PL133371B2 - Process for preparing dehydrogenase of 3-phosphoglyceric aldehyde - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania dehydrogenazy aldehydu 3-fosfogliceryno- wego, której nazwa systematyczna brzmi: E.C. 1.2.1.12, Oksydbreduktaza aldehyd 3- fosfoglicerynowy: NAD, fosforylujaca. Preparat ten jest enzymem stosowanym do celów diagnostycznych w analityce klinicznej.Dehydrogenaza aldehydu 3- fosfoglicerynowegojest produkowanadla celów komercjalnychz miesni królika i drozdzy.Z publikacji: Gy.Jecsai: XIII. Isolation of D-glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase from Heart Muscle, Acta Physiol. Acad. Sci Hung. XVII, 161, 1960; znany jest sposób otrzymywania dehydrogenazy aldehydu 3-fosfoglicerynowego z miesnia sen^wego wolu przez ekstrakcje woda ochlodzonej miazgi i frakcjonowanie siarczanem amonu oraz poddawanie dzialaniu zmiennej temperatury podczas krystalizacji. Rozdrobnione miesnie zalewa sie dwukrot¬ nie woda i ekstrakty laczy, a nastepnie wysala siarczanem amonu do 0,7 nasycenia i saczy przez bibule. Do supernatantu dodaje sie 0,1 objetosci nasyconego siarczanu amonu i pozostawia przez tydzien, zmieniajac cyklicznie temperature otoczenia od 277 do 293 K, przy pH = 6,7. Uzyskuje sie w ten sposób krysztaly, które rozpuszcza sie i wytraca ponownie siarczanem amonu i znowu poddaje dzialaniu zmiennej temperatury, jak poprzednio. Nie podano aktywnosci specyficznej otrzymanego tym sposobem enzymu. Ze wzgledu na dlugi czas preparacji mozna przyjac, ze wytworzony enzym ma niska aktywnosc specyficzna, zas tak przeprowadzone frakcjonowanie wskazuje na znaczne zanieczyszczenia innymi enzymami.Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania dehydrogenazy aldehydu 3-fosfoglicerynowego, z miesnia sercowego wolu, przez ekstrakcje oraz frakcjonowanie bialek siarczanem amonu i rozdzie¬ lanie bialek przy pomocy chromatografii kolumnowej z zastosowaniem buforu ze wzrastajacym stezeniem chlorku sodowego.Istota wynalazku polega na tym, ze ekstrakcje przeprowadza sie buforem zlozonym z trójhyd- roksymetyloaminometanu, kwasu solnego i soli sodowej kwasu wersenowego przy pH = 7,5, po czym supernatant frakcjonuje sie i otrzymana frakcje w zakresie 0,62-0,8 nasycenia siarczanu amonu wprowadza sie na kolumne chromatograficzna wypelniona fosfoceluloza i usuwa bialka balastowe wyzej wymienionym buforem zawierajacym chlorek sodowy najkorzystniej o stezeniu 60 mM, a nastepnie uwalnia sie enzym wlasciwy wymienionym buforem ze wzrastajacym stezeniem chlorku sodowego, do stezenia koncowego co najmniej 400 mM i stabilizuje sie go przez dodanie dwunukleotydu nikotynamidoadeninowego. Wyizolowany wlasciwy enzym oczyszcza sie przez naniesienie na kolumne chromatograficzna wypelniona karboksymetyloceluloza, usuwa bialkat \ ! 2 133371 \ balastowe buforem zlozonym z betamerkaptoetanolu i soli sodowej kwasu wersenowego o pH = 7,0, natomiast wlasciwy enzym uwalnia sie tym samym buforem ze wzrastajacym stezeniem chlorku sodowego do stezenia koncowego co najmniej 300 mM, stabilizuje przez dodanie dwijnu- kleotydu nikotynamidoadeninowego i wysala siarczanemamonu. j Sposób wedlug wynalazku charakteryzuje sie tym, ze otrzymana droga ekstrakcji i frakcjono¬ wania bialek zageszczana frakcje zawierajaca dehydrogenaze aldehydu 3-fosfoglicerynowego Uczy sie z fosfoceluloza w warunkach zapewniajacych wiazanie z nia wlasciwego enzymu, dzieki czemu mozliwe staje sie maksymalne usuniecie innych bialek. Zwiazany z fosfoceluloza wlasciwy eni;ym po uwolnieniu i wytraceniu oczyszcza sie przez chromatografie z zastosowaniem karboksymetyio- -celulozy w warunkach zapewniajacych wiazanie z nia wlasciwego enzymu i usuwa reszte bialek balastowych, a potem uwalnia sie wlasciwy enzym. Dzieki tak przeprowadzonym procesom: ekstrakcja-frakcjonowanie-rozdzielanie dwukrotne z zastosowaniem róznych buforów uzyskuje sie dehydrogenaze aldehydu 3-fosfoglicerynowego o aktywnosci apecyficznej nie mniejszej niz 130 jednostek na 1 mg bialka, przy przyjeciu za jednostke enzymatyczna wytwarzanie 1 mikromola produktu w ciagu 1 minuty w temperaturze 298 K wobec 1,3 difosfoglicerynianu jako substratu, wedlug: Biochemica Information, Boehringer, Mannheim, str. 105 oraz oznaczenie bialka spektro- fotometrycznie przy 280 nm przyjmujace E 1%/1 cm = 10. Trwalosczawiesiny enzymu w roztworze siarczanu amonu wynosi 12 miesiecy przy przechowywaniu w temperaturze 277 K.Tak otrzymany enzym jest praktycznie wolny od aktywnosci nieswoistej; nie wykazuje aktyw¬ nosci izomerazy fosfotriozowej, aktywnosci dehydrogenazy fosfoglicerolu, natomiast aktywnosc dehydrogenazy mleczanowej nie przekracza 0,01%, aktywnosc kinazy 3-fosfoglicerynianowej nie przekracza 0,02% i fosfogliceromutazy 0,05% w przeliczeniu na aktywnosc dehydrogenazy alde¬ hydu 3-fosfoglicerynowego. Ze wzgledu na wysoka aktywnosc specyficzna i trwalosc, otrzymany enzym moze byc uwazany za odpowiednik enzymu miesniowego produkowanego przez firme Boehringer. Oczyszczanie na karboksymetylocelulozie gwarantuje uzyskanie enzymu o wysokiej aktywnosci, praktycznie wolnego od aktywnosci nieswoistych. Zastosowanie w celu stabilizacji enzymu dwunukleotydu nikotynamidoadeninowego zapewnia trwalosc enzymu w okresie przynaj¬ mniej jednego roku.Przyklad. Do 500 g surowca w postaci oczyszczonych z tluszczu i tkanki lacznej rozdrobnio¬ nych i zamrozonych miesni sercowych wolu dodaje sie 1000 ml buforu zlozonego z trojhydroksy- metyloaminometanu o stezeniu 50 mM, kwasu solnego i soli sodowej kwasu wersenowego o stezeniu 1 mM i pH = 7,5 i miesza mechanicznie przez 30 minut w temperaturze 277-279 K.Wszystkie dalsze operacje wykonuje sie w tej temperaturze. Homogenat wiruje sie, supernatant poddaje sie frakcjonowaniu siarczanem amonu w zakresach 0-0, 62-0,8 nasycenia, utrzymujac pH = 7,5. Uzyskana frakcje bialkowa zawarta pomiedzy 0,62-0,8 nasycenia siarczanem amonu w postaci osadu rozpuszcza sie w 150 ml wyzej wymienionego buforu o pH = 7,5, odsala sie na sicie molekularnym i wprowadza na kolumne chromatograficzna wypelniona fosfoceluloza wyrówno- wazona tym samym buforem. Kolumne plucze sie 5 objetosciami tego buforu z chlorkiem sodo¬ wym o stezeniu 60 mM, az do uzyskania absorbancji wyplywu mierzonej przy 280 nm mniejszej niz 0,05, co jest miara usuniecia bialek balastowych.Nastepnie nanosi sie znów wymieniony bufor ze wzrastajacym stezeniem chlorku sodowego do stezenia koncowego 400 mM chlorku sodowego, co powoduje uwolnienie wlasciwego enzymu.Aktywne frakcje majace powyzej 70 jednostek na 1 mg laczy sie i dodaje 20 krotny nadmiar dwunukleotydu nikotynamidoadeninowego w stosunku molowym i wysala siarczanem amonu do stezenia koncowego 0,75 nasycenia i pH = 7,5. W celu oczyszczenia enzymu zawiesine wiruje sie, osad rozpuszcza w buforze zlozonym z betamerkaptoetanolu o stezeniu 5 mM i soli sodowej kwasu wersenowego o stezeniu 5mM i pH=7,0, dializuje do tego buforu i wprowadza na kolumne chromatograficzna wypelniona karbofcsymetyloceluloza uprzednio wyrównowazona tym samym buforem. Kolumne plucze sie 5 objetosciami tego samego buforu, az do uzyskania absorbancji wyplywu mierzonej przy 280 nm mniejszej niz 0,05, co jest miara usuniecia bialek balastowych.Wlasciwy enzym uwalnia sie przez na naniesienie wymienionego buforu ze wzrastajacym stezeniem chlorku sodowego do stezenia koncowego 300 mM. Aktywne frakcje zawierajace powyzej 100 jednostek na 1 mg laczy sie, dodaje 20-krotny nadmiar dwunukleotydu nikotynamidoadeninowego w stosunku molowym i wysala siarczanem amonu do stezenia koncowego 0,75 nasycenia i pH = 7,5. Otrzymuje sie 0,075 g dehydrogenazy aldehydu 3-fosfoglicerynowego.133 371 3 Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania dehydrogenazy aldehydu 3-fosfoglicerynowego, z miesnia sercowego wolu, przez ekstrakcje oraz frakcjonowanie bialek siarczanem amonu i rozdzielanie bialek przy pomocy chromatografii kolumnowej z zastosowaniem buforu o wzrastajacym stezeniu chlorku sodowego, znamienny tym, ze ekstrakcje przeprowadza sie buforem zlozonym z trójhydroksymety- loaminometanu, kwasu solnego i soli sodowej kwasu wersenowego przy pH = 7,5, po czym super- natant frakcjonuje sie i otrzymana frakcje w zakresie 0,62-0,8 nasycenia siarczanu amonu wprowadza na kolumne chromatograficzna wypelniona fosfoceluloza i usuwa bialka balastowe wyzej wymienionym buforem zawierajacym chlorek sodowy, najkorzystniej o stezeniu 60 mM, a nastepnie uwalnia sie enzym wlasciwy wymienionym buforem ze wzrastajacym stezeniem chlorku sodowego do stezenia koncowego co najmniej 400 mM i stabilizuje sie go przez dodanie dwunu- kleotydu nikotynamidoadeninowego, zas tak wyizolowany wlasciwy enzym oczyszcza sie przez naniesienie na kolumne chromatograficzna wypelniona karboksymetyloceluloza, usuwa bialka balastowe buforem zlozonym z betamerkaptoetanolu i soli sodowej kwasu wersenowego o pH = 7,0, natomiast wlasciwy enzym uwalnia sie tym samym buforem ze wzrastajacym stezeniem chlorku sodowego do stezenia koncowego co najmniej 300 mM, stabilizuje przez dodanie dwunu- kleotydu nikotynamidoadeninowego i wysala siarczanem amonu. PL

Claims (3)

1. Zastrzezenie patentowe

2. Sposób wytwarzania dehydrogenazy aldehydu

3. -fosfoglicerynowego, z miesnia sercowego wolu, przez ekstrakcje oraz frakcjonowanie bialek siarczanem amonu i rozdzielanie bialek przy pomocy chromatografii kolumnowej z zastosowaniem buforu o wzrastajacym stezeniu chlorku sodowego, znamienny tym, ze ekstrakcje przeprowadza sie buforem zlozonym z trójhydroksymety- loaminometanu, kwasu solnego i soli sodowej kwasu wersenowego przy pH = 7,5, po czym super- natant frakcjonuje sie i otrzymana frakcje w zakresie 0,62-0,8 nasycenia siarczanu amonu wprowadza na kolumne chromatograficzna wypelniona fosfoceluloza i usuwa bialka balastowe wyzej wymienionym buforem zawierajacym chlorek sodowy, najkorzystniej o stezeniu 60 mM, a nastepnie uwalnia sie enzym wlasciwy wymienionym buforem ze wzrastajacym stezeniem chlorku sodowego do stezenia koncowego co najmniej 400 mM i stabilizuje sie go przez dodanie dwunu- kleotydu nikotynamidoadeninowego, zas tak wyizolowany wlasciwy enzym oczyszcza sie przez naniesienie na kolumne chromatograficzna wypelniona karboksymetyloceluloza, usuwa bialka balastowe buforem zlozonym z betamerkaptoetanolu i soli sodowej kwasu wersenowego o pH = 7,0, natomiast wlasciwy enzym uwalnia sie tym samym buforem ze wzrastajacym stezeniem chlorku sodowego do stezenia koncowego co najmniej 300 mM, stabilizuje przez dodanie dwunu- kleotydu nikotynamidoadeninowego i wysala siarczanem amonu. PL