Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywa¬ nia nowych podhodinych N-i/N^N-ddmetyloamino/- -acylowych estrów metylowych i 3VN,N-diimetylo- aimino^propyiloamidów malkrolidów polienowych o wzorze ogólnym, przedstaiwionyim na rysunku, gdzie R oznacza reszte;, zwiazanego aimidowo z gru¬ pa aminowa aimiinocuikru (makrolidu polienowego, aminokwasu o lancuchu prostym lub rozgalezio¬ nym, w którym atomy wodoru grupy wzglednie grup aminowych w pozycji a, jjflj," y i dalszyoh w stosunku do . grupy karboksylowej aminokwasu .podstawione sa grupami metylowymi, o dowolnej konfiguracja. M oznacza reszte makrolidu polle¬ nowega, zas X oznacza grupe metoksylowa w estrze makrolidu polienowego lulb reszte 3-yNjN- ^dimetylloaffmiino/-propylOaiminy, której I-rzedowa grupa aminowa, zwiazana jest amidowo z grupa karboksylowa makrolidu polienowego.'Dotycihczas znane isa N-acylowe pochodne estru metylowego amfoterycyny B-^J. Antibiotics 25 (4), 256—258 (1972), W. MecMinskij,, C. "P. Schaffner.Poahodne te otrzymuje sde w reakcji amfoterycy^ ny B z bezwodnikami odpowiednich kwasów, a nastepnie uzyskana N-acylowa pochodna amfotery¬ cyny iB przeprowadza sie w ester metylowy przy uzyciu dwuazometanu. Posiadaja one znacznie mniejsza 'aktywnosc przeciwgrzybowa w porówna¬ niu z wyjsciowymi antybiotykami ii nie sa roz¬ puszczalne, jak równiez nie tworza rozpuszczalnych iw wodzie soli. Znane /pochodne N-aminoacylowe, 10 20 25 30 w których grupa NH2 aminokwasów jest niepod^ stawiona,, — J. Antibiotics 35 ,(7), 911^914 (198*2), J. J. Wright, J. A. AUbarefc, L. R. Krepski, D.Loebenberg, charakteryzuja sie aktywnoscia prze¬ ciwgrzybowa porównywalna z aktywnoscia wyj¬ sciowych antybiotyków i zdolnoscia tworzenia roz^ puszczalnycih w wodzie soli.(Pochodne te otrzymuje sie w reakcji acylowanie N-chronionych aminokwasów *z makroilidami po1- lienowymij a nastepnie przeprowadzeniu - uzyska¬ nej pochodnej w ester. Tok syntezy jest wielo¬ etapowy i wymaga usuwania oslon grupy amino¬ wej w aminokwasie acylujacym makrolid polie- .noiwy po' zakonczeniu reakcji acylowania. Z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4.365.058 znane sa estry benzylowe N-acetylopi- mairycyny, N-acetyiloamifoterycyny fi oraz N-acety- lonyistatyny.Spoisób otrzymywania tych estrów polega na re¬ akcji N-acetylowej pochodnej makroilidu polieno¬ wego z dicykloheksylokarbodiimidem i aLkoiholem benzylowym. Estry te posiadaja .znacznie mniejsza aktywnosc przeciwgrz,ybowa w porównaniu z wyj¬ sciowymi antybiotykami i nie sa rozpuszczalne w wodzie, jak równiez nie tworza rozpuszczalnych w wodzie soli.Sposób otrzymywania nowych pochodnych N^/N,N- -dimetyloaminoZ-acylowych estrów metylowych i 3- -,/[NJN-dimetyloaiminoi/-propyloaimidów makrolidów poOiiienowyoh ó wzorze ogólinym, przedstawionym 142 8483 142 848 4 na rysunku* gdzie R oznacza resztej, zwiazanego amidowo z grupa aminowa aminoeukru makro- lidu 'polienowego, aminokwalsu o lancuchu prostym Hub rozgalezionym, w którym atomy wodoru gru¬ py wzgledmiie grup aminowych w pozycji a, fi, y 5 i dalszych w' stosunku do ' grulpy (karboksylowej aminokwasu podstawione 'sa grupami metylowy¬ mi! o, dowolnej konfiugracji, M oznacza reszte mafcrolidu polienowego, zas X oznacza grupe me- toksylowa w estrze mafcrolidu; pollienlowego lub 10 reszte 3-/Nl?N-diimJe!tyloaimdTiOHpaxpyloamm której I /rzedowa grupa aminowa zwiazana, jest ami¬ dowo z grupa' karboksylowa makrolidu polieno¬ wego^ wedlug wynalazku polega ma tymj, ze na' ester metylowy wzglednie WNj^-dimetyloamdino1/- 15 -propyloamid makrolidu polienowego, w srodowi¬ sku rozpuszczalnika organicznego lub ich miesza¬ niny ii w obecnosci substancji wiazacej kwas dzia¬ la sie niewielkim nadmiarem N,N-dimetyloamino- kwasu z grupa karboksylowa, aktywowana azyd- 20 kiem diestru fenylowego 'kwasu o-fosforowego lub N-hydroksysiulkciyniLoimidem w obecnosci dicyklohek- syiokariboddiiimMui, calosc .pozostawia -do przere- agowania, a nastepnie z mieszaniny poreakcyjnej wytraca estrem etylowym surowy produkt kon- 25 cowy, oczyszcza sie go i ewentualnie przeprowadza w sól.Stosuje sie ester metylowy Hub 3-AN,N-dimety- loamiino/-propyioamid korzystnie nastepujacych makrolidów polienowych: amfoterycyny fi, kandy- 30 dyny, mykoheptyny,, nystatyny, poilifunginy, aure- ofacyny i kandycydyny.Korzystnie stosuje sie N,iN-idimetyilowe .pochod¬ ne nastepujacych aminokwasów: glicyny;, ^-alani¬ ny, D-alaniny, L-alaniny, L-fenyloalaniny, L-lizy- ny, L-waliny oraz kwasu L-&,4^diaminomaislowe- go. Jako rozpuszczalniki organiczne stosuje sie korzystnie N,N-dimetyloformamid|, N,N-dilmetyloa- cetamid, N,N-dimetylosulfotlenek lub ich mieszani- 40 ne.Jako substancje wiazaca kwas stosuje sie ko¬ rzystnie trietyioamine. Sposób otrzymywania- N- -/NjN-dimetyloamino/^acylowydh pochodnych es¬ trów metylowych i 3-M';N-dimetyloamiiJno/-propy- 45 loamidów makrolidów polienowych prowadzi jed- , noznacznie do otrzymania zadanegio produktu bez zmian w strukturze pozostalej czesci czasteczki an¬ tybiotyku. Pelen dowód struktury opisuje przy¬ klad potwierdzenia budowy chemicznej estru me- 50 tylowego N^N,,N-dimetytloglicylio/-adnifoterycyny fi.Identycznosc elektronowego widma absorpcyjne¬ go estru metylowego N-ZN-yN-idimetylloglicyio/amlo- terycyny fi z widmem wyjsciowego antybiotyku dowodzi, ze opracowany sposób nie prowadzi do 55 degradacji chromotforu polienowego, a wysoka war¬ tosc ekstynkcji Ei cm = 1^00 Przy 3a2 mm swiad¬ czy o wysokim 'stopniu czystosci otrzymanego pro¬ duktu.W widmie absorpcyjnym w podczerwieni estru 60 metalowego N-/N,N-dimetyloglicyio/-aimfoterycyny fi obserwuje sie pasmo odpowiadajace drganiom walencyjnym grupy karbonylowej estru metylo- wegói jy = 1730 cm-1,, co swiadczy o tym, ze ugru- ~~ powanie estrowe pozostalo niezmienione podczas 65 reakcji). Natomiast w widmie estru metylowego N-/N,N-dimetylogilicylo/-amfoterycyny fi obser¬ wuje sie pojawienie pasma o liczbie falowej 1640 om—1, odpowiadajacego drganiom walencyjnym grupy karbonylowej w amidzie drugorzedowym, co jest (bezposrednim dowodem na dbecnosc wia¬ zani^ amidowego w otrzymanym produkcie. iMase czasteczkowa estru metylowego N-/N,N- -dimetyloglicyloi/-amfoterycyny fi potwierdzono w oparciu o widmo masowe tego zwiazku wykona¬ ne technika desorpcji poilem na podstawie za¬ obserwowanego jonu imolekularnego zgodnie z o- czekiwanym (M+ = M = 10(22). Przeprowadzono takze hydrolize kwasowa estru metylowego' N-/N,N- dimetyloglicylo/^amfoterycyny fi w 6N kwasie sol¬ nym przez 1;2 godzin i w hydrolizie potwierdzono obecnosc N^-idiimetyloglicyny metoda chroimatogra- fiil cienkowarstwowej wobec wzorca N,N-diimietylo- gllicyny. Natomiast w w^iku hydrolizy 'kwasowej estru metylowego N-/N,N-dimetyilogldcyW-amfote- rycyny fi, przeprowadzonej w lagodnych warun¬ kach przy pomocy .3% wodnoalkotholowego roz¬ tworu chlorowodóru przez 1'9 minut, otrzymano po zobojetnieniu N^N,N-dinietyiloglMcylo/-niyikozamdne, której boidowe chemiczna potwierdzono metoda spektroskopii N M R i spektrometrii masowej. Sta¬ nowi to bezposredni dowód swiadczacy o tym, ze reszta NjN-idinietyloglicyny tworzy wiazania ami¬ dowe z grupa aminowa aminoeukru, to jest myko- zaniny oibecnej w czasteczce amfoterycyny fi.Pozostale pochodne NH/N,N^dimetyloaminoi/-acy- iowe estrów metylowych i 3-yiN,Njdimetyloamino/- -propyloamidów imiakrolidow polienowyicih charak¬ teryzowano w podolbny do opisanego wyzej spo¬ sób. Panzedstawione fakty 'dowodza, ze proponowa¬ ny spoisólb otrzymywania, -N-/N,N-dimetylO'aiminoi/-a- cylowych pochodnych estrów metylowych i 3-/N,N- -dimetyiloamino/-propyloamidów makrolidów poiie- inowych prowadzi do otrzymania zadanych pochod¬ nych bez naruszania pozostalych, ugrupowan, obec¬ nych w czasteczce tych antybiotyków.-Dla otrzymanych zwiazków oznaczono aktyw¬ nosc iprzeciwgirzybowa oraz toksycznosc in vitro.Aktywnosc przeciwgrzybowa oznaczono wobec Sac- chairomyces oerevisiae oraz Candida albioaris, a za jej miare przyjeto stezenie badanego preparatu hamujace w 50°/o wzrost drobnoustroju oznaczo^ ny spektrotfotometrycznie przy 660 nmi, po 24 go¬ dzinnej inkubacji w temperaturze 27°C (JC50).Za miare toksycznosci liin vitro przyjeto stezenie badanego preparatu powodujace w standardowych warunkach ^OP/o hemolize erytrocytów ludzkich (EH50).Analogicznym sposobem do opisanego mozna o- trzymac N^/N,N-dimetyloamino/-acylowe .poohodne róznych estrów oraz róznych prostych i podstawio- nych amidów miakroliidow poliienowych. Przykla- dowOp otrzymac mozna pochodne N-,/Ni,N-.d\iimetylo- aimino/-acylowe taikich estrów makrolidów .polie¬ nowych, jak ester metylowy, etylowy, butylowy, benzyLowy, fenylo'wy, p^nitrofenyilotwyi, anyzkowy oraz takich amidów, jak amid izojproplowy, n-bu- tylowy, izobutylowy, heksylowy, 2-hydroksyetylo- wy, 3-hydroksypropyflowyi, benizyJiowy, morfolinowy, cykloheksylowy, n-decyloiwy, n-dodecylowyB n-okta-142 848 5 6 15 20 decylowy, n-oktylowy, 3-yN),N-dimetyloamijno/-prio- pylowy, S-ZN^-izopropyloairndinio^-propyljOiwy, 1h/N, N-dimetyloaimino/Hizopropylowy, piperydylowy.Wszystkie te pochodne wykazuja aktywnosc prze- ciwgrzybowa porównywalna z macierzystymi anty- 5 bilotykiatmi oraz tworza iz kwasami rozpuszczalne w wodzie isoHe, niemniej jednak optymalne wlas- ciwosci biologiczne), wylkazaija pochodne N^/N,N- ^dimetyloaminoZ-acylowe estrów metylowydh i 3- -^N,N^dimety^oaimino/-propyloamiidów maikrolidów 10 polienowych.Przedmiotowe pochodne w odróznieniu od estrów oraz prostych amidowi, nie zawierajacych pod¬ stawników o ehairakterze zasadowym, makrolidów polienoWycih daja ze slabymi kwasami ddbnze roz¬ puszczalne w wodzie sole, Iktóre w porównaniu z wyjsciowymi estrami i amidami imakrolidów polie¬ nowych zachowuja pelna aktywnosc przeciwgrzy- bowa.Pochodnie N-/N,N-dimety!ljoamino;/-aicyilowe zasa¬ dowych amidów makroiliidów poliienowych w po- równaniu z wyjsciowymi amidaimi tworza ze sla¬ bymi jkwasami sole o szczególnie idobrej rozpusz¬ czalnosci w wodzie. Nieoczekiwanie okazalo sie, a czego inde mozna bylo przewidziec z góry;, ze sole przedmiotowych pochodnych ze slaflbymi kwasami bardzo dobrze rozpuszczaja sie w wodzie mimo, ze w wyniku podstawienia estru metylowego lub 3-y[N,N-dLmetyloamino/-propyloam!idu retsizte NJtf- -diimetyloamiinokwasu nie nastepuje ani zwieksze¬ nie w czasteczce soli ilosci elektrycznych ladun¬ ków jednoimiennjych, ani tez (wprowadzenie silnie hydrofilnych podstawników.Przedmiotowe pochodne, charakteryzujac sie wy- 35 soka aktywnoscia* przeciwgirzyfoowai, obnizona tok¬ sycznoscia in vitro w porównaniu z macierzysty-" mi antybiotykami oraz zdolnoscia tworzenia z kwa¬ sami sold bardzo' doibrze rozpuszczalnych w wo¬ dzie rokuja duze nadzieje ma zastosowanie ich do 40 ¦leczenia grzyibic1 ukladowych. Bardzo .dobra roz¬ puszczalnosc w wodzie soli uzyskanych pochod¬ nych jest szczególnie cenna1 dla medycyny z uwa¬ gi na ito, ze jedyny, stosowany dotychczas w le¬ czeniu grzybic 'ukladowych, lek zwany fungizo- 45 nem tworzy w wodzie -wylaczanie roztwory kolo¬ idalne. Ponad fcoj, sposób otrzymywania- pochod¬ nych Nw/IN,N-d!i!metylofainiino/^acylowycih estrów i amidów makrolidów 'polienowych jest prosty i' pro- wadzi do uzyskania produktów z dobra wydaj- 50 nosoia, a przez zastosowanie N,tN-dimetylowej po- chiodnej aminokwasu eliminuje koniecznosc wpro- wadzaoia ochron grup aimiinowyohi,, które imiusialyby byc usuwane po reakcji acylowania.Sposób otrzymywania inowych pochodnych N- 55 n/N,N-dimetyflcaimlno/acylowych estrów imetylowych i 3-iANiN-dimetyloaimino/-propiykamidów makroli¬ dów polienowych ilustruja podane nizej przykla- dy.Przyklad I. 240 mg estru metylowego amfo- 60 terycyny B o E lv^m = 1560 przy 382 mm roz¬ puszcza sie w 8 ml N,.N-diirrretyfloformamidu i schladza w lazni z lodem. Do roztworu mieszajac dodaje sie 713 mg chlorowodorku N3N-dimetylo- glicyny, 0,22 ml tóetyloaiminy oraz 0,14 ml azydku 65 diestru fenylowego kwasu o-fosforowegoi i pozo¬ stawia na li2 godzin. Po przereagowaniu do roz¬ tworu dodaje sie eter etylowy az do wytracenia osadu, który po odwirowaniu, przemyciu eterem etylowym i wysuszeniu rozpuszcza sie w n-buta- nolu,, a wairstwe m-butainolowa przemywa kilka¬ krotnie woda do pH 7. Roztwór m-butanolowy za^ geszcza sie pod zmniejszonymi cisnieniem w tern- peraturze indJe wyzszej niz 40<°C i wytraca zen osad przy pomocy nadmiaru eteru etylowego. Osad odwirowuje sie, przemywa eterem etylowym1, n- -iheksainem i suszy w eksykatorze prózniowym.Otrzymuje sie 2510 mg surowego produktu o E i°cm = 1E80 przy 382 nm.; Produkt 'oczyszcza siie na drodze jonowymiennej z uzyciem karfbokis.ymetylocelulozy.Osacl rozpuszcza sie w kilku mdfliiilitrach mieszaniny metanolu i wody w stosunku objetosciowym 2:1,, nanosi nia kolumne napelniona 2,5 g kali^boksyme- tylocelulozy OM -r 5i2 firmy WHATMAN zawie¬ szonej w mieszaninie metanolu i wody \(Qi:lfvlv) i kolumne przemywa sie ta rnliieszainina. Nastepnie produkt eluuje sie z kolulmny z'a pomoca 51% roz¬ tworu chlorku sodu w mieszaninie rnetainol-woda <2:li/v/v). Z zebranych frakcji odparowuje sie me¬ tanol pod zmniejszonym cisnieniem!,' pozostalosc roz¬ ciencza isie woda, dodaje trietyloaiminy do pH B ii poddaje sie w rozdzielaczu ekstrakcji za pomoca n-butanolu. Warstwe n-butanolu .przemywa sie woda az do zarniku jonów chlorkowych, wykry¬ wanych przy pomocy testu z azotanem srebra, za¬ geszcza pod zmniejszonym cisnieniem do malej ob¬ jetosci i wytraca osad przy pomocy na-dmiaru ete¬ ru etylowego". Osad odwirowuje siie,. przemywa kil-* kakrotnie eterem etylowym, n-heksaoem di suszy w leksykatorze prózniowym. Otrzymuje sie 190 mg estru metylowego N-^,N-dimety'loglicylo/-airnifO'te^ rycyny fi o IEi°cm = 1400 przy 3812 mm w postaci wolinej zasady, co stanowi 72P/oi wydajnosci te¬ oretycznej. IC50 = 0,12 y/gtai (Saccharomyces ce^ revisiae); IC50 = 0,;1 /Ug/iml (Camdida albicams 1(4)40); EH50 = 30 i/g/ml. W celu otrzymania roz¬ puszczalnej w wodzie soli estru metylowego N- -t/N,N-dimetylo^licylo/-amifoterycyniy fi zawiesza sie 2IO0i mg (tegoi estru w 5 rnl wody i dodaje sie kro¬ plami iroztwór 27 mg kwasu L-asparaginowego w 2 ml wody, obserwujac postepujace rozpiuszczame sie lestru, a nastepnie przy pomocy nadmiaru aceto¬ nu x i niewielkiego dodatku eteru etylowego wy¬ traca osad. Osad odwirowuje sie, przemywa ace¬ tonem z niewielkim dodatkiem eteru etylowego,, eterem etylowym i suszy w eksykaitonze próznio¬ wym. Otrzymuje sie 210 mg doskonale rozpuszczal- inego w wodizde Li-asparaginiainu estru metylowego N-i/N,N-'diirnetylogljilcyloi/^amfoterycyny fi o Ej0/°m = — 112510 przy 382 mm, co stanowi 901% wydajnosci teoretycznej w stosunku do wolnej zasady. IC50 = = '0,115 i^ug/ml iCiSaiccharomyces iceirevaisiae); IC50 = = 0,115 ^ug/irria (Camdida aUbicams 1440); EHgo = 35 jugfnn.Przyklad II. 200 mg 3^,NHdtaetyloamiino/- -propyloamidu amfoterycyiiy $ o Ej0/°m = 1400 przy 382 nm rozpuszcza sie w 6 ml N^-dimetylo- fortmamidu i po schlodzeniu w lazni z lodem do-daje sie 60 ,m;g chlorowodorku N,N-dimetyloglicy- ny, 0,19 ml trietyloamiilny oraz 0,13 mi azydku die¬ stru fenylowego kwasu o-fosfoirowego i pozosta*- wia na lf2 godzlin do przereagowania mieszajac.Dalszy tok postepowania jak w przykladzie I. O- trzymiuje sie-175 mg 3-yiN^-dimety,kamiiiiioi/-p,ropy- loamidu Nn/N;tf-dimetyloglacyW fi -o E i°cm [=1(300 przy J38I2 nim w! postaci woilinej za¬ sady, co stanowi 80V» wydajnosci teoretycznej. 1^50 = M2 ^g/ml .(Saccharoimyces cerevisiae); IC50 = 0,1 i//g/rni (Candida albflcams 1440); EH50 1= = 20 ywg/ml.W celu otrzymania rozpuszczalnej w wodzie so¬ li zawiesza sie 170 mg 3-/N, pylloamudu N-/N,N-dimetylogldcylo/-aimifoterycyiny fi w 4 ml wody i dodaje kroiplaimii1 roztwór 43 mg kwasu Lnasparaginowego w 3 imfl. wody obserwujac postepujace rozpuszczanie sie amidu, a nastepnie wytraca osad przy pomocy nadmiaru acetonu. Osad odwirowuje sie, przemywa acetoruemy eterem ety¬ lowym i suszy w eksykatorze prózniowym. Otrzy¬ muje sie 196 mg L-iasparaginilanu 3-i/N^N^diimety- loalmiinio/-propyloiamidu N-t/,N,JlN^dimietylog.licylo/-am- foterycyny fi o ^fcm H1O0O |przy 882 mmi, co sta¬ nowi 9,2fVo wydajnosci teoretycznej w stosunku do • wolnej zasady. IC50 = 0,15 ^g\frrn (Saccharomyces cerev:isiae); IC50 = 0,14 i^gtoil (Oandidai albicans); EH50 f= 26 //g/ml.IPrzyklad III. 200 mg estru metylowego am- foberycyny fi o Ej°cm = 15160 przy 382 nm rozpu¬ szcza sie w 10 ml N,N-dimetylotfiormamdidu i schla¬ dza w lazni z lodem. Do roztworu dodaje isie mie¬ szajac 93 mg chlorowodorku NiJN-dimetyloHjff-ala- miny, 0,25 mil trietyloalminy oraiz 0,16 ml azydku diestru fenylowego kwasu o^fosforowego i pozo¬ stawia nia lf2 godzin do (pirzereagowania.. Dalszy tok postepowania jak w przykladzie I. Otrzymuje sie 2157 mg estru metylowego N-/N,|NHdimety- loH^-alanyloZ-amfoterycyny fi o Ej cm =l!370 pirzy 882 inm, co etanowi 83|°/o wydajnosci teoretycznej.IC50 f= 0,1 ^wg/tani idSaccharotmiyoes cerevisiiae); IC50 1— 0,12 ^agyiml (Candida albicans); EH50 = 20 W celu otrzymania rozpuszczalnej w wodzie so¬ li z kwasem L-askorhinowym zawiesza isiie 207 mig estru metylowego N^;,;N^imetyllo^-aiamylo/-am- foterycyny fi w 6 mil wody, dodaje kroplami roz- tyór- 35 mg ikwasu LHasiko^biinowego w 4 ml wo¬ dy i po calkowitym rozpuszczeniu zawieszonego osadu przy pomocy nadmiaru acetonu wytraca sie osad, który odwirowuje sie, porzemywa aceto^ nem, eterem etylowym i suszy w eksykatorze próz¬ niowym. lOtrzyimiuje siie 223 img, L-asikoirlbilnianiuestru metylowego !N-/N^N-diirnetytlo^^alanylo/-amfoitery- cyiny fi o EJ'(!m != 1180 pirzy 38)2 nmA co stanowi 9)3P/q wydajnosci teoretycznej w stosunku 'do wol¬ nej zasady. IC50 = 0,114 ^g/lml (Saoaharomyces ce- revdisiae); IC50 l= 0,17 pgfonl (Candida albicans); EH50 = 30 /*g/ml, ¦¦ 1 Przsyklad IV. Do roztworu 2f80i mg estru me¬ tylowego) amfoterycyny fi o Eicm ~ 1560 przy 382 min w 10' ml N,N^diimetylofoa^ma(midu schlo- (dzonego w lazni z lodem dodaje sie mieszajac 2848 165 mg dichlorowodorku NB,iN2,.N6,N6-tetraimetylo-L- f '-(lizyny. 0,34 iml trietyloamiiny oraz 0,17 iml azydku diiestru fenylowego kwasu oi-fo&forowego i pozo¬ stawia do przereagowania na 12 godzin. Dalszy tok 5 postepowania jak w przykladzie I. Otrzymuje sie 228 mg estru .metylowego iN-/N2^^4,N4*tetraimety- lo-L-lizylo^-amfoterycyny fi o Ej ^m = la4:0 Przy $812 nmj, co istanowi eSP/o wydaijnpisci iteoretycznej.^Cso = 0,2 pg/ml (Sacciharomiycest cerevisiiae); 1(f IC50 ;= 031'7 po/toA (Candida albicans 1^40); EH50 = = 35 ^gAnl- " W celu otrzymania rozpuszczalnego' w wodzie L^aispairagiindanu estru metylowego N-y^jN^N8^6- -tetrametyloi-L^lizylioi/-amifoter'yicynjy^ ¦poisitepuje sie 15 analogicznie, jak, w przykladzie I, stosujac pro- poircje sulbstratów: 2 mole kwas LHasparaginowego' ma- 1 mol estru.Przyklad V. 470 mg estru metylowego ny- statyny o E }0,° = 860 przy 304 nm rozpuszcza sie 20 w 10 ml Ni^N-dimety^lofor.maimlildu i is,clhladza w la¬ zni z lodem. Do roztworu dodalje sie mieszajac 140 img chlorowodorku N^N^diimetylogiicyny, 0,4fi ml triistyloaminy oraz 0,26 ml lazydku diestru fenylo¬ wego ikwasu o-fosforowego i poiapstawia ina 12 go- . dzin do przereagowania. Dalszy tok postepowania jak w przykladzie I. Otrzymuje islile 333 img estru metylowego N-iAN5N-di)metyloglicyloi/Hnystatyny o E 1 cm = 81^ przy 304 nm, co stanowi 65l%! wydaij- so nosci teoretycznej. IC50 = 0„4 /^g/ml (iSaccharomy- ces "cerevis:iae); IC50 = 0,36 //g/ml ^Candida albi¬ cans 1440); EH5a = 1150 ygfml.Przyklad VI. li,2 g 3-f/N^N-dinTietylo'amitno/-pro- pyloamidu auneofacyny o E11c°m= 700 przy 379 nm 35 roiztpuiszcza sie w 20 ml N,N^dimetylotormamidu i schladza w lazni z lodem. (Do roztworu dodaje sie 0,28 chlorowodorku NjN^dimetylogilicynyl, 0,84 ml trietyloamiiny oraz 0,4J6 ml azydku diestru feny¬ lowego kwaisu o-fosforowegioi. Mieszanine reakcyj- 40 na pozostawia do przereagowaniiia przy ciaglym imiieszainiu. Nastepnie dodaje sie 60 ml acetonu ,i wytraca osad przy .pomocy nadmiaru eteru etylo¬ wego. Osad odwirowuje sie^ przemywa eterem etylowym i siusizy w elksylkaltorze iprózniowym, a 45 nastepnie rozpuszcza w n-butamolu, a' warstwe n- 4)utanolowa przemywa kilkakrotnie woda. iRoztwór m-^butanolowy zageszcza sie do1 .malej objetoscdi pod zmniejszonym cisnieiniem' i przy po¬ mocy eteru etylowego wytraca osad,, który odwi- 50 rowuje sie, przemywa eterem etylowymi i suszy w eksykatorze prózniowym. Otrzymuje sie 1,03 g su¬ rowego produktu. Produkt oczyszcza sie na dro¬ dze ekstrakcji przeciwpradowej w aparacie Craiga stosujac mieszanine rozpuszczalników: chloroform, 55 metanol i 0,'5!% roztwór wodny dhlorlcu sodu w stosunku objetosciowym 2:2:1. Frakcje zawiera¬ jace produkt koncowy laczy sile, odparowuje z nich chloroform i metanol pod zmniejsizoriym cisnieniem, a pozostalosc rozciencza woda i poddaje ekstrak- 60 cji n-butanolem., Warstwe n-butanolowa przemywa sie woda az do zaniku jonów cMorkowych (test z azotanem srebra), a nastepnie zageszcza do malej objetosci pod zmniejszonym cisnielndiem i wytraca osad nadmiaru eteru etylowego. Osad odwirowuje $5 sie, przemywa kilkakrotnie etereim etylowym i soi-9 szy w eksykatorize prózniowym. Otrzymuje sie 0,66 g 3-yNrN-d'imetyloamino/-piropyl^^ NVN,N^dft- metyloglicyloi/^aureoiacyniy o E}0/*m = 780 przy 379 nin% oo starcowi 51% wydajnoscii teoretycznej.IC50 = 0,0002 ^g/mtt (Saccfharomyces, cerevisiaie); IC50 = 0,0003 jig/mfl. (Candida allbicans 1440);.EH50 \= 31 pglml.W celu otrzymania rozpuszczalnej w wodzie soli • 3-W,N-diJinetyloaimirK/ip^opaloamiildii N-ZN^N-dirnie- tyloglicylo/-aureo£acyny zawiesza sie 257 img tego zwiazku w 5 ml wody, 'dodaje krojplami roztwór 54 mg kwasu L-asparagimoiwego iw 4 nil wody i pozostawia ara kilka minut mieszajac. Nastepnie dodiaije Sie acetonu do calkowitego rozpuszczenia soli. 'Produkt wytraca sie nadmiarem miieszainiiiny acetonu i eteru etylowego w istoisuniku 1:3, odwi¬ rowuje sie, przemywa mieszanina acetonu i eteru etylowego1 w stosunku 1 :3, eterem etylowym i su¬ szy w eiKsykatoflnze prózniowym. Otrzymuje sie 280 tmg L-asparagiaidaniu 3-/N,N-idiimetyloam!ino/-propy- loamidu N-^lN,NHd,imetyloglicylo/-a,ujreiO[facyny o E 1 cm = ®%Q P^zy 379 mma. co Etanowi 90% wy¬ dajnosci teoretycznej w stosunku do wolnej za¬ sady. IC50 = 0,002 /*g/ml (Saccharomyces cerevi- siae); IC50 1= 0,003 //g/ml (Candida aibicans 1440); EH50 = 60 -/AghaL- Przyklad VII. 1,2 g 3^/N,N-dimetyloaimiaioj/-lpiro- ipylloamldu aiureotfacyny 01 E^m = 700 iplrzy 379 rozpuszcza sie w 20 ml N,N^taetyloformaimlidu i po schlodzeniu w lazni z lodem dodaje mieszajac 0,31 g chlorowodorku NsN^dimetyio-^-ial^niiny. 0,84 ma trietyiloamLniy.oraz 0,46 ml azydku diestru fe- mylowego kwasu o-fosforowego i pozostawia do przereagowainiia. Dalszy tok postepowantila jak w przykladzie VI. Otrzymuje sie 0,72 g S-ZN^N-dime- tylo^minoZ-propyloamidu N-i/N,N-diinxetylo-^-aianiy- loMiureofacyny o E/0^ = 770 przy 879 nmi, co stanowi 56P/o wydajnosci teoretycznej. IC50 — '= 6,0006 fug/ml (Saccharomycies cerevnsiae); IC50 — = 0.OG04 //g/rnl (Candida afllbicans 1440); EH50 = 13. //g/lml. - Przyklad VIII. 368 mg esitru metylowego au- reofacyny o Ej1^ = 1080 przy 379 .nm rozpuszcza slie w 5 mJl N,N-ddmety!loiformaimidu i .po schlo¬ dzeniu w lazni z lodem dodaje mieszajac 11'5 mg chlorowodorku N;NJdimetylo-^-alaniny,, 0,2i8 ml trietyloaminy oraz 0,18 ml azyldku diestru fenylo- wego kwasu o-fosforowego i pozostawia do prze- reagowamia. Do roztworu dodaje sie 1'5 ml aceto¬ nu ii wytraca osad nadmiarem eteru etylowegot Osaid odwirowuje sie, przemywa kilkakrotnie ete¬ rem etylowym, suszy w eksykatorze prózniowym i. rozpuszcza w niewielkiej ilosci m/ieszaniiny 'meta¬ nolu i N,N-dLmetyMormia:midu w stosunku 3:1 oraz nainiosi na kolumne wypelniana zelem SephaT dex LH-20, zawieszonym, w metainiodu (110 cm .X IX; 3,6 cm). Produkt eduuje sjie z kolumny meta¬ nolem. Frakcje zawierajace produkt laczy sie, za¬ geszcza do malej objetosci pod zmniejszonym ci- sniendem ii dodaje eteru etylowego 'az do wytra¬ cenia osadu". Osad odwirowuje sie., przemywa ete¬ rem etylowym i suszy iw eiksykatorze prózniowym.Otrzymuje siie 327 mg estru metylowego N-t/NjN-dL- . 2 848 10 metylo-J(?-ala(nylo1/-aureo£acynjy o E J°cm =1025 przy 379 nm, co stanowi 8.11% wydajnosci teoretycznej.IQo = 0,0003 /ig/ml (iSacdharomyces cerevisfliae); JC50 = 0,0OQi3 ^g/ml iflCandida albicans 1440); 5 EH50 = 7 ^giym'1.¦ - Przyklad IX. 356 ^mg peomycyny o E} cm = 1= 805 przy 379 nm rozpuszcza sie w 6 ml N,,N-dii- metylóformamidu i schladza w laznli z lodem. Do roztworu dodaje sie mieszaijac 115 img chlorowo¬ dorku N,'N^dimetylo-jffHalandlny, 01,28 ml trietyioami- ny oraz 0,18 ml azydku diestou fenylowego ikwa,- su o^fosforowiego i pozostawia -do przereagowania, Dallsizy tdk postepowanlia jak w przykladzie VIII. ._ Otrzymuje sie 306 img N-yN;jN-idimetyloi-^-alan;y- • l°/o lo/iperiimycyny o Ex cm = 7115 przy 379 nim, co stanowi 78!% wydajnosci teoretycznej. IC50 = 1= 0,0003 //g/ml (Sacoharpmyces cereviiiaiae); IC50 ^ = 01,0003 i^ta/ml XCamdida allbicaos ,1440); EH50 = 3 20 yogjlml.Przyklad X. 105 mg chlorowoidlorku N,N-di- metyloglioyny rozpuszcza isie w 6 ml NiN-ditaety- loformamidu, dodaje 159 mg dicyMoheksylokaribo- diimidu oraz 87 mg N-hydroksysiikcynoimidu i po- 25* zolstaiwiia na 12 godzin do przereagowanlila1. Powsta¬ ly oisad oidsacza sie, przemywa N^N^imetyloforma- midem i przesacz dodaje do roztworu 3i50 mg elstiru metylowego amcBoterycyny fi o Ex ^m = 1960 przy 382 im w 6 ml N,N-dilmetyiloformamdidu z do- 30 datkiem 0,11 ml trietyloamdiny. Calosc 1!2 godzin w temperaturze piokojowej., P01 przere- agowalniu do mieszaniny dodaje sie eter etylowy az 'do wytracenia osadu, który odwiiirowuje sie, przemywa ietere.m etylowym ii suszy w eksykato- 35 rze prózndowym. Osad rozpuszcza sie w n-buta- nolu przenosi do rozdzielacza i przemywa woda do pH 7. Warstwe nHoultanolowa zageszcza pod zmniejszonym cisnieniem fio nialej ofbjetosci w temjpieraturze poiniilzej 40°;C ii eterem etylowym wy- 40 traca surowy produkt, który odwirowuje sie, prze¬ mywa eterem etylowym i suszy w eiksykatorze prózniowym. Produkt oczyszcza sie metoda roz¬ dzialu przeciwpradowego w aparacie Craiga w mieiszantinie irolzpusizczajlników dMoroform : metanol: 45 :woda 2:2:1. Otrzymuje sie 266 mg estru metylo¬ wego Nn/N,N-diimetyloglicydo/-Tam[fo;terycyny fi o E }°cm =; 1360 przy 382 mm, co stanowi, 7(^/0 wy¬ dajnosci teoretycznej. .IC50' 1= 0,12 ^gi/ml (Saccha- "romyces cerevisiae); IC50 1= 0,11 IjUig^ml (Candida 50 allbicans 1440); EH50 '= 30 ^gjlml.Przyklad XI. ll!5k2 mg chloroiwodorku N,N- diiimetylo^-alaniny rozpuszcza' sie w 15 inO. N,N- -dimetyioacetamidu, dodaje 159 mg dicyMoheklsylo- 55 karbodiimidu oraz 87 mg N-hydiroksysukcyrioiimd- idu i ,pozio)stawia do przereagowania na 12 godzin.Powstaly osad Oidsacza sie ,przemywa niewielka iloscia .N;iN^dimetylio:acetamidu, a przesacz dodaje db roztworu 377 mg S-yNjN-dLmetyloiamliiniO^-propy- 60 lamidu kandydyny o Li°cm' = '14150. przy '382 mn w 8 ml N,N-dimetyioacetamidu z dodatki'em 0(,11 mi trietyloamiiny. Calosc miiesza sie przez 12 go¬ dzin w temperaturze pokojowej.. Dalszy tok poste¬ powania jak w ^przykladzie X. Otrzymuje sie 298 .65 mg 3-/N,NHdiorietyl'Oamino/-propy!loa^idu N-/N,N-142 848 11 -dimetylo-/?-alanylo/-kandydyny o E^ = 1300 przy 382 inim), co stanowi T2P/& wydajnosci teoretycznej, IC50 i= W® &wgtór (Saiooharomyioes carevisiae); IC50 = 0,17 yUigi/ml (Caindida alfbiicaos 1440); EH50 = = 22 ^g/md. 12 Zastrzezenia patentowe 1. Sposób otrzymywania inowych pochodnych N- -/NjN-dimetyloamiino/-acylowych estrów 'metylowych IC5o[gtoil] Nr. prz.ykl. " 1 ~ - Nazwa produktu1 koncowego E 1% 1 cm Sacchatrom. Cahdida icereviisiae aMc. 1440 EH50 liug/ml] 2 xm , ester metylowy 1400 N-/TSr,N-dimetyloHD-aliainyao/-ka!n^ (382nm) XIX 3-^N-dimetyloaiminoi/propylo- 1300 amid N-yiN.N-diimietylo-lD-adainyao/1- (382nm) -kaindycydyny 0,20 oft2a 25 XX Sn/NjN-dirnetyloaimiiino/^propyloiai- 1210 mid N-yN,N-dirmetyllo-L-fein'yJoaila^ <382nm) nylioZ-amfoterycyiny ifi 0,18 0,16 35 Nr przylci. otrzym.- XUII XIV XV XVI XVII XVIII dydyiny* ester metylowy Nn/N,N^dimetylo-L-fenyloalanylo/- -amfoterycymy fi ester metylo'wy N-/N,N-dimetylo-L-walilo/-poli- funginy ester metylowy N-/N,N-d,iimetyllo-L-,aiLainjylo/kaiiidy- cydyny** ' ester metyllowy N-/N2,NB,N4,Nf-tetra!metyio-L-2,4- -diaimmoibutyrylo/Haureoifacyaiy*** ester metylowy NVN,N-dimety:lo-a(lanylo/Hny£ita- tyny ester metylowy N-/N,N-dimetylogMcyfloi/Hkandy- cydyny 1290 (382inim) 790 (3l04nim) 980 (379nm) 980 <679nm) 800 ,(304mm) 960 (379nm) 0,17 0,16 0,35 0,0004 0,0002 0,38 0,0003 0,17 0,15 0,56 0,0004 0,0002 0,45 0,0005 15 26 85 7 3 97 8 I I I VIII VIII X X II II XXI 3-/N,N-dimeitylioaiminjo/-iproipyloiai- 1310 mid N-/N,N-diimeityilo-L-walilo/- i(382»nim) -a 22 II XXII 3H^,N-dimietyloamiinoi/pro:pylo- 900 amiid N-,/N2rN2,N4,N4-teltrametylo- (379mm) -L-2,4-diamitnO'biityryilo/-aureofa- XXIII XXIV cyny 3-rtNi,'N-dimetyloamiino/propylo- amid N-/l^,N^N^NMe1xaimetylo;- -L-lizylo/-ikandycydyny 3-^N|,N-dmietyloaminoi/piropylo- amid N-^W^-diimetylo-^-aJlianylo/- -inystatyiny ' 820 (379nm) 730 (304nm) 0,;0OO5 0,0008 0,4 0,0004 0,0006 Q,4 16 12 100 ¦VL VI XI * — kandydyna jest trójskladnikowa imieszainina, w sklad 'której wchodzi kaindydyniaj, kamdydoina, i kam- dydyTiinu ** — kandycydynia jest synonimem leworyny *** — atoeofaicyna jest syinoniiirneim patrycyny Prizyklad XII—XXIV. Aoallogiczinie jak w przykladach I—XI otrzymano nastepujace poclhod- ne N-/N,N-.dimetyloamino/^propy'loa!midów makroiM.- dówx polienowyeh), ipinzedstawione w taibeli: i' Sn/lNjN-dimetyloaminoi/ipropi^oalmidów maikroli- dów poiienowych o wzonze ogólnym' pnzedstawio- nim na~ rysunfcu, gdzie R oznaczai reszte zwiaza¬ nego amldowo z grupa aminowa amdiniocukru ma-13 142 848 14 krolidu polienowego, aminokwasu o lancuchu pro¬ stym lub rozgalezionym, w którym laitomy wodo- ru grupy wzglednie grup airniinlowych w poizycji a, $, y i dalszych w stosunku ido grupy karbofcsy- ilowej aminokwasu podstawione sa grupami mety- Lowymi, o 'dowolnej 'konfjguracjii, M oznacza reszte maikrolidu poMieoowego, zas X oznfaiczia grupe meto- ksylowa w estrze makrolidu polienowego lub re- sizte 3-i/N,,N-'dimieityloamdino/-propyQoiamii;ny, której I- rzedowa grupa aminowa zwiazana jest amido- wo z grupa karlboksylowa ma!krolidu polienowego, znamienny tym, ze na ester metylowy wzgiledroie 3H/N)3NHdiimetyloaimmo(/-!p]X)!P'yJl^ makrolidu po¬ lienowego,, w srodowisku rozpuszczalnika lulb ich mieszaniny i w obecnosci substancji wiazacej kwa&, daMa isie niewielkim nadmiarem N,N-dimetydoaimii- nokwasu z grupa karboksylowa, aktywowana azyd¬ kiem diestru fenylowego kwasu o'-fosforowego lub N-hydroksy&ukcynoimidem w obecnosci dicyklo- heiksylokarbodiimidu, calosc pozostawia do przere- agowania, a nastepnie z miesizandny poreakcyjnej 10 15 20 wytraca eterem etylowym' surowy (produkt konco¬ wy, oczyszcza sie go i ewentualnie przeprowadza w sól. 2. Sposób wedlug zaostrz. 2, znamienny tym, ze stasuje sie ester metylowy lulb 3-i/N,N-dimetyloami- nq/-propyloaimid nastepujacych, makrolidów poile- nowycih: amfoterycyny B, kandydyny,, mykohepty- nyi, nystatymy, polifungiiny, aureofacyny, kamdycy- ~ny. 3. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze stosuje sie N,NHdimetyllowe podhodne nastepuja¬ cych aminokwasów: glicyny], ^alianijmy, D-aianiny, Lnalaminy, L-fenyloalaniny, L-lilzyny, L-Waldny oraz kwasu L-2,4-diammomaslowego. 4. iSposób wedlug zastrz. % znamienny tym, ze jako rozpuszczalniki organiczne stosuje isie N,N-di- metylotfotrmamid, N,N^dimetyloacetamid, N^N-dime- tylosulfo'tlemek lub ich miieszanine. 5. Sposób wedlug zatstrz. 2, znamienny tym, ze jako substancje wiazaca kwas stosuje sie triety- loaimiine. • ' R-Cf „ ,0 VNH-M-C( PL