PL153465B1

PL153465B1 - Pesticide

Info

Publication number: PL153465B1
Application number: PL1986262107A
Authority: PL
Priority date: 1985-10-30
Filing date: 1986-10-29
Publication date: 1991-04-30
Also published as: IL80441A0; EP0221024A2; GR3004102T3; US4797279A; GB8526774D0; ZA868281B; CS782986A2; EP0221024A3; ES2035823T3; EP0221024B1; IE862830L; JPS62107782A; PL262107A1; CA1325393C; AU596125B2; KR870004134A; CN86107242A; NZ218078A; DE3684406D1; AU6450986A

Description

RZECZPOSPOLITA OPIS PATENTOWY 153 465 POLSKA

URZĄD

PATENTOWY

RP

Patent dodatkowy do patentu nr--Int. Cl.⁵ A01N 63/00//

Zgłoszono: 86 10 29 (P. 262107) C12N ^1/00

Pierwszeństwo: 85 10 30 Wielka Brytania

JSUUI

Zgłoszenie ogłoszono: 87 12 28

Opis patentowy opublikowano: 1991 11 29

Twórca wynalazku:--Uprawniony z patentu: Sandoz AG,

Bazylea (Szwajcaria)

Środek owadobójczy

Przedmiotem wynalazku jest środek owadobójczy zawierający hybrydy Bacillus thuringiensis (oznaczone dalej jako B.t.).

Środek, według wynalazku zawiera szczep Bacillus thuringiensis i znane substancje pomocnicze i charakteryzuje się tym, że zawiera hybrydowe komórki bakteryjne zawierające plazmidy z genem kodującym syntezę delta-endotoksyny B.t. kurstaki oraz plazmid z genem kodującym syntezę delta-endotoksyny B.t. tenebrionis, przy czym komórki te są zdolne do syntezy zarówno kryształów delta-endotoksyny typowych dla szczepu B.t. kurstaki jak i szczepu B.t. tenebrionis. Kryształy delta-endotoksyny szczepów B.t. kurstaki mają typową formę bipiramidalną. Kryształy delta-endotoksyny B.t. tenebrionis mają typową formę równoległościanu (lub sześcianu).

Hybrydy B.t. umożliwiają biologiczne zwalczanie szkodników zwalczanych przez ich macierzyste szczepy B.t. kurstaki i B.t. tenebrionis.

B.t.-hybrydy stosowane w sposobie według wynalazaku można otrzymać w znany sposób przez koniugację (połączenie) syntezującego delta-endotoksynę szczepu B.t. kurstaki ze szczepem B.t. tenebrionis syntezującym delta-endotoksynę i wyizolowanie B.t. hybrydów przy zastosowaniu znanej techniki.

Sposoby koniugacji są dobrze znane w inżynierii genetycznej (źródła: np. Gonzalez J.M. i Carlton B.C., 1982, Plasmid Transfer in Bacillus thuringiensis 85-95, Genetic and Cellular Technology, wydawca L.P. Gage, tom i Genetic Exchange, wydawca U.M. Streips et al. Marcel Dekker Inc., Nowy Jork i Bazylea).

Zwykle koniugację przeprowadza się za pomocą sprzęgającego plazmidu. Odpowiednim przykładem takiego sprzęgającego plazmidu jest pAM β i otrzymany ze Streptococcus faecalis, znanego ogólnie jako /3-plazmid. Następnie plazmid ten wprowadza się w znany sposób (np. podany przez Fischera Η. - M 1983, Plasmid und Plasmidiiber tragung bei Bacillus thuringiensis, PHD Thesis ETH nr 7375, Swiss Federal Institute of Technology, ADAG Administration and Druck AG, 83 strony: lub Gonzaleza et al jak podano wyżej) do szczepu B.t. Tak otrzymany szczep B.t. zawierający /3-plazmid może służyć jako donor w koniugacji szczepu kurstaki ze szczepem tenebrionis.

153 465

W celu ułatwienia rozpoznania i izolacji koniugatów zarówno szczep dawcy jak i biorcy są oznakowane genetycznie. Takie oznakowanie można wprowadzić w znany sposób. Tak na przykład wiadomo, że w bakterii gram-dodatniej /ł-plazmid wykazuje odporność na etytromycynę. Właściwość tę można wykorzystać do eliminowania tych wszystkich szczepów, które po koniugacji nie mają tej właściwości.

W przypadku gdy drugi partner koniugacji jest również znakowany np. wprowadzoną lub spontaniczną odpornością w stosunku do innego antybiotyku takiego jak tetracyklina, można eliminować wszystkie szczepy nie mające tych cech (wszystkie szczepy nie koniugowane) przez hodowlę mikroorganizmów w odpowiednim -środowisku hodowlanym zawierającym erytromycynę i tetracyklinę. Tylko organizmy zdolne do rozwoju w takim środowisku mają obie właściwości, odporność na etytromycynę i odporność na tetracyklinę.

Końcową izolację B.t. hybrydów stosowanych w środowisku według wynalazku można przeprowadzić w znany sposób, np. przez wizualną identyfikację kolonii zawierających kryształ typu zarówno szczepów B.t. kurstaki jak i B.t. tenebrionis lub też przy użyciu znanych technik biologiczno/biochemicznych.

Zwykłym postępowaniem - przy otrzymywaniu B.t. hybrydów stosowanych w środku według wynalazku jest koniugacja szczepu B.t. kurstaki ze szczepem B.t. tenebrionis, przy czym szczep dawcy zawiera sprzęgający plazmid i zarówno szczep dawcy jak i szczep biorcy mają odpowiednie selekcyjne cechy genetyczne. W procesie koniugacji korzystnie stosuje się jako dawcę szczep B.t. kurstaki. Na ogół koniugację prowadzi się w odpowiednim ośrodku zawierającym źródło azotu, węglowodany i czynniki wzrostowe, w temperaturze w granicach 20-40°C.

Materiał wyjściowy otrzymuje się w znany sposób wychodząc ze znanych szczepów B.t. kurstaki i B.t. tenebrionis. Czas inkubacji wynosi na ogół 4-96 godzin, przy czym w środowisku ciekłym zwykle stosuje się napowietrzanie lub wstrząsanie.

Środki według wynalazku zawierające hybrydy B.t. mają użyteczne właściwości owadobójcze. Działają one na szkodniki podatne na szczepy B.t. kurstaki jak i szkodniki podatne na szczepy B.t. tenebrionis. Na ogół mają one działanie owadobójcze przewyższające działanie fizycznych mieszanin ich macierzystych partnerów zarówno w zakresie poziomu działania jak i spektrum działania lub w obu zakresach.

Niespodziewane właściwości szkodnikobójcze selekcjonowanych B.t. hybrydów stosowanych w środku potwierdza niżej podana próba biologiczna na aktywność przeciwko larwie Trichoplusia ni, Spodoptera littoralis i Phaedon cochleariae (żaczka warzuchówka).

Próba biologiczna. Zawiesinę w wodzie zawierającą 10^e sporów/ml opryskuje się przeciętne liście kapusty chińskiej mikropistoletem natryskowym do odcieku. Po wyschnięciu oprysku każdy liść jest umieszczony na wilgotnej bibule filtracyjnej w plastykowym naczynku Petriego o średnicy 9 cm. Wprowadza się 10 owadów (2 forma w stadium rozwojowym) do każdego naczynka. Używa się 3 naczynka na każdy gatunek owadów. Próbę prowadzi się w komorze klimatyzacyjnej w temperaturze 25°C i wilgotności względnej 65% i naświetlaniu przez 16 godzin. W tych warunkach larwy żerują na traktowanych liściach przez 5 dni. Ustala się śmiertelność larw i wyraża się ją w %. Otrzymane wyniki zestawiono w tabeli.

Tabela

Szczep hybrydy B.t.	Śmiertelność w % po 5 dniach
Spodoptera	Trichoplusia	Phaedon
L 21001	87	100	100
L 21004	90	100	100
L 21016	97	100	100
L 21017	97	100	100
L 21019	93	100	100
Kui^s^ti^l^i ‘1’ HD73	0	100	0
Tenebrionis <’	0	0	100
Mieszanina „k +1“^<3>	0	100	43

153 465 (1) Z /5-plazmidem (użytym w przykładzie koniugacji) (2) szczep odporny na tetracyklinę (stosowany w przykładzie koniugacji) (3) mieszanina przygotowana przed zastosowaniem oprysku przez dyspergowanie kurstraki⁰' i tenebrionis ^l2> w równych proporcjach i doprowadzona do ogólnego stężenia 10⁸ sporów/ml.

Niektóre ' z wyżej podanych szczepów hydrydów umieszczono w kolekcji Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Peoria, Illinois 61604. USA. Szczepy L 21004, L 21017 i L 21019 są zarejestrowane w NRRL odpowiednio pod numerami B-18011, B-18012 i B-18013. Podane w tabeli dane wykazują, że hybrydy L 21001, L 21004, L 210016, L 21017 i L 21019 wykazują aktywność nie tylko przeciwko gatunkom owadów, które są podatne na ich szczepy macierzyste, lecz niespodziewanie działają na gatunki owadów np. Spodoptera, które nie są podatne na ich szczepy macierzyste. Te wyniki są szczególnie niespodziewane, ponieważ prosta mieszanina szczepów macierzystych jest mniej aktywna niż tenebrionis, stosowany sam, na Phaedon i w ogóle nie działa na Spodoptera.

Środek wedug wynalazku jest stosowany zwykle w postaci koncentratu zawiesinowego lub proszku.

Środki według wynalazku zawierają odpowiednie rozcieńczalniki oraz różne dodatki tolerowane przez mikroorganizmy takie jak środki chroniące przed ultrafioletem, substancje powierzchniowo czynne, emulgatory itp. Środki otrzymuje się w znany sposób zgodny ze sposobem otrzymywania znanych biologicznych, owadobójczych preparatów zawierającch szczep B.t.

Określenie rozcieńczalnik oznacza ciekły lub stały materiał dopuszczony w agrotechnice, który można dodać do środka według wynalazku, aby przeprowadzić je w postać lepiej i łatwiej nadającą się do stosowania, względnie rozcieńczyć do użytecznego lub żądanego stopnia aktywności.

Należy podkreślić, że B.t. hybrydy stosowane w środku według wynalazaku, otrzymane przez koniugację można bardziej ekonomicznie reprodukować/rozmnażać przez fermentację w odpowiedniej pożywce zawierającej źródło azotu (np. mączkę rybną), źródło węglowodanów (np. skrobia) i sole mineralne i doprowadzonej do wartości pH 7. Taką fermentację prowadzi się zwykle w temperaturze 20-40°C, np. 30°C. Odpowiedni czas fermentacji wynosi 24-72 godziny, np. 36 godzin.

Odpowiedni koncentrat zawiesinowy według wynalazku można otrzymać przez odparowanie cieczy fermentacyjnej do potrzebnego stężenia. W miarę potrzeby wprowadza się dodatki.

Analogicznie można otrzymać preparat proszku zwilżalnego przez suszenie rozpyłowe cieczy fermentacyjnej zawierającej ewentualnie emulgatory, środki chroniące przed ultrafioletem itp. i następnie sproszkowanie tak otrzymanego ciała stałego. Tak otrzymany preparat zawiera istotną część składników pożywki jako rozcieńczalnik.

Alternatywnie, ciecz fermentacyjną można odwirować w celu oddzielenia większych cząstek pożywki i następnie przeprowadzić jak podano wyżej w odpowiednie preparaty w postaci koncentratu zawiesiny lub proszku zwilżalnego. Odpowiedni preparat zawiera np. od 1000 do 40 000IV na 1 mg lub 1 ml spreparowanego produktu.

W niżej podanym przykładzie ilustrującym koniugację stosuje się B.t. kurstaki jako donor zawierający /J-plazmid służący jako plazmid sprzęgający z cechą odpornościową na erytromycynę. Szczep biorcy B.t. tenebrionis jest mutantem z naturalną odpornością na tetracyklinę.

Temperatura jest podana w stopniach °C, a części są częściami wagowymi.

Przykład I. Koniugacja.

Miesza się 2,5 ml kultury szczepu B.t. kurstaki MD-73 (NRRL B-4488) zawierającego sprzęgający fragment pAM Streptococcus farcalis i 2,5 ml kultury naturalnie odpornego na tetracyklinę mutanta B.t. tenebrionis (Deutsche Sammlung for Mikroorganizmen, DSN 2803) - każdy z nich w ekspotencjalnej fazie wzrostowej (około 5 X 10⁷ komórek/ml i sączy się na membranowym filtrze z octanu celulozy (Oxcid/Nuflow) (0,45μιη, średnica 25 mm). Filtr umieszcza się na płytce z pożywką Luria Medium (LA)(1 litr pożywki Luria Medium zawiera: 15gagaru, 10 gtryptonu, 5 g wyciągu drożdży, 10 g NaCl, 0,02 g tymidyny w wodzie) i inkubuje się przez 16-24 godzin w temperaturze 37°C. Filtr zawiesza się w 0,5 ml cieczy LA (bez agaru), intensywnie homogenizuje i

153 465

Forma Elewacja Obrzeże Powierzchnia nieregularna wygięta faliste chropowata

10° i 10 ^{* 1} rozcieńczeń umieszcza się na płytkach LA zawierających 50/ig/ml erytromycyny i 5 pg/ml tetracykliny w celu oddzielenia ex-koniugatów.

Tak otrzymane koniugaty odporne na erytromycynę i tetracyklinę umieszcza się w środowisku umożliwiającym zarodnikowanie i następnie bada się pod mikroskopem na obecność i rodzaj delta-endotoksyn: w szczepach hybrydowych zarodnia przed lizą zawiera kryształ w formie podwójnej piramidy typowy dla szczepów B.t. var. kurstaki i ponadto kryształ w formie równoległościanu (lub sześcianu) typowy dla szczepów - B.t. var. tenebrionis. Takie kryształy mające wymiar w przybliżeniu 2//m są łatwo widoczne w fazowym mikroskoie kontrastowym.

Hybrydy zatem są łatwo rozpoznawane przez wizualną identyfikację. Kolonie hybrydów (po 16 godzinach, w 30°, na płytkach LA) mają taką samą mofrologię jak kolonie B.t. tenebrionis, lecz są łatwo odróżnialne od kolonii kurstaki.

Kolonie Tenebronis lub hybrydów Kurstaki kulista wypukła pełne (całobrzegia) gładka

Wprowadzenie plazmidu ze szczepu donora do szczepu biorcy można łatwo prześledzić za pomocą analizy elektroforezowej w żelu agarozowym DNA ekstrahowanego z otrzymanych hybrydów. Molekuły DNA (plazmidy) stają się widoczne przez napromieniowanie UV po barwieniu w bromku ethidium i są tofografowane (patrz Lereclus D., Menou G., Lecadet Μ. - M. 1983, Mol. Gen. Genet. 191. 307-313).

Większość hybryd według wynalazku ma oprócz innych, typowych 10 Megadalton (Md) plazmid pochodzący ze szczepu biorcy B.t. tenebrionis i 5,6 Md plazmid typowy dla szczepu B.t. kurstaki będącego donorem. Plazmidy noszące gen kodujący syntezę delta-endotoksyny w B.t. kurstaki i w B.t. tenebrionis mają w przybliżeniu ta ki sam ciężar cząsteczkowy, a zatem trudne są do rozróżnienia w plazmidogramie szczepu hybrydowego.

Przykład II. Rozpuszczalne koncentraty.

Otrzymuje się wodną pożywkę zawierającą: około 1,86% melasy buraczanej, 1,4% bezolejowej mączki endospermu ziarna bawełny, 1,7% pozostałości namoku kukurydzianego, 0,1% węglanu wapnia, doprowadza się do pH 7,2-7,6, sterylizuje się przez 20-30 minut w temperaturze 121° i następnie inokuluje się 5% objętościowymi B.t. hybrydów. Kulturę prowadzi się przy mieszaniu pod ciśnieniem wstecznym około 5 psig i w temperaturze inkubacji 30°,- Brzeczkę chłodzi się do 18-20° i doprowadza się do wartości pH 5,5 stężonym H2SO4. Brzeczkę cedzi się przez sito o 150 mesh^ulturę przecedzoną odwirowuje się celem usunięcia części zanieczyszczeń i odparowuje do objętości mającej potrzebne stężenie. Do koncentratu dodaje się: 0,4% wagowego emulgatora (np. izooktylofenylopolioksyetanolu) i 0,8% wagowego absorbera ultrafioletu.

Przykład III. Proszek zwilżalny.

Objętość zatężonego koncentratu według poprzedniego przykładu suszy się rozpyłowo i tak otrzymany techniczny koncentrat miesza się z nośnikową mieszaniną zawierającą: 10% krzemionki i 90% proteiny sojowej. Ilość mieszaniny nośnikowej zależy od potrzebnego użytkowego stężenia koncentratu i potrzebnego użytecznego stężenia proszku zwilżalnego. Do tak otrzymanego proszku zwilżalnego można dodać: 0,4% wagowych emulgatora i 0,8% wagowych absorbera ultrafioletu.

Korzystne B.t. hydrydy według wynalazku otrzymuje się przez koniugację przy użyciu B.t. . tenebrionis jako szczepu biorczego i B.t. kurstaki jako' donora.

Claims

Zastrzeżenie patento we

Środek owadobójczy, zawierający komórki Bacillus thuringiensis i znane substancje pomocnicze, znamienny tym, że zawiera hybrydowe komórki Bacillus thuringiensis, zawierające gen kodujący syntezę delta-endotoksyny B.t. kurstaki i gen kodujący syntezę delta-endotoksyny B.t. tenebrionis, przy czym komórki te zdolne są do wytwarzania kryształów delta-endotoksyny typowych zarówno dla szczepu B.t. kurstaki jak i dla szczepu B.t. tenebrionis.

Zakład Wydawnictw UP RP. Nakład 100 egz.

Cena 3000 zł