PL154118B1

PL154118B1 - Method for manufacturing hirudine

Info

Publication number: PL154118B1
Application number: PL1987266756A
Authority: PL
Priority date: 1986-07-10
Filing date: 1987-07-10
Publication date: 1991-07-31
Also published as: KR960013464B1; DK355887D0; DK355887A; US5591640A; JP2733602B2; ATE153066T1; DK175195B1; PL266756A1; DE3752063D1; US5902735A; NO872878D0; HU214236B; DE3752063T2; EP0252854B1; CZ527787A3; PT85296A; GR3024368T3; BG80504A; AU614933B2; RU1776276C

Description

OPIS PATENTOWY

Patent dodatkowy do patentu nr--Zgłoszono: 87 07 10

Pierwszeństwo ^{86 07}86 12

Int. Cl.⁵ C12N 15/15 /P. 266756,/ dla zastrz.1-12 Francja dla zastrz.13-19 Francja

URZĄD

PATENTOWY

RP

Zgłoszenie ogłoszono: 88 06 23

Opis patentowy opublikowano: 1991 11

Twórcy wynalazku: Gerard Loison, Yves Lamoine, Nathalie Labat, Alain Balland

Uprawniony z patentu: Transgene SA, Courbavoie /Francja/

SPOSÓB W/TW/ARAAIA HIRUDYNY

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania hirudyny, który stanowi ulepszenie sposobu według zgłoszenia francuskiego nr 8 506 672 i dotyczy wektorów ekspresji proteiny majęcej aktywność hirudyny z pijawki /H. meeicćinlls/.

W zgłoszeniu patentowym francuskim nr 8 506 672 opisano sposób wytwarzania przez drożdże S. cerevisile hirudyny wyddielanej w środowisku hodowlanym w postaci aktywnej.

Wynnlazek dotyczy nowych wektorów zapewniających produkcję hirudyny, zwłaszcza HVI, w lepszych warunkach. t^yn^zek dotyczy w szczególności funkcyjnych DNA pozwe^jących na wytwarzanie hirudyny z drożdży, które to bloki charakteryzują sią tym, że zawierają co najmniej sekwencję:

Str “ Lex - Sci - gen H w której :

- gen H jest genem kodującym dla hirudyny lub jednego z jej wariantów. Według wynalazku gen H jest korzystnie genem kodującym dla HV1 lub HV2, eweetualnie gen H może być połączony z sekwencją końcową drożdży, na przykład z sekwencją genu PGK,

- S_tr jest sekwencję DNA zawierającą sygnały zapewniające transkrypcję genu H przez drożdże,

- L_xe jest sekwencję lieeram pozwalającę na uzyskanie wydzielania produktu z genu,

- S^ jest sekwencję DNA kodującą dla mejsca zerwania przez proteinazę yscF, mejsce zerwania jest pojedyńcze i umieszczone w prekursorze hirudyny bezpośrednio powyżej genu H, ponadto element S - gen H może być powtórzony szereg razy.

Taki typ bloku ekspresji pozwala na uzyskanie pojedyńczej proteiny, dojrzałej i poprawnej.

154 118

W praktyce przy konstrukcji opisanej w zgłoszeniu patentowym francuskim nr 8 506 672, S.cerevisiae wytwarzają hirudynę o postaci prekursora posiadającego dwa miejsca zerwania dla proteinazy yscF, produktu genu ΚΕΧ2, /1/. Aktywność endo-peptydazowa yscF jest potrzebna dla dojrzewania tego prekursora hirudyny. Jednakże tylko przypadek zerwania w drugim miejscu, tym najbardziej oddalonym od końcówki NH₂ prekursora, pozwala na uwoonienie hirudyny aktywnej, natomiast jeśli zerwanie zachodzi nie w drugim a w pierwszym miejscu to wydzielana jest forma dłuższa, różniąca się od hirudyny wydłużeniem reszt aminokwasów w końcówce NH₂·

Ta ostatnia niepożądana forma może zanieczyszczać dojrzałą i poprawną hirudynę podczas różnych faz oczyszczania i w związku z tym komplikować proces oczyszczania i pociągać za sobą obniżenie wydaaności wytwarzania hirudyny czystej.

Dzięki wynalazkowi, w drożdżach syntetyzuje się prekursora hirudyny posiadającego tylko jedno miejsce zerwania dla yscF tak, że dojrzewanie do hirudyny prowadzi wyłącznie do wydzielania formy żądanej.

Spośród sekwennci Lg_X należy w szczególności przytoczyć sekwencję zwaną “pre-pro“, pozwaaającą na wydzielanie z drożdży feromonu płcoowego alfa. Jako przykład systemu wydzielania wybrano syetem wydzielania feromonu alfa, co oznacza, że w poprzedniej sekwennći - Lθ_χpochodzi z genu feoomonu patowego alfa z drożdży, lecz mogą być również zastosowane inne systemy /na przykład system proteiny Killera/ /4/.

Korzystne jest, by drożdże gospodarze plazmidów zawierających bloki funkcyjne według wynalazku były dowolnego typu płciowego i ponadto ^c^o^^y być hodowane bez nacisku selekeci.

W tych warunkach, drożdże transtoimowane mogą być stosowane w skali przemysłowej w sposób szczególnie dogodny. Dla tego celu, wynalazek proponuje bloki ekspresj DNA takie jak opisano poprzednio, lecz w których sekwencja St_r zawiera promotora genu drożdży innego niż promotor genu MFaafal, na przykład promotora genu PGK drożdży.

W praktyce, w konstrukcjach opisanych w zgłoszeniu patentowym francuskim nr 8 506 672, gen prekursora hirudyny jest transkrybowany z promotora genu MFaafal. Promotor ten funkcjonuje z maksimum swotej mocy w szczepach typu lłctowigo Mataalfa. Wybór gospodarza ogranicza się do tego typu szczepu, co wyklucza szczepy typu płcóowego Mata oraz diploidy lub lolilloidy pozbawione typu płciowego. Wyklucza to zwłaszcza szczepy drożdży stosowane w przemyśle, należące do tej ostatniej kategooii. Przez zmianę promotora można uzyskać ekspresję hirudyny niezależną od cechy płciowej szczepu gospodarza. Ogólnie biorąc, bloki DNA niesione są przez plazmidy zawierające ponadto oryginał replikacji w drożdżach, na przykład oryginał replikacji plazmidu 2 y.

Ola ułatwienia konstoukcci wektorów, plazmidy będą mooły być “czółenkami coli-dfożdża i zawierać elementy pozwe^jące na ich ieplikajję w E.coli, na przykład oryginał replikacji

D taki jak pB322 i marker selekcji taki jak amys . Plazmidy te będą również zawierały mrker selekcji dla drożdży, na przykład gen kodujący lozwotająjy na kżiplθmiitację αuksstritri, zwłaszcza będzie się stosować gen URA3.

W opisie patentowym WO 86/01224 wykazano, że wprowadzenia pewnych mutacci nadających oporność na 5-FU w szczepie ura3 tranrtoiżowanyi w ura+ przez nitkę plazmidu, p^z^T^woiło na większy wybór środowisk hodowlanych takich tranrtiimowanyjh szczepów, zwłaszcza uitożliwiło to stosowanie przemysłowych środowisk komplaksowych.

Wynalazek dotyczy zwłaszcza syntezy i sekreeci wariantu HV1. Gen HV1 był już zsyntetyzowany chemicznie w celu jego ekspresj w E.coli /opis patentowy francuski nr 8413250/. Większość syntetycznych oligonukleotydów stosowanych w opisie patentowym nr 8 413 250 była konserwowana dla kżnstrukcji sekwannci kodującej dla prekursora HV1, z wyjątkiem tych, które pozwaaały na różne połączenia z sekwencjami dołączanymi na początku i na końcu sekwe^cj.

Otrzymanie hirudyny wydzielonej wymaga obecności prekursora zawierającego informacje potrzebne dla sekrecji i dla prawidłowego dojrzewania tego polipeptydu w normalnej przemianie metabolicznej drożdży. W zgłoszeniu patentowym francuskim nr 8 506 672 wykazano, że sekwencja ΝΗ₂ - terminalna prekursora faktora alfa może być stosowana dla sekrecji wriantu H12 hirudyny.

Wynnlazek dotyczy stosowania tego systomu dla sekrecji wariantu HV1.

154 118

Wynalazek dotyczy zwłaszcza bloku funkcyjnego DNA pozwalającego na wytwarzanie hirudyny z drożdży, który zawiera co najmniej :

- gen HV1,

- sekwencją DNA /S_tT/ zawierającą sygnały zapewniające transkrypcję genu HV1 przez drożdże.

Ten blok funkcyjny, integrowany w plazmidzie lub w chromozomach drożdży, korzystnie rodzaju Saccharomyces, pozwała - po transformacji tych drożdży - na ekspresję hirudyny, bądź w formie aktywnej , bądź w formie nies^^nego prekursora mogącego regenerować hirudynę przez aktywację.

Wymienione bloki funkcyjne posiadają korzystnie następującą strukturę:

-S -L - S . - qen H tr ex cl a w której :

- gen H oznacza gen kodujący dla HV1, gen H jest jwenaualaij połączony z sekwencją końcową drożdży, taką jak sekwencja genu PGK;

- str ‘Ozncza sekwwenję DNA zawierającą sygnały zapewniające transkrypcję genu H przez drożdże;

- L omnaca sekwwenćę lidera potrzebną dla uzyskania wydzielania produktu z genu;

- S , ©oznacz sekwwencę DNA kodującą dla miejsca zerowania, zawierającą ewentualnie na końcu 3*, przed genem K, kodon ATG lub dwa kodony kodujące dla Lys-Arg bądź pięć kodonów kodujących dla Ser-Leu-Asp-Lys-Arg;

- ponadto,. element - gen H może być powtórzony szereg razy.

Spośród sekwencci L_„ należy przytoczyć sekwencję feromonu płcrowego alfa drożdży, zaś ΘΧ jako S_tr należy przytoczyć promotora genu MFaafal oraz promotora genu PGK, jednakże mogą być stosowane również inne sekwencce, w szczególności Jako przykład systemu sekrecji wybrano system sekrecji foremonu alfa, co oznacza, że w poprzedniej sekwencci sekwencja ί.θ_χ pochodzi z genu feromonu płciowego alfa drożdży, jednakże mogą być stosowane również inne systemy /na przykład system proteiny Killera/ /4/.

Dla kierowania ekspresją i sekrecją hiΓudnan w środowisku hodowlanym, odpowiedni gen jest iategrowcay w wektorze drożdży lub w plazmidzie acwijrajęnmi blok funkcyjny opisany powyżej oraz przynajmniej jeden oryginał replikacji w drożdżach. Plazmid zawiera korzystnie następujące elementy:

- oryginał replikacji plazmidu drożdży 2 ,

- gen ura 3,

- oryginał replikacji w E.coli i marker oporności na antybiotyk,

- obszar 5* genu IMadal obejmujący promotora transkrnpoji, sekwencję “lidera i sekwencję pre-prr precursrra faktora alfa, przy czym sekwencja ta będzie przyłączona, w cyklu powyżej sekwennci kodującej hirudyny HV1,terminatrr transkrypcji genu PGK z drożdży, który będzie umieszczony poniżej genu hirudyay.

Ogólnie biorąc, bloki ekspresji według wynalazku będą morly być intθgrowcnj w drożdżach, zwłaszcza 5^^ι^ιυοθ3, bądź w plazmidzie o replikacji autoarlicznej , bądź w chromrzomie drożdży.

Oeśli plazmid jest autonomiczny, to będzie zawierać elementy zapewnaającj jako replikację, tzn. oryginał replikacji taki jak oryginał replikacji plazmidu 2 yu. Ponadto, plazmid będzie mógł zawierać elementy selekcji, takie jak gen URA3 lub LEU2 zcpjwnaająjj krmilemijaa3-2- .

cję drożdży ura lub leu . Plazmidy takie mogą również zawierać elementy zapewniające ich replikację w bakteriach, podczas gdy plazmid winien być plazmidem łódeczką, na przykład oryginał replikacji taki jak oryginał replikacji pBR322, gen mmrker taki jak Amp i/lub inne znane elementy.

Wynalazek dotyczy również drożdży transformowanych przez blok ekspresji według wynalazku, bądź niesiony przez plazmid, bądź integoowany w chromosomach, zwłaszcza szczepów Saccharomyces, a w szczególności szczepów S.cerevisiae głównie typu płciowego Mata lub tez szczepów diploidalnych lub poliploddałnych pozbawionych typu płotowego, jednak szczególnie szczepów ^dro^żdż^y ura” transfamrnowanycłi ura* przez plazmid wedłu^g wynalazł i uodpornionych na 5-Sluorouracyl, przy czym szczepy te mogą być hodowane w środowisku przemysłowym.

154 118

Jeśli promotorem jest promotor genu feromonu alfa, to drożdże będę korzystnie typu płciowego Małalfa. Na przykład, będzie się stosować szczep genotypu ura lub Leu będż inny, komplementowany przez plazmid dla zapewnienia utrzymania plazmidu w drożdżach przez odpowiedni nacisk selekcCi. I wreszcie, sposób wytwarzania hirudyny lub jednego z jej wariantów polega na fermentacCi drożdży transformowanych, takiej Jak opisana poprzednio w środowisku hodowlanym i odzyskania hirudyny wytworzonej w środowisku hodowlanym w postaci dojrzałej lub w postaci prekursora hirudyny dojrzewającej in vitro będż in vivo, a także samej hirudyny lub jaj wariantów otrzmrnywanych tym sposobem.

Wprawdzie można otrzymać hirudynę przez fermentację poprzednich szczepów tr^^r^s^^mowanych w odpowiednim środowisku hodowlanym, przez akummuację hirudyny w komórkach, to korzystniej jest wydzielać hirudynę w środowisku, będż w formie dojrzałej będż w formie prekursora, który winien być przetwarzany in vitro.

Dojrzewanie może być prowadzone w kilku etapach. Najpierw może okazać się konieczne zerwanie niektórych elementów pochodzących z translacji sekwennci L„„, przy czym zerwanie takie może być prowadzone na poziomie sekwennci odpowwadającej S_cj. Dojrzała hirudyna może być poprzedzona mioniną, która zostanie selektywnie ocięta za pomocą bromofyZ^nu. Sposób ten stosuje się, gdy sekwencja kodująca hirudynę nie zawiera (mioniny.

Możliwe jest również przewidzenie na końcu N dipeptydu Lys-Arg, który jest odcięty w COOH przez specyficzną endopeptydazę, ponieważ enzym tan jest aktywny w procesie sekrecji to można bezpośrednio otrzymać dojrzałą proteinę w środowisku hodowlanym. Jednakże, w niektórych przypadkach może być konieczna przewidzenie zerwania enzymatycznego po sel^i~^<^ci przez dodanie enzymu specyficznego. W niektórych przypadkach, zwłaszcza po traktowaniu bromocyjenem, może okazać się niezbędna renaturacja proteiny przez odtworzenie mostków disiarczkowych. W tym celu peptyd denaturuje się, na przykład za pomocą chlorowodorku guanidyny, po czym renaturuje w obecności glutatóonu zredukowanego i utlenionego.

Tak otrzymana hirudyna może być stosowana jako inhibitor trombiny, jako lek a-ntykfagulujęcz. jako produkt laboratoryjny do utrudniania koagulacji i/lub jako środek diagnostyczny /przy użyciu produktu znaczonego/. W szczególności, w komppoycjach farmaceutycznych można stosować HV1, sam lub w połączeniu z innymi składnikami aktywnymi, lub też w ramach testów bądź diagnostyki, in vitro bądź in vivo. W tym ostatnim przypadku może być interesujące znakowanie cząsteczki, na przykład markerem radioakzwnym, fluoroscencyjnym, enzymatycznym lub innym.

Poniższe przykłady ilustrują pozostałe charakterystyki i korzyści z niniejszego wynalazku, na załączonych rysunkach:

- fig.l oznacza konstrukcję i strukturę M13TG897,

- fig.2 oznacza mutagenezę in vitro DNA fago^go M13TG897 w M13TG1827: a/ sekwencja oligonukle/tydl z naganety, b/ sekwencja częściowa DNA M13T897 hzbrzdzzljącθu/ się do oligonlklnotzdu, c/ sekwencja rautowana,

- fig. 3 oznacza konstrukcję pTG8S3,

- fig. 4 oznacza konstrukcję pTG892,

- fig. 5 oznacza konstrukcję M13TG989,

- fig. 6 oznacza strukturę pTG1828 i pTG1833,

- fig. 7 oznacza strukturę prekursora hir^udyny /dpowiadającego sekwencjom ninsior^yr przez różne plazmidy, przedstawiono połączenie pomiędzy a/ miejscem zerwania /yys arg/ tajbliższym końca NH₂ prekursora i b/ sekwencją dojrzałą hiΓudznz HV2 /NH₂ - Ile - Thr - itd/,

- fig.8 oznacza sekwencje i pozycję oligonukleotydów stosowanych do syntezy sekwencji DNA kodującej dla HV1,

- fig.9 i 10 oznaczają kartę restrykcji i translację sekwencji do aminokwasów podczas syntezy sekwennji DNA kodującej dla HV1.

Plazmidy i strategie stosowane i opisane w zgłoszeniu patentowym francuskim nr 8 506 672 nie zostały objęte niniejsymi zgłoszeniem.

154 118

Przykład 1« Plazmid pTG897 niesie informację dla prekursora hirudyny, który zawiera tylko jedno miejsce zerwania dla proteinazy yscF. Dojrzewanie w tym miejscu zerwania uwalnia hirudynę nieaktywną. Odcięcie przez proteinezę yscF uwalnia cząsteczkę hirudyny wydłużoną w NH₂ przez 4 reszty Glu Ala Glu Ala. Usunięcie fragmentu DNA kodującego dla tej sekwennji Glu Ala Glu Ala pozwoliłoby na uwolnienie łańcucha hirudyny poprawnie przetworzonego. Usunięcie przeprowadzono za pomocą techniki mutagenezy kierowanej in vitro.

Plazmid pTG897 ocięto przez podwójne trawienie PSTI - BgUI, fragment DNA zawierający sekwencję hirudyny klonowano w postaci replikatwⁿej faga jednonidowego M13TG131 dla uzyskania faga M13TG897 /tysunek 1/.

Hybrydowano oligonukleotyd o sekwencji:

5'-TCTTGGGATAAAAGAATTACGTATACAGAV-3' do DNA geclmicznegl tego faga M13TH897. Oliglnukleltyd ten hybrydyzuje się w jego pierwszej połowie /15 par zasad,/ z sekwencją 15 par zasad bezpośrednio powyżej snkwennji do usunięcia i w jego drugiej połowie z sekwencją 15 par zasad bezpośrednio poniżej /rysunek 2/. Ten oligonukleotyd służył jako matryca do syntezy in vitro dci komplemencarnej genomu faga M13TG897.

Po działaniu ligazą DNA T4 przeznaczoną do zamknćęcia w sposób kowalentny nowo utworzonej nici, transfekrowaro bakterię receptorową, na przykład 3M103 /Δ /Lac-Pro/ SupE Thi EndlA ^sbcB15 strA rlc- mk+/F' ^Tra^D36 ^ProA^B+ LacI® LacZ Δ ^M15 / i acalioowaco ^fa^gi wychodząca z tej transfekcji przez hybrydyzację DNA-DNA stosując jako sondę lligocuklθotyd opisany poprzed32 nio i znakowany w P przez kinację, według typowej procedury /2/. Taki fagowy DNA poprawnie murowany tworzy z oIlgoπukleotydem z mutagenezy kompleks hybrydyzacyjny odznaczający się większą trwałością, większą opornością w warunkach surowych, podczas gdy kompleks hybrydyzacyjny utworzony przez DNA fagowy nie nutowony i oIlgocukIeotyd destabilizuje się w związku z obecnością pętki DNA _<jndrn)nicioongo.

Przykład II. Przenoszenie fragmentu murowanego do nowego wektora ekspresji.

Plazmid pTG883 uzyskuje się z plazmidu pT876 przez proste usunięcie miejsca BgUI, znajdującego się w pobliżu terminatora transkrypcji genu PGK. W tym celu, plazmid pTG876 trawiono częściowo za pomocą BgUI, po czym działano fragmentem Klerowa polimerazą DNA I z E.coli w obecności 4 nukleotydów i związano kowolθntcin cząsteczki DNA ze sobą dzięki działaniu ligazy DNA faga T4. Plazmid pTG883 posiada tylko jedno miejsce BgUI, umieszczone powyżej promotora genu feromonu /tysunek 3/.

Plazmid pTG883 /20/ig/ stosowano przez trawienie BgUI, po czym poddano trawieniu za pomocą nukleazy Bal31 /1.4 jednostki, 10 minut - Boθhricler Mannheim/ znanym sposobem. Tak potraktowany DNA oczyszczono przez sukcesywne ekstrakcje fenolem i chloroformem - alkoholem izoamylowym, po czym frakcję /5 yjg/ poddano działaniu polimerazt Kierowa w celu uzyskania maksimum wolnych końcówek. Tak potrafowany DNA połączono z łącznikami BamHI nie fosforolowanymi /5*-GGGATTTTG/ w obecności ligazy faga T4, według techniki opisanej przez Lathe i ic./3/. Po transformacc! E.coli 1106 i selekcji dla oporności na arricyticę, wyizolowano plazmid pTG892 szkodliwy dla obszaru 5* otaczającego gen MFalfal /yysunek 4/, przy czym łącznik BamHI zlokalizował zasadę powyżej ATG według schematu:

5'- TΑGGΑ-TTTG A ATG AGA TTT ...

łącznik BamHI część kodująca MTaafa1_2

Tak otrzymany nowy fragment BamHI. - Sali klonowano pomiędzy miejscami BamHI - Sali faga M13TG120 uzyskując fag M13TG889 /tysunek 4/. Z faga M13-G889 wyizolowano fragment Bam^l. BgUI zawierający całą część kodującą Εγ^οπ™ alfa, w celu połączenia z dużym fragmentem B^11I plazmidu pTG848. Plazmid otrzymany po połączeniu, pTG8S2b, zawiera fragment BamHI - Bglll odpowóadający części kodującej feromonu umieszczonej za miejscem BglU promotora genu PGK.

DNA pTG892b zawiera jedno miejsce Bglll, jedno miejsce Sali, dwa miejsca otaczające krótką sekwencję obejmującą miejsce Pstl. Przez podwójne usunięcie BglU i Sali, elucję dużego fragmentu i wiązanie z syntetyznnym poli-łącznkkiem zastąpiono krótką sekwencją systetycznym poli-łącznikiem. Ten poiiłącznik o sekwennji:

5'-GACCGAkGCTGAAATCTGCATGCGGTCGACTGTAGAACGTACCAGCT-- posiada jedną końcówkę łączącą z fragmentami uwolnionymi przez Bglll, jedną końcówkę łączącą z fragmentami uwolnionymi przez Sali

154 118 oraz dwa miejsca rozpoznawcze dla między innymi enzymów BglH i SphI.

Tak otrzymany nowy wektor nazwano PTG1819. ONA tego wektora była trawiona przez enzymy SphI i. Pstl· Przez to podwójne trawienie otrzmmano trzy fragmenty: Pstl - Pstl o 6,5 kb, Pstl - SphI o 1,9 kb oraz SphI - Pstl o 0,5 kb·

Dwa najdłuższe fragmenty oczyszczono i zmieszano z fragmentem SphI - Pstl odpowiadającym mutowanej hirudynie i pochodzącym z faga M13TG1827, otrzymując w ten sposób nowy ekspresji: pTG1828 /rysunek 6/,

Przykład III. Przenoszenie fragmentu do wektora pTG88l: nowy plazmid pTG1833·

ONA pTG881 trawiono częściowo za pomocą Pstl tak, aby uwolnić fragment o 6,1 kb·

Fragment ten wyizolowano, po czym trawiono całkowicie za pomocą Bglil, co uwolniło 2 fragmenty Pstl - Pstl i Pstl - BgUI, Oba te fragmenty związano z fragmentem Pstl - Bgill o 0,62 kb pochodzącym z pTG1828. Rekonstytuowano w ten sposób nowy wektor pT1833, różniący się od plazmidu pTG897 tylko usunięciem sekwescji kodujących dla Glu Ala Glu Ala. Strukturę tak utworzonego prekursora przedstawiono na rysunku 7· Plazmid pTG1833 posiada oryginał replikacji dla E.coli, gen na ampicyyinę, gen Lue2 S.Cerevisiae, fragment plazmidu 2^ pozwalający na replikację w S.csrsvisiae, promotor genu MFFlfa, kodujący dla pre-pro oraz gen hirudyny /yysunek 6/. Przykład IV· Transformacja drożdży przez plazmidy pTG1828 i pTG1833.

Szczep S·cersvisiae TGYlsp4 /Matalfa ura-3-251-373-328 his 3-11-15/ transformowαio plazmidami pTG1818, pTG1828 i pTG1833, Rezultaty zestawione w tabeli 1 wskazuję, że pTG1818 i PTG1833 powodują sekrecję takiego samego poziomu aktywności hirudyny. Przeciwnie, TGYlsp4 pTG1828 wydziela dwa razy mnej aktywności hirudyny od pozostałych dwóch szczepów· 3ako kn^^rolę zastosowano szczep TGYlsp4 pTG881 nie posiadający informacji genetycznej dla hirudyny· Porównano również produkcję hirudyny wydzielanej przez szczepy S.cerevisiaa /Mat a/ TGY 14-1 transloΓmowαnr bądź przez pTG1828 bądź przez pTG1833 i TGY14-2 transformowany przez te same plazmidy /tabela 2/. Zauważono też, że w przypadku szczepu TGY14-2 /yyp płciowy Matalfa/ plazmid pTG1833 wyw^aje lepszą sekrecję hirudyny niż plazmid pTG1828, Przeciwnie, w przypadku szczepu TGY14-1 /typ płciowy Mat a/ pTG1833 nie wywduje sekrecci hiurdyny, jak tego oczekiwano, podczas gdy TGY14-2 produkuje hirudynę·

Tabela 1

Aktywność aitytlrmbinowa supernatantów hldowii YNBG i kαsamiiokwajów 0,5%^·

Receptor Plazmid drożdży /10 rn, 48 godzin hodowH,

Aktywność całkowita środowisko

TGYlep4 pTG881 PTG1818 PTG1828 PTG1833 nie wykryto 158

149

Tabela 2

Aktywność αitytlmmbinowa supernatantów hodowwi drożdży /10 ml, 72 godziny hodowwi, środowisko YNBG + kasamiiokiasr 0,5%'·

Receptor	Plazmid	Aktywność całkowita
TGY14-1	PTG881	nie wykryto
	PTG1828	54
	PTG1833	nie wykryto
TGY14-2	PTG881	nie wykryto
	PTG1828	103
	PTG1833	210

Przykład V· Izolacja szczepów, które mogę być hodowane w kompletnym środowisku, bez zagubienia fenotypu plazmidowego·

W opisie patenrow^ WO 86/01224 wykazano, że wprowadzenie pewnych nadających oporność na 5-FU do szczepu ura3 transformoiaisgl w ura+ przez plazmid pozwala na większy wybór środowiska do hodowwi tych transformowanrjh szczepów, zwłaszcza można stosować kompleksowe środowiska przemysłowe· Ze szczepu TGYlji4 pTG1833 wyizolowano spontaniczne

154 118 mutanty zdolne do tworzenia kolonii w środowisku kompletnym /YPO/ uzupełnionym 5-fluorouracylem 1 mg/ml, według procedury opisanej w opisie patentowym WO 86,/01224. Sześć mutantów hodowano w środowisku kom^l-etny^m i wybrano z nich jeden, który nie posiadał żadnej kolonii wolnej dla plazmidu po ponad 20 generacjach wzrostu w warunkach nie selektywnych.

Mutant, nazwany TGY1sp4-3, mógł być użyty w produkcji hirudyny w środowisku komppetnym.

Przyk ład VI. Strategia syntezy ONA kodującego dla HV1.

Sekwencja ta powinna nosić elementy pozwalające na złączenie, w cyklu, sekwencci HV1 z częścią pre-pro MFaafai oraz sygnały pozwatojące na poprawne dojrzewanie wydzielanej hirudyny, w szczególności obszar łączenia będzie zawierać dublet Lys-Arg bezpośrednio powyżej pierwszej reszty NH2-teΓminalπegi HV1. Zastosowana strategia była podobna do opisanej w opisie patentowym francuskim nr 8 413 250. Synteza zachodziła w dwóch oddzielnych blokach, które następnie połączono dzięki ich kohezyjnym końcówkom Bammi. Pierwszy blok zawierał 9 il/gonukleotydów ponumerowanych od 1 do 9 a drugi blok zawierał 10 nukleotydów ponumerowanych od 10 do 19. Ich sekwencje oraz pozycję iligocukleatddów przedstawiono na rysunku 8.

Kartę restrykcji oraz translację sekwan^i do aminokwasów przedstawiono ci rysunkach i 10.

Przyk ład VII. Przyłączenie gonu syntetycznego.

Pierwszy blok syntetyczny

Oligonukleotydy 2 do 8 /rysunek 8/ fosforylowano na końcach 5* dla uniknięcia tworzenia dinerów lub polimerów: 500 pikoroU każdego oligonukleotydu trakoowano polinukleotddem kinezą /2 jednostki/ w objętości końcowej 25 ul Tris HC1 60 mM, pH 7,5, KgCi~ 10 mM, ditiotreitol 8 mM, zawierający 3,3 pikomole gamma - ATP P /5000 Ci/nmoo/, po 15 minutach inkubacji w temperaturze 37°C dodano 5 nmdi ATP nie znakowanego.

Po inkubacji w temperaturze 37°C w ciągu 30 minut, fragmenty komplementarne hybrydyzowano dwa na dwa, z wyyątkiem fragmentów 1, 2 i 3, które zmieszano razem. 300 pikom^o-i każdego oligonukleotydu zastosowano w objętości końcowej 10^ul Tris HC1 66 mM, pH 7,5, MgClg 6 mM,

NaCl 100 mM, spermidyna 0,5 mM, DTT 8 mM.

Mieszaniny te ogrzewano w temperaturze 1OO°C w ciągu 3 minut, po czym oziębiono powoli do temperatury 37°C w ciągu 2 godzin. Oligonukleotydy 1-2-3 shybrydyzowann zmeszano z oligonukleotydami 4-5 i inkubowano w 37°C w ciągu 2 godzin. W taki sam sposób przeprowadzono hybrydyzację par oligonukleoyydów 6-7 z 8-9. W pieiwszym etapie połączono 9 oligonukleotydów, które inkubc^em w 37°C w objętości końcowej 100jol.

pikomoli takich shybrydyzowanych lliglnukleotydów ρotΓaklowαnl ligazą T4 w ciągu 15 godzin w 15°C. Następnie do mieszaniny reakcyjnej dodano 50 ng dużego fragmentu HinddH BamHI z M13TT131, uprzednio oczyszczonego na żelu. Mieszaninę po wiązaniu użyto następnie do transformacji klmelnenttych komórek E.coli 3M113. Spośród 12 klonów fagowych tak otrzymanych, tylko jeden posiadał pożądaną sekwencję:

Drugi blok syntetyczny

Zastosowano taką samą strategię do syntezy drugiego bloku /rysunek 8/, który klonowano pomiędzy miejscami BamHI i Sallfaga M3TG1H. Dwa z 12 testowanych klonów posiadały wstawkę odpowiadającą pożądanej snkweetji. Jeden z tych klonów nazwano M13TT1189.

Połączenie genu syntetycznego

Dwie podwójne nici DNA z M13TG1888 i M13TG1889 trawiono odpowiednio za pomocą Htnddll i BamHI oraz BamHI i Sali, po czym mieszaniny z dużym fragmentem Hinddll - Sali z pBR322 oczyszczono na żelu. Po związaniu, mieszanina służyła do transformacji E.coli 1106. Przez selekcję dla oporności na αmplcylinę otrzymano plazmid PTG1890 zawierający sekwencję syntetyczną poprawnie rekonstytuowaną .

Przykład VIII. Konntrukcja wektora ^11891 pozwalającego na sekrecję syntetyzowanej hirudyny.

Fragment DNA z pT11890 niosący sekwencję kodującą HV1 odtwarza się w formie fragmentu

Hindlll - Bglll /miejsce Bglll jest usytuowane bezpośrednio powyżej m^jsca Sali, które służyło do poprzedniego klonowania/ w celu wstawienia pomiędzy miejsca Hinddll i Bglll plazmidu ^1881 opisanego w zgłoszeniu pltenliwye francuskim nr 8 506 672. W otry/manym plazmidzie

154 118 pTG:1891 gen HV1 jest więc wstawiony pomiędzy sekwencje pre-pro MFalfa 1 i terminatora transkrypcji. Taka konstrukcja powinna zapewnić dojrzewanie i sekrecję hirudyny HV1, ponieważ jest identyczna z pTG1818 /opis patentowy nr 8 506 672/ z wyjątkiem sekwennji kodujących HV2 zastąpionych przez sekwencje kodujące HV1.

Przykład IX. Transformacja szczepu TGYlsp4 przez DNA plazmidu pTCG89l.

Szczep TGYlsp4 /alfa-l ura-3-251-373-328, His3-ll-15/ transformowano plazmidem pTGG89l.

klony otrzymane przez selekcję dla charakteru ura+ poddano hodowli i oznaczono produkcję hirudyny wydzielanej w środowisku hodowlanym. Jako kontrolę oznaczano w takich samych warunkach ilość hirudyny wydzielanej przez TGYlsp4 pTG1818.

Zmierzono dwa razy większą aktywność antytfombinową w supernatancie hodowU szczepu TGYlsp4 pTGl891 /0,9 mg/1 supernatantu hoi^owU,/ niż w supernatancie hodowK szczepu TGYlsp4 PTG1833.

Zdegonowanie_ragrazęntatywnych_szęzęgów_według_WYnąlazku

Następujące szczepy zdeponowano w Collection Nationele de Cultures de Micrffrg8ii^mis de 1'nnstitut Pasteur, 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15:

- 6 czerwca 1986:

. Seccharomycis cirivisiei TGYlsp4 pTG1828, pod numerem 1-569 . Saccharomyces cerevisiae TGYlsp4.3pTG1833, pod numerem 1-570.

- 6 lisoopada 1986:

. Saccharomyces cerevisiae TGYlsp4 pTG1891, pod numerem 1-623 Literatura

1/ Achsteeter, T. i Wof, D.H. /1985/ EMBO Journal 4, 173.

2/ Zoller, M.3. i Smith M.H. /1983/ Maths in Enzym. 100,469.

3/ Lathe, R., Kieny, M.P.; Skory, S. i Lecocę 3-P /1984/ DNA 3, 173.

4/ Bussey H., Saville D., Greene D. i in. /1983/ Moi.. Celi. Biol. 3, 1362-1370.

Claims

Zastrzeżenia patenoowe

1. Sposób wytwarzania hirudyny, znamienny t y m, że stosuje się blok funkcyjny DNA pozwaaający na wytwarzanie hirudyny z drożdży, który zawiera co najmniej sekwencCę:

- S„ - L - S , - gen H tr ex cl ° w której

- gen H oznacza gen kodujący dla hirudyny lub jednego z jej wariantów,

- S oznacza sekwencję DNA zawierającą sygnały zapewniające transkrypcję genu H przez drożdże,

- Lex oznacza sekwencję lidera potrzebną dla uzyskania wydzielania produktu z genu,

- s oznacza sekwencję DNA kodującą dla miejsca rozerwania przez proteinazę yscF, przy czym miejsce rozerwania jest pojedyńcze i umieszczone w prekursorze hirudyny bezpośrednio powyżej genu H.
2. Sposób według zastrz.l, znamienny tym, że stosuje się blok funkcyjny, którego sekwencja L_v jest sekwencją umool^wi-ającą sekrecję feromonu płcóowego alfa z drożdży.
3. Sposób według zastrz.l albo 2, znamienny tym, że stosuje się blok funkcyjny, którego sekwencja S_tr zawiera promotor genu drożdży inny niż promotor genu MFalfa 1.
4. Sposób według zastrz.3, znamienny tym, że stosuje się blok funkcyjny, którego sekwencja S_tr zawiera promotor genu PGK drożdży.
5. Sposób według zastrz.l albo 4, znamienny tym, że stosuje się blok funkcyjny, w którym gen H jest genem kodującym dla HV1 lub HV2.
6. Sposób według zastrz.l, znamienny tym, że wykorzystuje się plazmid zawierający elementy potrzebne do wydzielania hirudyny w drożdżach, który zawtera blok funkcyjny taki jak zdefinoowany według zastrz.1-5 i przynajmniej jeden oryginał replikacji w drożdżach.

154 118
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny t y m, że stosuje się plazmid, którego oryginał replikacji jest oryginaeem plazmidu 2yu.
8. Sposób według zastrz.6 albo 7, znamienny tym, że stosuje się plazmid, który zawiera ponadto gen URA3.
9. Sposób wytwarzania hirudyny, znamienny tym, że stosuje się blok funkcyjny DNA pozwalający na wytwarzanie hirudyny HV1 z drożdży, który zawiera co najmniej sekwencję:

- Sł - L„ - S . - gen H tr ex cl 3 w której:

gen H oznacza gen kodujący dla HV1,

-Sr oznacza sekwencję DNA zawierającą sygnały zapewnnające transkrypcję genu H przez drożdże,

- |_ oznacza sekwencję lidem potrzebną do uzyskania wyddielania produktu z genu,

- S_cl oznacza sekwencję DNA kodującą dla miejsca rozerwania i zawierającą, ewentuaanie, na końcu 3*, przed genem H, kodon ATG lub dwa kodony kodujące dla Lys-Arg, bądź pięć kodonów kodujących dla Ser-Leu-Asp-Lys-Arg, ponadto element Scj - gen H może być powtórzony szereg razy.
10. Sposób według zastrz.9, znamienny tym, że stosuje się blok funkcyjny, którego sekwencja L Jest sekwencję feromonu płciowego oć drożdży.

ΘΧ
11. Sposób według zastrz. 9 albo 10, znamienny tym, że w bloku funkcyjnym za genem H znajduje się sekwencja terminatora drożdży taka jak sekwencja genu PGK.
12. Sposób według zastrz.9 albo 10 albo 11, znamienny tym, że stosuje się plazmid zawierający elementy potrzebne do wyddielania hirudyny przez drożdże, który zawiera blok funkcyjny według zastrz. 9 - 11 i przynajmniej jeden oryginał replikacji w drożdżach.
13. Sposób według zastrz.12, znamienny tym, że stosuje się plazmid, który zawiera:

- oryginał replikacji plazmidu drożdży 2yj,

- gen ura3,

- jeden oryginał replikacji w E.coli i jeden marker odporności na antybiotyk,

- obszar 5“genu Maafa^ obejmujący promotora ^anek^n^ i, sekwencję “lidera i sekwencję pre-pro prekursora faktora alfa, przy czym sekwencja ta jest włączona w fazę, powyżej sekwan^i kodurącθj dla hirudyny HV1,

- terminator transkryp^^ genu PGK drożdży umieszczony poniżej genu hirudyny.
14.

sformowane

Sposób według zastrz.1, znam plazmidem według zastrz.6,7, 12 lenny tym, że stosuje się drożdże tranlub 13, bądź blokńem funkcyjnym według zastrz.1-5 lub 9-11.
15. Sposób według zastrz.14, znamienny tym, że jako drożdże Saccharomyces.
16. Sposób według zastrz.15, znamienny tym, że jako drożdże S.jernvislen.
17. Sposób według zastrz.15 i 15, znamienny tym, ze stosuje szczepu typu płcoowego Mata lub też szczepu diploidannego bądź poliploidannego typu płciowego.
18. Sposób według zastrz.14 albo 15 albo 16, znamienny tym, się szczep drożdży, który po transforma^i jest odporny na 5-fluorouracy!.

stosuje się stosuje się się drożdże pozbawionego że stosuje
19. Sposób według zastrz.1, znamienny tym, że wytwarzanie hirudyny lub jednego z jej wariantów przez fermentacją drożdży według zastrz,14-18 i odzyskiwanie hirudyny wytworzonej w środowisku hodowlanym w formie dojrzałej lub w formie prekursora dojrzewa jącego in vitro bądó in vivo.

154 118

SMAI-ECORf Bd.ll*

Podwójne trawienie PSTI-BGLII Klonowania w ^Μ131Ό131 na miejscachPSThBIAMH¹

Hybrydyzacja DNA z M13TG897 z oligon. z mutagenezy (a) 5' -KTTTCCATAMAGAArTACGTATAGAGAC- 3' f b) 3...... TTTTTTATACAAATTTATTTTTTTAATCTZATATCTTTCATC......5

T A Γ C

T T

T T

C T

A T I

Elongacja nici komperentarną przez polimerazę Klenowa Wiązanie. Transformacja E.coli (c)^'......TTCCCTAMACA/A^TTTATrTTTTTATrTATTTTT^CCAiTiG......5'

Fig. 2: mutageneza in vitro

154 118

SMA1^e/EG0R1^e

Częściowe trawienie

Klenow

Wiązanie

Fg 3

SMAf/EGORl’

Otwarcie przez Bglll Generowanie usunięć działaniem BAI31

Wstawianie miejsca Barn HI 1 para zasady powyżej ATG inicjatora MFaltal

15^-fcPSTI ^Gura PROM**-HINDIII (X4, MfFAfHHiAĄSAU ' HVUII 7EGORI bgliic

PVUlf/HINDIII^e

HINDIII

PSTI'

ECORI

PSTI

PSTI’

EGORI

KansSrukcja HTG892 z HTG883

Fig. 4

154 118

Trawienie ONA z pTG892 przez Sali i Barn HI Izolacja najkrótszego fragmentu ONA Klarowanie tego fragmentu pomiędzy miejsca Sali i BamHI poi i - tgcznika z M13tg12O.

i

M133g889

Struktura M13TG889

Sekwencja MI3TG12O ' ^J Fragment Sali-BamHI z pTG892

Fig. 5

HINOIII

HINOIII

ECORI

BAMHI - BGLII | /^PSTI> / rECORI HINOIII ΧΒΑΙ KPNI ^LSPHI BGLII PVUII ΡΛΛΐ’-ΗΙΝΟΙΐΙ*

ECORI ^PSTI

EOORI

Fig. 6

154 118 cięcie endopeptydazowe YSCF feromon O pTG886 pTG897 pGT18O6 pGT1818 pGT 11328

PGG1833

Lys Arg Glu Ala Glu Ala Trp His...

Lys Arg Glu Ala (Gu Ala Trp Leu Gin Val Asp Gly Se* Met lleGhr.

Lls Arg (Gu Ala Glu Ala He Thr...

Lys Arg Glu Ala (Gu Ala Lys A^i^g lle Thr...

Lyy Arg Gu Ala Glu Ala Ser Leu AspLys Arg Ile Gir...

... Lys Arg lle Thr...

Fi^g.7

HINDlII , 4

AGOGTCGGGGGAGAAM^GrTGOTGAUCKCOG^KCCGCCCCCMAGCCTTGCGAA..

ATAAACCTATGTGCOATCSATAGTTGACTGACTGTGCTTATGCCAGTCTG .. 2 > 3 l 5 cctttgcctgtgtgaagtggcga acgtttgcggtcaggGta acaaa ..

GGACACTTACACTCTGCCAAGATTCTSAAACTCO AGTCCCAT TGTTT..

♦ 7 l

TGTCATGZTCgWcCGACG^GAMMAACCATTGCGTGACASTTTGAA..

ACGTAGTATOCTAGGCTGCCACT T TGTTTTTOCTCAATGTCCACG T..

9 ♦ 12 l

GTTACGCCTAAAboZATTCrCAG A ACGACCTTTGACTTCGA A..

CCATGAT(TSTTT(TXGT(OATATATTGGTGGCCATGTAGGTG..

13 I 15 taaatgccagaataaGcgtGcattaataatatctt CTT TAATGTCTTCT T AGAACGTCATTATGCTAGACATCT t 16 ♦ 18 cai i

Fig. 8

154 118

1-Alul 1 V

1-Hinfl

1-ACCI

V V

2-Hinfl 1-Ηρα II

V V

AGCTTCTTTGGAT/AlAAGAGTCtiTATAAACTGACCijCAACGAAirCCGGTC

1-Maelll

1-Maell 1-Nsil

V V V 100

AAAACCrcT(CXTGTGMAATTGTAACGlTTGAGATGAAGATAACAAA 78 100

Fig .9

1- Sau3A

2- Binl

D2

103

119

143 «8 ,'18

111

111

Fig. 9-1

150

106

154 118

1-Xmnl

1-Mboll

1-Toql t-Asuil

3-Maelll

3-Hphl 2-Mboll

W W V V 200

CCGMACCGCAGTCTCATAACGACACTGTCTTCTAGGAGATTCCAC^

180

185

186

188

138

201

2-$au3A

Φ

AAGAATACTTGCAGTAATAAGATCTGFig.9-2

ATG GTA GTT TAT ACC GAC TGC ACC GAA TCC Met Vol Val Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser

GGT CAG AAC CTG TGC CTG TGC GAA GGT TCT Gly Gin Asn LeuCys Leu Cys Glu Gly Ser

AAC GTT TGC GGT CAG GGT AAC AAA TGC ATC Asn Val Cys Gly Gin Gly Asn Lys Cys Ile

101

CTC GGA TCC GAC GGT GAA AAA AAC CAG TGC Leu Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gin Cys 131

GTT ACA GGT GAA GGT ACT CCG AAA CCG CAG Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gin ^,eTCT CAT AAC GAC GGT GAC TTC GAA GAA ATT Ser His Asn Asp Gly Asp Phe Glu Glu Ile

191

CCA GAA GAA TAT TTA CAA TGA AAA ATG AAA Pro Glu Glu Tyr Leu Gin xxx Lys Met Lys

221 251

GAA TAT CAA TCA TAG AGA ATT TTG ATT T Glu Tyr Gin Ser xxx Arg Ile Leu Ile ^Flg·¹⁰

154 118

Zakład Wydawnictw UP RP. Nakład 100 egz.

Cena 3000 zł