozdzielanie bialek przy pomocy chromatografii kolumnowej z zastosowaniem buforu o wzrastajacym stezeniu chlorku sodowego, znamienny tym, ze ekstrakcje przeprowadza sie buforem zlozonym z trójhydroksymety- loaminometanu, kwasu solnego i soli sodowej kwasu wersenowego przy pH = 7,5, po czym super- natant frakcjonuje sie i otrzymana frakcje w zakresie 0,62-0,8 nasycenia siarczanu amonu wprowadza na kolumne chromatograficzna wypelniona fosfoceluloza i usuwa bialka balastowe wyzej wymienionym buforem zawierajacym chlorek sodowy, najkorzystniej o stezeniu 60 mM, a nastepnie uwalnia sie enzym wlasciwy wymienionym buforem ze wzrastajacym stezeniem chlorku sodowego do stezenia koncowego co najmniej 400 mM i stabilizuje sie go przez dodanie dwunu- kleotydu nikotynamidoadeninowego, zas tak wyizolowany wlasciwy enzym oczyszcza sie przez naniesienie na kolumne chromatograficzna wypelniona karboksymetyloceluloza, usuwa bialka balastowe buforem zlozonym z betamerkaptoetanolu i soli sodowej kwasu wersenowego o pH = 7,0, natomiast wlasciwy enzym uwalnia sie tym samym buforem ze wzrastajacym stezeniem chlorku sodowego do stezenia koncowego co najmniej 300 mM, stabilizuje przez dodanie dwunu- kleotydu nikotynamidoadeninowego i wysala siarczanem amonu. PLThe present invention relates to a process for the preparation of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, the systematic name of which is: E.C. 1.2.1.12, Glyceraldehyde-3-phosphate oxidase: NAD, phosphorylating. This preparation is an enzyme used for diagnostic purposes in clinical analysis. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase is produced for commercial purposes from rabbit muscle and yeast. From Gy.Jecsai: XIII. Isolation of D-glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase from Heart Muscle, Acta Physiol. Acad. Sci Hung. XVII, 161, 1960; It is known to obtain glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from goiter sleep muscle by water extraction of chilled pulp and fractionation with ammonium sulphate and subjecting to the action of variable temperature during crystallization. The crushed muscles are poured twice with water and the extracts are combined, then sent with ammonium sulphate to 0.7 saturation and filtered through blotting paper. 0.1 volume of saturated ammonium sulfate is added to the supernatant and left for a week, cyclically changing the ambient temperature from 277 to 293 K, at pH = 6.7. In this way, crystals are obtained, which are dissolved and destroyed again with ammonium sulphate and again subjected to the changing temperature as before. The specific activity of the enzyme obtained in this way was not reported. Due to the long preparation time, it can be assumed that the enzyme produced has a low specific activity, and the fractionation carried out in this way indicates significant contamination with other enzymes. The invention relates to a method of producing glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from goiter's heart muscle by extraction and fractionation of proteins with ammonium sulfate and separation of proteins by column chromatography using a buffer with increasing concentration of sodium chloride. The essence of the invention is that the extraction is carried out with a buffer consisting of trihydroxymethylaminomethane, hydrochloric acid and sodium edetic acid at pH = 7.5, after the supernatant is fractionated and the fractions obtained in the range of 0.62-0.8 ammonium sulfate saturation are introduced on the chromatographic column filled with phosphocellulose and the ballast proteins are removed with the above-mentioned buffer containing sodium chloride, most preferably with a concentration of 60 mM, and then the enzyme proper is released. m buffer with increasing sodium chloride concentration to a final concentration of at least 400 mM and is stabilized by adding nicotinamide adenine dinucleotide. The isolated enzyme proper is purified by applying to the column a chromatography column filled with carboxymethyl cellulose, removing the protein! 2 133371 \ ballast with a buffer consisting of betamercaptoethanol and sodium salt of edetic acid at pH = 7.0, while the proper enzyme is released with the same buffer with increasing sodium chloride concentration to a final concentration of at least 300 mM, stabilized by adding nicotinamide adenine binder and siseed ammonium sulfate. The method according to the invention is characterized by the fact that the obtained route of protein extraction and fractionation of the concentrated fraction containing glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase is taught with phosphocellulose under conditions ensuring binding of the proper enzyme to it, thanks to which it is possible to remove other proteins as much as possible. The specific phosphocellulose associated with the release and sedimentation is purified by chromatography using carboxymethylcellulose under conditions ensuring the binding of the appropriate enzyme and removing the rest of the ballast proteins, and then the appropriate enzyme is released. Thanks to the processes carried out in this way: extraction-fractionation-separation twice with the use of different buffers, we obtain glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase with an apecific activity of not less than 130 units per 1 mg of protein, assuming the production of 1 micromole of product in 1 minute at a temperature of 1 minute per enzyme unit. 298 K against 1,3 diphosphoglycerate as a substrate, according to: Biochemica Information, Boehringer, Mannheim, p. 105 and determination of the protein spectrophotometrically at 280 nm assuming E 1% / 1 cm = 10. Stable enzyme suspension in ammonium sulphate solution is 12 months when stored at 277 K. The enzyme thus obtained is practically free from non-specific activity; does not exhibit phosphotriose isomerase activity, phosphoglycerol dehydrogenase activity, while lactate dehydrogenase activity does not exceed 0.01%, the activity of 3-phosphoglycerate kinase does not exceed 0.02%, and phosphoglyceromutase activity does not exceed 0.05%, based on the activity of aldehydrogenase-aldehydrogenase. glycerin phosphate. Due to its high specific activity and stability, the enzyme obtained can be regarded as the equivalent of the muscle enzyme produced by the Boehringer company. Purification on carboxymethylcellulose guarantees a highly active enzyme, practically free from non-specific activities. The use of nicotinamide adenine dinucleotide to stabilize the enzyme ensures the stability of the enzyme for a period of at least one year. 1000 ml of a buffer consisting of 50 mM trihydroxymethylaminomethane, hydrochloric acid and sodium salt of edetic acid with a concentration of 1 mM and pH = 7 are added to 500 g of raw material in the form of crushed and frozen cardiac muscles of goiter removed from fat and connective tissue. , 5 and agitated mechanically for 30 minutes at 277-279 K. All further operations are performed at this temperature. The homogenate is centrifuged, the supernatant is fractionated with ammonium sulfate in the saturation ranges 0-0.62-0.8, maintaining the pH = 7.5. The obtained protein fraction, contained between 0.62-0.8 saturation with ammonium sulphate in the form of a precipitate, is dissolved in 150 ml of the above-mentioned buffer with a pH = 7.5, it is desalted on a molecular sieve and the chromatographic column filled with phosphocellulose equilibrated with the same buffer. The column is rinsed with 5 volumes of this 60 mM sodium chloride buffer until the effluent absorbance measured at 280 nm is less than 0.05, which is a measure of the removal of the ballast protein. Then the exchanged buffer is reapplied with increasing sodium chloride concentration. to a final concentration of 400 mM sodium chloride, which releases the appropriate enzyme. Active fractions of more than 70 units per 1 mg are combined and a 20-fold excess of nicotinamide adenine dinucleotide in a molar ratio is added and ammonium sulphate is released to a final concentration of 0.75 saturation and pH = 7 , 5. In order to purify the enzyme, the suspension is centrifuged, the precipitate is dissolved in a buffer consisting of betamercaptoethanol at the concentration of 5 mM and sodium salt of edetic acid at the concentration of 5 mM and pH = 7.0, dialyzed into this buffer and introduced on the chromatographic column filled with carbofcsymethyl cellulose, previously equilibrated with the same . The column is rinsed with 5 volumes of the same buffer until the effluent absorbance measured at 280 nm is less than 0.05, which is a measure of the removal of the ballast protein. The correct enzyme is released by applying the said buffer with increasing sodium chloride concentration to a final concentration of 300 mM . Active fractions containing more than 100 units per 1 mg are combined, a 20-fold molar excess of nicotinamide adenine dinucleotide is added and the ammonium sulphate is released to a final saturation concentration of 0.75 and pH = 7.5. 0.075 g of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase is obtained. 133 371 3 Patent claim Method for the preparation of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from goiter cardiac muscle by extraction and fractionation of proteins with ammonium sulphate and separation of proteins by column chromatography with increasing sodium concentration buffer , characterized in that the extraction is performed with a buffer consisting of trihydroxymethylaminomethane, hydrochloric acid and sodium salt of edetic acid at pH = 7.5, then the supernatant is fractionated and the obtained fraction in the range of 0.62-0.8 of sulfate saturation ammonium is introduced into the column by chromatography filled with phosphocellulose and the ballast proteins are removed with the above-mentioned buffer containing sodium chloride, preferably at a concentration of 60 mM, and then the enzyme is released with the above-mentioned buffer with increasing sodium chloride concentration to a final concentration of at least 400 mM and stabilized by adding two- nicotinamide adenine cleotide, and the proper enzyme isolated in this way is purified by applying a chromatographic column filled with carboxymethylcellulose, removing ballast proteins with a buffer composed of betamercaptoethanol and sodium salt of edetic acid at pH = 7.0, while the appropriate enzyme is released with the same sodium buffer, thus increasing in the same concentration to a final concentration of at least 300 mM, stabilized by adding nicotinamide adenine dinucleotide and released with ammonium sulfate. PL