PL152518B1 - Sposób wytwarzania kompleksu antybiotycznego A-21978C i jego czynników - Google Patents

Description

Twórca wynalazku —

Uprawniony z patentu: Eli Lilly and Company,

Indianapolis (Stany Zjednoczone Ameryki)

Sposób wytwarzania kompleksu antybiotycznego A-21978C i jego czynników

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania kompleksu antybiotycznego i jego czynników.

Rodzina antybiotyków A-21978C to znakomite środki przeciwbakteryjne. Szczególnie ważną grupą pochodnych A-21978C są związki o wzorze przedstawionym na rysunku, ujawnione w opisie patentowym St.Zjedn. Am. nr 4 537 717. Dotychczas wytwarzano te pochodne w procesie wieloetapowym, który jest czasochłonny i drogi. Znany sposób wytwarzania pochodnych o wzorze przedstawionym na rysunku, takich jak pochodna n-dekanoilowa A-21978C, wymagał przeprowadzenia następujących etapów:

1. Fermentacja szczepu wytwarzającego A-21978C.

a) Inicjowanie procesu hodowlą z ampułki z ciekłym azotem.

b) Etap pierwszego inokulum (48 godzin).

c) Etap drugiego inokulum (24 godziny).

d) Etap trzeciego inokulum (24 godziny).

e) Fermentacja (140 godzin).

2. Filtracja, adsorpcja na żywicy, elucja i zatężanie.

3. Przygotowanie kompleksu zabezpieczonego grupą III-rz.-biutoksykarbonylową (t-Boc).

4. Zatężanie zabezpieczonego kompleksu.

5. Fermentacja drobnoustroju dezacylującego, np. Actinoplanes utacensis.

a) Inicjowanie procesu hodowlą z ampułki z ciekłym azotem.

b) Etap pierwszego inokulum (72 godziny).

c) Etap drugiego inokulum (48 godzin).

d) Fermentacja (67 godzin).

6. Dezacylacja kompleksu za pomocą drobnoustroju dezacylującego.

7. Filtracja, absorpcja na żywicy, elucja i zatężanie.

8. Powtórne acylowanie.

9. Hydroliza grupy zabezpieczającej.

10. Końcowe oczyszczanie.

152 518

Odpowiednimi drobnoustrojami wytwarzającymi A -21978C są szczepy Streptomyces roseosporus NRRL 11379 (A-21978.6) i nowy NRRL 15998 (A-21978.65), mutant szczepu NRRL 11379. Szczepy te są zdeponowane w kolekcji szczepów Northern Regional Research Center, U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois 61604, gdzie sę one dostępne ogólnie pod numerami NRRL 11379 i NRRL 15998. Szczep S. roseosporus NRRL 11379 oraz warunki jego stosowania i wytwarzania antybiotyków A-21978C zostały opisane w opisie patentowym St.Zjedn.Am. nr 4 331 594.

Występującymi w naturze czynnikami A-21978C, opisanymi w opisie patentowym St.Zjedn.Am. nr4331 594, są czynniki Co, Ci, C₂, C3, C4 i C5. W czynnikach Ci, C₂, C3, C4 i C5 R we wzorze przedstawionym na rysunku jest specyficzną grupę Cio-Ci₂-alkanoilową. Czynnik Co kompleksu A-21978C, który jak sądzono zawierał rozgałęziony boczny łańcuch Cio-alkanoilowy, okazał się być mieszaniną dwóch składników w przybliżonym stosunku 2:1. Główny składnik zawiera rozgałęziony łańcuch boczny o 10 atomach węgla, a składnik pomniejszy zawiera prosty łańcuch boczny o 10 atomach węgla.

Dla wygody, przy omawianiu sposobu wytwarzania związku o wzorze przedstawionym na rysunku, nazywa go się także czynnikiem A-21978C. Poza występującymi w naturze czynnikami, do oznaczania czynników liczby wskazujące długość łańcucha bocznego. Np., związek o wzorze przedstawionym na rysunku, w którym R oznacza grupę oktanoilową, wytwarzany sposobem według wynalazku, określa się jako czynnik A-21978Ce.

Po zakończeniu fermentacji wytworzony związek o wzorze przedstawionym na rysunku można wyodrębniać znanymi metodami (patrz np. opis patentowy St.Zjedn.Am. nr 4 331 594).

Wynalazek dotyczy ulepszonego sposobu wytwarzania antybiotyków A-219978C polegającego na hodowaniu nowego szczepu Streptomyces roseosporus NRRL 15998, w warunkach podpowierzchniowej fermentacji aerobowej, aż do uzyskania znacznego poziomu antybiotyków A21978C. Kompleks antybiotyczny A-21978C można ekstrahować z brzeczki fermentacyjnej i z grzybni polarnymi rozpuszczalnikami organicznymi. Poszczególne czynniki A-21978C można też rozdzielać i dalej oczyszczać znanymi metodami, np. metodą chromatografii kolumnowej.

Zazwyczaj drobnoustrój wyizolowany ze źródeł naturalnych (,,dziki“) wytwarza antybiotyk z małą wydajnością. Często wytwarzanie antybiotyków nie przebiega prawidłowo, zatem szczepy o zwiększonej aktywności oraz szczepy powtarzalnie wytwarzające antybiotyki przedstawiają wielką wartość.

Sposób według wynalazku jest znacznie ulepszonym sposobem wytwarzania antybiotyków A-219978C na drodze hodowania szczepu Streptomyces roseosporus NRRL 15998 lub jego wytwarzającego A-21978C mutanta, warianta lub rekombinanta, w pożywce hodowlanej zawierającej przyswajalne źródła węgla, azotu i sole nieorganiczne w warunkach pozapowierzchniowej fermentacji aerobowej, aż do wytworzenia antybiotyków A-21978C. Kompleks antybiotyczny A-21978C lub poszczególne czynniki można wyodrębniać stosując różne znane metody wyodrębniania i oczyszczania.

Drobnoustrój stosowany w tej części wynalazku oznaczono symbolem A-2i978.65. Szczep ten uzyskano drogą selekcji i mutacji z drobnoustroju oznaczonego symbolem A-21978.6 (NRRL 11379). Szczep A-21978.6, zbadany i scharakteryzowany przez Fredericka P.Mertza i Ralpha E.Kastnera z Lilly Research Laboratories, pochodzi z macierzystego szczepu wyizolowanego z gleby z góry Ararat w Turcji. Szczep A-21978.6 został sklasyfikowany jako nowy szczep Streptomyces roseosporus, Falcao de Morias i Dalia Maia, 1961. Klasyfikacji dokonano na podstawie porównania z opublikowanymi opisami (R.E. Buchanan i N.E. Gibbons, „Bergey's Manuał of Determinative Bacteriology, The Williams and Wilkins Company, wydanie 8, 1974; oraz E.B. Shirling i D. Gottlieb, „Coooperative Description of Types Strains of Streptomyces¹¹, Intern. Journal of Systematic Bacteriol. 808-809 /1972/).

Klasyfikację oparto na metodach zalecanych dla „International Stremptomyces Project [E.B. Shirling i D. Gottlieb, „Methods of Characterization of Stremptomyces Species, Inter. Journal of Systematic Bacteriol., 16, 313-340 /1966] oraz na różnych dodatkowych testach. Przyswajanie węgla oznaczano na pożywce podstawowej ISP nr 9, do której dodano źródła węgla do końcowego stężenia 1,0%. Źródła węgla wyjałowiono przez sączenie, a pożywkę podstawową wyjałowiono w

152 518 autoklawie. Płytki były gotowe po 14 dniach inkubowania w temperaturze 30°C. Cukry ściany komórkowej oznaczano stosując zmodyfikowaną metodę Lechevaliera (M.P. Lechevalier, „Chemical Methods as Criteria for the Separation of Actinomycetes into Genera“. Praca sponsorowana była przez Subcommittes on Actinomycetes of the American Society of Microbiology, przewodniczący dr Thomas G. Pridham; prowadzona w Institute of Microbiology, Rutgers University, The State University of New Jersey, New Brunswick, New Jersey, 1971). Izomer kwasu dwuaminopimelinowego oznaczano metodą Beckera i wsp. [B.Becker i wsp., „Rapid Differentiation Between Norcadia and Streptomyces by Paper Chromatography of Celi Hydrolysates, Appl. Microbiol., 11, 421-423 /1964/]. Analizę aminokwasów przeprowadzono na przemytych fragmentach ściany komórkowej. Pigmenty melanoidowe oznaczano stosując pożywkę ISP nr 1 (trypton z wyciągiem drożdżowym), ISP nr 6 (agar żelazowy z peptonem i wyciągiem drożdżowym), ISP nr 7 (agar tyrozynowy), ISP nr 7 zmodyfikowana (ISP nr 7 bez tyrozyny) oraz próbę tyrozynową ]Yuzuru Mikami i wsp., „Modified Arai and Mikani Melamin Formation Test of Streptomyces, Intern. Journal of Systematic Bacteriol., 27/3/, 290/1977/]. Hydrolizę skrobi badno testując jodem na obecność skrobi.

Zakres temperatury, tolerancję na NaCl, zakres PH oraz wrażliwość na antybiotyki badano stosując agarową pożywkę ISP nr 2. Próby prowadzono w temperaturze 25,28,30,34,37,40,45,50 i 55°C. Tolerancję na chlorek sodowy badano dodając do agaru 0,1,2,3,4,5,6,8,10 i 12% NaCl. Próbki inkubowano w temperaturze 30°C. Zakres pH badano na agarze od pH 3,0 do 11,0, w przedziałach co 1,0 pH, ustalając pH bezpośrednio przed rozlaniem agaru. Wrażliwość na antybiotyki oznaczano stosując krążki z antybiotykami na zaszczepionych płatkach z agarem.

Barwę ustalano stosując nazwy według metody ISCC-NBS (K.L. Kelly i D.B. Judd, „The ISCC-NBS Methods of Designating Colors and a Dictionary of Color Names, U.S. Departement od Commerce Circ. 553, Washingtony, D.C., 1955).

Symbole w nawiasach zwykłych odnoszą się do serii barw Tresnera i Backusa [H.D. Tresner i E.J.Backus, „System of Color Wheels for Streptomyces Texonomy“, Appl. Microbiol., 11,335-338 /1956/], a symbole barw są podkreślone. Bloki barw według Maerza i Paula podane są w nawiasach kwadratowych (A. Maerz i M.R., Paul, „Dictionary of Color, McGraw-Hill Book Company, Inc., New York, N.Y., 1950). Morfologia.

Hodowla szczepu A-21978.6 zawiera sporofery typu Rectus-Flexibilis /RF/. Łańcuchy zarodników mają >10 zarodników w jednym łańcuchu. Powierzchnia zarodników jest gładka.

Szczep A-21978.6 charakteryzuje się wytwarzaniem przeważająco czerwonej masy powietrznej zarodników i czerwonawo-brązowego spodu. Są także obecne jasnobrązowe rozpuszczalne w wodzie pigmenty. Taką charakterystykę obserwuje się na trzech z 14 pożywek agarowych na płytkach (ISP nr 2, ISP nr 7, TPO). Te trzy pożywki są jedynymi, na których obserwuje się obfity wzrost powietrzny i wegetatywny.

Na dwóch pożywkach agarowych na płytkach, ISP nr 4 i agarze glukozowo-asparaginowym, wytwarzana jest biała do szarej powietrzna masa zarodników z żółtym spodem. Nie obserwuje się rozpuszczalnych pigmentów. Te dwie pożywki podtrzymują dobry, ale nie obfity wzrost powietrzny i wegetatywny.

Stosowano także dziewięć innych pożywek agarowych, ale wzrost i zarodnikowanie były słabe lub nie było ich wcale. Barwa masy powietrznej, jeśli była chociaż słaba, mieściła się w serii barw białej do szarej.

Brak jest pigmentów melanoidowych. Głównymi składnikami ściany komórkowej LL-DAP, glicyna, glukoza i ryboza. Wskazuje to na ścianę komórkową typu I oraz skład cukrozy typu C (R.E.Buchanan i N.E. Gibbons, „Bergery's Manuał of Determinative Bacteriology, The Williams and Wilkins Company, wydanie 8, str. 658, 1974).

W testach laboratoryjnych porównywano z drobnoustrojem A-21978.6 pięć następujących szczepów: Streptomyces albovinaceous ISP5136, ATCC 15833, Streptomyces candidus ISP5141, ATCC 19891, Streptomyces moderatus ISP 5529, ATCC 23443, Streptomyces roseosporus ISP 5122, ATCC 23958, Streptomyces stonii ISP 5395, ATCC 25497.

Szczepy te należą do białych i czerownych serii barw, mają morfologię sporoforów typu RF, gładką ornamentację powierzchni zarodników, oraz, według opisów ISP, nie wytwarzają melaniny i nie mają wyraźnej barwy spodów lub rozpuszczalnych w wodzie pigmentów. Taka charaktery4 152 518 styka wraz z obrazem przyswajania węgla i innymi drugorzędnymi cechami, odpowiada cechom drobnoustroju A-21978.6.

Po porównaniu powyższych szczepów z A-21978.6 w warunkach laboratoryjnych cztery z nich odrzucono. S. Candidus i S. setonii wykazują żółtą masę powietrznych zarodników na wielu . pożywkach co różni je od drobnoustroju A-21978.6. S. albovinaceous i S. moderatus dają wyraźną czarną barwę spodu, oraz wytwarzają rozpuszczalne w wodzie pigmenty melanoidowe, co różni je od drobnoutroju A-21978.6. Opis ISP podaje czerwonawo-brązową lub wyraźnie brązową barwę spodu dla S. moderatus, ale nie dla S. albobinaceus. Żaden z tych szczepów nie jest zaliczany do wytwarzających melaminę.

Drobnoustrój A-21978.6 sklasyfikowano więc jako szczep Streptomyces roseosporus, Falcao de Morias i Dalia Maia 1961. Klasyfikację tę oparto na porównaniu z opublikowanymi opisami i bezpośrednim porównaniu laboratoryjnym. Cechy hodowlane z bezpośrednich badań porównawczych zestawiono w tabelach 1 i 2, a inne właściwości podano w tabelach 3-5. W tabeli 3 znak + oznacza przyswajanie, a znak - oznacza brak przyswajania. W tabeli 5 znak + oznacza, że szczep jest wrażliwy (występuje strefa zahamowania), a znak - oznacza, że szczep nie jest oporny (brak sfery zahamowania).

W próbach, których wyniki podano w tabeli 2, stosowano pożywki oznaczone numerami jak poniżej:

1. Marchew, 2. Ziemniaki, 3. ISP nr 1 (agar z tryptonem i wyciągiem drożdżowym), 4. ISP nr 2 (agar z wyciągiem drożdżowym i słodowym), 5. ISP nr 3 (agar owsiany), 6. ISP nr 4 (agar skrobiowy z solami nieorganicznymi), 7. ISP nr 5 (agar glicerynowo-asparaginowy), 8. ISP nr 7 (agar tyrozynowy), 9. Zmodyfikowany agar Benneta, 10. Agar z jabłczanem wapnia, 11. Agar z roztworem Czapeka, 12. Agar Emersona, 13. Agar glukozowo-asparaginowy, 14. Agar glicerynowoglicynowy, 15. Agar odżywczy, 16. Agar owsiany z pastą pomidorową.

Tabela 1

Morfologia
A-21978.6	S.roseosporus
Sporofory proste do falistych /RF/, nie obserwuje się haczyków, pętli lub spirali. Łańcuchy zawierają >10 zarodników. Powierzchnia zarodników obserwowana w mikroskopie elektronowym jest gładka
Zarodniki: podłużne do owalnych Przeciętna wielkość: 0,85 X 1,78 μτη Zakres wielkości: 0,65-0,97 X 0,97-2,6 μπι	Zarodniki: podłużne do cylindrycznych Przeciętna wielkość: 1,01 X 2,47 χ/m Zakres wielkości: 0,97-1,3 X 1,63-3,25 μ

Tabela 2

Nr
pożywki A-21978.6	S. roseosporus
Wzrost P - powietrzny, W - wegetatywny, oraz cechy dodatkowe	barwa	Wzrost P - powietrzny W - wegetatywny, oraz cechy dodatkowe	barwa
1 2	3	4	5
1 P: dobry; W: obfity; Brak rozpuszczalnego pigmentu	szara c różowa brązowa	P: brak: W: dobry; Brak rozpuszczalnego pigmentu	brak żółto-brązowa
2 P: dobry; W: obfity; Ciemnobrązowy pigment rozpuszczalny	szara c różowa brązowa	P: brak: W: umiarkowany; Brak rozpuszczalnego pigmentu	brak pomarańczowo-brązowa
3 P: umiarkowany; W: dobry;	/W/ a biała P: słaby; [10A1J bladożółtozielona W: słaby;	/W/a biała [10B2] bladożółtozielona

Brak rozpuszczalnego pigmentu ’ Brak rozpuszczalnego pigmentu

152 518

1	2	3	4	5
4	P: obfity; W: obfity; Jasnobrązowy rozpuszczalny pigment	/R/5cbgy. żółto-różowa [5010] 11. czerwonobrązowa	P: obfity: W: obfity; Jasnobrązowy rozpuszczalny pigment	/R/ 3ca bladopomarańczowożółty [12L7] lt. oliwkowobrązowa
.....5	P: umiarkowany; W: umiarkowany; Jasnobrązowy rozpuszczalny pigment	/W/a biała [10a2] bladożółtoróżowa	P: slaby: W: umiarkowany; * Brak rozpuszczalnego pigmentu	/W/a biała bladozielonkawoszara
6	P: dobry; W; dobry; Jasnobrązowy rozpuszczalny pigment	/W/b biała [ 1 OB 1 ] bladożółtozielona	P: dobry: W: obfity; Brak rozpuszczalnego pigmentu	/R/ 3c2 bladopomaraóczowożółta [HIS] szara wo-żółta
7	P: umiarkowany; W; dobry; Różowy rozpuszczalny pigment	/W/ 13ba purpurowawo- P: umiarkowany: biała [3B7]gy. żółto-różowa W: dobry; Jasnobrązowy rozpuszczalny pigment	/W/b biała [10C2] szara wo-żółta
8	P: obfity; W: obfity; Ciemnobrązowy rozpuszczalny pigment	/R/ 5cbżółto-różowa [7L12]umiarkowanie czerwono-brązowa	P: obfity; W: obfity; Jasnobrązowy rozpuszczalny pigment	/R/ 5cbgy. żółto-różowa [ 11 E5]żółto-brązowa
9	P: brak; W: slaby; Brak rozpuszczalnego pigmentu	bladożółtobrązowa	P: obfity: W: obfity; Jasnobrązowy rozpuszczalny pigment	/R/ 5eb szarożółto-różowa [11D4] szara wożółta
10	P: brak; W: umiarkowany; Jasnobrązowy rozpuszczalny pigment	[7L12] umiarkowanie	P: słaby; /W/a biała W: słaby; bladożółtozielona Bladożółto-zielony rozpuszczalny pigment
11	P: słaby; W: słaby;	/W/a biała biaława	Pbrak; W: brak;	—
12	P: slaby; W: obfity; Brak rozpuszczalnego pigmentu	[13L6]	P obfity; W: obfity; Jasno-brązowy rozpuszczalny pigment	/R/5cb gy. żółtoróżowy [1115] gy. żółta
13	P: dobry; W: dobry; Brak rozpuszczalnego pigmentu	/W/b biała [12B2]gy. żółta	P umiarkowany: W: dobry; Brak rozpuszczalnego pigmentu	/W/b biała [12B2] bładożółto-zielona
14	P. słaby; W: obfity; Brązowy rozpuszczalny pigment	[8L12]ciemna gy.	P: obfity W: obfity; Jasnobrązowy rozpuszczalny pigment	/W/ /WA biała [10G3]ji<ao-tÓłta
15	P: brak; W: słaby; Brak rozpuszczalnego pigmentu	bladożółtoszara	P umiarkowany: W: dobry; Brak rozpuszczalnego pigmentu	/W/b biała bladożółtoszara
16	P: obfity; W: obfity; Brązowy rozpuszczalny pigment	/R/ 5cb gy. żółto-różowa [8L12]dk.gy. brązowa	P obfity; W: obfity; Brązowy rozpuszczalny pigment	/R/ Scbgy. żółto-różowa [12L7]żółtobrązowa

Tabela 3

Substrat	Przyswajanie węgla
A-21978.6	S.roseosporus
L-arabinoza	+	+
D-fruktoza	+	—
D-galaktoza	+	+
D-glukoza	+	+
i-Inozytol	—	—
D-mannitol	+	—
D-rafinoza	—	—
L-ramnoza	+	+
Salicyna	+	+
Sacharoza	—	—
D-ksyloza	+ .	+

152 518

Tabela 4

Charakterystyka	A-21978.6	S. roseosporus
Pigmenty malanoidowe
ISP nr 1 (trypton-wyciąg drożdżowy)	—	—
ISP nr 6 (pepton-wyciąg drożdżowy, agar żelazowy)	—	—
ISP nr 7 (agar ryrozynowy)	—	. —
ISP nr 7 zmodyfikowany (ISP nr 7 bez tyrozyny	—	—
Próba tyrozynowa	—	— .
Upłynnianie żelatyny	+	+
Działanie na mleko zbierane	słaba hydroliza	słaba hydroliza
Hydroliza skrobi	+	+
Zakres pH	5-11	5-11
Zakres temperatury	25-40°C	25-45°C
Redukcja azotanów, wzrost do stężenia	10%	6%

Tabela 5

Antybiotyk	Stężenie na krążku	Klasa	Wrażliwość na antybiotyki
A-21978.6	S.roseosporus
Erytromycyna	15/zg	makrolid	+	+
Cefalotyna	30 pg	β-laktam	+	+
Linkomycyna	2pg	glikozyd	. —	—
Nystatyna	100 j.	polien	. —	—
Polimyksyna B	300 j.	peptyd	+	—
Streptomycyna	10/zg	aminoglikozyd	+	+
Tetracyklina	30pg	tetracyklina	+	+
Wankomycyna	3ty/g	glokopeptyd	+	+

Pewne cechy szczepu A-21978.6 różnią się od cech opisanych dla S.reseosporus. Hodowla szczepu A-21978.6 różni się od opisanego szczepu pod względem wielkości zarodników, wzrostu na marchwi i ziemniakach, tolerancji NaCl i redukcji azotanów.

Szczep A-21978.65 posiada cechy identyfikacyjne takie jak szczep A-21978.6, ale różni się pod względem ilości wytwarzanych antybiotyków A-21978C. Wcześniejszy szczep wytwarza w najlepszym przypadku nie więcej niż 100//g antybiotyków A-21978C w mililitrze brzeczki fermentacyjnej. Ulepszony szczep A-21978.65 wytwarza co najmniej 2,5 razy większą ilość w fermentatorach i aż 18 razy więcej podczas fermentacji w kolbach trzęsawkowych. Ta zwiększona zdolność wytwarzania A-21978C przez nowy szczep umożliwia otrzymywanie tych antybiotyków w znacznie lepszy sposób.

Jak to ma miejsce i w przypadku innych drobnoustrojów, cechy nowego szczepu wytwarzającego A-21978C, Streptomyces roseosporus NRRL15998, podlegają wariacjom. Rekombinanty, warianty i mutanty szczepu NRRL 15998 mogą być otrzymywane drogą działania różnymi znanymi czynnikami mutagennymi, takimi jak promieniowanie UV, promieniowanie rentgenowskie, fale wysokiej częstotliwości, promieniowanie radioaktywne oraz czynniki chemiczne. Naturalne i indukowane warianty, mutanty i rekombinanty szczepu Streptomyces roseosporus NRRL 15998, które zachowują zdolność wytwarzania z wysoką wydajnością antybiotyków A-21978C, mogą być również stosowane w sposobie według wynalazku.

Jako pożywkę dla wzrostu szczepu Streptomyces roseosporus NRRL 15998 można stosować dowolną ilość wielu pożywek. Niektóre pożywki są jednak korzystne ze względu na ekonomikę procesu, optymalną wydajność i łatwość izolowania produktu. Np., korzystnym źródłem węgla w fermentacji w wielkiej skali jest dekstryna z tapioki, chociaż można również stosować glukozę, fruktozę, galaktozę, maltozę, olej z nasion bawełny, oleinian metylu, glicerynę, rafinowany olej sojowy i podobne. Korzystnym źródłem azotu jest enzymatyczny hydrolizat kazeiny, ale można także stosować rozpuszczalny pepton mięsny, mąkę sojową, hydrolizat sojowy, śrutę sojową, drożdże, aminokwasy, takie jak L-asparagina i DL-leucyna, i podobne. Do odżywczych soli nieorganicznych, które można dodawać do pożywek hodowlanych, należą rozpuszczalne sole zawierające jony potasowe, amoniowe, chlorkowe, siarczanowe, azotanowe i podobne. Szczegół152 518 7 nie przydatny dla wytwarzania antybiotyków jest siarczan potasowy. Także przydatne są suszona melasa, dializat suszonej melasy i syntetyczne mieszanki mineralne.

W procesie wytwarzania antybiotyków A-21978C korzystne jest stosowanie destylowanej lub dejonizowanej wody, gdyż niektóre związki nieorganiczne zawarte w wodzie wodociągowej, np. zawierające jony wapniowe i węglanowe, wydają się przeszkadzać wytwarzaniu antybiotyków.

Do pożywki trzeba dodawać podstawowe mikroelementy niezbędne dla wzrostu i rozwoju drobnoustroju. Zazwyczaj jednak te mikroelementy towarzyszą w postaci zanieczyszczeń innym składnikom pożywki w ilościach wystarczających na pokrycie wymagań wzrostowych drobnoustroju.

Może być niezbędne dodwanie małych ilości (np. 0,2ml/litr) środka przeciwpieniącego, takiego jak glikol polipropylenowy, w tym przypadku fermentacji w wielkiej skali, jeśli powstaje problem pienienia.

W przypadku wytwarzania znacznych ilości antybiotyków A-21978C korzystnie prowadzi się podpowierzchniową fermentację aerobową w fermentorach. Natomiast małe ilości antybiotyków A-21978C można otrzymywać w hodowli w kolbach trzęsawkowych. Ze względu na opóźnienie w wytwarzaniu antybiotyku, zwykle związane ze szczepieniem dużych fermentorów zarodnikującą postacią drobnoustroju, korzystne jest stosowanie inokulum wegetatywnego. Inokulum wegetatywne przygotowuje się przez zaszczepienie małej ilości pożywki zarodnikującą postacią lub fragmentami grzybni drobnoustroju. Otrzymuje się w ten sposób świeżą, znajdującą się w fazie wzrostu hodowlę drobnoustroju. Inokulum wegetatywne przenosi się następnie do większego fermentora.

Nowy szczep wytwarzający A-21978C może wzrastać w zakresie temperatury od około 20°C do około 40°C. Optymalną wydajność A-21978C uzyskuje się w temperaturze około 30-32°C.

Jak to zwykle ma miejsce w procesach podpowierzchniowej hodowli aerobowej, przez pożywkę przepuszcza się jałowe powietrze. Dla zapewnienia efektywnego przebiegu procesu wytwarzania antybiotyków A-21978C, procent nasycenia powietrzem w fermentorach powinien być wyższy od 20%, korzystnie powyżej 30% (temperaturze 30°C i pod ciśnieniem około 98,1 kPa).

W hodowli w fermentorach korzystne jest utrzymywanie wartości pH pożywki w zakresie około 6,5-7,0. Uzyskuje się to drogą dodawania odpowiednich ilości, np. wodorotlenku sodowego we wcześniejszych stadiach oraz kwasu solnego w późniejszych stadiach.

Powstawanie antybiotyków A-21978C można śledzić w czasie fermentacji pobierając próbki brzeczki lub ekstraktów grzybni i oznaczając aktywność antybiotyczną wobec drobnoustrojów wrażliwych na te antybiotyki. Jednym z drobnoustrojów, użytecznych do testowania wytwarzanych antybiotyków jest Micrococcus lutens. Badanie bilogiczne prowadzi się korzystnie stosując krążki bibułowe na płytkach z agarem.

Alternatywnie, stałe składniki pożywki, w tym zawierające grzybnię, można stosować bez ekstrakcji lub wyodrębniania, ale korzystnie po usunięciu wody, jako źródło antybiotyków A21978C. Np., po zakończeniu produkcji antybiotyków A-21978C brzeczkę można liofilizować i stosować bezpośrednio jako dodatek do przedmieszek paszowych.

Związki o wzorze przedstawionym na rysunku są doskonałymi środkami przeciwbakteryjnymi.

Sposob według wynalazku ilustrują poniższe przykłady.

Przykład I. Wytwarzanie kompleksu A-21978C.

Przygotowano hodowlę podstawową i utrzymywano ją w parach ciekłego azotu. Streptomyces roseosporus NRRL 15998, utrzymywany uprzednio w parach ciekłego azotu, stosowano do zaszczepienia 50 ml pożywki wegetatywnej o następującym składzie.

Składnik Ilość (%)

Bulion tryptykazowo-sojowy^x’ 3,0

Dekstryna 2,5

Woda dejonizowana 94,5 ^x> Baltimore Biological Laboratories, Cockeysville, MD.

152 518

Zaszczepioną pożywkę inkubowano w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml, w temperaturze 30°C w ciągu 48 godzin, na trzęsąwce obrotowej o skoku około 5 cm i 250 obrotach/minutę. Dojrzałą hodowlę wegetatywną rozlano do wielu pojemników, po 0,5 ml (pojemnik przechowywano w parach ciekłego azotu).

W celu uzyskania większej jednorodnej ilości materiału, jeden milimetr hodowli utrzymywanej w ciekłym azocie stosowano do zaszczepienia 80ml powyżej opisanej pożywki wegetatywnej. Zaszczepioną pożywkę wegetatywną inkubowano w kolbach Erlenmeyera o pojemności 250 ml, w temperaturze 30°C w ciągu 48 godzin, na trzęsawce obrotowej o skoku około 5 cm, przy 250 obrotach/minutę.

Dziesięć mililitrów powyższej hodowli stosowano do zaszczepienia 450 ml wegetatywnej pożywki wzrostowej drugiego stadium o takim samym składzie jak opisana powyżej pierwsza pożywka wegetatywna. Pożywkę w drugim stadium inkubowano w kolbie Erlenmeyera o pojemności 2 litrów, w ciągu 24 godzin, w temperaturze 30°,na trzęsawce obrotowej o skoku 5 cm, przy 250 obrotach/minutę.

Jeden litr wegetatywnej hodowli z drugiego stadium stosowano do zaszczepienia 39 litrów jałowej pożywki wzrostowej trzeciego stadium o następującym składzie:

Składnik	Ilość (%)
Mąka sojowa	0,5
Wyciąg drożdżowya	0,5
Glukonian wapniowy	1,0
KClb	0,02
MgSO4-7H2Ob	0,02
FeSO4-7H2Ob	0,0004
Sag471 (środek przeciwpieniący)c	0,03
Woda	97,9296

^a Difco Laboratories, Detroit MI ^b Roztwór zawierający pierwiastki śladowe przygotowano następująco: FeSC>4’7H2O (7,6 g) rozpuszczono w 76 ml stężonego kwasu solnego, dodano 380 g MgSO4’7H₂O, 380 g KC1 i wodę dejonizowaną do objętości 3800 ml. Aby zapewnić właściwą ilość pierwiastków, stosowano 80 m’ - otworu na 39 litrów pożywki wzrostowej trzeciego stadium.

^Ł Union Carbide, Danbury Cl.

Zaszczepioną pożywkę inkubowano w ciągu ^4 godzin w fermentorze ze stali nierdzewnej w temperaturze 30°C, napowietrzając jałowym powietrzem z szybkością 0,85 objętości na objętość na minutę i mieszając typowym mieszadłem przy 350-350 obrotach/minutę.

W fermentorze utrzymywano nadciśnienie około 34,5 kPa.

Jeden litr inkubowanego inokulum z trzeciego stadium stosowano do zaszczepiania 119 litrów jałowej pożywki produkcyjnej o następującym składzie.

Składnik	Ilość (%)
Mąka sojowa	2,2
Fe/NH4/2SO4 · 6H2O	0,066
Dekstroza	0,825
Sag 471	0,022
Dekstryna ziemniaczana	3,3
Melasa	0,275
Woda wodociągowa	93,312

Wartość pH skorygowano do 7,0 po dodaniu pierwszych dwóch składników i powtórnie po dodaniu wszystkich składników, bezpośrednio przed sterylizacją.

Zaszczepioną pożywkę produkcyjną inkubowano w ciągu 6 dni w nierdzewnym stalowym fermentorze w temperaturze 30°C i napowietrzano jałowym powietrzem z szybkością 0,5 objętości na objętość na minutę. Mieszano typowym mieszadłem przy 250 obrotach/minutę do piętnastej godziny i przy 350 obrotach/minutę po 15 godzinie. Wartość pH utrzymywano na poziomie 6,5 lub powyżej dodają roztwór wodorotlenku amonowego. Wydajność kompleksu A-21978C wynosiła 0,282 g/litr brzeczki po zakończeniu fermentacji. Zawartość poszczególnych czynników podano w tabeli 6.

152 518

Przykład II. Wytwarzanie kompleksu A-21978C w hodowli w kolbach na trzęsawce. Postępowano tak jak opisano w przykładzie I, lecz stosując dla hodowli w kolbach na trzęsawce następującą pożywkę do fermentacji.

Składnik Ilość (g/litr)

Glukoza 7,5

Dekstryna’ 30

Enzymatyczny hydrolizat kazeiny⁶ 5

Pepton^c 5

Melasa 2,5

Woda dejonizowana do 1 litra ^a Stadex 11, A.E.Staley Co., Decatur IL ^b NZ Aminę A, Humko Sheffield Chemical, Lyndhurst NJ ^c Biosate, Baltimore Biological Laboratories, Cockeysville MD Wydajność kompleksu A-21978C po fermentacji wynosiła 1800Mkg/ml brzeczki. Przykład III. Wytwarzanie kompleksu A-21978C i jego czynników w różnych warunkach. Postępowano zasadniczo tak jak w poprzednich przykładach, stosując dwa różne szczepy drobnoustroju NRRL15998 i wprowadzając następujące zmiany. Prekursor wprowadzano w kwasie oleinowym w stężeniu 50% objętościowych z taką szybkością by uniknąć jego nadmiaru. W celu wytworzenia odpowiedniego inokulum szczepu A-21978.6 stosowano stadium hodowli na skosie z użyciem takiej samej pożywki jak w stadium wytwarzania pierwszego inokulum, lecz zestalonej agarem. Po inkubacji przez 7 dni w 30°C połowę hodowli z powierzchni skosu użyto do zaszczepienia pożywki w stadium wytwarzania pierwszego inokulum.

Przeprowadzono szereg doświadczeń w różnych warunkach temperatury i pH. Uzyskane wyniki podano w tabelach 6-9. Tabele 6 i 7 ilustrują wpływ odpowiednio pH i temperatury na przebieg procesu wytwarzania kompleksu A-21978 i jego czynnika LY146032 (wzór, w którym R oznacza n-kaprynoil) w przypadku użycia szczepu A-21978.6 a tabele 8 i 9 ilustrują wpływ pH i temperatury na przebieg procesu w przypadku użycia szczepu A-21978.65.

Tabela 6

pH	Czas (godziny)	Stężenie (pg/ml)	% LY146032
5,5	116	165	30
6,0	140	453	56
6,5	140	542	49
7,0	140	493	20
7,5	140	429	17
8,0	116	50	38

T a b e 1 a 7

Temperatura (°C)	Czas (godziny)	Stężenie (pg/ml)	% LY146032
25	140	291	41
27	140	243	36
31	117	599	43
32	140	592	39
34	140	588	50

Tabela 8

PH	Czas (godziny)	Stężenie (//g/ml)	% LY146032
5,5	139	12	58
6,0	115	1153	28
6,5	139	1603	61
7,0	139	1526	58
7,5	139	1560	59
8,0	115	121	35

Tabela 9

Temperatura	Czas (godziny)	Stężenie (//g/ml) % LY146032
25	115	462	60
27	138	1188	50
30	138	1556	67
31	138	1730	47
32	138	1221	58
34	115	477	23
Za	strzeżenia	patentowe

1. Sposób wytwarzania kompleksu antybiotycznego A-21978C i jego czynników, znamienny

Claims (3)

1. Sposób wytwarzania kompleksu antybiotycznego A-21978C i jego czynników, znamienny tym, że Streptomyces roseosporus NRRL 15998 lub jego wytwarzający A-21978C mutant, wariant lub rekombinant hoduje się w pożywce hodowlanej zawierającej przyswajalne źródła węgla, azotu i sole nieorganiczne, w warunkach podpowierzchniowej fermentacji aerobowej aż do wytworzenia antybiotyków A-21978C i ewentualnie wyodrębnia się powstały kompleks A-21978C, po czym ewentualnie wyodrębnia się poszczególne czynniki z kompleksu A-21978C.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w dodatkowym etapie wyodrębnia się kompleks A-21978C z pożywki hodowlnej.

3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stosuje się dodatkowy etap wyodrębniania poszczególnych czynników Co, Ci, C2, C3, C4 lub C5 z kompleksu antybiotycznego A-21978C.