PL152355B1

PL152355B1 - Method for producing useful substances using genetically engineered viral DNA.

Info

Publication number: PL152355B1
Application number: PL1985254100A
Authority: PL
Original assignee: Daiichi Seiyaku Co
Priority date: 1984-06-21
Filing date: 1985-06-20
Publication date: 1990-12-31
Also published as: PL254100A1; AU588236B2; CA1284119C; DK173054B1; BG60254B2; KR860000383A; EP0175852A3; NO175215B; NO852433L; ATE71655T1; FI852322L; KR930000273B1; FI89184B; EP0175852A2; HU202581B; FI89184C; DK282385D0; IE59420B1; HUT38969A; EP0175852B1

Description

RZECZPOSPOLITA OPIS PATENTOWY 152 355 POLSKA

URZĄD

PATENTOWY

RP

Patent dodatkowy do patentu nr--Zgłoszono: 85 06 20 (P. 254100)

Pierwszeństwo: 84 06 21 Japonia

Zgłoszenie ogłoszono: 86 08 12

Opis patentowy opublikowano: 1991 08 30

Int. Cl.⁵ C12N 15/12

Twórca wynalazku--Uprawniony zpateatu: Daiichi SeiyaUu Co., Ltd., Tokio (Japonia)

Sposób wytwarzania produktu genu egzogennego dla wirusa jądrowego polihedrozy u Bombyx mori

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania produktu genowego, a zwłaszcza genu egzogennego dla wirusa jądrowej polihedrozy u Bombyx mori (BmNPV).

Opublikowane są liczne sposoby wytwarzania produktów genowych w Escherichia coli, Batillus subtilis, Saccharomyces ceroviciae i tak dalej, z zastosowaniem plazmidów i im podobnych, i z wykorzystaniem technik rekombinowanego DNA.

Znane są również próby wytwarzania J-interferonu i J-galaktozydazy w hodowanych komórkach (ustalonej linii komórkowej ze Spodoptera frugi perda) przy użyciu wirusowego DNA, a mianowicie DNA wirusa jądrowej polihedrozy Autographa californica, po wstawieniu do niego strukturalnego genu (Molecular and Cellular Biology, 3/12/, 2156-2165 /1983; ibid., 4/3/, 399-406 /1984). Zagadnienia tego dotyczą między innymi publikacje Pennock'a i innych [Pennock, G.D., C.Shoamaker and L.K. Miller, Mol. Celi. Biot, 4, 399-406 (1984) oraz Smith'a i innych (Smith G.E., M.D. Summers and M.J. Fraser, Mol. Celi. Biol., 3, 2156-2165 (1984)].

W publikacji Pennock'a i innych ujawniono ekspresję genu uzyskanego przez połączenie polihedrynowego pochodzącego od pręcikowego wirusa jądrowej polihedrozy Autographa californica (AcNPV) i genu kodującego J-galaktozydazę Escherichia coli w komórkach owadów, przy czym AcNPV stanowi wektor, i pod kontrolą promotora polihedryny.

W publikcji Smith'a i innych ujawniono metodę wytwarzania β- interferonu w komórkach szkodników zainfektowanych AcNPV, w którym wbudowany jest gen β- interferonu, w której ekspresja genu β- interferonu jest pod kontrolą promotora genu polihedryny z AcNPV. Autographa californica stosowana w tych metodach jest szkodnikiem żyjącym na polu i dlatego metody te nie są odpowiednie do wytwarzania produktów genowych.

Sposobem według wynalazku wytwarza się produkty genowe, takie jak białka czy glikoproteiny, metodą inżynierii generycznej przez zastosowanie DNA wirusa jądrowej polihedrozy Bombyx mori, określanego dalej w skrócie BmNPV. Sposobem wedug wynalazku otrzymuje się produkty genowe wykorzystując działanie rejonu promotora we wspomnianym BmNPV DNA.

152 355

Skuteczną transfekcję przeprowadza się przez zastosowanie, w połączeniu z BmNPV, zrekombinowanego wektora, który zawiera fragment DNA z BmNPV pierwotnie występujący przed genem strukturalnym polihedryny w kierunku 5' i jeszcze obejmujący rejon promotora dla tego genu strukturalnego, kodon inicjujący translację i egzogenny gen kodujący użyteczną substancję, z lub bez fragmentu DNA z BmNPV pierwotnie występującego za genem strukturalnym polihedryny w kierunku 3'. Produkty genowe można także wytworzyć na drodze, która obejmuje tworzenie zrekombinowanego BmNPV przez inokulację hodowli komórek lub żywych larw jedwabnika mieszaniną rekombinowanego transferowego wektora i BmNPV DNA, i utworzenie w ten sposób zrekombinowanego BmNPV w komórkach lub żywym organiźmie, albo przez inokulację hodowanych komórek lub żywej larwy jedwabnika w ten sam sposób zrekombinowanym BmNPV skonstruowanym przez połączenie DNA z BmNPV i plazmidu z Escherichia coli, takiego jak pBR322, a ponadto obejmuje zastąpienie strukturalnego genu polihedryny zawartego w wymienionym zrekombinowanym DNA genem kodującym produkt genowy i reprodukcję zrekombinowanego BmNPV w komórkach lub żywym organiźmie.

Według wynalazku sposób wytworzenia produktu/genu egzogennego dla wirusa jądrowej polihedrozy u Bombyx mori (BmNPV), polega na tym, że reprodukuje się w hodowli komórek lub u gospodarza zrekombinowany DNA wytworzony przez rekombinację z dwuniciowym DNA zawierającym (i) fragment DNA z BmNPV, pierwotnie występujący przed rejonem promotora genu strukturalnego kodującego białko polihedrynowe w kierunku 5', wraz z przyległym do niego rejonem promotora tego genu strukturalnego, (ii) kodon inicjujący translacje i (iii) gen dokujący produkt egzogenny dla wymienionego wirusa, skutecznie związane z rejonem prmotora we fragmencie DNA z BmNPV w kierunku 5', przy czym zrekombinowany BmNPV reprodukuje się w linii komórkowej z Bombyx mori lub w żywych jedwabnikach.

Fig. 1 przedstawia schemat konstruowania plazmidu serii pIFN-ΙΒ użytecznego przy wytwarzaniu zrekombinowanego BmNPV DNA. Fig. 2 przedstawia mapę restrykcyjną fragmentu EcoRI -EcoRI z pBmE36. Fig. 3 przedstawia sekwencje par zasad części fragmentu Hpal - Hind III. Fig. 4 przedstawia sekwencję par zasad w sąsiedztwie ATG genu polihedryny. Fig. 5 ilustruje sposób wytwarzania pBM030. Fig. 6 przedstawia mapę restrykcyjną pokazującą sekwencję par zasad rejonu poliłącznika i miejsca cięcia enzymami restrykcyjnymi w pBM030. Fig. 7 ilustruje sposób wytwarzania plazmidów serii pIFN 2BN. Fig. 8 ilustruje sposób wytwarzania pBM034.

Sposób według wynalazku wyjaśnia dokładniej poniższy opis typowego zatosowania w praktyce.

BmNPV jest jednym z wirusów owadzich należących do grupy baculowirusów. Odznacza się wysoką specyficznością w stosunku do gospodarza i zaraża jedwabnika (Bombyx mori) celem gromadzenia w jego komórkach dużych ilości polihedryny. Wirus ten ma dwuniciowy kolisty genom o około 140 kbp; ten DNA można otrzymać z cząsteczek wirusa za pomocą konwencjonalnej metody, np. przez działanie proteazą, laurylosiarczanem sodowym (SDS) itd, oraz ekstrakcją itd. Ten dwuniciowy kolisty DNA, dalej określany w skrócie jako wirusowy DNA lub BmNPV DNA, jest dość duży. W związku z tym korzystne jest wybranie do zastosowania mniejszego fragmentu DNA, zawierającego strukturalny gen polihedryny i części przed i za tym genem (części w kierunku 5' i części w kierunku 3') z fragmentów DNA wytworzonych przez działanie enzymem restrykcyjnym. Znane są i dostępne na rynku liczne enzymy restrykcyjne. Dlatego dobór odpowiedniego enzymu czy enzymów do powyższego celu jest łatwy i można wybrać odpowiednie warunki ich użycia zależnie od enzymu czy enzymów. Syntezę (chemiczną syntezę, cięcie enzymem lub enzymami restrykcyjnymi), wydzielanie i wykrywanie fragmentów DNA, analizę sekwencji DNA i działanie na Escherichia coli itd. (transformację, namnażanie, odzyskiwanie plazmidów, itd.) podane w dalszej części technologicznej, przeprowadza się stosując dobrze znane techniki inżynierii genetycznej.

W doborze fragmentu DNA, zawierającego część z genem strukturalnym, spośród szeregu fragmentów DNA wytworzonych z BmNPV DNA, metodą pomocną wśród innych jest hybrydyzacja Southerna z użyciem sondy wytworzonej konwencjonalnym sposobem. Chociaż wybrany fragment musi zawierać część z genem strukturalnym, ważne jest aby wspomniany fragment zawierał także dość długi łańcuch DNA po stronie 5' (czyli występujący przed) i w niektórych wypadkach taki łańcuch DNA również po stronie 3' (czyli występujący za). Długość każdego

152 355 łańcucha jest ważna z uwagi na wydajność wytwarzania żądanej użytecznej substancji. Chociaż łatwość manipulowania jest również czynnikiem istotnym, jak będzie wspomniane poniżej, stwierdza się eksperymentalnie czy dana długość łańcucha jest odpowiednia czy nie. Wykorzystując fragmenty DNA o różnej długości skonstruowano zrekombinowane wirusy zawierające gen kodujący użyteczną substancję taką jak cr-IFN jak opisano w przykładzie I. Następnie tymi zrekombinowanymi wirusami zakażono hodowlę komórek dla porównania produktywności użytecznej substancji. Po zapoznaniu się z poniższym opisem a szczególnie przykładami, nie powinno przedstawiać żadnych istotnych trudności, dla zorientowanego w tych zagadnieniach, przeprowadzenie koniecznych w związku z tym eksperymentów, nawet jeżeli wymaga to wiele czasu i pracy. Chociaż fragment o około 10,6 kbp, który można otrzymać przez cięcie EcoRI jest jednym z fragmentów odpowiednich do tego celu, szereg fragmentów np. Cla I - Cla I, Pst I - Pst I itp. otrzymanych przy zastosowaniu innych enzymów restrykcyjnych można również zastosować.

Można zastosować skutecznie różne techniki do usunięcia części z genem strukturalnym z fragmentu zawierającego strukturalny gen polihedryny z łańcuchami DNA poprzedzającym i następnym oraz wydzielenia łańcucha DNA o odpowiedniej długości i zawierającego rejon promotora przed wspomnianym strsukturalnym genem i, zależnie od wymagań, łańcucha DNA o odpowiedniej długości i pierwotnie występującego za wspomnianym strukturalnym genem.

Fragmenty otrzymane przy użyciu różnych enzymów restrykcyjnych poddane są badaniu sekwencyjnemu celem identyfikacji części z genem stsrukturalnym aby można było tę część usunąć przez trawienie enzymami egzonukleazy np. trawienie przez Ba 131 lub egzonukleazę III. Potrzebne łańcuchy DNA poprzedzający i następujący można wytworzyć np. jako części pozostałe po trawieniu Ba 131, lub przez cięcie enzymem restykcyjnym, a następnie określenie odpowiednich sekwencji DNA, albo na drodze chemicznej syntezy.

Sekwencję aminokwasową białka - polihedryny wytworzonego w jedwabniku określił S. Serebriani i jego współpracownicy (J. Intertebrate, Pathology, 30, 442-443 (1977)) i podał, że zawiera ono 244 aminokwasy. Dlatego można sprawdzić, której części genu białka odpowiada fragment DNA pochodzący z BmNPV lub czy wspomniany fragment jest z jakiejś innej części niż wspomniany gen, oznaczając sekwencję zasad wspomnianego fragmentu, budując sekwencję aminokwasową w oparciu o tę sekwencję zasad według reguły kodon - aminokwas, i porównując otrzymaną sekwencję aminokwasową z sekwencją podaną przez Serebriani'ego i współpracowników.

Stwierdzono, że do usunięcia części za genem strukturalnym i wykorzystanie górnego i dolnego fragmentu DNA, najodpowiedniejszy jest fragment BmNPV DNA o około 10,6 kbp, otrzymany przez cięcie wspomnianego fragmentu Hindlll daje dwa fragmenty, które są łatwe do zastosowania. Jednakże wspomniany fragment nie jest jedynym, za pomocą którego można osiągnąć cele wynalazku. Inne odpowiednie fragmenty np. cięcie - 582 otrzymano metodą screeningu z użyciem różnych enzymów restrykcyjnych. W poniższym opisie przedstawiono przypadek zastosowania wyżej wspomnianego fragmentu. Sekwencje DNA oznaczono, jeżeli nie wyszczególniono inaczej, w sposób konwencjonalny. Tak więc koniec 5' podano z lewej strony, a koniec 3' z prawej strony, natomiast fragment otrzymany przez cięcie enzymem restrykcyjnym oznaczono łącznikiem między nazwami enzymów restrykcyjnych. W tym przypadku również, lewa i prawa strona mają te same znaczenia jak wspomniano powyżej.

Dla przykładu fragment EcoRI - EcoRI przedstawiono na schemacie: EcoRI Hind III Hpa I Hind III BamHI Hind III EcoRI _φ

, 1,8 k b χ.	{ --
\ ? 3,9 kb ,,
¹ ' ^L ' ^{- p} 10,6 kb

3,1 kb

152 355

Część z genem polihedryny można wykryć przez dalsze cięcie powyższego fragmentu na mniejsze fragmenty, a następnie screening, na przykład metodą hybrydyzacji Southern'a. W tym przypadku obecność genu strukturalnego, o którym mowa, ustalono we fragmencie Hpa I - Hind III o' około 1,8 kb. Sekwencję zasad części wspomnianego fragmentu Hpa I - Hind III (od zasady przy + 201 za miejscem cięcia przez Hpa I do miejsca cięcia przez Hind III) 1567 bp od -382 do 1185 w odniesieniu do miejsca inicjacji ATG// przedstawiono na fig. 3. Celem zastosowania części poprzedzającej i następującej po strukturalnym genie korzystnie stosuje się dwa fragmenty, Hind III - Hind III o około 3,9 kb i Hind III - Hind III o około 3,1 kb, wytworzonych przez działanie Hind III. Te dwa fragmenty można wydzielić za pomocą konwencjonalnej metody np. elektroforezy na żelu agarozowym.

Wydzielone dwa fragmenty poddaje się konwencjonalnym manipulacjom wprowadzając je oddzielnie do plazmidów zawierających sztuczne łączniki. Odpowiednimi do tego celu są np. dostępne w handlu plazmidy pUC9 i pUC8, oba produkcji Pharmacia P-L-Biochemicals.

Fragment Hind III - Hind III o około 3,1 kb występujący za genem strukturalnym wprowadzono do pUC8 w miejscu cięcia Hind III. Fragment Hind III - Hind III poprzedzający, który zawiera gen polihedryny wprowadzono do pUC9 w miejsce cięcia Hind III, produkt z wstawką przecięto w jednym miejscu enzymem restrykcyjnym, np. EcoRI, a otrzymany w ten sposób fragment DNA poddano trawieniu Ba 131, za pomocą którego można dogodnie regulować długość łańcucha DNA, ponieważ Bal31 trawi zasady pojedyńczo z obu końców miejsca cięcia. Przez wytworzenie kilku fragmentów o różnej długości przez zmienianie czasu oddziaływania i poddanie ich analizie na kolejność zasad, można znaleźć fragment nie zawierający genu polihedryny, na podstawie znajomości sekwencji par zasad w genie polihedryny.

Po usunięciu genu białka w powyższy sposób można otrzymać fragment DNA zawierający rejon promotora pochodzący od wirusa występującego przed tym genem. Fragment ten jest użyteczny przy wytwarzaniu wektora plazmidowego; wspomniany fragment wprowadza się wspólnie z fragmentem DNA występującym za genem polihedryny, otrzymywanym również w powyższej eliminacji genu polihedryny, do plazmidu i następnie wytwarza się zrekombinowany plazmid przez wprowadzenie egzogennego genu dla użytecznej substancji w miejsce pomiędzy obu fragmentami, które jest danym miejscem występowania genu polihedryny.

Na przykład część poprzedzającą po działaniu Hind III wprowadza się do pUC9 otrzymując jeden plazmid, natomiast część następującą w postaci fragmentu Hind III-Hind III o około 3,1 kb wprowadza się do pVC8 w miejsce Hind III otrzymując inny plazmid. Następnie, korzystając z miejsc enzymów restrykcyjnych wspólnych dla obu plazmidów, konstruuje się dalszy plazmid zawierający obie części poprzedzającą i następującą, tak jakgdyby były one wprowadzone do jednego i tego samego plazmidu. W tym przypadku dogodnie jest czasem przy wprowadzaniu genu dla użytecznej substancji konstruować tak, aby część sztucznego łącznika znalazła się pomiędzy obu częściami. Można również stosować inne konwencjonalne metody wprowadzania sekwencji DNA do plazmidów.

W przypadkach, gdy dookoła kodonu inicjującego translację genu polihedryny oraz w i dookoła kodonu zakończenia translacji/znajdują się delecje, można je zapełnić przez uzupełniające dodanie syntetycznych DNA lub na drodze mutagenezy in vitro. Naprawy takie wykonuje się stosując konwencjonalne techniki rekombinowanych DNA.

Dla wytwarzania użytecznych substancji zgłoszonych jest szereg genów; poza tym oczekuje się, że wydzielenie wielu naturalnych genów i syntezy takich, czy innych genów będą zrelacjonowane w przyszłości. Jest zrozumiałe, że wszystkie one mogą być zastosowane w sposobie według wynalazku. Wspomniane użyteczne substancje obejmują substancje biologicznie czynne np. peptydy i glikoproteiny, np. limfoliny takie jak /-interferon, /5-interferon, cr-interferon, TNF i interleukiny, hormony takie jak insulina, ludzki hormon wzrostu, szczepionki takie jak przeciwko ludzkiemu zapaleniu wątroby A i B, szczepionki przeciwgrypowe i inne substancje takie jak TPA, somatomedyny i czynniki stymulujące kolonizację. Zazwyczaj korzystne jest przyłączenie kodonu ATG inicjującego translację do genów dla produkcji użytecznych substancji przed dalszymi proceduralnymi etapami.

Następnie wytwarza się zrekombinowany plazmid przez wprowadzenie do wektora genu dla wytwarzania użytecznej substancji z przyłączonymi łącznikami do obu jego końców, lub przy

152 355 pomocy innej odpowiedniej konwencjonalnej metody. Wskutek tego otrzymany zrekombinowany plazmid zawiera fragmenty pochodzące od wirusa, mianowicie fragment DNA zawierający rejon promotora i dolny fragment DNA zaczynający się od kodonu zakończenia translacji, fragment poprzedzający i następujący po genie dla wytwarzania użytecznej substancji, odpowiednio. W etapach wyżej wspomnianych może ewentualnie nastąpić odwrócenie sekwencji zasad przy wprowadzaniu fragmentu DNA. Dlatego konieczne jest potwierdzenie w każdym etapie, przed przystąpieniem do następnego etapu, że sekwencja zasad ma prawidłowy kierunek.

Otrzymany w powyższy sposób zrekombinowany plazmid można zastosować do transformacji Escherichia coli i w niej namnożyć.

Nie zawsze konieczne jest aby fragment w kierunku 5', zawierający rejon promotora, zachował sekwencję zasad pierwotnie występującą w BmNPV DNA. Podobny stopień ekspresji otrzymuje się nawet wtedy, gdy wspomniany fragment jest mniej lub więcej zmodyfikowany.

Charakterystycznego tzw. TATA box obecnego w rejonie promotora nie można zazwyczaj zidentyfikować w określony sposób w tej części BmNPV DNA, która znajduje się przed ATG strukturalnego genu polihedryny. Jednakże, jak przedstawiono w przykładzie C-2 i w następnych przykładach oraz tablicy I, pewne delecje przed ATG, mianowicie delecje -7 do -1 bp i -19 do -1 bp, nie mają istotnego wpływu na doskonały wynik uzyskiwany bez tych delecji. Zadowalający wynik otrzymuje się również przy delecji -29 do -lbp. Natomiast delecje -82 do -l bp prowadzą do znacznego pogorszenia wyniku. Dlatego wydaje się, że sąsiedztwo -80 zasady już obejmuje ważny rejon promotora. DNA w kierunku 5', który zawiera połączenie wspomnianego rejonu promotora i poprzedzającego fragmentu DNA użytecznego do rekombinacji z wirusowym DNA, może być różnej długości. Na przykład może on mieć długość do kilku tysięcy par zasad, poprzedzających ATG. Określając bardziej szczegółowo, użycie tej części fragmentu Hpa I - Hind III o około 1,8 kb występującego przez ATG lub użycie tej części fragmentu Hind III - Hind III o około 3,9 kb występującego przed ATG albo jego części daje zadowalające wyniki. Przypuszczalnie nie jest warunkiem koniecznym, aby DNA w kierunku 5' zawierał dalszą część w tym kierunku wspomnianego fragmentu o około 3,9 kb. Wspomniany rejon promotora jest ważny dla doskonałej białkowej wydajności produktywnej BmNPV DNA, jak już podawano powyżej.

Sekwencja DNA zlokalizowana przed wspomnianym rejonem promotora i sekwencja DNA za strukturalnym genem polihedryny są ważne jako klucze do wytworzeniarekombinowanego wirusa przez wprowadzenie genu dla użytecznej substancji razem z kodonem inicjacji translacji do BmNPV DNA, jak opisano powyżej. A zatem, mieszana infekcja BmNPV DNA i zrekombinowanym DNA do przeniesienia, np. plazmidem, który ma fragment poprzedzający i następujący po wspomnianym genie, sekwencje DNA homologiczne w stosunku do poszczególnych odpowiednich części BmNPV DNA, daje w rezultacie Crossing over i przeniesienie genu dla wytwarzania użytecznej substancji do BmNPV DNA, dzięki homologii we wspomnianych kluczowych częściach, dając rekombinowany BmNPV DNA.

Określenie, modyfikacja i zastosowanie poszczególnych sekwencji DNA w częściach występujących przed i za strukturalnym genem polihedryny nie są bynajmniej trudne do przeprowadzenia dla fachowca w tej dziedzinie, kiedy odnosi się do nich opis podany powyżej i poniżej, jak również w przykładach. Fachowiec może zrozumieć i stosować w praktyce związane z daną sprawą techniki, jednakże mogą być one kłopotliwe bez jakiegoś pomysłowego kroku w myśli technicznej. Należy zaznaczyć, że każdy rodzaj wykonania, który jest możliwy do przeprowadzenia w tym przypadku, leży w zakresie sposobu według wynalazku.

Stosując wyżej wspomniany rekombinowany plazmid można otrzymać różnymi metodami rekombinowany BmNPV DNA, zawierający gen dla użytecznej substancji. Na przykład, jedną metodę stosuje się in vitro, a w innych używa jedwabnika. W dalszym sposobie stosowania w praktyce nie używa się takiego rekombinoawnego plazmidu, lecz wytwarza się rekombinant BmNPV DN A i plazmidu pBR322 lub podobnego, po czym w tym rekombinancie zastępuje się gen poilhedryny genem dla użytecznej substancji otrzymując zrekombinowany wirusowy DNA.

Mieszana infekcja in vitro hodowanych komórek, na przykład komórek ustalonej linii komórkowej z Bombyx mori (Bm komórki), za pomocą BmNPV DNA i rekombinowanego plazmidu, zawierającego gen dla wytwarzania użytecznej substancji, daje w rezultacie over Crossing

152 355 i przeniesienie żądanego genu dla wytwarzania użytecznej substancji do wirusowego DNA; otrzymuje się zrekombinowany wirusowy DNA- zrekombinowany BmNPV DNA. Rekombinację tę wykonuje się w niektórych przypadkach przez zastąpienie żądanym genem rejonu strukturalnego genu polihedryny, a w innych przypadkach przez dodatkowe wprowadzenie jednego lub wielu genów dla wytwarzania użytecznej substancji do wirusowego DNA w jakiś inny jego rejon lub rejony. Taka mieszana infekcja dokonana in vitro daje w wyniku namnożenie zrekombinowanego wirusowego DNA i wskutek tego nagromadzenie żądanej użytecznej substancji. W środowisku może znajdować się nierekombinowany jak i zrekombinowany wirus; rekombinowany wirus można wyizolować za pomocą metody konwencjonalnej, np. metody rozcieńczenia lub metody łysinek.

Powyższą mieszaną infekcję można również wykonać w jedwabniku.

Przez infekcję komórek Bm in vitro wirusem hodowanym w komórkach Bm - albo mieszaniną rekombinowanych i nierekombinowanych wirusów albo wydzielonym z niej rekombinantem - lub wstrzyknięcie wirusa larwie jedwabnika podskórnie albo do jamy ciała, można wytworzyć wydajnie żądaną użyteczną substancję. Substancję tę można następnie wyodrębnić i oczyścić za pomocą odpowiedniej znanej metody.

Sposobem według wynalazku można wytworzyć użyteczne peptydy, białka i glikoproteiny bezpiecznie i ekonomicznie w dużych ilościach. .

Sposobem według wynalazku wytwarza się białko lub peptyd w komórkach eukariotycznych. Dlatego, gdy stosuje się gen pochodzący od eukarioty, wytwarzany peptyd czy białko może podlegać tym samym modyfikacjom, które występują in vitro w eukariotach, jak usunięcie peptydu syg nalizacyjnego i dodanie łańcucha cukrowego, i w związku z tym spodziewana jest dużo większa użyteczność tych produktów w porównaniu z produktami otrzymanymi za pomocą konwencjonalnych . technik inżynierii genetycznej stosujących bakterie. Ponadto produkty te można bardzo łatwo oczyszczać, gdyż są one wydzielane poza komórki.

Ponadto, wieloletnie doświadczenia w hodowli jedwabników i zgromadzone liczne wyniki badań pozwalają łatwo przeprowadzić hodowlę jedwabnika na dużą skalę. Obecnie możliwe jest również hodowanie jedwabnika na sztucznym pożywieniu. Dlatego wytwarzanie użytecznych substancji na poziomie żywego organizmu z użyciem wektorów wirusowych jest przypuszczalnie o wiele odpowiedniejsze do celów przemysłowych i bardziej ekonomiczne niż wytwarzanie takich substancji na poziomie . komórki.

Poniższe przykłady, w których opisano wytwarzanie a-interferonu (α-IFN), białka użytecznego jako leku, stosując gen α-IFN jako gen do wytwarzania użytecznej substancji wyjaśniają szczegółowo przedmiot wynalazku bez ograniczenia jego zakresu.

Przykład L

A. Klonowanie i propagacja BmNPV techniką łysinek.

Larwy Bombyx mori w trzecim stadium infekuje się doustnie BmNPV. Po kilku dniach zbiera się płyn ustrojowy,· rozcieńcza przy pomocy TC -10 (J. Invertebrate Pathology, 25,363-370 (1975)) i używa do infekcji komórek Bm (ustalonej linii komórek Bombyx mori: Appl. Environ. Microbiol., 44,227-233 (1982)) hodowanych w formie jednowarstwowej. Infekowane komórki umieszcza się warstwą na pożywce TC-10 zawierającej 0,75%· agarozy. Po zestaleniu się pożywki przeprowadza się inkubację w temperaturze 27°C w ciągu kilku dni. Łysinki utworzone na płytce izoluje się za pomocą pipetki pasteurowskiej. Po dwóch powtórzeniach procedury techniką łysinek otrzymuje się genetycznie homogeniczne wirusowe produkty separacji. Szczep BmNPV T3, charakterystyczny dla tych · wirusowych produktów separacji, stosuje się w dalszym doświadczeniu.

Szczep T3 · poddaje się propagacji · w' komórkach Bm i następnie stosuje do podskórnej inkubacji celem infekcji larw jedwabnika · w · piątym stadium. Po sześciu dniach odwirowuje się zakażoną tkankę zawierającą utworzoną polihedrynę z dodaną destylowaną wodą, zawiesza osad w destylowanej wodzie i rozciera·, na proszek. Polihedrynę oczyszcza· się przez frakcjonowane odwirowanie z prędkością 3000 obrotów na minutę przez 30 minut i odwirowanie w nieciągłym gradiencie stężeń 45% i 55% w/w roztworów sacharozy z prędkością 2000 obrotów na minutę przez 30 minut. Zawiesinę polihedryny poddaje się frakcjonowanemu odwirowaniu, dla usunięcia roztworu sacharozy z prędkością 3000 obrotów· na minutę przez 10 · minut, oczyszczone wielościany zawiesza s^ię w 0,¹ M węglame sodowym (^pH Π) - O,⁰⁵ M cMorku sodowym w temperaturze ²⁵°C

152 355 na okres 30 minut dla spowodowania wydzielenia cząstek wirusowych. Tę zawiesinę wirusową poddaje się celem oczyszczenia, odwirowaniu w gradiencie stężenia sacharozy wynoszącym 10-40% w/w z prędkością 18000 obrotów na minutę przez 30 minut. Sacharozę usuwa się metodą dializy lub przez frakcjonowane odwirowanie z prędkością 40000 obrotów na minutę przez 30 minut i otrzymuje oczyszczone cząstki wirusowe.

B. Wytwarzanie wirusowego DNA, identyfikacja genu wielościanu i klonowanie.

B-l Ekstrakcja wirusowego' DNA. Do. otrzymanego w ten sposób . roztworu zawierającego wirus dodaje się 1% w/w laurylosulfonianiu sodowego SDS oraz proteazę K produkcji Merck'a 1 mg/ml. Po około dwóch godzinach inkubacji. w temperaturze 37°C dodaje się do powyższego roztworu równą objętość roztworu fenolu nasyconego w 10 mM buforze Tris-HCl (pH 7,6) -1 mM EDTA, wstrząsa łagodnie mieszaninę przez około 5 minut i następnie odwirowuje przy 12000 obrotów na minutę przez 5 minut. Zbiera się warstwę wodną i powtarza dwukrotnie ' takie samo traktowanie fenolem. Do warstwy wodnej zawierającej DNA dodaje się równą objętość chloroformu, następnie wstrząsa łagodnie przez około 5 minut i odwirowuje przy 12000 obrotów na minutę przez 2 minuty. Odbiera się warstwę wodną, powtarza dwukrotnie takie samo traktowanie chloroformem i poddaje warstwę wodną dializie 10 mM buforem Tris - HC1 o pH 7,6 -1 mM EDTA w czasie około 2 dni. Otrzymany w ten sposób wirusowy DNA stosuje (ATCC m 40188) się w dalszym klonowaniu genowym i transfekcji komórek Bm.

B-2. Klonowanie genu polihedryny. Wytwarzanie sondy: Larwy w 5 stadium zaraża się podskórnie szczepem BmNPV T3. Po kilku dniach ekstrahuje się cały RNA z tłuszczowej tkanki ciała metodą z chlorowodorkiem guanidyny i oczysza na kolumnie wypełnionej olgo(dt) celulozą otrzymując mRNA zawierający poli(A). Otrzymany mRNA poddaje się badaniu z użyciem układu translacji retukulećytów królików in vitro. Uzyskane wyniki wskazują, że mRNA kodujący polihedrynę stanowi 90% lub więcej całkowitego mRNA. Stosując wspomniany mRNA jako matrycę, oligo(dt) jako starter i odwrotną transkryptazę syntetyzuje się cDNA. Przy tej okazji stosuje się jako substrat dCTP-³²P i w ten sposób znaczony cDNA używa się jako sondę do klasyfikowania genu polihedryny.

Klonowanie fragmentu EcoRI zawierającego gen polihedryny: Oczyszczony DNA BmNPV T3 poddaje się trawieniu przez EcoRI. Fragmenty poddaje się elektroforezie na 0,7% żelu agarozowym, przenosi na filtr nitrocelulozowy, a następnie poddaje się hybrydyzacji z wyżej wspomnianą sondę. Fragment DNA o około 10,6 kb wyraźnie hybrydyzowany wprowadza się do pBR322 w miejscu jego przecięcia przez EcoRI. Wirusowy DNA poddaje się trawieniu przez EcoRI, a następnie traktuje fenolem i chloroformem w sposób opisany powyżej, w przykładzie B-1. Oddziela się warstwę wodną i dodaje do niej 1/20 objętości 4 M chlorku sodowego i 2 objętości zimnego etanolu; wytrącony DNA rozpuszcza się w małej ilości buforu Tris (10 mM Tris - HC1 (pH 7,6) -1 mM EDTA). Oddzielnie poddaje się pBR322 trawieniu przez EcoRI, potem oddziela w ten sam sposób, jak wyżej, następnie traktuje bakteryjną alkaliczną fosfatazą BAP produkcji Bethesda Researsh Laboratories, znów poddaje działaniu fenolu i działaniu chloroformu i wytrąca przez dodanie etanolu. Osad rozpuszcza się w małej ilości buforu Tris.

Produkty trawienia przez EcoRI wirusowego DNA i pBR322 poddaje się ligacji w temperaturze 5°C w czasie 10 godzin z dodaną ligazą T4. Produkt ligacji wprowadza się do Escherichia coli K12 JM83 i powstałe tetracyklino - oporne transformanty klasyfikuje się metodą hybrydyzacji kolonii z zastosowaniem jako sondy wspomnianego wyżej cDNA. W ten sposób otrzymuje się szczep Escherichia coli noszący plazmid zawierający fragment EcoRI o około 10,6 kb z genem polihedryny. Szczep ten hoduje się, a następnie oczyszcza plazmidowy DNA metodą z użyciem chlorku cezowego; ten plazmidowy DNA oznaczono- symbolem pBmK36. Mapę enzymów restrykcyjnych części wstawki EcoRI - EcoRI w pBmK36 przedstawiono na figurze 2. Część wstawki DNA badano dalej metodą hybrydyzacji Sothern'a stosując jako sondę wspomniany wyżej znaczony cDNA. Wspomniany cDNA hybrydyzował tylko z fragmentem Hpa I-HindIII o około 1,8 kb.

C. Usunięcie części strukturalnego genu polihedryny.

C-l. Klonowanie części zawierającej gen polihedryny i części znajdującej się przed nią. Fragment Hind III - Hind III o około 3,9 kb zawierający powyższy fragment Hpal -Hind III i fragment Hind III - Hind III o około 3,1 kb zawierający część występującą przed genem polihedryny

152 355 sprowadza się do handlowych klonujących wektorów pUC9 i pUC8 według wymienionej kolejności, w ich miejscu Hind III otrzymując odpowiednio p9H18 i p8H225.

C-2. Usunięcie części genu polihedryny. Plazmid p9H15 przecina się za pomocą EcoRI i następnie poddaje działaniu Bal31 celem obcięcia części obu stron miejsca cięcia. Zmieniając czas oddziaływania Bal31 wytwarza się fragmenty o różnej długości. Poddaje się je działaniu Hind III, rozdziela metodą elektroforezy na 0,7% żelu agarozowym i ekstrahuje, otrzymując szereg fragmentów DNA pochodzących od wirusa, różniących się długością.

pUC9 poddaje się działaniu Smal i Hind III, po którym następuje ligacja z uprzednio otrzymanymi fragmentami DNA, posiadającymi tępy koniec i koniec Hind III. Wytworzonymi plazmidami transformuje się Escherichia coli K12 JM83 i następnie hoduje; odzyskuje się plazmidy i oznacza sekwencję zasad od strony 3' każdego wprowadzonego fragmentu DNA pochodzącego od wirusa metodą dideoksy stosując starter -15-zasadowy sekwencyjny starter dla Ml 3 - celem zidentyfikowania części wirusowego genu polihedryny. W ten sposób sekwencję zasad odpowiadającą sekwencji aminokwasów białka polihedryny w publikacji Serebryani'ego i innych, znaleziono wśród sekwencji zasad fragmentów DNA pochodzących od wirusa; zidentyfikowano również inicjujący translację kodon ATG. Wśród szeregu plazmidów otrzymanych przy różnej długości oddziaływania Bal31, oznaczono symbolem p9B241 plazmid wykazujący brak 29 zasad przed kodonem ATG inicjującym translację genu polihedryny i strukturalnego genu polihedryny łączenie z ATG.

Podobnie plazmidy wykazujące brak 82 par zasad, 19 par zasad, 18 par zasad i 7 par zasad przed ATG, ATG i następnych nazwano kolejno p9B587, p9B310, p9B276 i p9B585, a wykazujących brak 23 par zasad za ATG nazwano p9B312. Sekwencje zasad tego regionu przedstawiono na figurze 4.

D. Konstruowanie plazmidów wykazujących brak części ze strukturalnym genem polihedryny.

Plazmid poddaje się działaniu EcoRI i Aatll; plazmid p8H225, skonstruowany w C-l, poddaje się osobno działaniu EcoRI, Aatll i Scal; niepotrzebny pochodzący z pUC8 fragment przekształca się w mały kawałek pod działaniem Scol. Każdą z mieszanin reakcyjnych zadaje się fenolem, potem chloroformem i wreszcie etanolem celem wytrącenia. Oba wytrącone DNA poddaje się razem ligacji i transformuje Escherichia coli K12 JM83 otrzymanymi plazmidami. Plazmidy ekstrahuje się z transformantów i wyselekcjonowuje się plazmid, w którym oba górny i dolny pochodzące od wirusa fragmenty DNA są odpowiednio ukierunkowane. Cięcie różnymi enzymami restrykcyjnymi wykazało, w ten rekombinowany plazmid zaiwera marker oporności i na ampicilinę i zawiera górną część wirusowego DNA, która zaczyna się od 30-ej pary zasad w górę od startowego kodonu ATG dla genu polihedryny i sięga długością około 3 kb w górę od wspomnianej 30-ej pary zasad, ta część obejmuje rejon promotora, przy czym wspomniana część jest nietranslacyjną częścią łącznie z promotorem oraz dolną część około 3,1 kb w dół od terminalnego kodonu dla wspomnianego genu, wykazującą jednakże brak około 300 par zasad w dół od terminalnego kodonu, każdą część w tym samym kierunku jak w pierwotnym wirusie. Plazmid ten był zdolny do propagacji w organizmach Escherichia coli; oznaczono go symbolem p89B241. Podobnie skonstruowano p89B587, p89B310, p89B276 i p89B585 stosując kolejno p9B310, p9B587, p9B276 i p9B585.

E. Wprowadzenie genu α-IFN - konstruowanie pIFN-1 -B241.

i/Gen leukocytowy IFN wyszukuje się z bibliotek i rekombinantów ludzkiego genomu λ faga Charon 4A (Lawn i inni, Celi, 15,1157 - 1174 (1978)), otrzymany w ten sposób DNA zawierający gen c-IFN-J poddaje się działaniu Hind III i EcoRI, wyodrębnia fragment zawierający gen σ-IFN-J metodą elektroforezy na żelu agarozowym i poddaje ligacji z pUC9 traktowanym Hind III i EcoRI. Otrzymanym plazmidem transformuje się Escherichia coli K12 JM83. Wydobyty z transformanta plazmid poddaje się działaniu Mst II i Pvu II - wyodrębnia fragment DNA zawierający gen α-IFN-J i przyłącza łącznik Smal (Takara Shuzo) do obu końców tego fragmentu. Produkt połączenia poddaje się działaniu Smal i liguje z fragmentem Smal z plazmidu p89B241 otrzymanym w przykładzie D, uzyskując rekombinowany plazmid. Po potwierdzeniu, że gen σ-IFN-J wprowadzono do plazmidu w odpowiednim kierunku, transformuje się tym plazmidem Escherichia coli K12 JM83 i hoduje wytwarzając dużą ilość plazmidu, którego oznaczono symbolem pIFN-l-B241. Wplazmidzie tym po części przed gen polihedryny odokoło-3 kbparyzasaddo-30

152 355 pary zasad występuje posiadająca 13 bp pozostałość łącznika użytego przy konstruowaniu plazmidu p89B241 i dalej posiadający 32 bp 5'-nietranslacyjny rejon pochodzącego od chromosomu genu σ-IFN-J, po którym to rejonie kolejno występował gen σ-IFN-J, zaczynający ATG i posiadający odpowiedni kierunek. Ponadto, znajdowała się jeszcze część za genem polihedryny, od pary zasad około 300 bp -za kodonem terminalnym do pary ' zasad około 3,1 kbp za wspomnianą parą zasad, przyłączona do wspomnianego genu σ-IFN-J.

ii/ Escherichia coli K12 . JM83 transformuje się powyższym plazmidem, mianowicie produktem ligacji wyżej . wspomnianego fragmentu Hind III - EcoRl, zawierającego σ-IFN-J gen, z pUC9. Plazmid 'wydobywa się z transformantu, poddaje działaniu Hpa II, wyodrębnia -fragment. DNA zawierający σ-IFN-J gen i poddaje ligacji z produktem połączenia chemicznie zsyntetyzowanego oligomeru CGGGCCATC fosforylowanego z użyciem ATP-³²P i T< polinukleotydowej kinazy (Takara Shuzo) z innym syntetycznym oligomerem CCGGGATGGCC. Produkt ligacji rozdziela się elektroforetycznie na żelu agarozowym i ekstrahuje, następnie znów fosforyluje stosując ATP³²P i polinukleotydową kinazę T< i poddaje ligacji z fragmentem Xmal plazmidu p89B241 otrzymanego w przykładzie D, uzyskując rekombinowany plazmid. Po potwierdzeniu, że gen σ-IFN-J został wprowadzony do plazmidu w prawidłowym kierunku transformuje się Escherichia coli K12 JM83 wspomnianym plazmidem i hoduje, dzięki czemu wytwarza się plazmid w dużej ilości. Plazmid ten oznacza się symbolem pIFN-2-B-241.

W plazmidzie tym po odcinku przed genem polihedryny, od pary zasad około 3 kb przed do -30- pary zasad, występuje posiadająca 13-bp pozostałość ' łącznika użytego przy -konstruowaniu plazmidu p89B241, następnie gen - σ-IFN-J zaczynający się ATG i wprowadzony w -prawidłowym kierunku, i dalej dolna (od genu polihedryny)- część, sięgająca od pary zasad około 300 bp za kodonem terminalnym do pary około ' 3,1 kb za wspomnianą parą zasad.

W ten sam sposób konstruuje się pIFN-2-B-587, pIFN-2-B310, pIFN-2-B276 i pIFN-2-B585, stosując jako materiały startowe kolejno p89B587, p89B310, p89B276 i p89B585.

iii/Synteza łącznika. Chemiczna synteza oligodeoksyrybonukleotydów. Według raportu H. Ito i innych (Nucleic Acid Research, '10,1755 (1982)), oligomery syntetyzuje się metodą fazy stałej używając żywicy polistyrenowej. W ten sposób przeprowdza się około 100 mg całkowicie zabezpieczonego dwufunkcyjnego dimeru o wzorze 1 w odpowiedni 3-fosfodiester o wzorze 2, działając w roztworze tert-butyloamino-pirydyny 1:9 v/v; i 3-fosfodiester o wzorze 2 kondensuje się z żywicą nukleozydową z wolnym końcem 5' o wzorze 3, stosując jako czynnik kondensujący mezytylenosulfonylonitrotriazolid MSNT w ilości 100 mg. Grupę hydroksylową 5' nieprzereagowanej żywicy o wzorze 3 acetyluje się używając roztworu bezwodnik octowy-pirydyna 1:9 v/v. Dalsze działanie w 2% kwasie trójchlorooctowym TCA-chlorku metylenu daje produkt detrytylacji o wzorze 4. Powyższe szeregi reakcji powtarza się aż do otrzymania właściwej żądanej sekwencji.

Do około 20 mg otrzymanej w ten sposób żywicy ze związanym oligomerem dodaje się 0,5 ml 0,5 M tetrametyloguanidynopirydyno-2-aldoksymu w roztworze pirydyna - woda 15:4. Po 8 godzinach reakcji w temperaturze 37°C zadaje się mieszaninę reakcyjną stężonym wodnym amoniakiem w temperaturze 55°C na okres 8 godzin. Roztwór poddaje się filtracji na żelu stosując 2,5 x 60 cm kolumnę wypełnioną Sephadexem G-50 fine. Otrzymany DMTr-oligomer oczyszcza się następnie metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej HPLC stosując kolumnę z odwróconą fazą SSC-ODS-272 o wymiarach 0,6 x 20 cm i ' roztwory A (0,02 M trietyloamonowy octan pH 7,0) i B (50% acetonitryl w 0,02 Μ ΊΈΑΑ pH 7,0), celem wytworzenia liniowego gradientu stężenia. Oczyszczony w ten sposób DMTr-oligomer zadaje się 80% kwasem octowym w temperaturze pokojowej na okres 20 minut w celu dokonania detrytylacji, a następnie stosuje się tę samą metodę HPLC jak powyżej. Eluat poddaje się dializie w 10 ml Tris - HC1 pH 7,5 - 1 mM EdtA pH 8,0 otrzymując żądany oligomer. Homogeniczność otrzymanego w ten sposób całkowicie zabezpieczonego oligodeoksyrybonukleotydu potwierdza fakt, że chromatografia kolumnowa z odwróconą fazą daje tylko - jeden pojedynczy pik oraz fakt, że elektroforeza na 15% żelu - poliakryloamidowym-7 M moczniku następująca po znakowaniu końca 5' z użyciem ATP-y-^wP i polinukleotydowej kinazy T< daje tyko jedno pojedyńcze pasmo.

iv/ Wprowadzenie genu σ-IFN - konstruowanie pBM034. Plazmid pBM030 . wytwarza się z plazmidu p9B312, co przedstawiono na figurze 5. Plazmid ten zawiera rejon promotora oraz rejon termitatora oryginalnie występujący w BmNPY za wyjątkiem trzech par zasad (3 bp) i zawiera

152 355 poliłącznik pomiędzy tymi rejonami zamiast genu polihedryny, co przedstawia fig. 6. Przedstawiona na figurze 6 metoda wytwarzania p9M312 z p9B312 jest znana jako mutageneza in vitro [bezpośrednia mutageneza oligonukleotydu; Nucleic Acid Research 9 (15) 3647 - 3656 (1981)], którą stosowano również w niektórych innych częściach.

Do wektora (pBM030) wprowadzano gen c-IFN sposobem przedstawionym na figurze 8 i uzyskano pBM034.

F. Transfekcja komórek Bm - wytwarzanie rekombinantu BmNPV.

Wirusowy DNA (ATCC nr 40188) szczepu BmNPV T3 i pIFN-l-B241, w stosunku 1: 100, się z roztworami I i II o następujących składnikach:

I. Woda destylowana. 2,1 ml

Nośnikowy DNA (jądro łososia, 1 mg/ml) 50μ1

BmNPV DNA 10μ1 pIFN-l-B241 DNA 50/zl

M chlorek wapniowy 300μ1

II. 50 mM bufor HEPES pH 7,1 zawierający 0,28 M chlorku sodowego 2,5 ml

Bufor fosforanowy (35 mM Na₂HPO4-35 mM NaHsPO·») 50/zl

Otrzymaną zawiesinę w ilości 1 ml dodaje się do 4 ml pożywki komórek Bm celem wprowadzenia powyższego DNA do komórek Bombyx mori. Po dwudziestu godzinach pożywkę zastępuje się świeżą porcją pożywki. Po 5 dniach dalszej hodowli regeneruje się pożywkę i odwirowuje. Klarowny supernatant poddaje się oznaczeniu na aktywność α-IFN. Ponadto, supernatant otrzymany z regenerowanej pożywki przez wirowanie przy 1000 obrotów na minutę w czasie 5 minut, rozcieńcza się i poddaje oznczeniu metodą łysinek. Po czterech dniach bada się łysinki pod mikroskopem i wybiera łysinki wolne od polihedryny. Po trzech powtórzeniach tej procedury otrzymuje się pojedyńczy szczep wirusowy. Szczepem tym infekuje się komórki Bm i po pięciu dniach hodowli regeneruje się podłoże.

G. Eksprecja c-IFN w Bombyx mori.

W pierwszym dniu piątego stadium larwom wstrzykuje się podskórnie podłoże regenerowane po pięciu dniach hodowli, jak opisano w przykładzie F, lub podłoże regenerowane po pięciu dniach hodowli następującej po infekcji pojedyńczym szczepem wirusowym, w ilości 0,5ml/głowę (10⁷pfu) i karmi liśćmi morwy w temperaturze 25°C przez pięć dni. Następnie wbija się igłę do wyrostka odwłoka i zbiera płyn ustrojowy do probówki EppendorFFa chłodzonej lodem. Płyn ustrojowy, z dodaną równą objętością pożywki TC-10, odwirowuje się z prędkością 10000 obrotów na minutę przez pięć minut i oznacza w supernatancie aktywność a-IFN.

H. Oznaczanie biologiczne c-IFN i/ Pomiar aktywności. Zgodnie z raportem C. Philip'a i innych [Methods in Enzymology, 78 387-394 (1981)], określanie aktywności c-IFN przeprowadza się oznaczając inhibicję efektu cytopatycznego (50% CPE inhibition) na płytce do mikromiareczkowania o 96 wgłębieniach, stosując ludzkie, pochodzące z owodni komórki FL i wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej vesicular stomatifis virus VSV-, i porównując ze standardem α-IFN z NIH. Otrzymane wyniki przedstawiono w tablicach 1 i 2 dla każdego pojedyńczego szczepu wirusa.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania produktu genu egzogennego dla wirusa jądrowej polihedrozy u Bombyx mori (BmNPV), znamienny tym, że reprodukuje się w hodowli komórek lub u gospodarza zrekombinowany DNA wytworzony przez rekombinację z dwuniciowym DNA zawierającym (i) fragment DNA z BmNPV, pierwotnie występujący przed rejonem promotora genu strukturalnego

152 355 kodującego białko polihedrynowe w kierunku 5', wraz z przyległym do niego rejonem promotora tego genu strukturalnego, (ii) kodon inicjujący translację i (iii) gen kodujący produkt egzogenny dla wymienionego wirusa, skutecznie związane z rejonem promotora we fragmencie DNA z BmNPV w kierunku 5'.
2. Sposób wedługzastrz. 1, znamienny t ym, że zrekkoibinnwany BmNPV reprooukuje s ię w linii komórkowej z Bombyx mori lub w żywych jedwabnikach.

B3 0 B? 0 I II | II

DMTr-0j0-0-0--0-ę--(CH 2 )2 CN 0 0

WZÓR 1

B3 0 B2 o

DMTr- oJ-O-^-oJ-O-P-CA^N®

0 0 JL Cl 1 Cl

WZÓR 2

Bi 0 0

I 11 ll / >

HOj-O- C-(CH₂)₂C-NHCH2-<2>-R5 WZÓR 3 ilMPPT iilTCA

B3 0 ³ II

B? 0

Bi 0 ‘ II

I II I II I II II /=\

HOjO- P0J--P-0Jo- (HC^^C-NHC^-dJ-R wzOr λ

SCHEMAT

FiG. 2

BmNPV DNA pBmE36

CL .

'B

I □' o ' m ^- I ^a

1,8. Kb-3.9Kbmz

L

-3.1Kb-10.6Kb

FiG. 3 A
5' ’^38£aggaagaggttatactaaac

TGTTACATTGCAAACGTG6TTTCGTGTACCAAATGTGAAA

ACCCATGTTTGATCAAGGTCTGACACATTTTTACAATTA C^jACTCCAAGTGT(5T(^CG3G(^GJA3G(^/LTGCC.TCTTTTAATC AAATCACAAGATGTGTATAAAACACAAAACTGAA^AAAAA TGAAAACTGTAGACAAGATCTGTCCGTTTGGTGGCAAATG CAAG<G3GCACAATCAAATTTGTAATTATTGAACAATAAAA CAATTATAAATGTCAAATTTGTTTTTTATTAACG ATACAA ATGG/AATAATAACCATCTCGCAAATA>AATAAGTATTTTA ATGTTTTCGTAAAAGTTTTGTAATAAAAAAACCTATAAAT i^JJCCGAATTATTCTTACAAXC<AACATCGGGAGTAATT AAGTGTAAGACAATAAATATTAAAAAAAATTGGG CTGTCT TATAAAAAAAGACAAGAGAAAGAAGAAAATAGTCGAAAAT GAACAAGAGGAGAAGC AATGGG ATATTCTAGACAAATAAA TGGTTGCGCAA5ATACCTTTΓTAGGACCGGGAAAAAAAAA AAAAATTAACCTTTTTAAAGAAATTCGAAG'ΓGTGAAAACA GATACAATGAAGTTAATCGTAAACTGGAGAGGAAAAGAGT TTTTGCGTGAAACTTGGACCAGTTTTGTTGAGGAAAGATT ACCCATTGTAAAAGAAAAAGAGGTGATGGAAGTGTACATA GTAGCCAAACTCAAACACAAACGCCCCAACAGGTGCTAAA AGTTCATCGCTCAACAAGCTCTTAG<5TGGGAAGAAGAATA CGTGCAXACGGA<yΓAATCAGMTTATGGAGACATCCTAA GTG(X:>GATGGACAA(A3AA'TACAGAATTAGTATGGCTAAAA AGM>CA©CAGGCTGCAAATCAT<GAAATCCAAAGAGAGTA

F'iG. 3 B

AAACAAATAGTTCGAGTAGTTTGTGAACCGCGTCATATGG GAGAAATTATACAAACCCATCGTTTACATAGGAAAAGACT ATGAAGAAGAAGA(G3AAATACTAATTGAGGT T TCTCT CGT TTTCAAAATAAAGGAGTTTGAA(AAGAAGAGCATATGTTC ACTOGTCCGGCGTATTAAAACACTATACATTGTTATTAGT AAATTTATTAAGAGTTAGATTCTGTGAGTT3TTGATTTAA AGAAAATTGTTGTAA37ATTTTAATAATTCATTAAATTTG TAATATTTAGGGTGGTATGTTAGAGCG/kAAATCAAATGAT TTTAAAGTAGTATTTGTATATGAATTTAAATATTAAATAC TCAATAGATTTGTAAAATAGGTTTCGATTGGTTTAAAAAA AG<G3TTGTTTTTGAAAACCGATGGATGGACTATATAATGG ATTTTCGATCAACACCACACGACTTG CCAAATCTTGTAGC AGCAATCTAGCTTTGTCGATATTCGTTTGTGTTTTGTTTT GTAATAAAGATTAGACGTAGTTCAAAATATTATGAGCTTT TGTATTTTTTTCATCACTGTCGTTGGTGTACAATTGAATC GACGTAAACACGTTAAATAAAGCTT 3 '

1185

FiG. 4 , 8 7«TA cl

5’ - CG A

AA AT GG A A A T A A T A AC C A T

CTCGCAAATAAATAAGTATTTTACTG

2 4 1«^ 2 7 ——I

-30 310—H ttttcgtaIacagttt tg tIaIa taa a a a

5 8 5—|

-1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 aaccItataaat-atg-ccg-aat-tat312—1 Pro ^Asn Tyr

1314415 161718 192021 222324 252627 282930 313233

TCA-TAC-ACC-CCC-ACC-ATC-G -3’

Ser Tyr

FiG. 5 pQB312 (plazmid serii p9B) bromek etydyny. DNasa I twarty kolisty DNA (niciowy plazmid ) ' 21 mer ACCTATTAGATATCCCGAaTA polimeraza I i l i gaza TA heterodupleks plazmid - E.coli MC1061 (mutageneza jn yitro)

P9M312 1 EcoRI ρΒφΕ36 , EcoRI

PUC9 I EcoRI polimeraza I ' ligacja p9BmE2

Jxt>^aI i EcoRI fragment o 6,5kb poHmeraza ^I

- ligacja E. coli MC1061

ΡΒΧ010 ' 33 mer GGTCCGGCGATATCTGAAAGGGCTTAAAACAC (mutageneza in yitro)

PBM010

- Xtbil, EcoRV

29 mer 5' CTAAGAGCAC(CC>GGAA'AnCCATGGATAA 3^,e 33 mer 3' GATTCTCGAGGGOGCTTAAGGTACCTATAGATC 5’’ _v E.coli MC1061 ^pBM030 syntetyzowan^y mutator — rejon promotora

TG T AAT AAAAAAACC TAT AGA TC T A AG AGCljcC CGGG kmcIęATGG AT ATJCTAGAT AG G C Cl | EcoRI Ncol

TAA

Smal

Xbal EcoRV Aat I

FiG. 6

FiG 7 pBmE36 j EcoRI fragment o 10.6kb

PUC 9

EcoRI ligacja p9BmE-2 uXbaI i Sca I polimeraza I Sma I fragment o 7,3kb l-:I ligacja plazmid serii p IFN 2BN plazmid seri i pIFN 2B υ BamHi i Sca I polimeraza I fragment o 6,0 kb _J

PIFN-1-B241 v bromek etydyny. DNasa I -25 mer AAGGATTGATATCTAGACTGGTTCA. ,_f (mutageneza in vitro) pTK-9-58 I Hpall, Xbal fragment zawierający oC -IFN

9 mer AATATGGCC pBM 030 11 mer TTATACCGGGC J Bgl II. Xbal <- , ligacja