Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania koniugatów immunoglobullny, które sa zwiazkami nowymi i wykazuja wlasciwosci farmaceutycznie uzyteczne, a zwlaszoza aktywnosc oytostatyozna.Grupa zwiazków, które sa zwiazkami cytostatycznymi i sa szeroko stosowane w leczeniu raka, sa alkaloidy Ylnoa /indolo-dwuwodóroindolowe/ 1 otrzymywane z nioh leki* Chemoterapeu¬ tyczne zastosowanie tych leków niekiedy ogranlozaja, pod wzgledem efektywnosoi, niepozadane objawy oboczne u paojenta i przedmiotem wielu prac badawczych byty usilowania zminimalizowa¬ nia tych dzialan* I tak np*, w brytyjskim opisie patentowym nr 2 090 837 opisano koniugat windezyny, jednego z leków alkaloidowych Ylnoa wzmiankowanych powyzej, w którym ugrupowanie windezyny jest przylaczone bezposrednio w pozyoji 3 czasteczki windezyny* W przypadku, gdy immunoglobulIna stanowi przeciwcialo, koniugat gromadzi sie w miejscu dzialania ze zmniej¬ szeniem toksyoznego wplywu na inne tkanki oraz z potencjalnym zmniejszeniem niepozadanych objawów ubocznych u pacjenta* Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania nowego konlugatu zawierajacego ugrupowanie alka¬ loidu Ylnoa kowalenoyjnie zwiazane w pozyoji k grupa o wzorze - OC0KCO-, w którym X oznacza grupe alkilenowa o 1-4 atomaoh wegla, z immmunoglobulina lub fragmentem immunoglobullny. No¬ wy koniugat jest poohodna alkaloidu Ylnoa, takiego jak 4-aoetoksylowy lub ^-hydroksylowy przw- oiwn owotwórowy dlmeryozny alkaloid indolo-dwuwodorolndolowy 1 moze zawierac jedno lub wieoej ugrupowan Ylnoa zwiazanyoh kowalencyjnie* ' ImmunoglobulIna, lub jej fragment, jest przec iwo lalem, lub fragmentem przeciwciala, z wlasciwosciami rozpoznawania antygenu. Korzystnym materialem immunogl obulInowym jest prze- oiwoialo lub fragment przeciwciala zaadoptowany do rozpoznawania antygenu na powierzohnl niepozadanych komórek typu wystepujacego w oiele ludzkim* Tym niemniej materialy immunoglo- bulinowe innyoh rodzajów takze objete sa zakresem wynalazku, jezeli moga one zostac uzyte do leczenia zwierzat oraz do eksperymentów kontrolnych i badawozyoh*2 ikk 887 Koniugaty wytwarzane sposobem wedlug wynalazku, sa uzyteczne, miedzy innymi, w lecze¬ niu róznyoh postaoi nowotworu. Zwiazki te sa potencjalnie skuteczniejsze i daja mniej obja¬ wów ubocznyoh z racji ich wlasciwosci powodowania zwiekszania stezenia leku cytostatyczne¬ go w miejscu dzialania* Zwiazanie ugrupowania leku grupa przerywnikowa -OCOXCO- czesto u- latwia otrzymanie wiekszego stezenia leku na imraunoglobulinie, a tym samym zwieksza sku¬ tecznosc koniugatu. Wynalazek obejmuje swym zakresem takze koniugaty do uzycia w sposób bez¬ posredni, w którym mozna je zastosowac do rozpoznania przeciwciala swoistego wobec antyge¬ nu powierzchniowego komórki.Bardziej szczególowo, koniugaty wytwarzana sposobem wedlug wynalazku mozna przedsta¬ wic wzorem 1, w którym Ig oznacza immunoglobuline lub fragment immunoglobuliny, X ma wyzej 1 2 podane znaozenie, R oznacza grupe COOH, COOC. alkil lub CONH , R oznacza CH_ lub CI10, 5 3 k -* * -* R oznacza H, jeden z podstawników R i R oznacza etyl, zas drugi H lub OH* Immunoglobu- lina lub jej fragment, moga byc zmodyfikowane Jedna, lub kilkoma, resztami alkaloidu Yinoa.Niektóre z dobrze znanyoh alkaloidów Yinoa, z których otrzymuje sie koniugaty wytwa¬ rzane sposobem wedlug wynalazku, zawieraja, np. ugrupowanie alkaloid owe Vinoa o wzorze 1, w którym w pozycji k moga znajdowac sie rózne podstawniki, tak jak w przypadku winblasty- 1 2 3 4 ny, gdy we wzorze R oznaoza grupe COOCH-, R oznacza metyl, R oznacza hydroksyl, R oz¬ nacza etyl, R oznacza wodór, a podstawnikiem w pozycji k jest grupa acetoksylowa, w przy- 12 3 padku windezyny, gdy we wzorze R oznacza CONH_» R oznaoza metyl, R oznaoza hydroksyl, J4 K 2 R oznaoza etyl. R oznacza wodór, a podstawnikiem w pozycji k jest grupa -OH, w przypadku 12 3 k winkrystyny, gdy we wzorze R oznaoza COOCH • R oznaoza ferwyl, R oznacza hydroksyl, R oznaoza etyl, R oznaoza wodór, a podstawnikiem w pozycji k jest grupa acetoksylowa, w przy- 1 2 3 *l padku leurozydyny, gdy we wzorze R oznaoza COOCH , R oznacza metyl, R oznaoza etyl, R 5 - , oznaoza hydroksyl, R oznaoza wodór, a podstawnikiem w pozycji 4 jest grupa acetoksylowa, 1 2 w przypadku VLB *An /4'-dezoksywinblastyny/, gdy we wzorze R oznaoza grupe COOCH , R oz- 35 k ? naoza metyl, R i R oznaozaja wodór, R oznaoza etyl, a podstawnikiem w pozyoji k jest grupa acetoksylowa. w przypadku VLB NHn /^'-dezoksyleurozydyny/, gdy we wzorze R oznaoza 2 3 *l 5 grupe COOCH , R oznaoza metyl, R oznaoza etyl, R oznaoza wodór, R oznacza wodór, a pod¬ stawnikiem w pozyoji k jest grupa acetoksylowa, w przypadku leurozyny, gdy we wzorze R oz- 2 3 ** 5 naoza grupe COOCH 9 R oznaoza metyl, R oznaoza etyl, R i R razem tworza pierscien tlen¬ ku etylenu, a podstawnikiem w pozyoji k jest grupa acetoksylowa i w przypadku leuroforminy 1 2 1 /N-f ormyloleurozyny/, gdy we wzorze R oznacza grupe COOCH , R oznacza formyl, R oznaoza etyl, R IR razem tworza pierscien tlenku etylenu, a podstawnikiem w pozyoji k jest gru¬ pa acetoksylowa.Odnosniki literaturowe dla macierzystych alkaloidów pochodnych *l-dezacetylowych sa na¬ stepujace: leurozyna - opis patentowy Stanów Zjednoczonych nr 3 370 057, VLB - opis paten¬ towy Stanów ZJednoozonyoh nr 3 097 137, leurozydyna /winrozydyna/ i leurokrystyna /winkry- styna/ - dla obu opis patentowy Stanów Zjednoczonych nr 3 205 220, dezmetylo - VLB opis patentowy Stanów Zjednoczonych nr 3 35^ 163, windezyna i inne 3-karboksyamidy - opis paten¬ towy Stanów Zjednoozonyoh nr k 203 898, kwas winblastynowy, kwas winkrystynowy itd. - opis patentowy Stanów Zjednoczonych nr k 012 390, 4'-eplwLnkrystyna - opis patentowy nr k 1^3 0*t1, leuroformina, formyloleurozyna - opis patentowy nr k 279 816 oraz dezoksy-VLB "A" i "BH /Tetrahedron Letters, 783/1958-/* Inne alkaloidy Yinoa ujawnione sa w opisach patentowych Stanów Zjednoozonyoh nr k 166 810 i RB 30 56O.Immunoglobuliny swoiste wobeo antygenów na powierzohni komórek przeznaczonych do zni¬ szczenia, a takze sposoby Loh otrzymywania z surowioy zwierzat uodpornionych, albo za po- * moca prowadzenia hodowli hybridoma wydzielajacych produkty monoklonalne, sa dobrze znane.Korzystnym rodzajem przeciwciala do stosowania w sposobie wedlug wynalazku Jest' immunoglo- bulina klasy IgG. Niektórymi reprezentatywnymi immunogl obullnami sa nastepujace mono- lub poliklonalne przeciwciala wobeo: 1/ ludzkich lub zwierzeoych antygenów zwiazanych z nowo¬ tworami, /II/ ludzkich antygenów komórek B i T, /III/ ludzkich antygenów la, /IV/ antyge¬ nów wirusów, grzybów lub bakterii, /V/ komórek zaangazowanyoh w ludzkich reakcjach zapal¬ nyoh lub alergioznyoh.ikk 887 3 Z korzystnych przeoLwoial przeciw antygenom zwiazanym z ludzkimi i zwierzecymi nowotwo¬ rami mozna wymienic nastepujace: /i/ Ig kóz lub baranów uodpornionych antygenem karoyno-em¬ brionalnym, /li/ Ig z surowicy królika przeciw ostrej bialaczce 1imfoblastycznej, /III/ Ig z immunosurowio róznych naozelnych przeciw ostrej bialaczce 1imfoblastycznej, ostrej biala¬ czce meloblastycznej, przewleklej bialaczce 1imfoblastycznej i przewleklej bialaczce szpi¬ kowej, /IV/ Ig kóz lub baranów uodpornionych materialem z raka pluc, /V/ monoklonalna Ig z mysich hybridoraa wydzielajacych przeoiwolala przeciw ludzkiemu rakowi okreznioy 1 odbytnicy, /VI/ monoklonalna Ig z mysich komórek hybridoma wydzielajacych przeciwciala przeciw ludzkie¬ mu czerniakowi, /VII/ monoklonalna Ig z mysich komórek hybridoma wydzielajacych przeoiwola¬ la reagujace z ludzkimi komórkami bialaczkowymi, /VIU/ monoklonalna Ig z mysich hybridoma wydzielajacych przeoiwolala reagujace z ludzkimi komórkami nerwlaka niedojrzalego, /IX/ mo¬ noklonalna Ig z mysich hybridoraa wydzialajacyoh przeciwciala reagujace z ludzkimi komórkami raka sutka, /X/ monoklonalna Ig z mysich hybridoma wydzielajacych przeciwciala reagujace z ludzkimi komórkami raka jajnika, /XI/ monoklonalna Ig z mysich hybridoma wydzielajacych przeciwciala reagujace z ludzkimi komórkami miesaka kosci, /XII/ monoklonalna Ig z mysich hybridoma wydzielajacyoh przeciwciala przeciw rakowi pluc.Jak wskazano w powyzszej czesci opisu, koniugat mozna takze wytworzyc z udzialem frag¬ mentów inmunoglobulin, takich jak Fab, Fab' lub F/ab'/2? wzglednie monomer IgM, otrzymanych z przeciwciala za pomoca np* trawienia enzymem proteolitycznym* Materialy te i sposoby ich wytwarzania sa dobrze znane i mozna zauwazyc, ze korzystnymi enzymami proteolitycznymi sa pepsyna i papaina* Korzystnymi koniugatami wytwarzanymi sposobem wedlug wynalazku sa te koniugaty o wzorze 12 3 1. w którym R oznacza COOMe lub CQNHQ, R oznacza metyl lub forrayl, R oznacza hydroksyl, h 5 A R oznacza etyl i R oznacza wodór, szczególnie koniugaty otrzymane z dezacetylowinblasty- ny i windezyny. Korzystna grupa hydrofilowa o symbolu X stanowi C .-alkilen, a Ig korzyst¬ nie oznacza monoklonalne przeciwcialo przeciw antygenowi nowotworu ludzkiego lub zwierzece¬ go.Koniugaty wytwarzane sposobem wedlug wynalazku mozna otrzymywac za pomoca poddania Lm- munoglobuliny lub fragmentu immunoglobuliny reakcji z pochodna pólkwasowa zawierajaca ugru¬ powanie alkaloidu Yinoa z grupa o wzorze -OCQXCOZ, przylaczona w pozycji k, w którym to wzo¬ rze X oznacza wiazanie lub ewentualnie podstawiony lancuch o 1-10 atomach wegla, a Z oznacza grupe opuszczajaca* Bardziej szczególowo, sposób wedlug wynalazku obejmuje poddanie immunoglobuliny lub fra- \ 2 3 k 5 gmentu immunoglobuliny reakcji ze zwiazkiem o wzorze 2, w którym X, R f r f r f r IR ma¬ ja znaczenie wyzej podane dla rodników we wzorze 1, a Z oznacza grupe opuszczajaca* V powyzszym wzorze 2 Z onacza grupe opuszozajaca, która moze byc jakakolwiek dobrze zna¬ na grupa stosowana w chemii peptydów w celu utworzenia kowalencyjnego wiazania amidowego /-CONH-/ miedzy koniugatem a wolna grupa aminowa czasteczki immunoglobuliny lub fragmentu* Grupy takie znane sa dobrze w tej dziedzinie techniki i sa omówione np* w "Peptide Synthe- sis", M. Bodanszky, Y.S. Klausner i M.A* Ondetti, wyd. II/1976/, wyd* John Viley and Sons, zwlaszcza na stronach 85-136* A wiec Z moze oznaczac grupe azydowa /-No/, atom chlorowca. 7 7 taki jak atom bromu, a zwlaszcza ohloru, grupe acyloksyIowa o wzorze R' CO.O, w którym R oznacza reszte alifatyczna lub aromatyczna, taka jak grupa C .-alkilowa, grupa alkoksylowa, korzystnie C -alkoksylowa, lub aryloksylowa, grupa metanosulfonyloksylowa, tosyloksylowa lub benzenosulfonyloksylowa, rodnik imidazolilowy lub reszte pochodnej N-acylohydroksyloa- miny, np* wtedy, gdy Z oznacza grupe sukoynimidoksylowa, ftalimidoksylowa lub benzotriazoli- 1oksyIowa. Przykladowymi korzystnymi tego rodzaju zwiazkami, sa zwiazki, w których wzorze Z oznacza reszte N-acylohydroksyloaminy, takie jak estry N-hydroksysukoynimidowe, wytworzone z uzyciem metylo-p-toluenosulfonianu 1-cykloheksylo-3~/2-morfolinoetylo/karbodwuimidu lub 1,3~dwucykloheksylokarbodwuimldu9 lub poprzez mieszany bezwodnik, taki jak otrzymany przy uzyciu chloromrówozanu izobutylu* V przypadku gdy Z oznacza rodnik imidazolilowy, mozna go wytworzyc stosujac karbonylodwulmldazol, a w przypadku gdy Z oznacza grupe o wzorze R C0*0,k \kk 887 w którym R oznacza C -alkil, w szczególnosci etyl 1 izobutyl, mozna go wytworzyc przez zastosowanie, odpowiednio* 1-etoksykarbonylo-2-etokey-1,2-dwuwodoroohinoliny i ohloromrów- ozanu izobutylu* Zwiazki o wzorze 2 wytwarza sie za pomoca poddania odpowiedniego wolnego kwasu, w któ¬ rego wzorze 2 Z oznacza OH, reakcji z odpowiednia czasteczka aktywujaca w srodowisku roz¬ puszczalnika obojetnego, takiego jak dwumetyloformamid i korzystnie w temperaturze od -20 C do 75 C* Wolne kwasy, w których wzorze Z oznacza Oli, wytwarza sie zgodnie z nastepujacy¬ mi sposobami: Najpierw wytwarza sie odpowiedni if-dezaoetyloindolodwuwodoroindol metoda ta¬ ka jak metoda Hargrove'go podana w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych nr 3 392 173* Na¬ stepnie zwiazek 4-dezacetylowy acyluje sie bezwodnikiem kwasu karboksylowego o wzorze 3, w którym X ma wyzej podano znaczenie. Alternatywnie, mozna stosowac grupe acylujaoa o wzorze 12 1 2 Z CQXCOZ , w którym Z oznacza grupe aktywujaca, a Z oznacza grupe zabezpieczajaca grupe karboksylowa, a nastepnie usunac grupe zabezpieczajaca grupe karboksylowa, w wyniku czego otrzymuje sie zwiazek o wzorze 2, w którym Z oznacza OH* Nastepnie przeprowadza sie zwiaz¬ ki tego rodzaju, za pomoca reakcji z odpowiednia czasteczka aktywujaca, w zwiazek aktywo¬ wany* Gdy zamierza sie poddac indolo-dwuwodoroindol reakcji z bezwodnikiem bursztynowym al¬ bo podobnym zwiazkiem w oelu wytworzenia zwiazku o wzorze 2, w którym R oznacza COOH, gru¬ pa esterowa przy C-3, taka jak grupa estrowa przy C-*l, musi byc wpierw poddana hydrolizie, np* w przypadku VLB, kwasu 4-dezaoetylowinblastynowego - patrz opis patentowy Stanów Zjed- noozonyoh nr 4 012 390* Nastepnie, grupa karboksylowa przy C-3 musi zostac zabezpieczona grupa jak podano powyzej. Te pochodna z zabezpieczona grupa karboksylowa /przy C-3/, maja¬ ca wolna grupe hydroksylowa przy C-k poddaje sie, jak wyzej, reakcji z bezwodnikiem* Utwo¬ rzony zwiazek mozna nastepnie poddac obróbce chemicznej w oelu wytworzenia zwiazków odpo¬ wiadajacych wzorowi 2, w którym Z oznacza ugrupowanie aktywujace* z zapewnieniem warunków reakoji obojetnyoh lub zasadowych, dzieki czemu unika sie usuniecia grupy zabezpieczajacej grupe karboksylowa przy C-3* Gdy juz zadana grupa koncowa Z znajduje sie w przewidywanej pozyoji, mozna usunac grupe zabezpieczajaca grupe karboksylowa przy C-3, w wyniku czego o- trzymuje sie zwiazki o wzorze 2, w którym R oznacza COOH* Reakoje immunoglobullny lub fragmentu immunoglobuliny ze zwiazkiem o wzorze 2 korzyst- o nie prowadzi sie w srodowisku wodnym w temperaturze 5-25 C, takiej jak temperatura pokojo¬ wa, w pH 7,5-9,5, korzystnie 8,0-9,0. V wyniku tego prooesu uzyskuje sie przylaczenie wia¬ zaniem kowalencyjnym jednej, lub wiekszej ilosci reszt alkaloidów Yinoa do wolnych grup a- minowych ozasteozki immunoglobuliny, np* grup aminowych pochodzacych z reszt lizyny* Ilosc przylaozonych reszt zalezec bedzie od stezenia substratów reakcji 1 czasu jej trwania, ale srednia ilosc wynosi zazwyczaj np* od 1 do 20, korzystnie od 3 do 1*l* Na przyklad przy prowadzeniu reakcji roztwór zwiazku o wzorze 2 w odpowiednim rozpusz¬ czalniku, takim jak dwumetyloformamid, wkrapla sie powoli do buforowanego roztworu immuno¬ globuliny np* w 0,3*1 M buforze boranowym o pH 8,6* Koniugat wyodrebnia sie za pomooa filt- raoji zelowej i przechowuje w nasyoonyra roztworze siarczanu amonowego, przy czym latwo jest go przeprowadzic z powrotem do roztworu za pomooa dializy wobec roztworu buforowego np* roztworu soli, buforowanego fosforanami p pH 7'*» Alternatywnie mozna go przechowywac w lo¬ dówce w temperaturze k C lub zamrozony np. w temperaturze -20 C.Ocene koniugatu mozna przeprowadzic stosujac dobrze znane metody, takie jak chromato¬ grafia powinowactwa* Skuteoznosc koniugatu mozna ustalic przez liczenie zdolnych do zycia komórek po potraktowaniu zawiesiny komórek nowotworowych koniugatem, lub przez pomiar po¬ bierania trytowanej urydyny* Stezenie bialka i leku oznacza sie przez pomiar gestosci op¬ tycznej roztworu koniugatu przy dwóch dlugosciach fali, np* 270 i 280 nm i powiazanie o- trzymanyoh wartosci z wartosciami dla wolnego leku i nie skonlugowanej immunoglobuliny przy tyoh samych dwóch dlugosciach fali*1^4887 5 Nowe koniugaty otrzymane sposobom wedlug wynalazku sa uzyteczne w leczeniu raków i jako takie korzystnie przygotowuje sie je do uzycia w srodkach farmaceutycznych do iniekcji* Tak wifc srodek farmaceutyczny, taki Jak preparat do wstrzykiwania, zawiera koniugat wytworzony sposobem wedlug wynalazku lacznie z farmaceutycznie dozwolonym nosnikiem lub rozcienczalni¬ kiem, takim jak dobrze znane w tej dziedzinie techniki. Korzystnie srodek ma postac dawki Jednostkowej, przy ozym kazda dawka zawiera tip. 0,01-2 mg skladnika czynnego w stosunku do ugrupowania alkaloidów Vinca.Nowe koniugaty sa skuteczne w szerokim zakresie dawek i np. w leczeniu ludzi doroslych dawkowanie tygodniowe bedzie sie miescic normalnie w zakresie 1-10 mg/kg /ugrupowanie alka¬ loidów Vinca/, czesciej w zakresie 3-9 mg/kg. Tym niemniej nalezy rozumiec, ze ilosc aktua¬ lnie podawanego zwiazku ustali lekarz na podstawie istotnych okolicznosci takich jak stan chorego i droga podawania. Wynalazek objasniaja nastepujace opisy wytwarzania preparatów i przyklady wykonania wynalazku* Preparat 1. 4-sukoynoilodezacetylowinblastyna. 2 g 4-dezacetylowinblastyny rozpuszczono w pirydynie i dodano do tego roztworu 2 g bezwodnika bursztynowego. Mieszanine reakcyjna mieszano w temperaturze otoczenia w ciagu 5 godzin. Reakcje te mozna prowadzic w temperatu¬ rze w zakresie 0-50 C. Skladniki lotne usunieto za pomoca odparowania pod zmniejszonym ols¬ nieniem i pozostalosc rozpuszczono w CH Cl . Warstwe organiczna przemyto 5% wodnym roztworem wodoroweglanu sodowego, a nastepnie woda, po ozym osuszono i usunieto rozpuszczalnik pod zm¬ niejszonym olsnieniem, w wyniku czego otrzymano 4-sukoynoilodezaoetylowinyloblastyne.Powyzszym sposobem otrzymano nastepujace preparaty: 4-sukoynoilowlndezyna, 4-sukcynoi- 1odezacetylowinkrystyna i 4-sukcynollo-4'-epidezoksydezaoetylowinblastyna. Podobny sposób wy¬ korzystano w oelu wytworzenia 4-glutaroilodezaoetylowinblastyny, stosujac zamiast bezwodni¬ ka bursztynowego bezwodnik glutarowy.V kazdym z powyzszych procesów aoylowania, jakiekolwiek przypadkowe zacylowanie grupy -OH przy C-3 mozna odwrócic za pomoca potraktowania wilgotnym zelem krzemionkowym, zgodnie z me¬ toda Hargrove#a, podana w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych nr 3 392 173* Alternatywnie, zwiazki te mozna oczysoic od kazdej pochodnej 3-aoylowej, lub Innych produktów ubocznych re¬ akcji za pomoca chromatografii, dogodnie na zelu krzemionkowym, z zastosowaniem do elucji mieszaniny rozpuszczalników octan etylu/metanol.Preparat 2* Aktywowana 4-sukoynoilodezaoetylowinblastyna. 1 g 4-sukcynoilowinblastyny zmieszano z 380 g N-metylomorfoliny w 20 ml chlorku metylenu, po ozym dodano 390 mg ohloro- mrówczanu izobutylu* Mieszanine reakcyjna mieszano w temperaturze okolo O C pod azotem w ciagu okolo 45 minut. Nastepnie dodano 795 mg N-hydroksysukoynimldu, po ozym mieszanine re¬ akcyjna ogrzewano w temperaturze wrzenia pod chlodnica zwrotna, przy mieszaniu, w ciagu oko¬ lo 45 minut* Nastepnie mieszanine oziebiono i oziebiona mieszanine przemyto woda dejonizo¬ wana, a nastepnie szybko osuszono przy uzyciu Na SO. . srodek suszaoy odsaczono i przesaoz odparowano do sucha pod zmniejszonym cisnieniem.Przyklad 1* Koniugat windezynosukoynoil - królioza IgG. Do roztworu 25 mg 4- -sukoynoilowlndezyny w 0,4 ml suchego dwumetyloformamidu /DMF/ dodano przy mieszaniu 0,3 ni roztworu N-hydroksysukoynlmldu w suchym DMF o stezeniu 11,4 mg/ml, a nastepnie 0,3 ml roz¬ tworu metylo-p-toluenosulfonianu 1-cykloheksylo-3-/2-morfolinoetylo/karbodwuimidu w suchym DMF o stezeniu 41,7 mg/ml. Otrzymana mieszanine utrzymywano w temperaturze pokojowej w ciem¬ nosci w ciagu 48 godzin, w wyniku czego otrzymano roztwór estru 4-sukoynoilowlndezyny i N- -hydroksysukoynimidu o stezeniu 25 mg/ml. 90 ml powyzszego roztworu dodano przy szybkim mieszaniu do 0,9 al roztworu króliozej IgG przeoiwmyslej w 0,34 M buforze boranowym o pH 8,6, o stezeniu 10,7 mg/ml* Otrzymana mie¬ szanine mieszano w temperaturze pokojowej w oiagu 5 1/2 godziny 1 wyodrebniono produkt za pomoca filtracji zelowej na kolumnie o wymiarach 1x27 om /21 ml/ z Bio-Gel P-6 zrównowazo¬ naj roztworem soli, buforowanym fosforanami# Zbierano wyodrebnione frakcje szczytowe w laoz- nej objetosci 4,9 ml i badano pod wzgledem zawartosci bialka i windezyny metoda spektrosko¬ pii przy 270 i 280 ma. Tak wytworzony koniugat zawieral 7,9 mola windezyny/mol Ig.6 144 887 Przyklad XI* Koniugat windezynosukoynoil - mysie przeciwcialo monoklonalne przeciw rakowi kos oi©pochodnemu, 300 ml roztworu estru 4-sukoynoilowindezyny i N-hydroksy¬ sukcynimidu w suohym DMF, o stezeniu 28 mg/ml, przygotowanego w sposób podobny do opisane¬ go w powyzszym przykladzie I, dodano przy szybkim mieszaniu do 1,5 ml roztworu mysiego prze- oiwciala monokianalnego przeoiw miesakowi kosci opoohodnemu w 0,34 M buforze boranowym o pH 8,6, o stezeniu 19f 8 mg/ml• Otrzymana mieszanine mieszano w temperaturze pokojowej w oiagu 4 godzin, sklarowano za pomoca odwirowania 1 wyodrebniono produkt 8 supernatantu za pomoca filtracji zelowej na kolumnie o wymiaraoh 1,5x26,5 cm /46,8 ml/ z Bio-Gel P-6, zrównowazo¬ nej roztworem soli, buforowanym fosforanami* Zbierano wyodrebnione frakcje szczytowe w la¬ cznej objetosci 5,52 ml i badano pod wzgledem zawartosci bialka i windezyny metoda spektro¬ skopii przy 270 i 260 nm. Tak wytworzony koniugat zawieral 6,7 mola windezyny/mol Ig* Przyklad III. Koniugat windezynosukcynoll-mysie przeciwcialo monoklonalno przeoiw antygenowi czerniaka* 200 ml roztworu estru 4-sukoynoilowindezyny i N-hydroksysuk- oynimidu w suohym DMF, o stezeniu 20 mg/ml, przygotowanego w sposób podobny do opisanego w powyzszym przykladzie I, dodano przy szybkim mieszaniu do 1,0 ml roztworu mysiego przeciw¬ ciala monoklonalnego przeoiw antygenowi ozerniaka w 0,34 M buforze boranowym o pil 8,6, o stezeniu 21,2 mg/ml* Otrzymana mieszanine mieszano w temperaturze pokojowej w oiagu 4 go¬ dzin 1 produkt wyodrebniono za pomoca filtracji zelowej na kolumnie o wymiaraoh 1,5 z 26 om /45,9 ni/ z Bio-Gel P-6 zrównowazonej roztworom soli buforowanym fosforanami* Zbierano wy¬ odrebnione frakcje szczytowe w lacznej objetosci 12,31 ml i badano pod wzgledem zawartosci bialka i windezyny metoda spektroskopii przy 270 i 280 nm* Tak wytworzony koniugat zawie¬ ral 9,1 mola windezyny/mol Ig* Przyklad IV, Koniugat windezynosukcynoll - mysie przeciwcialo monoklonalne przeoiw antygenowi karcyno*-embrionalnemu* 1,0 ml roztworu estru 4-sukoynoilowindezyny i N- -hydroksysukoynoimidu w suohym DMF o stezeniu 22 mg/ml, przygotowanego w sposób podobny do opisanego w powyzszym przykladzie I, dodano przy szybkim mieszaniu do 7,0 ml roztworu my¬ siego prze oiwo lala monoklonalnego przeoiw antygenowi karcyno-embronaInemu v 0j4 M buforze boranowym o pH 8,6, o stezeniu 21,4 mg/ml* Otrzymana mieszanine reakcyjna mieszano w tempe¬ raturze pokojowej w ciagu 4 godzin, a nastepnie rozoienczano 3,5 ml roztworu 0,7 M chlorek sodowy/0,05 M bufor fosforanowy o pH 7,4 i wyodrebniono produkt za pomoca filtracji zelo¬ wej na kolumnie z Bio-Gel P-6 zrównowazonej roztworem soli, buforowanym fosforanami* Zbie¬ rano wyodrebnione frakoje szczytowe w lacznej objetosci 28,24 ml 1 badano pod wzgledem za¬ wartosci bialka i windezyny metoda spektroskopii przy 270 i 280 nm* Tak wytworzony koniu¬ gat zawieral 5,8 mola windezyny/mol Ig* Przyklad V* Koniugat dezacetylowinblastynosukcynoil - królicza Ig przeciwmy- sia. Do roztworu 18 mg 4-sukoynoilodezaoetylowinblastyny w 0,4 ml suchego DMF dodano przy mieszaniu 0,3 ml roztworu N-hydroksysukcynimidu w suchym DMF, o stezeniu 7,97 mg/ml, a na¬ stepnie 0,3 ml roztworu 1,3-dwucykloheksylokarbodwuitnidu w suohym DMF, o stezeniu 14,4 mg/ ml* Otrzymana mieszanine przetrzymywano w temperaturze pokojowej w ciemnosci w ciagu 19 go¬ dzin, w wyniku ozego otrzymano roztwór estru N-hydroksysukcynimidu i 4-sukcynoilodezaoety- lowinblastyny, o stezeniu 18 mg/ml* 200 ml powyzszego roztworu dodano przy szybkim mieszaniu do 1,8 ml roztworu króliczej Ig przeciwmysiej w 0,34 M buforze boranowym o pil 8,6, o stezeniu 8,02 mg/ml* Otrzymana mie¬ szanine mieszano w temperaturze pokojowej w oiagu 3 1/2 godz* po czym sklarowano za pomoca odwirowania i wyodrebniono produkt z supernatantu za pomoca filtracji zelowej na kolumnie o wymiarach 1,5 x 25 om /44 ml/ z Bio-Gel P-6 zrównowazonej roztworem soli, buforowanym fo¬ sforanami* Zbierano wyodrebnione frakcje szczytowe w lacznej objetosci 6,47 ml i badano pod wzgledem zawartosci bialka i dezacetylowinblastyny metoda spektroskopii przy 270 i 280 nm* Tak wytworzony koniugat zawieral 9,0 mola dezacetylowinblastyny/mol Ig.Przyklad VI, Koniugat dezacetylowinkrystynosukcynoil - mysie przeciwcialo mo¬ noklonalne przeoiw antygenowi czerniaka* Do roztworu 10 mg 4-sukcynoilodezacetylowinkrysty-ikk 887 7 ny w 0,1 ml suchego DMF dodano przy miossanlu 0,2 ml roztworu N-hydroksylosukcyniraidu w su¬ chym DMF o stezeniu 6,6 mc/ml, a nastepnie 0,2 ml roztworu metylo~p-toluenosulfonlonu 1-cy- kloheksylo-3-/2-morfolinoetylo/karbodwuimidu w suchym DMF, o stezeniu 24,0 mg/ml* Otrzymana mieszanine przetrzymywano w tempei*aturze pokojowej w ciemnosci w ciagu 65 godzin, w wyniku czego otrzymano roztwór estru N-hydroksysukoynltuidu i 4-sukcynoilodezacetylowinkrystyny, o stezeniu 20 mg/ml. 200 ml powyzszego roztworu dodano przy szybkim mieszaniu do 1,0 ml roztworu mysiego prze¬ ciwciala monoklonalnego przeciw antygenowi czerniaka w 0,34 M buforze boranowym o pU 8,6, o stezeniu 22,7 mg/ml* Otrzymana mieszanine mieszano w temperaturze pokojowej w ciagu k go¬ dzin, po czym wyodrebniono produkt za pomoca filtracji zelowej na kolumnie o wymiaraoh 3,2 x 2*l,5 cm /197 ml/ z Bio-Gel P-6 zrównowazonej roztworem soli, buforowanej fosforanami* Zbie¬ rano wyodrebnione frakcje szczytowe w Lacznej objetosci 14,16 ml i badano pod wzgledem za- wartosoi bialka i dezaoetylowinkrystyny metoda spektroskopii przy 270 i 280 nm. Tak wytwo¬ rzony koniugat zawieral 1^,3 mola dezaoetylowinkrystyny/mol Ig.Przyklad VII, Koniugat dezacetylowinblastynosukcynoil - mysie przeciwcialo mo- noklonalne przeciw gruozolako-rakowi pluo. 350 ml roztworu estru Jf-sukoynoilodezaoetylowin- blastyny i N-hydroksysukoynimidu w DMF, o stezeniu 1*t,7 mg/ml, dodano przy szybkim miesza¬ niu do 2,0 ml roztworu mysiego przeciwciala monoklonalnego przeciw drobnokomórkowemu rakowi pluo w 0,3^ H buforze boranowym o pH 8,6, o stezeniu 20,0 mg/ml* Po mieszaniu w temperatu¬ rze pokojowej w ciagu k godzin, mieszanine reakcyjna doprowadzono do pH 79k za pomoca 1 N HC1 i sklarowano przez odwirowanie. Produkt wyodrebniono za pomoca filtraoji zelowej na ko- lumnie o wymiaraoh 2,0 z 22 om /67,0 ml/ z Bio-Gel P-6 zrównowazonej roztworem soli, bufo¬ rowanym fosforanami. Zbierano wyodrebnione frakoje szczytowe w lacznej objetosci 9,7 ml i badano pod wzgledem zawartosci dezacetylowinblastyny 1 bialka metoda spektrometrii przy 270 i 260 nm* Tak otrzymany koniugat zawieral 7,5 mola dezaoetylowinblastyny/mol Ig* V podobny sposób, stosujac odpowiednio wyodrebnione estry N-hydroksysukoynimidu, otrzy¬ mano: koniugat windezynosukoynoil-mysie przeciwcialo monoklonalne prze oiw antygenowi karcy¬ no-embrionalnemu, koniugat windezynosukoynoil-mysie przeoiwotalo monoklonalne przeciw gru- ozolakorakowi pluc, koniugat dezaoetylowinblastynoglutaroil-mysie przeciwcialo monoklonalne przeciw antygenowi karoyno-embrionalnemu i koniugat 4'-epi dezoksydezaoetylowinblastynosutc- oynoil- mysie przeciwcialo monoklonalne przeciw antygenowi karcyno-embrionalnemu.Przyklad VIII. Preparat w postaci komórek rosnacych w hodowli rozdzielono do probówek do mikromiareozkowania na poziomie 10 komórek/probówke. Po zatezeniu zawiesiny ko¬ mórek za pomoca odwirowania dodano 0,2 ml próbki róznyoh stezen preparatów koniugatów* Ko¬ mórki przeprowadzono ponownie w zawiesine, inkubowano w temperaturze 37°C w ciagu 30 minut, a nastepnie odwirowano 1 usunieto supematant. Nastepnie zawieszono komórki w podlozu do ho- dowli tkanek 1 rozdzielono na plytki hodowlane do mikromiareozkowania na poziomie 10 komó¬ rek/dolek* Po uplywie 6 dni hodowli okreslono ilosc komórek obeonyoh w kazdym dolku 1 porów¬ nano z preparatem komórek potraktowanych samym roztworem soli buforowanym fosforanami* V jednym eksperymencie, ludzkie komórki czerniaka traktowane albo koniugatem windezyno— sukcynoil- mysie przeciwcialo monoklonalne przeciw antygenowi czerniaka /przyklad III/, al¬ bo koniugatem dezacetylowinkrystynosukcynoil-mysie przeciwcialo monoklonalne przeciw antyge¬ nowi czerniaka /przyklad Vl/ 1 okreslano wplyw na wzrost komórek, z nastepujacymi wynikami: 1 Lek sprzezony Yindezyna Stezenie leku sprzezonego mg/ml 50 5,0 0,5 Wzrost komórek jako procent ilosoi komórek kon¬ trolnych potraktowanych roztworem soli buforowanym fosforanami 16,0 1 61,8 84,28 ikk 887 Dezaoetylo- wlnkryatyna 50 5,0 0,5 21,5 7k,k 100,0 W innym eksperymencie ludzkie komórki raka okreznlcy i odbytnicy potraktowano koniu- fiatem windezynosukcynoil - mysie przeciwcialo monoklonalne przeciw antygenowi karoyno-em¬ brion owemu /przyklad XV/ otrzymujao nastepujace wyniki: Stezenie leku sprzezonego mg/ml 1 120 60 30 15 Wzrost komórek Jako procent ilosci komórek kontrolnych potraktowanych roztworem soli buforowanym fosforanami 3,2 39,9 89,9 104,8 Przyklad. V celu okreslenia skutecznosci koniugatu in vivo jako ozynników przeoiwaowotwórowyoh, grupom myszy bez grasicy wszczepiono podskórnie zawiesine komórek lu¬ dzkiego raka okreznlcy i odbytnicy, a nastepnie zastosowano dootrzewnowe wstrzykniecia 2 x tygodniowo w ciagu 5 tygodni* Myszom wstrzykiwano albo roztwór soli buforowany fosforanami, lub mysie przeoiwoialo monoklonalne /przeciw antygenowi karoyno-embrionalnemu/, albo koniu- gat windezyny z tym przeciwoLalem przygotowany jak opisano w przykladzie XV. Dawka przeciw¬ ciala wstrzykiwana kazdorazowo myszy miescila sie w zakresie 3,3-3,7 mg. Dawka windezyny w koniugaoie wstrzykiwana kazdorazowo myszy miescila sie w zakresie 119-128 mg.Po uplywie 61 dni od lmplantaoji nowotworu, grupy otrzymujace tylko PBS lub przeoiw¬ oialo zabito, wycieto nowotwór i zwazono* Myszy otrzymujace koniugaty windezyna - przeoiw¬ oialo zabito po uplywie 90 dni po implantacji. srednia wage nowotworu przedstawiono poni¬ zej: Grupa potraktowana I PBS ['Przeciwcialo /wylacznie/ Koniugat windezyna prze¬ oiwoialo Ilosc myszy 11 10 8 srednia waga nowotworu mg - S.D. 1793 i 1609 I 527 i **77 22 i 19 Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania koniugatów itnmunoglobuliny o wzorze ogólnym 1, w którym Ig oz¬ nacza immunoglobuline lub fragment Immunoglobuliny, X oznacza grupe C . alkilenowa, R oznacza grupe COOU, COOC alkilowa lub CONH , R oznacza grupe CH0 lub CHO, R5 atom wo- 3 /| ¦•"J 2 j doru, jeden z R i R oznacza grupe etylowa zas drugi oznacza atom wodoru lub grupe OH, znamienny tym, ze immunoglobuline lub fragment immnnoglobuliny poddaje sie re¬ akcji z pochodna pólkwasowa zawierajaoa ugrupowanie alkaloidu Vinca z grupa -OCOKCOZ przy- 1 2 3 U *i laczona w pozycji k, o wzorze 2, w którym X, R , R , R f R i RJ maja znaczenie podane po¬ wyzej a Z oznacza grupe opuszczajaca.ikk 887 9 2* Sposób wedlug zastrz. 1 znamienny t y m, ze stosuje sie Lmmunoglobuline lub fragment immunoglobuliny pochodzacy z monokianalnego przeciwciala przeoLw antygenom zwiazanym z nowotworem ludzkim lub zwierzecym. 3* Sposób wedlug zastrz. 1 albo 2znamienny t y ni, ze immunoglobuline mody¬ fikuje sie 3-1** resztami alkaloidu Yinoa.CH30 C-O-CHb Wzór 1ikk 887 C-O-CH CH30 Prtcowima Poligraficzna UP PRL. Naklad 100 egz.Cena 220 zl PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL