PL154252B1 - Insecticide - Google Patents

Description

RZECZPOSPOLITA POLSKA	OPIS PATENTOWY	154 252
		Patent dodatkowy do patentu nr--	Int. Cl.5 A01N 63/00
		Zgłoszono: 87 03 13 /P. 264628/
		Pierwszeństwo ®θ 03 15 Wielka Brytania	WtrM' g 6 δ tB t
URZĄD PATENTOWY	Zgłoszenie ogłoszono: 88 04 28
RP	Opis patentowy opublikowano: 1991 11 29

Twórca wynalazku: Uprawniony z patentu: Ciba - Geigy AG, Bazylea /Szwajcaria/ środek owagbOoczy

Przedmiotem wynalazku jest środek owadobbjczy zawierający białkową substancję czynną kodowaną fragmentem ONA pochodzącym z Bacillus thuringiensis var. kurstaki.

Oak przedstawiono w pracy S. Chang, Trends in Biotechnology 1 /4/, 100 /1983/ Bacillus thuringiensis /B. thuringiensis/ jest bakterią gram - dodatnią, patogeniczna w stosunku do owadów. Odmiany B. thuringiensis różnią sią miądzy sobą pod względem toksyczności i gatunków owadów - gospodarzy. Źródłem aktywności owadoobjczej B. thuringiensis są w znaczonej merze lub wyłącznie, parasporalne kryształy białkowe wytwarzane w stadium sporulacći. Gen /geny/ kodujący toksyczne białka /polipeptydy/ tych krysztaóów znaleziono w DNA plazmidowym i/uub w DNA chromosomalnym B. thuringensis.

Aby uniknąć niedogodności wynikających z obecność i innych związków wytwarzanych przez B. thuringiensis i uzyskać owadobójczy polipeptyd w dużych ilościach, pożądane jest użycie odpowiedniego genu, to jest odpowiedniej sekwennj DNA, kodującej żądane białko o^^tdc^t^ojcze poza organizmem B. thuringiensis. Ponadto, jest również możliwe, a w szczególnych przypadkach korzystne, transoomowanie B. thuringiensis taką sekwencją DNA.

W ten sposób można otrzymać białko analogiczne pod względem struktury i własności do białka naturalnego. Dla takiego białka /polipeptydu/ przyjąto w opisie termin MGE 1.

środek owadobójciy według wynalazku zawiera dopuszczalne w rolnictwie środki pomocnicze i substancją czynną i charakteryzuje sią tym, le jako substancją czynną zawiera ^czo skutecroą i^o^ć i -e^ndotoks^yny z B. t^huringiensis v^ar. kurstaki^, kodowanej przez fragment DNA pochodzący z B. thuringiensis var. kurstaki od miejsca dla Hpa I /0/ do miejsca dla Pst 1 /4355/. Fragment DINA kodujący < -endotoksyną opisany Jest sekwencją nukleotydową przedstawioną w tabeli II. Owadobóóczo skuteczna ilość $-endotoksyny z B. thuringiensis var kurstaki zawiera fragment opisany sekwencją aminokwasową przedstawioną w tabeli III.

154 252

154 252

Terminem S-endotokeyna określa eię w niniejszym opisie owadobójcze białko MGE ¹ oraz Jego pochodne i mooyfikacje otrzymane in vitro, takie Jak białko MGE 1 związane z innymi fragmentami białkowymi, zwłaszcza otrzymanymi z innego klonowanego DNA, kodującego substancje wykazujące inną aktywność szkodnikobójczą, a zwłaszcza owadobbjczą. Takie połączenia białek definiuje się Jako białka iuzyjne. Poza aktywnością owadobójczą, aktywność szkodnikobójczą obejmuje przykłddowo aktywność bakteriobójczą, wirusobójczą, grzybobójczą oraz chwassobójczą, a szczególnie aktywność przeciw organimmom patogenicznym dla roślin. Spośród substancji białkowych korzystne Jest owadobójcze białko MGE 1.

Stosowany w opisie termin ''transformacja” obejmuje rjwnież mechanizmy związane z koniugacją.

środek według wynalazku zawiera owadobójczo skuteczną ilość układu kapsułki biologicznej. W układzie tym, pierwszy Mteriał Jest całkowicie zawarty /zamknięty/ w drugim materiale pochodzenia biologicznego, przy czym pierwszym y8teriałem Jest tu, fragment DNA podany w tabeli il, a drugi yateriał stanowi cały martwy mikroorganizm, z zastrzeżeniem, że jeśli taki mikroorganizm należy do grupy Baccllus thuringiensis to jest on tranibrymoraiz fragmentem DNA opisanym w tabeli il. MateΓiałey DNA może być rjwnież fragment DNA pochodzący z Bscc^l^us thuringiensis var. kurstaki od miejsca dla Hpa i /0/ do miejsca dla Pest i /4355/, kodujący białkową substancję owadobójczą, oraz mogą to być sk^rone części tego fragmentu DNA, pod warunkiem, że kodowane przez nie białko nie zatraciło aktywności bwaddbójczej. Szczególnie dogodnymi mikroorganizmami są drożdże, zwłaszcza Saccharomyces cerevisiae, takie jak S. Cerewlsiae GRF 18. Komijki drożdży mogą być uprzednio transboymowαnt plazmidem PK 36 zdeponowanym pod numerem DSM 3668.

System uwalniania substancci czynnej składa się z transboimowαiych, żyjących lub martwych komórek drożdży, zawierających skuteczną owadobójczą ilość -endotoksyny, przynajmniej częściowo kodowanej przez fragment DNA kodujący białko MGE 1, taki system uwaanimia Jest dogodny dla dostarczania substancci aktywnej w formie zabezpieczonej. Deśli bowiem transboimowane komójki drożdży zastosuje się w sposóó konweenconalny, przykładowo przez opryskiwanie pola /soosowanie doglebowe i napowwetrznę/ to można uzyskać długotrwałe działanie owadobóóczθ. Substancja czynna jest dobrze chroniona przed przedwczesnym rozpadem wywołanym niekorzystnymi warunkami, na przykład światem słonecznym lub niekorzystnymi warunkami na powrerzchni listowia.

Można umieścić klonowany gen pod kontrolą proy^oora drożdżowego i dokonać Jego ekspresy. Aktywność owadobóóczą wykazać w a/ ekstraktach i b/ w całych komórkach.

DdpowWednie proy^oiory drożdżowe są podane w europejskim opisie patenoowym nr 100561. Szczególnie dogodnym promotorem jest promotor PH05.

Przynajmniej o niektórych genach B. thuringlθisle kodujących białka aktywne owadobójczo wiadomo, ze łączą się z promotorem rozpoznawanym przez DNA-ppoiierazę Escherichia coli /E, coli/. Proyooory te są usytuowane przed odpowiednim genem co zostało opisane w pracy H.C. Wong i in. The of Biolog^cal Chemi9ery 258 /3/, 1960 /1983/.

Dwadobbócią S -endotoksynę wytwarza się na drodze transkrypcji i translacji poprzez E.coli lub drożdże genu opisanego w wynalazku ze zdefinoowaną sekwencją DNA.

Ti sekwencja DNA rjżni się znacznie co do struktury od dotychczas znanych genjw B. thuringleisie opisanych w następujących pracach: H.E. Schnepf i in., The Dournal of Biological ΰιβπίδ^γ 260 /10/, 6264 /1985, M.D. Adang i in., Gene 36, 289 /1985/, Shi^bano i in. Gene 34, 243 /1985/ i publikacja PCT - W) 8601536.

Fragment DNA charakteryzuje się sekwencją nukleotydową podaną w umieszczonej niżej tabeli il i koduje on białko MGE 1. Fragment ten pochodzi z Bacillus ^ur^gi^s^ var. kurstaki od miejsca dla Hpa i /0/ do Miejsca dla Pst I /4355/ i koduje owadobójczą substancję białkową. Skromne fragmenty tego DNA. spełniają ten warunek, że kodują one białko, w k^rym zachowana jest aktywność bwadobbócza.

Dla uzyskania wyjściowego Maeri.ału DNA procesy opisane w niiietzzyy opisie prowadzono stosując Bacdlus thuringiensis var. kurstaki, szczep ETHZ44449. Szczep ten jest

154 252 zdeponowany w Departamencie Mikrobiologii Szwajcarskiego Federalnego Instytutu Technologii w Zurichu /Szwajcaria/ i udostępniany każdemu bez ograniczeń. Pochodzi on z kolekcji H. Dulmago z jednostki badawczej nad szkodnikami bawełny /Cotton Insects Research Unit/ Ministerstwa Rolnictwa Stanów Zjednoczonych Ammrrki. Agriculture Research Center, Brownnvllle, Texas, skąd jest on udostępniany każdemu bez ograniczeń.

Środek według wynalazku jest skuteczny w zwalczaniu owadów, zwłaszcza owadów należących do rzędu Lepidoptera, szczególnie gatunków Pieris, Heliothis, Spodoptera i Plutella, takich Jak Pieris brasslcae, Heliothis yicoecens, Heliothis zes, Spodotera litteralis, Plutella xylostella i pokrewnych, za pomocę białkowej substancji zawierającej białko MIE 1 kodowane przez sekwencję DNA podanę w tabeli II. Dwadom lub do ich środowiska podaje się skuteczną owadobójczą ilość substancci białkowej przynajmniej częściowo kodowanej przez fragment DNA zawierający kod dla białka MGE 1. środek zawiera skuteczną owadobójcze ilość substancci białkowej przynajmniej częściowo kodowanej przez fragment DNA zawierający kod dla białka MIE 1.

Testowanie biologIczne całych komórek drożdży zawierających ^kombinowany gen toksyny B. thuriigiensis.

Całe iom/óki zawie rające gen B. thuringiensis są formą kapsułki biologicznej produktu MGE 1 /sztucznie skonstruowany układ złożony z materiału biologicznego, zawierający materiał genetyczny otoczony materiare/ ochronnym/. Układ taki, zastosowany na rośliny jest lepiej chroniony przed degradacją w wyniku wpływu czynników rozkładających, takich jak światło, niż krystaliczne białko wytworzone w stadium sporulacji B. thuringieitit i przechodzące do podłoża hodowm w wyniku rozbicia koZr^i^k.

Koi^/óI^^ drożdży zawierające toksynę B. thuringimsis oraz io/óókl drożdży nie zawierające tej toksyny zawiesza się w wodzie destylowanej do odpowwedniej gęstości optycznej. Z otrzymanych zawiesin przygotowuje się odpowwednie stężenie i dodaje środek zwilżający w stężeniu 0,2% objętościowo. Aktywność owadobóóczą tych drożdżowych preparatów komórkowych oznacza się wykonując test na krążkach liści, opisany w przykładzie IX.7. Aktywność ornadobóócza eransfr/mowanyjh B. thuringiensis komórek drożdży w stosunku do lam Heliothis yirescens w pierwszym staduum rozwoju przedstawiona jest w tabeli I.

Tabela I

Mae^nLał	Stężenie	śmiertelność w % /N=30/
Kom/óki zawiera jące toksyny	1 : 5	72
	1 : 7,5	40
	1 : 11,3	37
	1 : 16,9	22
Korn/óri nie zawiera-	1 : 5	3
Jące toksyny	1 : 11,3	0
Krążki liści bez d rożdzy
kontrola 1	-	0
kontrola 2	-	3

Podobne wyniki można otrzymać stosując w tym ea/ym teście ekstrakty drożdżowe przygotowane według europejskiego opisu patentowego nr 100561, zamiast całych komórek drożdży.

Do stosowania jako środki omadobórcze, transfr/monαir mikroorganizmy zawierające reio/blititonk gen toksyny 9· thuringlensis, korzystnie, transfrιmowanr lub martwe

154 252 komórki, drożdży, w tym również mieszaniny żyjęcych i martwych komórek drożdży przygotowuje się w postaci niezmodyfikowanej lub korzystnie, łęcznie ze środkami pomoonlczymi zwykle używanymi do form użytkowych, wytwarzajęc w znany sposób formy użytkowe takie jak, koncentraty zawiesin, pasty powlekane, zawiesiny do bezpośredniego opryskiwania lub do rozcieńczania, proszki zwilżalne, proszki rozpuszczalne, proszki pyliste, granulaty oraz formy kapsułkowanie, na przykład w substancjach polimerycznych, Zależnie od rodzaju formy użytkowej oraz celu i panujących warunków dobiera się sposób stosowania, taki Jak opryskiwanie, rozpylanie cieczy, opylanie, rozpraszanie, powlekanie lub podlewanie .

Te formy użytkowe, to Jest środki lub preparaty zawierajęce transformowane, żyjęce lub martwe komórki drożdży lub ich mieszaniny, oraz ewennualnie, stały lub ciekły środek pommccnczy w^^warza się znanymi sposobamm, na przykład przez jednorodne zmieszanie komórek drożdży ze stałymi nośnikami i w razie potrzeby ze środkami powierzchniowo-czynnymi.

Jako stałe nośnnki, na przykład do proszków pylistych i proszków tworzęcych dyspersje stosuje się zwykle napełnlacze nieorganiczne pochodzenia naturalnego, takie jak kalcyt, talk, kaolin, mootmmcylonit lub atapulgit. W celu poprawienia własności fizycznych dodać kwas krzemowy o wysokim stopniu rozdrobn ienia lub polimeryczny absorbent o wysokim stopniu rozdrobnienia. Odpowiθdniri granulowanymi nośnikami adsorbcyjnymi sę tu nośniki porcwalθ, takie jak pumeks, tłuczona cegła, sepiolit lub bentonit a odpowiθdnimi nośnikami nlesorpcyjnymi sę ne^riały takie jak kalcyt lub piasek. Można również stosować wiele wstępnie granulowanych ni^ria^^w nieorganicznych lub organicznych, zwłaszcza dolomit lub sproszkowane pozostałości roślin.

Jako środki powierzchniowo-czynne stosuje się środki niejonowe, ka^anowe i/uub anionowe o dobrych własnościach dyspergowania i zwilżania. Terminem “środki ρowierzchnicwc-czyπnn“ określa, się w ninietz^rm opisie również mieszaniny tych środków.

□ako anionowe środki powierzchniowo-czynne można stosować zarówno rozpuszczalne w wodzie mydła Jak 1 syntetyczne zwięzki powierzchniowo-aktywne.

Mydłami odpowiednimi do środka według wynalazku sę sole meeali alkalccznych, sole meeali ziem alkali^nych albo niepcdstawlcnn lub podstawione sole amoniowe wyższych kwasów tuuszcoowych /CyQ-C22/‘ na przykład sole sodowe lub potasowe kwasu clθtnowegc lub stearynowego lub naturalnych mieszanin kwasów tfoszczowych, które otrzymać przykładowo z deju kokosowego lub łoju. Na uwagę zasługuję również sole kwasów tłuszczowych z mθnylotlłrynę, takie jak sól sodowa kwasu iis-2-/metyCo--okklddecθnylolrino/-ntanosulCncowego /korzystna ich zawartość w formach użytkowych wynosi 3%/.

Częściej jednak do tego typu form użytkowych stosuje się tak zwane syntetyczne środki powierzchniowo-czynne, zwłaszcza sulfoniany i siarczany tłuszczowe, sulknowane pochodne benzimidazolu, alkiCoaryCosulfonlany lub alkohole tuuszczowe, takie Jak 2,4,7,9 -tetaarntylc-5-deiyno-4,7-diol /korzystna zawartość w formach użytkowych wynosi około 2%/.

Sulfoniany lub siarczany tfosźczowe stosuje się zwykle w formie ich soli z meealami alkalceznymi, z imeslami ziem alkalccznych albo podstawionych lub niepodstawionych soli aminowych zawierajęcych rodnik Cg-C22 - alkilowy, posiadajęcy ponadto resztę alkilowa rodników acylowych, na przykład, sę to solLe sodowe lub wapniowe kwasu lignosulfonow^t^o, dodecylosiarczanu albo mieszaniny siarczanów alkoholi tfoszczowych otrzymanych z naturalnych kwasów tfoszczowych. Oo zwięzków tych należę również sole estrów kwasu siarkowego oraz kwasy sulfonowe adduktów alkoholu t^szorowago z tlenkeem etylenu. Sulfonowane pochodne benzimidazolu posiadaja korzystnie dwie grupy kwasu sulfonowego i jeden rodnik kwasu tłusicoowegc o 8 do 22 atomach węgla. Przykładami alkiloaΓylosulfonilnów sę sole sodowe, wapniowe lub trónelncoClrmtnown kwasów: dodecylcbnnznnctulfonowngc, dwubułylcnaftaneno^ulCooiwegc albo produktu kondennsaćl kwasu naftannnosulfociwego z formaldehydem. Można poza tym stosować cdpowiednie fosforany, na przykład, sole estru kwasu fosforowego z addukt:em paranonylofenolu -/4 do 14/ - z tlenkńem etylenu.

154 252 □ako niejonowe środki powierzchniowo-czynne stosuje się korzystnie pochodne eterowe pollglikolu i alkoholi aliaatyznnych lub cykloaliaatyzznych albo nasycone lub nienasycone kwasy tłuszczowe i alkilofenole, przy czym pochodne ae zawierają 3 do 30 grup eterowych glikolu i 8 do 20 atomów węgla w /alifa^^cznej^ reszcie węi^^oww^oro^^j oraz 6 do 18 atomów węgla w reszcie alkilowej alkilofenoli.

Odpowiednimi nielonowymi środkami powierzchniowo-czynnymi sę również rozpuszczalne w wodzie addukty polit/nnku etylenu z gliko/em pollplopyfnoiwym, gllko/em etylenodwuaminopropyeenowym i gllko/em alkilppoliprpyylθliwym, zawierajccym 1 do 10 atomów węgla w łańcuchu alkUw^y^m, przy czym addukty te zawieraję 20 do 250 eterowych grup glikolu ety/nnowego i 10 do 100 grup eterowych glikolu propylenowego. Zwięzki te zawieraję zw^le 1 do 5 jednostek glikolu eay/enowego na Jednostkę glikolu propylenowego.

Przykładami ni^eii^r^i^wych środków powierzchniowo-czynnych sę: nonyyofenolo-polietoksyetanole. etery poliglkkooowe oleju ręcznikowego, addukty politenoków/propyleno-etylowych/, tróJbutylofenoksypolietlksyθtanol, glikol poliet y/mowy i aktylnfenokyypolίetnkyy etanol. Odpowwednimi środkami ni^ei^^r^c^wy^^ sę również estry kwasów ałuszczowych z polihydrnksyetyl/nnynrbitanea, takie jak trójoleinian polihydroksyetalenosorbitanu.

Kationowymi środkami powierzchniowo-czynnymi sę czwartorzędowe sole amoniowe zawierające jako podstawnik przy azocie rodnik alk-Howy co najmniej ^3-^22 a Jako dalsze podstawnnki niepodsaawine/ lub chlorowcowane niższe grupy alki.b^we, grupę benzylowę lub niższe grupy hydroksyyalkilowe. Jako sole stosuje się korzystnie halogenki, mefylosiarczany lub /tylosiarczany, na przykład chlorek yaearylorróJmθtylaamoniowy lub bromek benzylo-dwou^-chloroe tylo/eyyloamoniowy.

środki powierzchniown-yzyee/ zwyczajowo stosowane do przygotowywania form użytkowych sę opisane w podręcznikach: “McCutcheon's Det/rg/nts and Emmłsyfi/ry Annual”, MC Publishing Corp. RLdgewo^id, New J/rs/y, 1980 oraz Helmut Stach/, ”T/esid-Taschβnbuyh” /Handbock oi Suriactants/, Carl Hanser Verlag, Munich Vienna, 1981.

środki przeznaczone do stosowania w agrochei^m^ zawierają od 0,1 do 99%, korzystnie 0,1 do 95% tran3loamowaeyyh, żyjących lub martwych komórek drożdży lub ich mieszaniny, 99,9 do 1%, korzystnie 99,8 do 5% stałego lub ciekłego środka pomanciczego i 0 do 25%, korzystnie 0,1 do 25% środka powierzchniowo-czynn/go.

Korzystnymi produktami handlowymi sę kmcennraty, natomiast użytkownik będzie zwykle stosował tormy rozcieńczone.

środki według wynalazku mogę również zawierać inne składniki, takie jak stabilizatory, środl<i przeciw-pienn/, środki regulujące lepkość, środki więżęce, zlepiające, jak również mogę być łączone z nawozami sztucznymi lub innymi składnikami aktywnymi, dodawanymi dla uzyskania określonego działania.

Translormnwae/, żyjęce lub martwe komrl^^ drożdży lub ich mieszanin zawierające reknmbleantowy gen toksyny B. thuringiensis nadaję się szczególnie do zwalczania szkodlwwych owadów, zwłaszcza owadów niszczących rośliny z rzędu Lepidoptera, korzystnie z gatunku Pi/ris, Hθlinthis, Spodoptera i Plutella, takich Jak na przykład Pieris brassica/, Helinehiy virescens. Hθlioehiy zea, Spodoppera litooralis i Plutella xylo3tella.

Dozowanie stosowanych komórek drożdży zal/ży od aktualnych warunków, takich jak pogoda, rodzaj gl/by, stopień wzrostu roślin i czas stosowania. W oparciu o badania prowadzone w cieplarni, przyjmuje się, ż/ zastosowani/ 1 do 10 kg a zwłaszcza 3 do 9 kg komór/k drożdży na hektar powinno być korzystne.

Wynalaz/k ilustrują poniższe przykłady, przy czym przykłady VII-XII dotyczę wytwarzania subssancji czynnej środka według wynalazku.

W przykładach I-VI, któr/ dotyczę iom użytkowych maferiału zawierającego toksynę 8. thuringi/nsis, t/rmin ''knmórki drożdży” oznacza komm^! drożdży zabierające r/kombinowany g/n toksyny 8. thuri^ngiensis /% = prnjeety wagoww/.

154 252

Przykład I. Granulaty

	_2Z
komórki drożdży	5%	10%
kaolin	94%	-
kwas krzemowy o wysokim
stopniu zdyspergowania	1%	-
atapulgit	-	90%
Kommrki. drożdży zawiesza się w chlorku meeylenowym, zawiesinę natryskuje się na
nośnik, po czym środek suspendujęcy odparowuje się	pod zmniejszonym ciśnieniem.
Przykład II. Proszki pyliste
	_θΖ	-±Z
komórki drożdży	2%	5%
kwas krzemowy o wysokim
stopniu zdyspergowania	1%	5%
talk	97%	-
kaolin	-	90%.
Proszki do bezpośredniego stosowania przygotowuje się przez dokładne	zmieszanie noś-
ników z komórkami drożdży.
Przyk ład III. Proszki zwilżalne
	_sZ		_£Z
komórki drożdży	25%	50%	75%
lignosulfonian sodowy	5%	5%	-
laurylosiarczan sodowy	3%	-	5%
dwu i zop r o py 1 e^n n f ta len oau 1 to—
nian sodowy	-	6%	10%
eter ok^ylofenolu z gliko^m
yolielyleoowyi /7-6 mooi tlenku
etylenowego/	-	2%	-
kwas krzemowy o wysokim
stopniu zdyspergowania	5%	10%	10%
kaolin	62%	27%	-
Kommrki drożdży miesza się dokładnie ze środkami pomoc^zym!, mieszaninę miele się
dokładnie w odpowiednim młynku, otrzymujęc proszek	zwilżalny,	ktćry po	rozcieńczeniu
wodę daje zawiesiny o żądanym stężeniu.
Przyk ład IV. Granulat wytłaczany
komórki drożdży		10%
lignosulfonian sodowy		2%
karbnksymmrylocelulnza		1%
kaolin		87%
K^i^mrlc^ drożdży miesza się i dok ładnie mele	ze środkami	pomocnez^ymi, a następnie
zwilża wodą, wytłacza i suszy w strumieniu powietrza.
Przykład V. GramuLat powlekany
komórki drożdży		3%
glikol polietyennowy		3%
kaolin		94%

Jednorodnie zmieszane komórki drożdży nanosi się równomiernie, w mieszalniku, na zwilżony glikoeem polieyylnnw»yri kaolin. Otrzymuje się niepyłacy granulat powlekany.

Przykład VI. Koncentrat zawiesiny

Kommrki drożdży	40%
glikol rtl'renowl	10%
eter nonylotennli z glkt^oemm polielyleoiwym /15 mooi tlenku etylenowego/	6%
sól tΓΰjetnnonoaminl z kwasem alklnbrtnennosιJtrnniwymx	3%

154 252 karboksymetyloceluloza 1% olej sillOonowy w formie

75% eeuUsjl 0,1% woda 39% x - alkil oznacza łańcuch oierozgałęziooy zawierający 10-14, a korzystnie 12-14 atomów węgla, oa przykład sól trótetoooloemoniową kwasu o-dodecylobeoztoosulfonowego.

Jednorodnie zmieszaoe koeeóki drożdży miesza się dokładnie ze środkami pooeociczymi otrzymujęc koncenirat zawieśmy, z którego po rozcieńczeniu wodę sporzędza się zawiesioy o żędaoym stężeniu.

Przyk ład VII. WyGorębnoanie plazmidowego ONA W przykładzie tym jako drożdże rozumie się Saccharomyces cereylsiac. Plazmidowy ONA wyodrębnia się w sposób oplsaoy poniżej metodę Whie'a opisaoę w Yournal of Bicceriology 141 /3/, 1134, /Marci, 1980/. '

VII.1. Wyoirębbiθnie plazmidowego DNA z Cacillus tiuriogieosls.

Kommrki E.coli HB 101 po^t^i^je się wzrostowi w ilości 1 litra podłoża LB w warunkach wytrzęsaoia w sposób opisoiy przez Wile's 1 Nester^ w */w. pracy. Kommókl zbiera się, zawiesza w alkal^onym buforze ^do Uzy i utrzymu^je w temperaturze 3⁷°C przez ²⁰-³⁰ minut. Otrzymany klarowny lizat zobojętnia się przez dodanie 2M Tris HC1 /pH 8/. Ciromo8omeliy ONA wytręca się przez dodanie SOS 1 NaCl. Lizat umieszcza się oa lodzie i usuwa chromo^malny ONA przez odwirowanie. Zawarty w supernatancie plazmidowy ONA wytręca się za pomocą 10 proitotowtgi PEG 6000. Po dobowym utrzymaniu w temperaturze 4 l zawiesza się teo plazmidowy ONA w ilości 7-8 ml roztworu TE. Plazmidowy ONA otrzymany z 1 litra hodowli oczyszcza się w dwu gradientach CsCl. Oo ilości 8,7 ml supernatantu dodaje się 8,3 g stałego CaCl. Po dodaniu bromku etidium /Sigma, końcowe stężenia 1 mg/ml supernatantu/ roztwór przenosi się do poliallmιteiowyci próbówek Qulck Seal /Beckman/ o pojemności 13,5 ml i wiruje w wirówce Beckman'a Ti 50 przez 40 godzin przy 40000 obrotów/minutę.

W okrasie fal długich UV /366 om/ można uwidocznić dwa pasma fluorescencyjne. Niższe pasmo zawiera wtórnie zwinięty plazmidowy DNA, który zbiera się przez przebicie próbówki z boku za pomocę 2 milimetrowej strzykawki /Igła 18 G/. Bromek etiduum usuwa się przez pięciokrotną ekstrakcję równymi objętośclaml lzopropanolu /wysyconego CsCl/. Produkt przenosi się do próbówek Corax o pojemności 30 ml, dodaje się po 2,5 objętości roztworu TE i. wytr^ęca si.ę ^DNA e^tanilee. Roztw^ór utrzymuje się nastę^pnle w te^^e^r^turze - ²°°^C przez 12-15 godzin. (Wtrącony ONA zbiera się przez wirowanie w wirówce Soryall HB-4 przez ³⁰ minut p^rzy 1²°°° obro^w/m inut^ę w temperaturze 0°C i rozpuszcza w ²°0/ul roztworu ^TE. W ten sam sposób poddaje się ekstrakcji i stosuje szczep E.coli JM 103.

VII. 2. WyoOrę^bnitnit plazmidowego DNA z E. coli

Κοη^^Ι ze 100 ml hodowli w podłożu LB zbiera się przez ultr-awioowaiie w wirówce GSA /^Sorva^al/ przez W ^m.nu^t z sz^koścra ⁶⁰⁰⁰ obro^w/minutę w temperatu rze 4°^ oastęooie zawiesza się w ilości 100 ml roztworu TE /10 mM Tris HCl. 1 mM EDTA, pH 8,0/ i powtórnie wiruje się w tych samych warunkach. Peletkę komórek zawiesza się w 3 ml roztworu Tsuc /50 MM Tris HCl, pH 7,5, 25 procent sacharozy /wagowo/ objętościowo i przenosi się do polipropy^^NTych próbówek Serwall SS-34. Wstyntkie następne etapy wykonuje się w warunkach ziębienia lodem: Po 5 moutach do^iaje się 0,3 ml roztworu liooyymu /10 mm/ml, 11000 jednostek/mg/ dostarczonego przez firmę Weethlogion. Następnie dodaje się 1,2 ml EDTA /500 mM, pH 8,0/ i po następnych 5 minutach dodaje się 4,8 ml detergentu /o składzie 0,1 procent. Tritoo'u Χ-100 /Merck/, 50 mM EOTA, 50 mM Tris HC1 /pH 8,0/. Po upływie dalszych 5 mout lizat wiruje się w uprzednio oziębionej wirówce SS-34 w czasie 40 minut w temperaturze 4 C. Supernato^ starannie usuwa się i po dodaniu stałego CsCl oczyszcza się go w gradientach CsCl w sposób opisany dla plazmidowego DNA B.thu Z ilości

100 ml hodowU uzyskuje się 5°-lJ0^Ąla hybrydowego plazmidowego DNA.

Przyk ład ^VIII. Antygen S -ti^ritiktⁿi^{n i} orzec iw: iaita kozie.

VIII. i. Prz^ygdowanie adoeiu k ^οΙΙοζ^ j ^S

Hodowlę Cacillus thu ringieisis /var. kurstaki HDi, szczeń ETHZ 4449// prowadzi się w koltach Ferilach a na podłożu Youstai^ i Roietf’a opisanym w Yournal of BacieΓiilogn

154 252

100, 1229 /1959/ 1 podanym powyżej, zawierającym zwiększone stężenie glukozy /0,3 procent zamiast 0,1 ^pro^^nt/. In^kubacj^{ę p}rowadzi si^ę w czasie ⁴-^{5 d}ni w tem^er^^urz^e 30°C. Kolonie zbiera się natychmiast po sporulacji metodę opisaną przez 8. TrOmpi, Zentralblat f. Bakteriologie Abt. II 305 /1976/. Ciała parasporalne oddziela się od spor metodą Oelafield's i wsp. opisaną w Yournal of Bacteriology 96, 713 /1968//.

a/ Rozdzielenie spor od kryształów:

- autolzzowane hodowle zawiesza się w buforze 1 M NaCl/0,02 M fosforanu potasowego /pH 7,0/ zawierającym 0,01 procent Trioonu Χ-100 /Merck/,

- suspensję filtuuje się dla oddzielenia stałych składników takich jak pozostałości agaru i podobnie,

- suspensję wiruje się,

- osad przemywa się wielokrotnie powyższym roztworem do czasu, gdy w supernatancie pozostaną jedynie ślady akładników wykazujących absorpcję przy 260 nm,

- stałe składniki przemywa się roztworem o składzie: 0,2 M NaCl/0,004 M bufor fosforanowy /pH 7,0/ 0,01% trioonu Χ-100,

- przemywanie powtarza się, stosując do orzemywania 0,01 procentowy Triton Χ-100,

- cząsteczki zawiesza się w wodzie,

- z suspensj usuwa się pozossałe komórlci,

- prowadzi się wirowanie i przemywa pozostałe spory i kryształy trzykrotnie roztworem o składzie: 0,02 M bufor fosforanowy /pH 7,0/ 0,01% Triton Χ-100,

- suspensję w 182 ml tego samego buforu przenosi się do cyltndżycznegz rozdzielacza zawieraj ącego 105 g 20 procentowego /wagowo/ wodnego roztworu siarczanu sodowego dekstranu 500 /Sigma/, 13,2 g stałego glikolu ioliθżylnoowego 6000 /Merck/, 3,3 ml buforu fosforanowego /pH 7,0/ i 7,5 g NaCl,

- w celu rozpuszczenia stałych składników zawartość rozdzielacza wytrząsa się,

- zawartość rozdzielacza dopełnia się do objętości 600 «1, dodając dobrze zmieszany roztwór o tym samym składzie, lecz bez składników bakteryjnych,

- prowadzi się energicznie wytrząsanie,

- jzostawia w temperaturze 5°C ⁱkzez 30 minuj

- z rozdzielonej cieczy ściąga się górną warstwę zawierającą większość spor lecz bardzo niewielką ilość kryształów,

- górną warstwę wiruje się,

- do pozossającej w rozdzielaczu dolnej warstwy, zawierającej mieszaninę spor i kryształów dodaje się supernatant,

- ekstrakcję pot^wiarza się.

Po dziesiątej ekstrakcj, kryształy znajdujące się w dolnej warstwie są całkowicie wolne od spor i mogą być zebrane przez wirowanie. Zarówno spory jak 1 kryształy przemywa się pięciokrotnie zimną wodą destylowaną. Kryształy przechowuje się w temperaturze -5°C w postaci zawiesin w woddie.

b/ Rozpuszczanie kryształów:

Pewną ilość zawiesiny kryształów wiruje się przez 10 minut przy 12000 g. Otrzymany osad zawiesza się w 0,05 M buforze węglanowym i 10 mM ditlotreitolu /OTT, Sigma, mieszanina buforu węglanowego 1 ditiotreitolu , określana w dalszej części opisu jako węglan /OTT” w stężeniu 5 mg osadz/ml mieszaniny: węglan/OTT.

Po inkubacj w temperaturze 37°C przez 30 minut , nierozpuszczone cząstki oddziela się przez wirowanie przez 10 minut przy 25000 g. Supernatant poddaje się dializie wobec buforu węglanowego a następnie przeznacza do testów biologicznych na zawartość białka

154 252 i aktywność. Do celów przechowywania, roztwór protoksyny dzieli się na porcje, które poddaje się głębokiemu zamrażaniu. Po rozmrożeniu, białko to, nie zawierające DTT posiada konsystencję żelopodobnę. Całkowite rozpuszczenie białka uzyskuje się przez dodanie 1 mM DTT.

c/ Inaktywacja związanych z kryształami proteaz:

Zawarte w suspensjach krysztaóów seryno-proteazy 1 proteazy Keał^ opisane przez

G.G. Chestukhina i wsp. w pracy ''Brokliniya” 43, 857 /1978/, inaktywuje się przez dodanie fluorofosforanu dwuizopropylowego /OFP, Serva/ 1 EDTA według następu jącego przepisu :

Kryształy zawiesza się w mieszaninie 0,01 M buforu fosforanowego /pH 8,0/ 1 1 mM EDTA, w stężeniu 5-10 mg kryształów/ml meszaniny buforu i EOTA. Zawiesinę tę poddaje się działaniu ultradźwięków aż do otrzymania Jednorodnej suspennji /zawierającej cząstki o tej samej wielkości/, co sprawdza się w mikroskopie optycznym.

Do tej suspennsi dodaje się pod wyciągiem, z zachowaniem ostrożności, 1 mM DFP. Próbówkę zawierającą suspensję zamyka się szczelnie, zabezpieczając przed dostępem powietrza i energicznie wytrząsa. Po inkubami w temperaturze pokojowej przez dobę, inaktywowaną suspensję poddaje się dializie, do stanu równowagi wobec Ι-^,Ο i 1 mM EDTA.

VIII.2. ^mmmuni^i^t^^a kóz

Z krysztaóów B.thuringiensis, serotyp H-3, przygotowuje się antygen przez rozpuszczenie tych kryształów w roztworze: węglan /DTT, dializowanie otrzymanego roztworu wobec buforu węglanowego i 1 mM DTT i oczyszczenie antygenu, sterylizując go przez filtrację przez filtry o średnicy porów 0,45/Um.

Roztwór antygenu miesza się z kompletnym adiuwantem Freunda /Bacto/ w stosunku 1:1 i ^ptzec^hzwuje si^ę w temperaturze ⁴°^C.

W stacji badawczej firny Ciba-Geigy AG w St. Aubin /Fribourg, Szwaacana/ poddano immeuizaαii protoksyną H-3 dwie kozy. Każdej z kóz wsttzylawαno śródskórnie 0,5 mg antygenu i podskórnie 1,5 ml preparatu Pertusis /Behring/. Ten ostatni preparat podawano w celu zwiększenia reakcj iemeunZozicznei. Takie pełne traktowanie wykonywano w dniach: 0, 28 i 76. Po 35, 40, 84 i 89 dniach pobierano próbki krwi, przy czym w 35 dniu pobierano 5 ml a w każdym z następnych wskazanych dni pobierano po 80 ml krwi. Po koagulacji kn^i, surowice inkubowano w temperatu rze 56°C przez 30 minut, inaktywując dopełniacz. ^rowice ^przechowyaanz w temperaturze -20°C.

VIII.3. Oczyszczanie i znakowanie - 125^ kozich przeciwciał przeciw H-3. a/ Oczyszczanie iemeunzloObliny :

Frakcję immeunoloOiliiy G /IgG/ koziej surowicy przeciw H3 oczyszcza się przez strącenia siarcz^em amonowym, następną ihromarografię na celulozie DEAE i analizuje techniką iemeunOdfuzji OuchteΓlziy*egz opisaną w Handbach of Immeuidiffusien and Immeunoiectrophoresis Ann Arbor Pubbishers, Arbor, Mich, USA /1968/ metodą opisaną przez Hubera-Lukac'a w PhD thesis Swiss Federal Institute of Technology Zurich, Swtzerland, No. 7050 /1982/. Tak więc ilość 30 ml 3,2 M siarczanu amonowego dodaje się kroplami do 15 ml koziej surowicy przeciw H3 w 15 ml P8S /0,01 M bufor fosforanowy /pH 7,4/ i 0,8% NaCl/ jak opisano w pracy S. Chang, Trends in Biotechnolzgy 1, /4/, 100 /1083/. Mieszaninę pozostawia się na 15 minut, wiruje przy 0,5 M NaCl 1 0,5 M itanoloαmiią. Następne przemywania prowadźi się roztworami 0,1 M NaHCO^ /pH 8,3/ i 0,5 M NaCl a następnie 0.1 M CHjCOONa /oH 4/ i 0,5 M Nad. Ostatni etap przemywania wykonuje się roztworem 0,1 M NaHCO- i 0,5 M NaCl. ^łą^^ł białko-Sepharose'^S' jest raraz (jotowe do napełniania kolumn^y Pharmacia ^K9 ^armaaca/, W ten sposób IgG może być skutecznie oczyszczana na kolumnie.

Specyficznie związane przeciwciała eluuje się 3M roztworem KSCN i dializuje wobec ^pbs2 /1^{0 mM foj}f^oraⁿ stówy /p^{H 7},⁸/, 0,1⁴ M ^NaC^l/^, przeciwciał znalcuje si^ę radioaktyw125 nym jodem O metodę z chloraminą T opisaną w Amersham Buchler Rewiew No. 18, Amersham

Buchler Gr^H and Co.KG. Braunschweig, FRG, /1979/.

154 252 b/ Znakowanie jodem:

Oo próbki zawierającej lOO.ul 0,5 M buforu fosfoaanowego /pH 7,2/ dodaje re 1 mCi 125 ' jodku sodowego / □/. Podczas ciągłego meszania dodaje się 5/Ug roztworu białk,. /0,5 mg/ ml w TBS/ i 5O^ug chloraminy T w 0,05 M buforze fosfornooiym /pH 7,2/. Po minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej dodaje się 120^ug NagSgO^. Ze znaczonego białka oddziela się niezwiązany Jod na wypełnionej 5ephadexem G-25 kolumnie o wymiarach 0,9x12 cm. Ola uniknięcia absorbowania znaczonego białka, przez kolumnę przepuszcza się najpierw 0,5 ml B5A /100 mg/mm/. Następnie znaczony maeri-ał przenosi się ilościowo na wierzchołek kolumny i eluuje buforem fosforanowym /pH 7,2/. Zbiera się frakcje po 1 ml do czasu całkowitego wymycia białka.

Przyk ^ład IX. Klonowanie genu ¢5 -an^rake^y:

Bank częściowo trawionego za pomocą 5au3A plazmidowego DNA z B. thuringiensis var. kurstaki HOl, szczep 4449 przygotowuje się według przepisu podanego przez Mariaris'’r i wsp. w pracy Mooecular Cloning: A Laboratory Manuał Cold Spring Harbor Laboratory,

Cold Spring Harbor, USA, str. 282 /1982/, i pod^orowoje etę do miejsca BamHI w pBR322 jako wektorze DNA w sposób następujący:

IX.1. Częściowe trawienie DNA z B. thuringiensis o wysokim ciężarze cząsteczkowym.

Trawienia za pomocą 5au3A wykonuje się w ten sposób, aby zabarwione bromkiem etidlum rozszczepiono fragmenty DNA w żelu agarowym wstępowały głównie w zakresie 2-10 Kb. Osiąga się to stosując metodę opisaną przez Maiaaj.s'a i wsp. w wyżej podanej pracy. Funkcjonowanie częściowo rozszczepionego ONA wykonuje się w preparat^nym żelu agarozowym w sposób opisany poniżej w punkcie Χ.2. lub korzystnie w gradiencie NaCl. Przygotowuje się linóowy gradient soli w zakresie 5 do 20 procent NaCl w buforze TE i prowadzi się wirowanie przy 35000 obrotów na minutę przez 3 godziny w wirówce Beckmana SW 40 Ti. Zebrane frakcje wytrąca się przez dodanie etanolu 1 analizuje w żelu agarozowym.

Hość lOyUg plazmidu pBR322 trawi się za pomocą 10 jednostek endonukleazy BamHI w 50/U1 roztworu o składzie: 10 mM Tris HC1 /pH 7,4/, 100 mM NaCl i 10 mM MgClg, w temperarorze ³⁷°^ w czasie 1-2 godzin. ^Działanle ^fos^fataz^ą na rozszczepom ^DNA się w sposób następujęcy: ilość lO^ug DNA rozpuszcza się w 50/ul Tris HC1 /pH 8/ i dodaje się alkaliczną fosfatazę z jelit bydlęcych 10000 g przez 20 minut, osad rozprowadza się w ^7,5 ml ^pBs1, trzykrotme dializuje s^ię w te^^er^turze 4°C wobec l^OO° ml ^PBS^1, nastę^pnie dializuje się wobec 1000 ml 0,01 M buforu fosforanowego o pH 7,8 i poddaje wirowaniu przy 3000 g w czasie 20 minut .

Supernatant podaje się na kolumnie DEAE o pojemności 30 ml i w temperaturze pokojowej eluuje za pomocą 0,01 M buforu fosforanowego o pH 7,8 z szybkością 20-80 ml/godz. Frakcje pierwszego piku łączy się i liofilizuje. Ogólna wydajność IgG wynosi 180 mg/15 ml surowicy. Stopień czystości frakcji IgG określa się metodą immuundyffuj opisaną przez O. Ouchterlony w Handórnk of Immulϋdiffurlon and ImmuunelθejΓophoieeis, Ann Arbor Science Publishers. Mich USA /1968/ stosując do testu przeciwciała przeciw kozim IgG oraz przeciwciała królika przeciw surowicy koziej /Miles Labooaroiies/. Przeciwciała oczyszcza się dalej przez absorpcję na kolumnie wypełnionej spharozą /pharmacii^do której przyłączono uprzednio prdtdksyię H2. Sprzęgania protoksyny z CNNrsephpi-ose's' /Pliai^matti^/' prowadzi się według instrukcji dostawcy w sposób następujący.

Dla uzyskania około 3 ml końcowej objętości żelu odważa się 1 g aktywowanej CNBr ^Separose^— ⁶ WB. Żel prze^my°a sⁱę ⁱ pozostawia do s^pęcznienia na filtzze ze soiekane^go szkła, stosując 200 ml 1 mM HCi. Otrzymane w części VIII.l.c. białko antygenu H2, rozpuszcza się w roztworze zawierającym 0,1 M NaHCo3 i 0,5 M NaCl. Ilość 1 ml żelu zawiera 5-10 mg białka. Zawiesinę żelu i antygen miesza się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Nadmiar białka wy^yia się za pomocą 0,1 M NaHCOj /pH 3,3/, /Boehringer/ w ilości 3 jednostki^ug ONA. Po SO-to minutowej inkubie cji w temperaturze 37°C. DNA ten dwukrotnie traktuje się fenolem, po czym prowadzi ekstrakcję chłdroloimem. Po straceniu etanolem OSA zawiesza się w 20/ul iwody i stosuje się do reakcji ligacji fragmentów pichddzącycP z częścrawego ti^awienia 3au3A. Reakcję tę prowadzi się następująco: do 0,4yug trawionego

154 252

3au3A DNA w 10/Ul wody dodaje się O,l/ug wektora traktowanego uprzednio fosfataza.

Reakcję ligacji prowadzi się w roztworze zawierajęcym 50 mM Tris HC1 /pH 7,4/, 1 nM ATP, 10 mM M)^cC-2 i 19 mM DTT, do którego dodaje się 20 jednostek ligazy DNA T4 /Biolabs/. Po dobowej inkubacji w 15°C DNA ten stosuje się do tr^^r^s:tom^owania kompenetnych komórek E.coli HBlOl.

Alternatwnę w stosunku do metody przygotowania banku trawionego Sau3A DNA jest przygotowanie banku DNA z B.thuringiensis /var. kuretaki H01, szczep ETRZ 444^/ przez wyczerpujące trawienie plazmidowego ONA za pomocę BamHI i częściowe trawienie za pomocą dal i następne klonowanie do pBR322 w miejscu między dal 1 BamHI.

IX.2. Transformacja z zastosowaniem procedury z chlorkiem wapniowym.

Kommpeentne komóóki przygotowuje się przez traktowanie chlorkiem wapniowym komórek rosn^ąc^ych do ^gęstoścl ⁵ x 1⁰? komórek na ml Ja^k o^plsano w ^prac^y T. ^Maniata'sa i ^wsp. ^{w M}°lecular doning: A. Laboratory Manuul, Cold Spring Harbor Laboratory USA, p. 282 /1982/. Transformację prowadzi się przez dodanie do tych komórek DNA i utrzymywanie przez 3 minuty w te^^er^^urże 42°d rozcieńczenie ilością 1 ml podłoże ^LB inkutację w ramperaturze 37°^C przez 6⁰ minut i wysianie na podłożu sel^c^ne znanym sposofciem opisanym w wyżej wym. pracy T. Mannatisa i wsp.

IX.3. Przygotowanie surowych llzoóów komórkowych.

Kolonie zawierające ^gen S-eidotoksyn^{y p}owinny wydzielać ^białko o alttywności ^bi^ologi^cznej podobnej do oczyszczonych i rozpuszczonych kryształów toksyny Jak opisano w pracy

H.E. Schnepf i wsp. Proc. Naal. Acad. Sci. USA 78, 2893 /1981/. A zatem, kolonie te podaje się skrinlngowi immunologicznemu wobec przeciwci^ kozich /przeciwciała H3 przeciw krystalccneemu białku B.thuringiensis var. kurstaki. Prowadzi się wzrost oddzielnych kolonii w 5 ml podłoża LB w obecności ammiiyHny. Dziesięć hodwwi puluje się, zbiera kornmóri, przemywa je 10 mM NaCl 1 w końcu prowadzi się lizę komórek w 2 ml roztworu o składzie: 400 mM NaCl, 0,1 M NaOH, 1 mM PM»F. Po 20-to minutowej inkubami w temperaturze pokojowej lizaty zobojętnia się przez dodanie 20^ul 2M Tris HC1 /pH 7,0//. Po wirowaniu w wirówce SS34 Servall /20 minut, 10000 obrotów na minutę/ poddaje się ekstensywnej dializie wobec TBS /10 mM Tris HC1 /pH 7,5/, 0,14 M NaCl/.

IX.4. Radloimmunilogicciy skrining ekstraktów komórkowych.

Ekstrakt^y testuje s^ię rldio^emeuno^togicznii na obecno^ antygenu ^£'-indoto^ks^yn^y metodą opisaną przez Ciarkę'go i wsp. w pracy Methods in En^y^t^llogy 68, 436 /1979/ z użyciem plastkocwych studzienek. Pojedyńcze studzienki plastikowe powleka się ilością 150^ul oczyszczonych kozich przeciwciał H3 /lO.ug/ml/ w 10 mM Tris HC1 /pH 9,3/ i utrzymuje l $ przez dobę w timppraturci 4 C. Następnie studzienki przemywa się trzykrotnie roztworem TBS/Twein /TBS + 0,5% Tween'e 2<^^, dodaje 150/ul ekstraktu bakteryjnego i inkubuje w temperaturze ³⁷°C przez ⁶ godzin. ^Po ⁱrzeeyciu^, studzienki napełnia s^ię iloścfo 150,uI.

125 5 ' znaczonych jodem O przeciwciał królika przeciw kozim H3 /60/ug. 10 cpm/ w roztworze

TBS zawieraj ccym 25 procent surowicy końskiej 1 inkubuje przez dobę w tie:^θr'^turzi pokojowej. Po przemyciu roztworem TBS/Tweem promieniowanie w studzienkach zlicza się w lcczniku scyntylacyjnym.

^IX·⁵. MafJa restry^yjna i lo^Hz^ja genu ^-en^to^^y w re^kom^bliantowym ^p1izικ10ζ1ι pKi9.

i/ Mapowanie restrykcyjne: Mapę restrykcyjną klonu DNA pK19 otrzymanego przez mi — sany po^żej ieιeeuntogicciy skrining trawionego Sau3A banku B-thuringiensis HD1, ETHZ 4449 opracowano na podstawie pojidyńccigo, podwójnego i potrójnego trawienia plazmidowego DNA różnymi eicymleί restrykcyjnymi. Wszystkie trawienia wykonywano według instrukcji podanych przez dostawców enzymów. Tak więc, DNA /1//U9/50 rozpuszcza się w buforze odpowiednim dla danej endonukleαcy restrykcyjnej i po 1-2 godzinnej inkubami w t^perarorro ³⁷°C ^a^o^ DNA p^rze^nosi s^ię do żeł-u ajrozowej i ooddaje elelitroforezii. Gęśli jest traktowanie następnym enzymem w warunkach nieodpowiednich dla pierwszego enzymu /na przykład zły bufor/ to prowadzi się ekstrakcję ONA eletililię 1:1 fenolu i chloroformu, wytrąca DNA etandem a następnie poddaje warunkom nieodpowiednim poprzednio /na przykład stosuje się bufor wymagany dla drugiego iizseι/.

154 252 b/ Przenoszenie DNA z żelu na filtr nitrocelulozowy metodę Southern'a.

Sekwencję kodującą f-nndotoksynę lokalizuje s^ię przez hybr^ydyzację onacoo^neg^{o RNA} wyi^zolowanego z komórek B. thuringiensis w stadium sporulacCi ze specyficznymi fragmentami restrykcyjnymi pH19. Wykonute się to technikę opisanę przez Southern'a /w 0. Mooec.Blol. 98, 503 /1975/.

Rozdzielone pod względem wielkości metodę elektroforezy w żeli agarozowym fragmenty

ONA denaturuje się, przenosi na filtry nitrocelυlzlowe i immmbillzuje. Zachowuje się względne położenia fragmentów ONA w żelu podczas ich przenoszenia na filtr. DNA zwięza32 ny z filtrem hybrydyzuje się następnie ze znaczonym P RNA i lokalizuje się pozycje pasm komplementarnych z radioaktywnę sondę metodę autoradioogafii. Przenoszenie DNA z żelów agarozowych na filtr titrocelulolowy wykonuje się sposobem opisanym przez Maniatis a i wsp. w Mooecular doming: A^aboratory Manuał Cold Spring Harbor Laboratory,

Cold Spring Harbor, USA, p. 383 /1982/.

c/ Hybrydyzacja fibrów Southerna.

Prehybrydyzację i hybrydyzację wykonuje się sposobem opisanym przez Maanaais^ i wsp. w Mooecular Cloning: A. Laboratory Manuua, Cold Spring Harbor Laboratory, USA, str. 387 /1982/ z następującymi moOifikacjami: wygrzane filtry umieszcza się w ciepło-szczennym o

worku plastUowym i dodaje 0,2 ml mieszaniny lrehnbryiyzacyJtej na cm filtra celulozowego. Skład mieszaniny prehytarydyzacyjnej : 4 x SSC: 50% formamid: 0,2% SOS; 20 mM EDTA:

mP fosforanu potasowego /pH 7,2/: 5% roztwór Denhhrdd^a; ^OOyug ml denaturowanego DNA z grasicy cielęt;

lWuki inku^buje si^ę zazwyczaj ^przez ³-^{4 g}odzinⁿ w temperaturze ³⁷°^C.

Mieszaninę prehybrydyzacyjnę usuwa się i zastępuje mieszaninę hybrydyzacyjnę /50 nul/cy filtra nitlocθlulolowegl/ o składzie takim Jak mieszanina lrehybrndazycyJna, lecz zawiera jącym son^dę znatawane^ ^p <ⁱenalurowanego iłNA /10θ - 1°⁷ cpm^:^fltr^ lrongltlorną w punkcie IX.5.d., poniżej.

Worki utrzymuje si^ę zazwyczaj w le^y^θΓ^^^uroe ³⁷°^C ^rzez ^dobę. ^Po ^hybrydyzaaji Mitry przemywa się przez 15 minut w 2 x SSC i 0,1% SDS w ley^¢^Γί^turoe pokojowej, przemywanie to powtarza się dwuukomie, po czym przemywa się filtry w 0,1 x SSC i 0,1% SDS przez 60 minut. Filtry suszy się następnie na bibule Whatman 3MM i przygotowuje do αutlradilgrafii.

d/ Izolacja i znakowanie pierwiast^em railoakno^|nnym RNA z B. thuringiensis var. kurstakl.

Prowadzi się hodowlę B. lhuringiensis var. kurstakl na pożywce RogoM^ za^i^r^i^Jęcej 01% glukozy opisać przez A.A. Yousten i MH. Rogoff w Yournal of ΒΗ^εΜ^ο^ 100 1229 /1969/. Objętości hodowOi po 500 ml w/trzęsa się w kolbach Erlenmeyera o pojemności 2 lir rów z sz^lcośc^ 3⁰0 o^brotów na minutę w le^m^er^^turoe 37°^C. ^dczas wzrosro pH spada z wartości 7 do około 4,8, następnie znów rośnie do 7. W tym punkcie komórki zaczynaj? się zbrylać. Punkt, w którym pH osięga swę pierwotnę w^ruść przyjmuje się jako poczętek sporuuacji. Wzrost komórek prowadzi się przez dalsze 5-6 godzin, dodaje się refamycynę /50 /Ug/mm/i wytrzęsa komórki przez 10 minut. Po oziębieniu lodem komórki zbiera się i zawiesza w 10 ml roztworu o składzie: 4 M tiocyjanianu guanidyniowego, 0,5% sarkozylu, 25 mM cytrynianu sodowego /pH 7/ 1 0,1 M 2-merkaproetanolu. Następnie komórki zam^ra^ża si^ę w temperaturze -⁸⁰°^C, ^po' czym rozrywa w ^prasle francuskiee . ^Po wirowaniu ekstraktu przez 15 minut przy 15000 obrotów na minutę /wirówka Sorvall S534/ do supernadodaje się 0,5 g/ml CsCl, po czym supernatam ten podaje się na warstwę 5,7 M CzCl, 0,1 M EDTA w próbówąe do wirowania Beckmann 60Ti. Po wirowaniu z prędkościę 38000 obrotów na minutę przez 20 godzin, peletkę RNA przemywa się etanolem, suszy, rozpuszcza w

7M chlorowodorku guanidyny i w^tręca etanolem. Całkowity RNA z komórek w stadium sporu32 lacji ieilsilΓnluje się i znakuje za pomocę P-ATP i kinazy polinukleotydowej T4, według następuję cej standardowej procedury opisanej przez N. toazel'a w Celi, 9 , 431 /1976/ Znakowanie R8A za kinazy lolinukleotydowej :

Hość około lyug RNA poi^t^óije się łagodnej hydraUzie alkalicznej ^zez ogrzewanie przez 20 minut w temperaturze 90°C w 50 mM Tris—HC1 /pH 9,5/. W wyniku hydrolizy powsta—

154 252 ją wolne grupy ''-hydroksylowe, służące jako substrat dla kinazy polinukleotydowej. Hydrolizę prowadzi się w zatopionej kapilarze, w całkowitej objętości 4^jl. Kinazę znakuje się w próbkach reakcyjnych o objętości lO/Ul zawierających 50 mM Tris-HCl /pH 9,5/, mM MjCl₂» 5 mM dit iot reit olu, 5% glicerolu 1 1/iiM znaczonej [tT -ATP o aktywności właściwej 6000 Ci mmml. Każda próbka reakcyjna zawiera około l^ug RNA i 2/ul kinazy polinukeeotddowej T4. Reakcję prowadzi się przez 45 minut w temperaturze 37 C. Otrzymuje si^{ę R}NA o aktywności właściwej ³ χ 10⁷ i.mpul.s^ów ^Cerenkov'a/min/y«g/cp^m//ug/. Następnta oddziela si^ę RNA o^d pF ^^p3 -AT^p poprzez trz^y strącenia etanolem w otacrwści ^5/ug ^nośnika tRNA.

IX.6. Ident^ikac ja klon<5w zawiera^jącyc^h ko^d <dla S -e^oksyny w ^ba^nku tra^wioneg^o BamHI-Clal plazmidowego DNA klonowego do pBR322. Serie pH25.

a/ Hybrydyzacja w koloniach bakteryjnych in situ:

Hybrydyzację w koloniach opisaną przez M. Grunstein i D. Hogness w PNAS, 72, 396 /1975/ prowadzi się przenosząc bakterie z płytki Petriego na filtr nitlocelulozowy. Kolonie na filtrze poddaje się lizie i uwolniony DNA więżę aię z filtrom przez ogrzewanie do wyso32 kiej temperatury. Po hybrydyzacji z· znaczoną P-sondą filtr Moontoruje się autlradilgraficznie. Kolonie, dla których otrzymano dodatni wynik autoradiograficzny, można odzyskać z płytek Petriego.

Wewnntrzny fragment DNA genu -endolokayiy stosuje się do skriningu banku trawionego plazmidowego DNA w pBR322. Procedura ta jest opisana przez Maatatis^ i wsp. w Mdacular Cloni^ng A. Laboratory Manuua, Cold Spring Harbor Laboratory, USA, str. 318 /1982/.

Filtry hybrydyzuje się ze znaczoną P sondą przygotowaną w sposób opisany poniżej w części IX.6.b.

W celu otrzymania obrazu autoradiografccznego filtr umieszcza się w osłonie Saran Wrap i filmuje na kliszy czułej na promienie X. Kolonie, które dały w tej próbie wynik dodatni izoluje się z płytki maacerzystej 1 analizuje. Kolonie te zawierają sekwencje DNA kodujące toksynę oraz region flankujący DNA, co stwierdza się iHmmuilooicziij /patrz część IX.4/, przez mapownalj restrykcyjne /patrz część IX.5. pon^wyże// oraz w bioteście in vivo /część IX.7, ponnżee/. Klonom tym nadano nazwę pH 25-i gdzie i oznacza liczby 1 do 7.

b/ Translacja DNA typu nick.

Wewnntrrny fragment DNA genu iT-endotoksyny znakuje się pierwiastkeem rtdioakt'ninym w następujący sposób:

Mieszaninę o składzie: 3/ul DNA /l^g/; l.5^ul buforu do translacji typu nick /10 x stężone : 0,5 M Tris, /pH 8/, 0,05 M MgC^/; l,5/iil 2,5 mM d-quanolrti-5'-ttój fosforynu /GTP/; l,5/uil 2,5 hM d-cytydynnoS'-trójfosforanu /CTP/; 1,5/ul 2,5 mM d-tymidyno-5*-rrój ^s^ronu /TTP/; 2,5^ul wody; 0,75/ul BSA /1 mg/rnH/; l,5y«l· 100 hM 0-merkaptoeta nolu miesza si^{ę i} dodaje ^do 1°⁰ uCI suc^ge^ ^p] -ATP o aktywnośicl wła^iwej 1⁰ mCi

Hmm^l, miesza się dokładnie ⁱ (dodaje 0^5^1 lxl°’⁴ roztworu DNA-zy I /i mg/ml./ w Morze do translacji typu “nick, inkubuje się w temperaturze pokojowej przez minutę, przenosi na lód, dodaje 1yAil polimerazy I z E.coli /Bidabs: końcowa objętość 15 Ail/, inkubuje się w ^tjH^θr^^tutrj 1⁵°^C przez ³ (godziny utrzymuje si^ę w tempero^rze 65^f>C ^pt^zer 10 Mnut, dodaje się 35/iil 50 hM EDTA i'10/ul /lOO/ug/ podstawowego tRNA. Następnie oddziela się niernięzaij nukleotydy na małej kolumnie Sjphtdex G50.

c/ Klonowanie klmptetie/o genu S-endoksyny w wektorze pUCS: klon pK36.

Wektor pUCB /New England Bidabs/ trawi się wyczerpująco enzymami restrykcyjnymi HincII i Pstl i traktuje fosfatazą alkaliczną /patrz część IX.1./. Fragiem Npea/Pstl ^z pK-25-7 /p^ro ^.⁶.^ t°wn^tżj/^, kodujący ^gen S -eMotaksy^ /tablica II/ ^p!ddaje się ligacji z DNA wektora i trans formuje do komórek E.coli HB101. Dednemu z tttnidlono lraπsltHmontiych klonów nadano nazwę pH36.

154 252

IX. 7. Test biologiczny dla oznaczania toksyn B. thuringiensis.

Do sklarowanego lizatu otrzymanego w części IX.3 dodaje się siarczanu amonowego do stężenia wynoszącego 30% nasycenia. Osad rozpuszcza się w 2 ml 50 mM węglanu sodowego /pH 9,5/ i dializuje wobec tego samego buforu. Oako kontrolę przygotowuje się ekstrakty E.coli zawierające DNA wektora bez DNA pochodzącego z B. thuringiensis. Ekstrakty komórek E.coli poddaje się działaniu ultradźwięków, przygotowuje 4 stężenia według zawartości toksyny w ekstraktach i miesza ze środkiem zwilżającym /0,1% objętościowo/.

Krążki liści wycięte z roślin bawełny, rosnące w kontrrOowrnyąh warunkach /temperatura 25°C, 60% wiljtności względnej w komoo-ze wzrostu^, zanurza si^ę w zawiesinto ekstraktów komórek E.coli. Następnie, na wysuszonych krążkach tych liści umieszcza 3ię larwy Heliothis virescens w pierwszym stadium rozwoju między wylinkami /30 larw na dane stężenie/, uprzednio standaryzowane w tekście na ‘odpowrednirść i prowadzi inkubację w temperaturze 25°C przez 3 dni.. Pomiarów śmiertelności /w %/ dokonuje się według kryteriów: żywy lub martwy. Ekstrakty niszczące larwy posiadają zatem aktywność owadobóóczą pochodzącą z klonowanego DNA z B. thuringiensis.

Przykład X. Sekwencjon^^o^ DNA:

Fragmenty DNA zawierające gen tT -en^dotoks^yny sekwencjmuje się na o^by^dwu niciach metodą F. Sanger'a i wsp. opisaną w Poc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 /1977/, stosując układ M13 opisany przez 0. Mssinga w Methods of Enzymology 101, 20 /1983//.

X. 1. Klonowwaie genu S -endotoksyny dd replilcacyjnee formy OMA M13.

Na podstawie mapowmia restrykcyjnego klonowanego genu £’tiπdotoksyiy i analizy Southern'a tego genu stwierdza się, że gen ten jest zlokαlirowαiy w dwu fragmentach DNA pK 36: we fragmencie Hpal /pozycja 0 w tej sekw^nj!/ do Hind III /pozycja 1847/ i we fragmencie EcoRI /pozycja 1732/ do Pstl /pozycja 4355/. Pierwszy fragment klonuje się do M13mp8 /New England Biolabs/ pomiędzy pojedyńczym miejscem HimcII a pojedyńczym miejscem Hinddll w reskeci analogicznej do procesu ligacji opisanego powyyej

Χ.2. Generowanie sekwencyjnych serii pokrywających się częściowo klonów.

Ola skrócenia fragmentu DNA Hpat-HindalI zawieraj ącego kod dla końca 5”ę^enu stosuje się metodę z użyciem Bal 31 opisaną przez M. Foncz 1 wsp. w Proc. Naal. Acad. Sci.

USA, 79, 4298 /1982//. Operację tę wykonuje się następująco: Powyższy fragment klonuje się do Ml3mp8 pomiędzy pojedyńczymi miejscami HindII a Hr^ddll. Próbkę 10 mg replikacyjnej formy DNA linaaryzuje się eidonukltazą restrykcyjną Hinddll i poddaje działaniu endrnukleazy Bal 31 w lOO^yil roztworu o składzie: 600 mM NaCl, 12 mM CaC^, 12 mM MgClg, mM Tris HC1 /pH 8/ i 1 mM EOTA. Mieszaninę tę poddaje się wstępnej inkubami w temperaturze 30°C ^przez 5 minut, ^po czym ^daje s^{ię 5} jenostek Bal 31. łtetychmiast ^po ^do^daniu tego enzymu i po 2, 4, 8, 10 i 12 minucie pobiera się próbki po 13yul mieszaniny rtαkcyjnet.

Do każdej z tych próbek, natychmiast po pobraniu dodaje się 25/ul fenolu i 40/iil buforu TE w celu zatrzymańia dalszej reskeci. Mieszaninę wiruje się, prowadzi ekstrakcję ąhlororoyιtem i wytrącanie etanolem. Otrzymany osad DNA zawiesza się w roztworze 20^ull00 mM NaCl, 20 mM Tris HC1 i 10 mM MgClg i trawienie drugim enzymem charakterystycznym dla drugiego końca uprzednio klonowanego fragmentu, w tym przypadku enzymem BamHI.

Po przeprowadzeniu rozdziału pod względem wielkości w żelu agarszowym, skrócone fragmenty barwi się bromkiem eti^duum i uwidacznia w zakresie fal długich UV /366nm/. Pasma agarozy zawierające te skrócone fragmenty wycina się z żelu, doprowadza do postaci ciekłej ^przez ogrzanie ^do temperatury ⁶⁵°C, ^dolrrwa^dza stężenie INaCl ^do 500 mM i ink^uj w tem^peraturze 6⁵°C ^przez 2⁰ minut. Itestjnie todaje si^{ę j}e^di^ą rbJ^ętoś^ć fmtoci /zrówmwjm^ go za pomocą 10 mM Tris HC1 /pH 7,5/, 1 mM EDTA, 500 mM NaCl/. Fazę wodną ekstrahuje się dwuurotnie fenolem i raz ąhlrroroimem. DNA wytrąca się za pomocą 2,5 objętości zimnego, absolutnego etanolu i ^w^^ućc. Peletkę DNA przemywa się zimnym 80% etanolem i suszy pod zmniejszonym ciśnieniem. DNA ten zawiesza się w 20/ul TE. Fragmenty otrzymane z próbek pobieranych w wymienioiych powyżej odstępach czasu są sukcesywnie skrócone o 200-300 bp dla każdego odstępu czasu i posiadają na jednym końcu pojedyńcze mejsca dla Bam^I i tępe końce z drugiej strony. Fragmenty te klonuje się do wektora H3mpB uprzednio

154 252 zlinearyzowanego przez podwójne trawienie enzymami BamHI i HincII w sposób opisany w części X.l. Stosujęc powyższe postępowanie otrzymuje się sekwencję DNA w postaci pojedyńczej nici od mejsca dla Hindlll w kierunku miejsca dla BamHI.

Strategia zastosowana do sekwencJonowania komplemmenarnej nici tego samego fragmentu DNA, mejsca restrykcyjne użyte do tego sekwencJonowwana, a wtięc do skrócenia drugiego fragmentu DNA oraz fragment EcoRI-Pstl i jego sekwencjonowanie zmodyfikowaną metodę M. Poncz'a i wsp. opisanę w Proc. Naal. Acad. Sci. USA, 79, 4298 /1982,/ sę przedstawione na rysunku i w tabeli IV, w której /a/ oznacza dane dotyczęce przykładu.

Tabela IV

	A	B	C	Mi3mpi
/BemóI/HIlI-HInnIIl
a/	BamHl	Hindlll	HincII	8
	Hindlll	BamHI	Smal	9
EcoRI-Pstl
	EcoRI	Pstl	Smal	8
	Pstl	Eram	Smal	9

Rysunek odnosi się do zmodyfikowanej metody M. Poncz'a i wsp. opisanej w Proc. Natl Acad. Sci. USA. 79. 4298, /1982/.

Konstruowanie banku delecyjnago mutanta. Etapy: 1/ Insert /innie grube/ klonuje się do M13 w miejscu lepkiego końca A. 2/ po linearyzacji w miejscu 8, DNA faga trawi się za pomocę BAL-31 w różnych okrasach czasu, przy czym linaami przerywanymi oznaczono zakres trawienia insertu /lnnia gruba/ i M13 /Unia cienka/, w Etapie 3 produkt trawienia rozszczepie się w miejscu A, izoluje serię Insertów pochodzących z trawienia Bal-31, otrzymujęc rodzinę insertów o różnej długości. Każdy z tych Insertów ma tępy koniec wytworzony przez działanie Bal-31 oraz lepki koniec A. W etapie 4 fragmenty te podklonowuje się do M13, co powoodue, że tępy koniec znajduje się w pobliżu mejsca paimnae P, stosowanego w analizie sekwennji DNA, X i C oznaczaję tępe końce. Proces przedstawiono na rysunku.

Χ.3. Transformacja szczepu E.coli OM 103.

Komórki E.coli OM 103 przechowuje się w maksynalnym podłożu M9. Transformację wykonuje się w sposób następujęcy:

1. Podłoże 2xYT zecycznple się pojedyńczę kolonię E.coli OM 103 i utrzymuje przez ^do^bę w ^te^m^^ri^^ u rze 3⁷°^ mieszaj ^ęc.

2. ilość 40 ml podłoża 2xYT zaszczepia się ilośclą 200 yul hodowwi otrzymanej w eta pie 1.

³. Prowadzi s^ię hodowlę w ^tem^eΓ^;^ttazn ³7°C, miesza^jęc ^do ^gęst^ości optyMn^ 0D^ę5q równej 0,5.

4. Hodowlę utrzymuje się przez 5 minut na lodzie.

5. Hodowlę wiruje się przy 6000 obrotach na minutę przez 5 minut w wirówce Servall SS34 uprzednio oziębionej.

6. Κοπι0^ϊ zawiesza się w 20 ml sterylnego, oziębionego w lodzie 50 mM roztworu CaClg /raztwór CaClg powinien być świeżo przygotowany/.

7. Zawiesinę utrzymuje się przez 40 minut na lodzie.

8. Prowadzi się wirowanie z szybkościę 6000 obrotów na minutę w wirówce Servall SS34 przez 5 minut.

9. Zawiesza się komórki w 3 ml oziębionego lodem roztworu CaC^

10. Do ilości 200 /Ul zawiesiny komórek otrzymanej w etapie 9 dodaje się 1-5 yul DNA lub 7-15yAl preparatu ligazy. '

154 252

11. Mieszaninę utrzymuje się przez 30 minut na lodzie.

1². Meszanⁱn^ę urtzymuje s^ię w ramperaturze ⁴²°C ^przez 3 minuty.

13. Oodaje się 200yul komórek otrzymanych w etapie 1.

14. Górny agar do^prowa<iza si^{ę d}o wrzenia, ^po czym utrzymuje w temperaturze 42°C.

15. Próbówki napełnia się ilością 3 ml górnego agaru, 30^ul X-GAL /20 mg/ml dwumetylosulfotlenku/ i 30/Ul IPTG /20 mg/ml wody/.

16. Zawartość próbówek dokładnie się miesza i szybko przenosi na ogrzane przed użyciem płytki 1 x YT.

17. Przykłada się suche krążki na koło godzinę. Płytki odwraca się dnem do góry i inkubuje w temperaturze 37°C. Otrzymane łysinkl nadaję się do dalszego traktowania. Kontrola: - 200/Ul kompeeentnych komórek bez egzogennego DNA + 1/Ul M13 mp8 /replikacyjna forma DNA, lO/ug/ ♦ 200/Ul kompetenttych komórek

Χ.4. Przygotowanie replikacyjnej formy rekombinowanego ONA faga:

1. Ostrożnie przenosi się oddzielną pojedyńczą białą łysinkę do 9 ml podłoża 2xYT i 1 ml hodowli otrzymanej w etapie 1 części Χ.3, powyżej 1 utrzymuje się w temperaturze ³⁷°^C przez ^{7 g}odzin.

2. Wiruje się przez 10 minut z szybkością 4000 obrotów na minutę.

³. Supernatant utrzymuje si^ę przez ^do^bę w te^^en^turze ⁴°C.

4. Litr podłoża 2xYT zaszczepia się ilością 10 ml supernatantu otrzymanego w etapie 3 i 10 ml hodowU otrzymanej w etapie 1, części Χ.3 ⁵. Hodowl^ę wytrz^ąsa si^ę w temperaturze 37°C ^przez ⁴ 1/² godzin^y.

6. Wiruje się z szybkością 5000 obrotów na mnultę przez 15 minut.

7. Kommrki zawiesza się w 10 ml 10% roztworu sacharozy w 50 mM Tris HCl /pH 8/ i oziębia się.

8. Zawiesinę przenosi się do 30 ml probówek do wirowania.

9. Dodaje się 2 ml świeżo przygotowanego lioozymu /10 mg/ml, 0,25 M Tris HCl /pH 8/.

10. Dodaje się 8 ml 0,25 M EDTA i ostrożnie miesza.

11. Utrzymuje na lodzie przez 10 minut.

12. Dodaje się 4 ml 10% SOS /łb 1,6 ml 25% SOS/, miesza się pałeczką szklaną.

13. Dodaje się 6 ml 5 M NaCl /końcowe stężenie = IM/, i ostrożnie się miesza

14. Utrzymuje się na lodzie przez godzinę.

15. Wruje się z szybkością 20000 obrotów na minutę przez 40 minut w wirówce

Servall 5S34.

16. Zbiera się supernatant i dodaje ilość równoważną 1/10 objętości 5M NaCl i 15 ml 30% PEG w TNE.

17. Utrzymuje się w tem^er;^turze 4°C przez dwie godziny lub przez dobę.

18. Wiruje się z szybkością 8000 obrotów na minutę przez 15 minut.

19. Peletki przenosi się do 18 ml TE /ph 8/.

20. Dodaje się 18 g CaCl /1 g/ml/.

21· Przenosi się albo do probówek Ti-50 i dodaje 0,4 ml bromku etidium /10 mg/mm/ albo do próbówek Ti-60 i dodaje 1,2 ml bromku etiduum /10 yg/my/.

22. Oodaje się roztwór CaCl /1 g CaCl ♦ 1 ml TE/.

23· Wruje się z szybkością 35000 obrotów na minutę w tem^s^ri^lturze 20°C przez

36-48 godzin. '

24. Niższe pasma obserwuje się w świetle UV /366 nm/.

25. Prowadzi się 3-4-krotna ekstrakcję butanolem wysyconym wodę.

26. Prowadzi się trzykrotną dializę w tem^er;^t:urze 4°C, za każdym razem wobec litra sterylnego TE.

Χ.5. Przygotowanie jednoosiowej matrycy DNA:

1. E.coli 3M 103 w 5 ml podłoża 2xYT wytrząsa się w temperaturze 37°C przez dobę. ¹

2. Do 25 ml podłoża 2xYT dodaje się dwie krople zawiesiny komórek otrzymanej w etapie 1.

154 252

3. Napełnia się próbówki ilością po 2 ml roztworu hodowli przygotowanego w etapie 2 i do każdej próbówki dodaje się Jednę łyslnkę otrzymaną w etapie Χ.3 powyej·

4. Prowadzi si^ę wytrząsanie w temperatur ³7°C praez ⁵ 1/2 godziw.

5. Zawartości próbówek przenosi się do próbówek Eppendorfa 1 wiruje przez 5 minut.

6. Do świeżych próbówek Eppendorfa przenosi się 1 ml supernatanta.

7. Oodaje się 200 yil 20% PEG 6000 w 2.5 M NaCl.

8. Utrzymuje się w temperaturze pokojowej przez 15 minut.

9. Wiruje się przez 5 minut.

10. Supernatant odrzuca się i wiruje dalej.

11. Uiuwa się ostrożnie supernatant, stosujęc podciśnienie i pipetę Pasteura.

12. Do pozostałości dodaje się lOO^ul TE i 50/Ul fenolu.

13. Wytrzęsa przez 10 sekund, pozostawia na 5 minut, wytrzęsa przez 10 sekund 1 wiruje przez minutę.

14. Fazę wodnę przenosi się do świeżych próbówek Eppendorfa.

15. Dodaje się 500yul eteru etylenowego, wytrzęsa i wiruje przez minutę.

16. Usuwa się eter stosujęc podccśnienie, próbówki pozostawia się nlezamknięte przez 10 minut 1 jeśli po tym traktowaniu faza wodna jest bardzo mętna, to za pomocę pipety Pasteura należy przez nię przepuszczać powwetrze do czasu wyklarowania się roztworu/.

17. Dodaje się 10/ul 3M octanu sodowego i 250yul etanolu.

18. Utrzymuje si^ę w temperaturze -⁸⁰°C praez ³⁰ minut.

19. Wruje się przez 5 minut.

20. Przemywa się 80% etanolem.

21. Wruje się przez 5 minut.

22. Supernatant usuwa się pipetę Pasteura.

23. Próbówki pozostawia się nlezamknięte przez 15 minut.

24. Rozpuszcza się paletkę w 25/ul TE.

25. Przenosi się 2^ul roztworu peletki do 0,6% żelu agarozowego.

Χ.6. Reakcja tekwencjoiowania.

Analizę sekwennjl ONA na maarycy DNA otrzymanego według części Χ.5., prnwźej wykonano według podręcznika ‘W5 cloning and ONA seguencing system* /Klonowanie ΜΓ5 1 układ sekwencjmowanla dna/ wydanego przez New England Biolabs. Analiza całkowitej sekmsnnji ONA wykazuue, że znajduje się w niej tylko jedna otwarta rama odczytu, której długość jest wystarczająca dla białka o ciężarze częste Beżowym 130.622. Koduje ona 1155 aminokwasów. Kod dla N-terminalnej reszty aαiirkwatowej tego białka jest zloZallolwany przy 156 bp, w dół od miejsce Hpal a ostatnia C-terminalna reszta aminokwasna jest kodowana przez kodon zaczynajęcy się przy 3618 nukleotydzie. Sekwencja ONA między miejscem Hpal a miejscem Pstl jest podana w tablicy II. Wprowadzona z niej sekwencja aminokwasna jest podana w tablicy HI.

^Przykład XI. ^Ekspresja ^genu ^S -mn^drtr^ktyn^y w ^koiór^kac^{h d}roż^dż^y.

XI.1. Wprowwdzenie miejsca dla Ncol przed pieiwszym AUG tego genu. W celu pomęczenia kodujęcej sekwennci białko genu toksyny B. thuringiensis z promotorem drożdżowym PH05 /opśsanym w opisie patentu europejskiego 100 561/, modyfikuje się sekwencję ONA wokół genu toksyny. Modyfikację tę osiąga się na drodze kier wanej rllgonukleotydem rautagenezy za pomocę jeyirnicrolmga wektora fagowego M^ippS, zawierajęcego insert BamHIiSacI o długości 1,5 Kb kodujmy region 5'genu toksyny. Ilość 200^ug takiego inser· tu otrzymuje się z plazmidu pK 36. przez trawlenie 3^ug plazmidowego ONA, enzymami BamHI i SacI i izolację fragmentu opisanymi powyżej standardcrnyii techn łkam. Replikacyj^ formę /RP/ wektora Ml3ipl8 /100,,ug/ trawi się tymi samymi enzymami, na otrzymany DNA działa się fenolem i wytrwa go etanolem, a następnie prowadzi reakcję ligacjl z ilośclę 200/,ug powyższego insertu DNA. Po translacji E.coli zbiera się sześć białych łysinek i analizuje je przez trawienie enzymami restrykcyjnymi BaiHI i SacI. Deden rrallyłolf w^^zr^(^laiy produkt otrzymał nazwę M^ippS/Bai-Sac.

154 252

W automatycznym aparacie APPLIED BIOSYSTEM DNA SYNTHESIZER syntetyzuje się oligonukltotyd o sekweecj: /5'/GAGGTAACCCATGGATAAC /3*/, Oligonukleotyd ten Jest komplementarny do sekwennj w Ml3mpi8/Bam-Sac od pozycj 141 do pozycj 164 genu protoksyny /tablica II/ za wyjątkiem niepasujących pozycj 154 i 155. Stosuje się tu ogólne zasady pro^^c^^e^r^lLa mutagenezy opisane przez D.M. Zoller a i M. Smith a w Nuci. Acids. Res. 10,

6487 /1982/. Oednoonciowy, fagowy DNA Ml3mpl8 8am-Sac /około 5^ug/ miesza się z 0,3^ug fosforylowanego ollgonukletydu w objętości 40/Ul. Mieszaninę ogrzewa się do temperatu^ry 65°C i ^utrzym^ujt ^w t^ej temperaturze ^przez ⁵ minut^, sc^hła^dza ^{do 5}0°C i p^lwo^li ^ozi.ę^bia do 4°C. Następnie dodaje się bufor, trój fosforany nukleotydów, ATP, llgezę ONA T4 i duży fragrnirnt ^poli^meraz^y DNA i ^prowadzi in^ku^bacj^ę przez ^do^bę w temperatur·^ 1.5°^C, ^wedł^ug przepisu podanego przez D.M. Zollera i M. Smith'a w Nuci. Acids. Res. 10, 6487 /1982/.

Po elektroforezie w żelu ngarozo*o®>kklisty dwuniciowy DNA oczyszcza się i dokonuje translacJi do E.coli, szczep OM 103. Otrzymane łysinki poddaje się skriningowi na obecnośc sekwennji hybrydyzujęcych zi znaczonym P oligonukleotydem a fagi analizuje się przez trawienie ecdlnukleazaii restrykcyjnymi. W otrzymanych fagach będę znajdować się klony, które maję prawidłowy cukliotyd C w pozycjach 154 i 155 zamiast T w DNA pK 36. Pagowi temu nadano nazwę: M.3m^l^/Ba^^Srac/NCo.

XI.2. Ligacja genu ^inndotoksycy z drożdżowym promotorem PH05. Stosujęc opisane powyżej standardowe techniki klonowania, insert Baimi-SacI o długości 1,5 Kb z faga M13mil8/bam-Sac/Nco klonuje się z powrotem do plazmidu pK 36, zastępujęc fragment —

-SacI typu dzikiego w tym plazmidzie, zmutowanym fragmentem o długości 1,5 Kb. Powwtaje plazmid pK 36 Nco posiadajęcy miejsce dla Ncol przed kodonem ATG w genie protlksyny:

Ncol

....GAGGTAAC/CCATGG/ATAAC. Ilość 5/Ug tego wektora trawi się za pomocę Ncol i recesyjne końce 5'uzupełnia się polimerazę Klonowa w sposób opisany przez Maanlatis'a i w9p. w Molecylar Cloning: A. Laboratory Manuul, Cold Spring larbor Laboratory, USA, str. 394 /1982/. Następnie plazmit ten trawi się za pomocę Aftami, ONA rozdziela się w 0,8% żelu agarozowym o niskiej temperaturze topnienia i eluuje w sposób opisany powytżl. Ilość 2^/ig opisanego w opisie patentu' europejskiego 100 561 plazmidu p31y trawi się lndonukllazą EcoRI i recysyjne końce 3'łączy się z lollme'rnzą Klonowa. Jak wyżej Llgację fragmentu genu proroke/ny o długości 3,6 Kb z tępymi końcami z wektorem p31y posladającym również tępe końce prowadzi się inkubujęc 200/Ug każdego z tych DNA w 20/til w temperaturze pokojowej w sposób llisan^{y p}rzez ^Mannatis'a i wsp. ²$.

Po transformat i E.coli dla nadania oporności na αmplcyticę, prowadzi się analizę restrykcyjną oddzielnych klonów. Godnemu oyizolowanθiu właścOwθiu klonowi nadano nazwę p31y Bt. Próbkę l^ug tego plazmidowego DNA trawi się enzymem BamHI i z miękkiego żelu ngnrlzlwego izoluje się fragment o długości 4 kB. Fragment ten poddaje się ligacji z uprzednio trawionym BarnHI, samoroplikujęcyi się wektorem drożdżowym pGDB207 /^0,5^ug/ opisanym w opisie patentu europejskiego 100 561/. Klony pozytywne izoluje się poprzez transformację E.coli i wypreparowanie plazmidu. Wyizolowane plazmidy analizuje się przez trawienie restryktazę BamHI.

Transformację szczepu drożdżowego GRF18 /MAT, ocitu2-3, leu 2-112, his-3-11, his 3-15, can. / wykonuje się według przepisu podanego w opisie patentu europejskiego 100 561.

Przykład XII. iWywarzanie DNA kodujęcigo białko MGE 1.

ONA kodujęcy białko MGE 1 otrzymuje się przez:

a/ izolację i lizę komórek B. thuringiensis var. kurstaki IDl i wyddlelenie plazmidów z otrzymanego maaeriału znanymi metoda·!. Uzyskany maeriał plazmidowy oczyszcza się i poddaje dializie.

b/ Utworzenie banku plazmidowego DNA B. thuringiensis var. kurstaki IDl. ^c/ Icloncwani^{1 piddactgi up}rzsdni^lj jagm^aaci p^z^dowe^ dna lt^^^^{iinnlgo w eta-} pie b/ w odpowiednim wektorze, korzystnie w plazmidzie.

d/ skrining ca obecność białka MGE 1, który można lrzyknydool przeprowadzić według etapów 1/ do g/.

154 252 e/ skrining klonów na obecność antygenu wrażliwego na przeciwciała przeciw krystalicznemu białku B. thuringiensis var. kurstakl /skrining na ekspresję odpowiedniego polipeptydu/.

f/ selekcję klonów, które szczególnie reaguję c antysurowicę kozią, oraz g/ oznaczanie aktywności owadoobjczej ekstraktów klonów otrzymanych w etapie f/. □NA można zidentyfliowαć znanymi sposobame, na przykład sposobem podanym w etapach h/ i 1/, a więc przez:

h/ mapowanie ONA klonów pozytywnych przez trawienie nzdonuklnacaei restrykcyjnymi 1 hydrydyzację uzyskanych fragmentów ze znakowanym pierwiaetkemm radioaktwfnym RNA, oraz

1/ snkwencjonowanin fragmentów DNA kodujęcych odpowiednie białka.

Skróty zastosowane w opisie maję następujęce znaczenie:

bp:

BSA:

OEAE:

DFPł □TT:

EDTA : IPTG:

Kb:

PBS¹:

PBS²:

PEG 6000: PM5F:

RT:

SOS:

STE:

TBS:

TE:

TES:

TNE:

Tris HCl:

X-GAL:

x YT:

pary zasad albumina surowicy bydlęcej dwi^eei^^loam.^t^e^tylo fluorofosforan dwuizopropylowy

1,-ditiotreitol /1,4-dwumerkkpto-2,3-bueanoOiol/ kwas ntynznodweaminocztnrooitowt izopropylo-^-tiogalkktopirnnozyd /Serva/ kilozasady roztwór o składzie: 0,01 M bufor fosforanowy /pH 7,4/ 1 0,8% NaCl roztwór o składzie: 10 mM fosforan sodowy /pH 7,8/ 1 0,14% NaCl glikol polietyennowy o średnim ciężarze częsteczoowym 6000 fluorek fenylomettloseltonylowy /Fluka/ temperatura pokojowa didθcylisilrccaz sodowy patrz TNE roztwór o składzie: 10 mM Tris HC1 /pH 7,5/ 1 0,14 M NaCl roztwór o składzie: 10 mM Tris HCl /pH 7,5/ i 1 mM EDTA roztwór zawierajęcy: 0,5 M Tris /pH 8,0/ roztwór zawierajęcy 100 mM NaCl, 10 mM Tris HCl /pH 7,5/ i 1 mM EOTA tris-/hydroStmmetyio/-emZiomntln, pH doprowadza się do żędanej wartości za pomocę HCl

5sbromoi4-chloro-3sindoksylisβ -D-galaktozyd podłoże o składzie: 16 g Bacco-tryptonu, g wysięgu drożdżowego /Bacto/ g NaCl

Podłoża, bufory i roztwory stosuje się w sposób następujęcy:

20XSSC w ilości 800 ml wody rozpuszcza się 175,3 g NaCl 1 88,2 g cytrynianu sodowego. Wartość pH doprowadza się do 7,0 kilooma kroplami 10 M roztworu NaOH i uzupełnia do objętości 1 litra. Rozlewa się na odpowOednin porcje i sterylizuje w autoklawie.

2xSSC 10 procent rozOιtoeu 20xSCC

6xSSC 33 procent ΓiιzOι»oeu 20xSSC

Roztwór Denhaadt^a Ficoll 70 o względnej masie częs^^k^ej /50x/ około 700 000 /Pharmacia/ 5 g polioizylipirolidoz /^ΙΜοοάβο- Behring Ccop./ 5 g

BSA /Sigma/ 5 g woda do 500 ml filtroje się przez filtr ^Halgezn^lχ) /Na^ene¹’. Nalg^e Co. In^c.

N.Y. Stany Zjednoczone/, rozdziela się na ilości po 25 ml i przechowuje w tem^en:lteize s20°C

154 252

Roztwory

Podłoże M9 zawiera w 1 litrze:

a/ Na₂HP0₄ 6 g

KHgP0₄ 3 g

NaCl 0,5 g

NH4CI 1 g

Wartość pH doprowadza się do 7,4, sterylizuje w autoklawie, oziębia i następnie dodaje:

b/ 1 M M3S104 2ml

20!$ glukozy 10 ml

M CaClg 0.1 ml witamina B^, /40 mg/10 ml/ 5 ml

Powyższe roztwory a/ i b/ powinny być steryiZoowane oddzielnie przez filtrację /glukoza-witamina B^/ lub w autoklawie.

Podłoże LB /Laurra-Bertani/ zawiera w litrze:

Bacto-trypton 10 g wyciąg drożdżowy Bacto 5 g

NaCl 10 g

Wartość pH doprowadza się do

7,5 wodorotlenkiem sodowym.

Pożywka L - patrz podłoże LB

W celu uzyskania oporu^cj! B. thuringiensls var. kurstaki stosuje się podłoże GYS wedłii^g Yousten'a i Rcgoff^ opi.sane^go w pracy pt. Yournal o^f Mctamolo^ WO, ^J22⁹ /1969/ o składzie /w g/litr/:

glukoza	1
wyciąg drożdżowy Olfeo	2
/nh4/2so4	2
k2hpo4	0.5
MgS04 . 7 H20	0.2
. 2 H2	0,08
CaClg
M^^^4 . H20	0,05

Przed sterylizacją w autoklawie doprowadza się pH do wartości 7,3 wodorotlenkiem potasowym.

Charakteryzacja mikroorganzzmów stosowanych w niniejzzym wynalazku:

1. HDO-ETHZ jest szczepem Bactllus thurlngiensis, podgatunek kurstaki. Po pierwsze charakteryzuje się on reakcję lmmuunloglcznę przeciw swemu antygenowi rzęskowemu. H01-ETHZ 4449 należy do serotypu 3a, 3b, opisanego w pracy A. Krlega The Prncaryotes, a handbode oraz habitats, isolation and identiflcatran of Bacceria, Springer V^rlag, New York, Heidelberg, Berlin p. 1743 /1981/. Po drugie, HDI-ETHZ 4449 charakteryzuje się poprzez specyficzny układ plam w próbie Southern'a typu biot, co Jest opisane w punkcie IX.5.b.

Ze szczepu izoluje się cały ONA, trawi wyczerpująco enzymem restrykcyjnym Hindlll i otrzymane fragmenty rozdziela się według wielkości w żelu agarozowym, po czym przenosi na krążek nitΓocelulozooy. Znaczony fragment EcoRI /poz. 423 do 1149 w tablicy il/ hybrydyzuje specyficznie z trzema fragmentami o wielkości odpowiednio 6,6 Kb, 5,3 Kb i 4.5 Kb.

154 252

2. HB1O1 jest szczepem hybrydowym Escherichia coli K12 z E.coli B. Gest to dobry gospodarz do oczyszczania ONA na wlelkę skalę. Stosuje się go do prób transformacji a komórki doprowadzane do stanu kompptennjl za pomocę CaClg sę dostępne w handlu. Dostawcę jest firma Cibco AG, Bazylea, Szwajcaria, numer katalogowy 530 S260 SA.

3. JM 103 jest szczepem Escherichia coli K12 1 jest dostępny w handlu. Oostawcę jest firma Pharmacia P-L Biochθmrcals, numer kjtalogoay 27-1545-xx /1984/.

E.coli., szczepy HB 101 i OM 103 sę opisane przez Mianiatisa i wsp. w pracy Molekuler Cloning: ALaboratory Mannua, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Sprong Harbor, USA AppendixC: Comn^moly used baccerial strains, str. 504, 506 /1982/.

Szczep	Genotyp
HB1O1	F“, hado20 /r^ ^^, recAj3» ara-14, proAg lacYj^ ^1κ^ rpsL2Q /Sm2/, xyl-5, «^^1, 9uPE44·
□Ml 03	Δ /lec pro/, thi, strA, supE, endA, sbcB, hsdR, F'tra036, proAB, laclq, Z Δ M15

Hodowle poniższych mikroorganzmmów stosowanych w niniejszym wynalazku zdeponowano w Międzynarodowej Kolekcji Szczepów /Deutsche Sam^ng von Mikrolrgalismel /DSM/, Niemiecka Kolekcja Mikroorganizmów/, GOttingen, RFN, zgodnie z wymagsunlaml Unrowy Budapeszteńskiej w sprawie międzynarodowego rozpoznawania zdeponowanych mikroorganimmów dla celów postępowania patentowego, uzyskujęc stwierdzenie żywotności z Międzynarodowej Kolekcci.

Mikroorga- nizm	Oata zdeponowania	Numer · akcesyjny '	Data potwierdzenia żywotności
HDl-ETHZ 4449 /Bacillus thuringlensls var. kurstaki H01, szczep ETHZ 4449/	4 marca 1986	DSM 3667	7 marca 1986
HB1O1 /pK 36/ /Escherichia coli	4 marca	DSM	7 marca
HBlOl transformowana ONA plazmidu pK 36//	1986	3668	1986
GRF 18 /Seccha™-	4 marca	DSM	7 marca
myces cerevisiae/	1986	3665	1986

*7 Numer akcesyjny jest nadany w wyżej wymienionej Międzynarodowej Kolekcci Szczepów.

154 252

Tabela II

Nikleotydowa sekwencja fragmentu DNA, kodującego białko MCE 1

10	20	30	40	50	60
GTTAACACCC	TGGGTCAAAA	ATTGATATTT	AGTAAAATTA	GTTGCACTTT	GTGCATTTTT
70	BO	90	1OO	11O	120
TCATAAGATG	AGTCATATGT	TTTAAATTGT	AGTAATGAAA	AACAGTATTA	TATCATAATG
130	140	150	160	170	180
AATTGGTATC	TTAATAAAAG	AGATGGAGGT	AACTTATGGA	TAACAATCCG	AACATCAATG
190	200	210	220	230	240
AATGCATTCC	TTATAATTGT	TTAAGTAACC	CTGAAGTAGA	AGTATTAGGT	GGAGAAAGAA
2Ξ0	260	270	280	290	300
TAGAAACTGG	TTACACCCCA	ATCGATATTT	CCTTGTCGCT	AACGCAATTT	CTTTTGAGTG
310	320	330	340	350	360

AATTTGTTCC CGGTGCTGGA TTTGTGTTAG GACTAGTTGA TATAATATGG GGAATTTTTG

370 380 390 400 410 420

GTCCCTCTCA ATGGGACGCA TTTCTTGTAC AAATTGAACA GTTAATTAAC CAAAGAATAG

430 440 450 460 470 480

AAGAATTCGC TAGGAACCAA GCCATTTCTA GATTAGAAGG ACTAAGCAAT CTTTATCAAA

490 TTTACGCAGA	500 ATCTTTTAGA	510 GAGTGGGAAG	520 CAGATCCTAC	530 TAATCCAGCA	540 TTAAGAGAAG
550 AGATGCGTAT	560 TCAATTCAAT	570 GACATGAACA	580 GTGCCCTTAC	590 AACCGCTATT	600 CCTCTTTTTG
610 CAGTTCAAAA	620 TTATCAAGTT	630 CCTCTTTTAT	640 CAGTATATGT	650 TCAAGCTGCA	660 AATTTACATT
670 TATCAGTTTT	680 GAGAGATGTT	690 TCAGTGTTTG	700 GACAAAGGTG	710 GGGATTTGAT	720 GCCGCGACTA
730 TCAATAGTCG	740 TTATAATGAT	750 TTAACTAGGC	760 TTATTGGCAA	770 CTATACAGAT	780 CATGCTGTAC
790 GCTGGTACAA	800 TACGGGATTA	810 GAGCGTGTAT	820 GGGGACCGGA	830 TTCTAGAGAT	840 TGGATAAGAT
850 ATAATCAATT	860 TAGAAGAGAA	Θ70 TTAACACTAA	880 CTGTATTAGA	890 TATCGTTTCT	900 CTATTTCCGA
' 910 ACTATGATAG	920 TAGAACGTAT	930 CCAATTCGAA	940 CAGTTTCCCA	950 ATTAACAAGA	960 GAAATTTATA
970 CAAACCCAGT	980 ATTAGAAAAT	990 TTTGATGGTA	1000 GTTTTCGAGG	1010 CTCGGCTCAG	1020 GGCATAGAAG
1030 GAAGTATTAG	1040 GAGTCCACAT	1050 TTGATGGATA	1060 TACTTAACAG	1070 TATAACCATC	1080 TATACGGATG
1090 CTCATAGAGG	1100 AGAATATTAT	111O T6GTCAGGGC	1120 ATCAAATAAT	1130 GGCTTCTCCT	1140 GTAGGGTTTT
• 1150 CGGGGCCAGA	1160 ATTCACTTTT	1170 CCGCTATATG	1180 GAACTATGGG	1190 AAATGCAGCT	1200 CCACAACAAC

154 252

c.d, tabeli II

1210 BTATTBTTBC	1220 TCAACTAGGT	1230 CAGGGCGTGT	1240 ATAbAACATT	1250 ATCGTCCACT	1260 TTATATAGAA
1270 GACCTTTTAA	1280 1ATAGGGATA	1290 AATAATCAAC	1300 AACTATCTGT	1310 TCTTGACGGG	1320 ACAGAATTTG
1330 CTTATGGAAC	1340 CTCCTCAAAT	1350 TTGCCATCCG	1360 CTGTATACAG	1370 AAAAAGCGGA	1300 ACGGTAGATT
1390 CGCTGGATGA	1400 AATACCGCCA	1410 CAGAATAACA	1420 ACGT6CCACC	1430 TAGGCAAGGA	1440 TTTAGTCATC
1450 GATTAAGCCA	1460 TGTTTCAATG	1470 TTTCGTTCAG	1480 GCTTTAGTAA	1490 TAGTAGTGTA	1500 AGTATAATAA
1510 GAGCTCCTAT	1520 GTTCTCTTGG	1530 ATACATCGTA	1540 GTGCTGAATT	1550 TAATAATATA	1560 ATTCCTTCAT
1570 CACAAATTAC	1580 ACAAATACCT	1590 TTAACAAAAT	1600 CTACTAATCT	1610 TGGCTCTGGA	1620 ACTTCTGTCG
1630 TTAAAGGACC	1640 AGGATTTACA	1650 GGAGGAGATA	1660 TTCTTCGAAG	1670 AACTTCACCT	1680 GGCCAIGATTT
1690 CAACCTTAAG	1700 AGTAAATATT	1710 ACTGCACCAT	1720 TATCACAAAG	1730 ATATCGGGTA	1740 AGAATTCGCT
1750 ACGCTTCTAC	1760 CACAAATTTA	1770 CAATTCCATA	1780 CATCAATTGA	1790 CGGAAGACCT	1800 ATTAATCAGG
1810 GGAATTTTTC	1820 AGCAACTATG	1830 AGTAGTGGGA	1840 GTAATTTACA	1850 GTCCGGAAGC	1860 TTTAGGACTG
1870 TAGGTTTTAC	1880 TACTCCGTTT	1890 AACTTTTCAA	1900 ATGGATCAAG	1910 TGTATTTACG	1920 TTAAGTGCTC
1930 ATGTCTTCAA	1940 TTCAGGCAAT	1950 GAAGTTTATA	1960 TAGATCGAAT	1970 TGAATTTGTT	1980 CCGGCAGAAG
1990 TAACCTTTGA	2000 GGCAGAATAT	2010 GATTTAGAAA	2020 GAGCACAAAA	2030 GGCGGTGAAT	2040 GAGCTGTTTA
2050 CTTCTTCCAA	2060 TCAAATCGGG	2070 TTAAAAACAG	2080 ATGTGACGGA	2090 TTATCATATT	2100 GATCAAGTAT
2110 CCAATTTAGT	2120 TGAGTGTTTA	2130 TCTGATGAAT	2140 TTTGTCTGGA	2150 TGAAAAAAAA	2160 GAATTGTCCG
2170 AGAAAGTCAA	2180 ACATGCGAAG	2190 CGACTTAGTG	2200 ATGAGCGGAA	2210 TTTACTTCAA	2220 GATCCAAACT
2230 TTAGAGGGAT	2240 CAATAGACAA	2250 CTAGACCGTG	2260 GCTGGAGAGG	2270 AAGTACGGAT	22ΘΟ ATTACCATCC
2290 AAGGAGGCGA	2300 TGACGTATTC	2310 AAAGAGAATT	2320 ACGTTACGCT	2330 ATTGGGTACC	2340 TTTGATGAGT
2350 GCTATCCAAC	2360 GTATTTATAT	23>70 CAAAAAATAG	2380 ATGAGTCGAA	2390 ATTAAAAGCC	2400 TATACCCGTT

15» 252

c.d. tabeli II

2410	2420	2430»	2440	2450	2460
ACCAATTAAG	AGGGTATATC	GAAGATAGTC	AAGACTTAGA	AATCTATTTA	ATTCGCTACA
2470	2480	2490	2500	2510	2520
ATGCCAAACA	CGAAACAGTA	AATGTGCCAG	GTACGGGTTC	CTTATGGCCG	CTTTCAGCCC
2530	2540	2550	2560	2570	2580
CAAGTCCAAT	CGGAAAATGT	GCCCATCATT	CCCATCATTT	CTCCTTGGAC	ATTGATGTTG
2590	2600	2610	2620	2630	2640
GATGTACAGA	CTTAAATGAG	GACTTAGGTG	TATGGGTGAT	ATTCAAGATT	AAGACGCAAG
2650	2660	2670	2680	2690	2700
ATGGCCATGC	AAGACTAGGA	AATCTAGAAT	TTCTCGAAGA	GAAACCATTA	GTAGGAGAAG
2710	2720	2730	2740	2750	2760
CACTAGCTCG	TGTGAAAAGA	GCGGAGAAAA	AATGGAGAGA	CAAACGTGAA	AAATTGGAAT
2770	2780	2790	2800	2810	2820
GGGAAACAAA	TATTGTTTAT	AAAGAGGCAA	AAGAATCTGT	AGATGCTTTA	TTTGTAAACT
2830	2840	2850	2860	2870	2880
CTCAATATGA	TAGATTACAA	GCGGATACCA	ACATCGCGAT	GATTCATGCG	GCAGATAAAC
2890	2900	2910	. 2920	2930	2940
GCGTTCATAG	CATTCGAGAA	GCTTATCTGC	CTGAGCTGTC	TGTGATTCCG	GGTGTCAATG
2950	2960	2970	2980	2990	3000
CGGCTATTTT	TGAAGAATTA	GAAGGGCGTA	TTTTCACTGC	ATTCTCCCTA	TATGATGCGA

3010	3020	3030	3040	3050	3060
GAAATGTCAT	TAAAAATGGT	GATTTTAATA	ATGGCTTATC	CTGCTGGAAC	GTGAAAGGGC
3070	3080	3090	3100	3110	3120
ATGTAGATGT	AGAAGAACAA	AACAACCACC	GTTCGGTCCT	TGTTGTTCCG	GAATGGGAAG
3130	3140	3150	3160	3170	3180
CAGAAGTGTC	ACAAGAAGTT	CGTGTCTGTC	CGGGTCGTGG	CTATATCCTT	CGTGTCACAG
3190	3200	3210	3220	3230	3240
CGTACAAGGA	GGGATATGGA	GAAGGTTGCG	TAACCATTCA	TGAGATCGAG	AACAATACAG
3250	3260	3270	3280	3290	3300
ACGAACTGAA	GTTTAGCAAC	TGTGTAGAAG	AGGAAGTATA	TCCAAACAAC	ACGGTAACGT
3310	3320	3330	3340	3350	3360
GTAATGATTA	TACTGCGACT	CAAGAAGAAT	ATGAGGGTAC	GTACACTTCT	CGTAATCGAG
3370	3380	3390	3400	3410	3420
GATATGACGG	AGCCTATGAA	AGCAAT1CTT	CTGTACCAGC	TGATTATGCA	TCAGCCTATG
3430	3440	3450	3460	3470	3480
AAGAAAAAGC	ATATACAGAT	GGACGAAGAG	ACAATCCTTG	TGAATCTAAC	AGAGGATATG
3490	3500	3510	3520	3530	3540
GGGATTACAC	ACCACTACCA	GCTGGCTATG	TGACAAAAGA	ATTAGAGTAC	TTCCCAGAAA

3550 3560 3570 5580 3590 3600

CCGATAAGGT ATGGATTGAG ATCGGAGAAA CGGAAGGAAC ATTCATCGTG GACAGCGTGG

154 252

c.d. tabeli II

3610 AATTACTTCT	3620 TATGGAGGAA	3630 TAATATATGC	3640 TTTAAAATGT	3650 AAGGTGTGCA	3660 AATAAAGAAT
3670 GATTACTGAC	36Θ0 TTGTATTGAC	3690 AGATAAATAA	3700 GGAAATTTTT	3710 ATATGAATAA	3720 AAAACGGGCA
3730 TCACTCTTAA	3740 AAGAATGATG	3750 TCCGTTTTTT	3760 GTATGATTTA	3770 ACGAGTGATA	3780 TTTAAATGTT
3790 TTTTTTGCGA	3B00 AGGCTTTACT	3B10 TAACGGGGTA	3B20 CCGCCACATG	3B30 CCCATCAACT	3840 TAAGAATTTG
3650 CACTACCCCC	3060 AAGTGTCAAA	3870 AAACGTTATT	38B0 CTTTCTAAAA	3890 AGCTAGCTAG	3900 AAAGGATGAC
3910 ATTTTTTATG	3920 AATCTTTCAA	3930 TTCAAGATGA	3940 ATTACAACTA	3950 TTTTCTGAAG	3960 AGCTGTATCS
3970 TCATTTAACC	3900 CCTTCTCTTT	3990 TGGAAGAACT	4000 CGCTAAAGAA	4010 TTAGGTTTTG	4020 TAAAAAGAAA
4030 ACGAAAGTTT	4040 TCAGGAAATG	4050 AATTAGCTAC	4060 CATATGTATC	4070 TGGGGCAGTC	4080 AACGTACAGC
4090 GAGTGATTCT	4100 CTCGTTCGAC	4110 TATGCAGTCA	4120 ATTACACGCC	4130 GCCACAGCAC	4140 TCTTATGAGT
4150 CCAGAAGGAC	4160 TCAATAAACG	4170 CTTTGATAAA	4180 AAAGCGGTTG	4190 AATTTTTGAA	4200 ATATATTTTT
4210 TCTGCATTAT	4220 GGAAAAGTAA	4230 ACTTTGTAAA	4240 ACATCAGCCA	4250 TTTCAAGTGC	4260 AGCACTCACG
4270 TATTTTCAAC	42B0 GAATCCGTAT	4290 TTTAGATGCG	4300 ACGATTTTCC	4310 AAGTACCGAA	4320 ACATTTAGCA
4330 CATGTATATC	4340 CTGGGTCAGG	4350 TGGTTGTGCA	4360 CAAACTGCAG

154 252

Tabela III

Sekwmcja aminokwasowa białka MGE 1

	Granice:	156 :	3623
ATG GAT	185 AAC AAT CCG AAC ATC AAT GAA TGC ATT CCT TAT AAT TGT TTA AGT	AAC CCT	215 GAA
Met Asp	Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu Ser	Asn Pro	Glu
GTA GAA	245 GTA TTA GGT GGA GAA AGA ATA GAA ACT GGT TAC ACC CCA ATC GAT	ATT TCC	275 TTG
Val Glu	Val Leu Gly Gly Glu Arg Ile Glu Thr Gly Tyr Thr Pro Ile Asp	Ile Ser	Leu
TCG CTA	305 ACG CAA TTT CTT TTG AGT GAA ΤΤΓ GTT CCC GGT GCT GGA TTT GTG	TTA GGA	335 CTA
Ser Leu	Thr Gin Phe Leu Leu Ser Glu Phe Val Pro Gly Ala Gly Fhe Val	Leu Gly	Leu
GTT GAT	. 365 ATA ATA TGG GGA ATT TTT GGT CCC TCT CAA TGG GAC GCA TTT CTT	GTA CAA	395 ATT
Val Asp	Ile Ile Trp Gly Ile Phe Gly Pro Ser Gin Trp Asp Ala Phe Leu	Val Gin	Ile
GAA CAG	425 TTA ATT AAC CAA AGA ΑΤΑ Γ.ΑΛ GAA TTC GCT AGG AAC CAA GCC ATT	TCT AGA	455 TTA
Glu Gin	Leu Ile Asn Gin Arg Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gin Ala Ile	Ser Arg	Leu
GAA GGA	485 CTA AGC AAT CTT TAT CAA ATT TAC GCA GAA TCT TTT AGA GAG TGG	GAA GCA	515 GAT
Glu Gly	Leu Ser Asn Leu Tyr Gin Ile Tyr Ala Glu Ser Phe Arg Glu Trp	Glu Ala	Asp
CCT ACT	545 AAT CCA GCA TTA AGA GAA GAG ATG CGT ATT CAA TTC AAT GAC ATG	AAC AGT	575 GCC
Pro Thr	Asn Pro Ala Leu Arg Glu Glu Met Arg Ile Gin Phe Asn Asp Met	Asn Ser	Al a
CTT ACA	605 ACC GCT ATT CCT CTT TTT GCA GTT CAA AAT TAT CAA GTT CCT CTT	TTA TCA	635 GTA
Leu Thr	Thr Ala Ile Pro Leu Phe Ala Val Gin Asn Tvr Gin Val Pro Leu	Leu Ser	Val
TAT GTT	. 665 CAA GCT GCA AAT TTA CAT TTA TCA GTT TTG AGA GAT GTT TCA GTG	TTT GGA	695 CAA
Tyr Val	Gin Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser Val	Phe Gly	Gin
AGG TGG	725 GGA TTT GAT GCC GCG ACT ATC AAT AGT CGT TAT AAT GAT TTA ACT	AGG CTT	755 ΑΓΤ
Arg Trp	Gly Phe Asp Ala Ala Thr Ile Asn Ser Arg Tyr Asn Asp Leu Thr	Arg Leu	He
GGC AAC	785 TAT ACA GAT CAT GCT GTA CBC TGG TAC AAT ACG GGA TTA GAG CGT	GTA TGG	815 GGA
Gly Asn	Tyr Thr Asp His Ala Val Arg Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg	Val Trp	Gly
CCG GAT	845 TCT AGA GAT TGG ATA AGA TAT ΑΛΤ CAA TTT AGA AGA GAA TTA ACA	CTA ACT	875 GTA
Pro Asp	Ser Arg Asp Trp Ile Arg Tyr Asn Gin Phe Arg Arg Glu Leu Thr	Leu Thr	Val
TTA GAT	905 ATC ΓΓΤ TCT CTA TTT CCG AAC 1ΑΓ GAT AGT AGA ACG TAT CCA ATT	CGA ACA	935 GTT
Leu Asp	Ile Val Ser Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Arg Thr Tyr Pro Ile	Arg Thr	Val
TCC CAA	965 TTA ACA AGA GAA ATT TAT ACA AAC CCA GTA TTA GAA AAT TTT GAT	GGT AGT	995 TTT
Ser Gin	Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asn Pro Val Leu Glu Asn Phe Asp	Gly Ser	Phe
CGA GGC	• 1025 TCG GCT CAG GGC ATA GAA GGA AGT ATT AGG AGT CCA CAT TTG ATG	1055 GAT ATA CTT
Arg Gly	Ser Ala Gin Gly Ile Glu Gly Ser Ile Arg Ser Pro His Leu Met	Asp Ile	Leu

154 252

c.d. tabeli IU

1085 1115

MC Asn

AGT Ser

ATA Ile

ACC Thr

ATC Ile

TAT Tyr

ACG Thr

GAT Asp

GCT CAT Ala His

AGA Arg

GGA Gly

GAA Glu

TAT Tyr

TAT Tyr

TGG Trp

TCA Ser

GGG Gly

CAT CAA His Gin

ATA Ile

ATG Met

GCT Ala

TCT Ser

CCT Pro

GTA Val

GGG Gly

TTT Phe

1145 TCG GGG Ser Gly

CCA Pro

GAA Glu

TTC Phe

ACT Thr

TTT Phe

CCG Pro

CTA Leu

TAT Tyr

1175 GGA ACT Gly Thr

ATG Met

GGA Gly

AAT Asn

GCA Ala

GCT Ala

CCA Pro

CAA Gin

CAA Gin

1205 CGT ATT Arg Ile

GTT Val

GCT Ala

CAA Gin

CTA Leu

GGT Gly

CAG Gin

GGC Gly

GTG Val

1235 TAT AGA Tyr Arg

ACA Thr

TTA Leu

TCG Ser

TCC Ser

ACT Thr

TTA Leu

TAT Tyr

AGA Arg

1265 AGA CCT Arg Pro

TTT Phe

AAT Asn

ATA Ile

GGG Gly

ATA Ile

AAT Asn

AAT Asn

CAA Gin

1295 CAA CTA Gin Leu

TCT Ser

GTT Val

CTT Leu

GAC Asp

GGG Gly

ACA Thr

GAA Glu

TTT Phe

1325 GCT TAT Ala Tyr

GGA Gly

ACC Thr

TCC Ser

TCA Ser

AAT Asn

TTG Leu

CCA Pro

TCC Ser

1355 GCT GTA Ala Val

TAC Tyr

AGA Arg

AAA Lys

AGC Ser

GGA Gy

ACG Thr

GTA Val

GAT Asp

1385 TCG CTG Ser Leu

GAT Asp

GAA Glu

ATA Ile

CCG Pro

CCA Fro

CAG Gin

AAT Asn

AAC Asn

1415 AAC GTG Asn Val

CCA Pro

CCT Pro

AGG Arg

CAA Gin

GGA Gly

TTT Phe

AGT Ser

CAT Hi s

1445 CGA TTA Arg Leu

AGC Ser

CAT Hi s

GTT Val

TCA Ser

ATG tet

TTT Fhe

CGT Arg

TCA Ser

1475 GGC TTT Gly Phe

AGT

AAT

AGT

AGT

GTA

AGT

ATA

ATA

AGA

1505 GCT

CCT

ATG

TTC

TCT

TGG

ATA

CAT

CGT

AGT

1535 GCT

Ser

Asn

Ser

Ser

Val

Ser

He

Ile

Arg

Ala

Pro

Met

Phe

Ser

Trp

Ile

His

Arg

Ser

Ala

GAA

TTT

AAT

AAT

ATA

ATT

CCT

TCA

TCA

1565 CAA

ATT

ACA

CAA

ATA

CCT

TTA

ACA

AAA

TCT

1595 ACT

Glu

Phe

Asn

Asn

Ile

Ile

Pro

Ser

Ser

Gin

Ile

Thr

Gin

Ile

Pro

Leu

Thr

Lys

Ser

Thr

AAT

CTT

GGC

TCT

GGA

ACT

TCT

GTC

GTT

1625 AAA

GGA

CCA

GGA

TTT

ACA

GGA

GGA

GAT

ATT

1655 CTT

Asn

Leu

Gly

Ser

Gly

Thr

Ser

Val

Val

Lys

Gly

Pro

Gly

Phe

Thr

Gly

Gly

Asp

Ile

Leu

CGA

AGA

ACT

TCA

CCT

GGC

CAG

ATT

TCA

1685 ACC

TTA

AGA

GTA

AAT

ATT

ACT

GCA

CCA

TTA

1715 TCA

Arg

Arg

Thr

Ser

Pro

G1 y

Gin

Ile

Ser

Thr

Leu

Arg

Val

Asn

Ile

Thr

Ala

Pro

Leu

Ser

CAA

AGA

TAT

CGG

GTA

AGA

ATT

CGC

TAC

1745 GCT

TCT

ACC

ACA

AAT

TTA

CAA

TTC

CAT

ACA

1775 TCA

Gin

Arg

Tyr

Arg

Val

Arg

Ile

Arg

Tyr

Ala

Ser

Thr

Thr

Asn'

Leu

Gin

Fhe

His

Thr

Ser

ATT

GAC

GGA

AGA

CCT

ATT

AAT

CAG

GGG

1005 AAT

TTT

TCA

GCA

ACT

ATG

AGT

AGT

GGG

AGT

1B35 AAT

Ile

Asp

G1 y

Arg

Pro

Ile

Asn

Gin

Gly

Asn

Phe

Ser

Ala

Thr

Met

Ser

Ser

Gly

Ser

Asn

TTA

CAG

TCC

GGA

AGC

TTT

AGG

ACT

GTA

1065 GGT

TTT

ACT

ACT

CCG

TTT

AAC

TTT

TCA

AAT

1Θ95 GGA

Leu

Gin

Ser

Gly

Ser

Phe

Arg

Thr

Val

Gly

Phe

Thr

Thr

Pro

Fhe

Asn

Phe

Ser

Asn

Gly

TCA

AGT

GTA

TTT

ACG

TTA

AGT

GCT

CAT

1925 GTC

TTC

AAT

TCA

GGC

AAT

GAA

GTT

TAT

ATA

1955 GAT

Ser

Ser

Val

Phe

Thr

Leu

Ser

Al a

Hi 5

Val

Phe

Asn

Ser

Gly

Asn

Glu

Val

Tyr

Ile

Asp

154 252

c.d. tabeli III

1985 2015

CGA ATT

GAA Glu

TTT Fhe

GTT Val

CCG Pro

GCA Ala

GAA

GTA ACC

TTT Phe

GAG Glu

GCA Ala

GAA Glu

TAT Tyr

GAT Asp

TTA Leu

GAA Glu

AGA GCA

Arg

Ile

Glu

Val Thr

Arg Ala

CAA

AAG

GCG

GTG

AAT

GAG

CTG

TTT

2045 ACT TCT

TCC

AAT

CAA

ATC

GGG

TTA

AAA

ACA

2075 GAT GTG

Gin

Lys

Ala

Val

Asn

Glu

Leu

Phe

Thr Ser

Ser

Asn

Gin

Ile

Gly

Leu

Lys

Thr

Asp Val

ACG

GAT

TAT

CAT

ATT

GAT

CAA

GTA

2105 TCC AAT

TTA

GTT

GAG

TGT

TTA

TCT

GAT

GAA

2135 TTT TGT

Thr

Asp

Tyr

His

Ile

Asp

Gin

Val

Ser Asn

Leu

Val

Glu

Cys

Leu

Ser

Asp

Glu

Phe Cys

CTG

GAT

GAA

AAA

AAA

GAA

TTG

TCC

2165 GAG AAA

GTC

AAA

CAT

GCG

AAG

CGA

CTT

AGT

2195 GAT GAG

Leu

Asp

Glu

Lys

Lys

Glu

Leu

Ser

Glu Lys

Val

Lys

Hi s

Ala

Lys

Arg

Leu

Ser

Asp Glu

CGG

AAT

TTA

CTT

CAA

GAT

CCA

AAC

2225 TTT AGA

GGG

ATC

AAT

AGA

CAA

CTA

GAC

CGT

2255 GGC TGG

Arg

Asn

Leu

Leu

Gin

Asp

Pro

Asn

Phe Arg

Gly

Ile

Asn

Arg

Gin

Leu

Asp

Arg

Gly Trp

AGA

GGA

AGT

ACG

GAT

ATT

ACC

ATC

22Θ5 CAA GGA

GGC

GAT

GAC

GTA

TTC

AAA

GAG

AAT

2315 TAC GTT

Arg

Gy

Ser

Thr

Asp

Ile

Thr

Ile

Gin Gly

Gly

Asp

Asp

Val

Fhe

Lys

Glu

Asn

Tyr Val

ACG

CTA

TTG

GGT

ACC

TTT

GAT

GAG

2345 TGC TAT

CCA

ACG

TAT

TTA

TAT

CAA

AAA

ATA

2375 GAT GAG

Thr

Leu

Leu

Gly

Thr

Phe

Asp

Glu

Cys Tyr

Pro

Thr

Tyr

Leu

Tyr

Gin

Lys

Ile

Asp Glu

TCG Ser

AAA Lys

TTA Leu

AAA GCC TAT ACC

CGT Arg

2405 TAC CAA Tyr Gin

TTA Leu

AGA Arg

GGG Gly

TAT Tyr

ATC He

GAA Glu

GAT Asp

AGT Ser

2435

CAA GAC

Lys

Ala

Tyr

Thr

Gin Asp

TTA

GAA

ATC

TAT

TTA

ATT

CGC

TAC

2465 AAT GCC

AAA

CAC

GAA

ACA

GTA

AAT

GTG

CCA

2495 GGT ACG

Leu

Glu

Ile

Tyr

Leu

Ile

Arg

Tyr

Asn Ala

Lys

His

Glu

Thr

Val

Asn

Val

Pro

Gly Thr

GGT

TCC

TTA

TGG

CCG

CTT

TCA

GCC

CCA AGT

CCA

ATC

GGA

AAA

TGT

GCC

CAT

CAT

2555 TCC CAT

Gly

Ser

Leu

Trp

Pro

Leu

Ser

Ala

Pro Ser

Pro

Ile

Gly

Lys

Cys

Ala

His

His

Ser His

CAT

TTC

TCC

TTG

GAC

ATT

GAT

GTT

2585 GGA TGT

ACA

GAC

TTA

AAT

GAG

GAC

TTA

GGT

2615 GTA TGG

His

Phe

Ser

Leu

Asp

Ue

Asp

Val

Gly Cys

Thr

Asp

Leu

Asn

Glu

Asp

Leu

Gly

Val Trp

GTG

ATA

TTC

AAG

ATT

AAG

ACG

CAA

2645 GAT GGC

CAT

GCA

AGA

CTA

GGA

AAT

CTA

GAA

2675 TTT CTC

Val

Ile

Phe

Lys

Ue

Lys

Thr

Gin

Asp G1 y

His

Ala

Arg

Leu

G1 y

Asn

Leu

Glu

Phe Leu

GAA

GAG

AAA

CCA

TTA

GTA

GGA

GAA

2705 GCA CIA

GCT

CGT

GTG

AAA

AGA

GCG

GAG

AAA

2735 AAA TGG

Glu

Glu

Lys

Pro

Leu

Val

Gly

Glu

Al a Leu

Ala

Arg

Val

Lys

Arg

Ala

Glu

Lys

Lys Trp

AGA

GAC

AAA

CGT

GAA

AAA

TTG

GAA

2765 TGG GAA

ACA

AAT

ATT

GTT

TAT

AAA

GAG

GCA

2795 AAA GAA

Arg

Asp

Lys

Arg

Glu

Lys

Leu

Glu

Trp Glu

Thr

Asn

Ile

Val

Tyr

Lys

Glu

Ala

Lys Glu

TCT

GTA

GAT

GCT

TTA

TTT

GTA

AAC

2825 TCT CAA

TAT

GAT

AGA

TTA

CAA

GCG

GAT

ACC

2855 AAC ATC

Ser

Val

Asp

Ala

Leu

Fhe

Val

Asn

Ser G1n

Tyr

Asp

Arg

Leu

Gin

Al a

Asp

Thr

Asn Ile

154 252

c.d

. tabeli

III

RCG Ala

ATG Met

ATT Ile

CAT His

GCG Ala

GCA Ala

GAT Asp

AAA Lys

CGC Arg

28B5 GTT Val

CAT His

AGC Ser

ATT Ile

CGA Arg

GAA Glu

GCT Ala

TAT Tyr

CTG Leu

2915 CCT GAG Pro Glu

CTG Leu

TCT Ser

GTG Val

ATT Ile

CCG Fro

ggt Gly

GTC Val

AAT Asn

GCG Al a

2945 GCT Ala

ATT Ile

TTT Phe

GAA Glu

GAA Glu

TTA Leu

GAA Glu

GGG Gly

CGT Arg

2975 ATT TTC Ile Phe

ACT Thr

GCA Ala

TTC Phe

TCC Ser

CTA Leu

TAT Tyr

GAT Asp

GCG Al a

AGA Arg

3005 AAT Asn

GTC Val

ATT Ile

AAA Lys

AAT Asn

GGT Gly

GAT Asp

TTT Phe

AAT Asn

3035 AAT GGC Asn Gly

TTA Leu

TCC Ser

TGC Cys

TGG Trp

AAC Asn

GTG Val

AAA Lys

GGG Gly

CAT His

3065 GTA Val

GAT Asp

GTA Val

GAA Glu

GAA Glu

CAA ,Gln

AAC Asn

AAC Asn

CAC Hi s

3095 CGT TCG Arg Ser

GTC Val

CTT Leu

GTT Val

GTT Val

CCG Pro

GAA Glu

TGG Trp

GAA Glu

GCA Ala

3125 GAA Glu

GTG Val

TCA Ser

CAA Gln

GAA Glu

GTT Val

CGT Arg

GTC Val

TGT Cys

3155 CCG GGT Pro Gly

CGT Arg

GGC Gly

ΤΑΓ Tyr

ATC Ile

CTT Leu

CGT Arg

GTC Val

ACA Thr

GCG Ala

31B5 7 AC Tyr

AAG Lys

GAG Glu

GGA Gly

TAT Tyr

GGA Gly

GAA Glu

GGT Gly

TGC Cys

3215 GTA ACC Val Thr

ATT He

CAT His

GAG Glu

ATC Ile

GAG Glu

AAC Asn

AAT Asn

ACA Thr

GAC Asp

3245 GAA Glu

CTG Leu

AAG Lys

TTT Phe

AGC Ser

AAC Asn

TGT Cys

GTA Val

GAA Glu

3275 GAG GAA Glu Glu

GTA Val

TAT Tyr

CCA Pro

AAC Asn

AAC Asn

ACG Thr

GTA Val

ACG Thr

3305 TGT AAT Cys Asn

GAT Asp

TAT Tyr

ACT Thr

GCG Ala

ACT Thr

CAA Gln

GAA Glu

GAA Glu

3335

TAT Tyr

GAG Glu

336S

3395

GGT

ACG

TAC

ACT

TCT

CGT

AAT

CGA

GGA TAT

GAC

GGA

GCC

TAT

GAA

AGC

AAT

TCT

TCT

GTA

Gly

Thr

Tyr

Thr

Ser

Arg

Asn

Arg

Gy Tyr

Asp

Gly

Al a

Tyr

Glu

Ser

Asn

Ser

Ser

Val

3425

3455

CCA

GCT

GAT

TAT

GCA

TCA

GCC

TAT

GAA GAA

AAA

GCA

TAT

ACA

GAT

GGA

CGA

AGA

GAC

AAT

Fro

Ala

Asp

Tyr

Ala

Ser

Ala

Tyr

Glu Glu

Lys

Ala

Tyr

Thr

Asp

Gly

Arg

Arg

Asp

Asn

3485

3515

CCT

TGT

GAA

TCT

AAC

AGA

GGA

TAT

GGG GAT

TAC

ACA

CCA

CTA

CCA

GCT

GGC

TAT

GTG

ACA

Pro

Cys

Glu

Ser

Asn

Arg

Gly

Tyr

G1y Asp

Tyr

Thr

Pro

Leu

Pro

Ala

Gly

Tyr

Val

Thr

3545

3575

AAA

GAA

TTA

GAG

TAC

TTC

CCA

GAA

ACC GAT

AAG

GTA

TGG

ATT

GAG

ATC

GGA

GAA

ACG

GAA

Lys

Glu

Leu

Glu

Tyr

F’he

Pro

Glu

Thr Asp

Lys

Val

Trp

Ile

Glu

Ile

Gly

Glu

Thr

Glu

36< *5

GGA

ACA

TTC

ATC

GTG

GAC

AGC

GTG

GAA TTA

CTT

CTT

ATG

GAG

GAA

TAA

Gly

Thr

Phe

Ile

Val

Asp

Ser

Vel

Glu Leu

Leu

Leu

Met

Glu

Glu

End

154 252

Claims (11)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. środek owadobójczy zawierający dopuszczalne w rolnictwie środki pomocnicze

   1 substancję czynnę, znamienny tym, że jako substancję czynnę zawiera owad^cbój^{czc s}kut^eczną ilość ^£ -endotoks^yn^y z Bacillus ^uringiensis var. kurstaki, kiwanej przez fragment DNA pochodzący z Bacillus thuringiensis var kurstaki od miejsca dla Hpa I /0/ do miejsca dla Pst I /4355/.
2. 2. środek wedłu^g zastrz. 1, znamienny tym, ^że z^awi^{era S -}eⁿd^ot^oksynę z Bacmius thuringiensis var. kurstaki, kodowanę przez fragment DNA opisany sekwencję nukleotydowę przedstawioną w tabeli II.
3. 3. śradek wedłu^g zatrz. 1, znamienny ^tym, ^że ranmera S ^n^ro^y^ kodowanę przez kodujące aktywność owadobójcza skrócone części fragmentu DNA pochodzącego z Bacillus thuringiensis var. kurstaki od miejsca dla Hpa I /0/ do miejsca dla Pst I /4355/, kodu^cego owadowójcz^{ę £}-en^dotoksyⁿę.
4. 4. środek według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera owadobójczo ^sku^e^czn^a iloś^{ć £} -endotoks^yn^y z Bacillus thuringiensis var. kurstaki ^zawierają^cej fragment opisany sekwencję aminokwasowę przedstawiona w tabeli III.
5. 5. środek według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera owadobójczo skuteczna ilość układu kapsułki biologicznej składajęcego się z pierwszego materiału całkowicie osadzonego w drugim maaerlale pochodzenia biologicznego, przy czym tym piewszym ma(^ri^^eem Jest owadobójczo skuteczna i.loś^{ć £} -endctcks^yn^y z Bacillus ^thurlnglensis var. kurstaki kodowana przez fragment DNA pcnhcdzęcy z Bacillus thuringiensis var. kurstaki od miejsca dla Hpa I /0/ do miejsca dla Pst I /4355/, a drugim ^^aeri^^łem Jest cały martwy mikroorganizm, przy czym jeżeli mikroorganizm ten należy do grupy Bacmius thuringiensis, to Bacillus Jest transoormowany fragmentem ONA pochodzęcym z Bacmius thuringiensis var. kurstaki od miejsca dla Hpa 1/0/ do miejsca dla Pst 1/4355// kodującym owadobójczo skutecznę ilość substancci białkowej. ·
6. 6. środek według zaetrz. 5, znamienny ty·, 'że zawiera pierwszy maeri.ał kodowany przez kodujęce aktywność owedobbjcza skrócone części fragmentu DNA pochodzącego z Bacillus ehuolnglentit var, kurstaki od miejsca Hpa 1/0/ do miejsca dla Pst 1/ ⁴355Λ taduj^e owadobójcza ^£ -en^doecks^yn^ę.
7. 7. środek według zastrz. 5, znamienny tym, że zawiera układ kapsułki biologicznej, w którym drugi materlał pochodzenia biologicznego stanowię otoczki martwych komórek Ba^ha^^ces nθrevislte.
8. 8. środek według zastrz. 7, znamienny tym, że zawiera drugi maeriLał pochodzenia biologicznego stanowiący otoczki martwych komórek Saccharcrynet cere/imae GRF 18, uprzednio eransCormoótne plasmidem pK 36, zdeponowany pod numerem rejestracyjnym DSM 366Θ»
9. 9. środek według zastrz. 2, znamienny tym, że zawiera owadobójczo skutecznę ilość układu kapsułki biologicznej składającego się z pierwszego maaeriału całkowicie osadzonego w drugim maaeriale pochodzenia biologicznego, przy czym tym pierwszym imeriabm Jes^t owadobójczo skuteczna iloś^{ć £} -endotok^ny z Baclllu^{s t}h^uri^ngiensis var. kurstaki kodowana przez fragment ONA opisany sekwencję nukleotydowę przedstawiona * tabeli II, a drugim maoriałem Jest cały martwy mikroorganizm, przy czym jeżeli mikroorganizm ten należy do grupy Bacillus thuringiensis, to Bacillus Jest transformowany fragmentem DNA opisanym sekwencję nukleotydowę przedstawiona w tabeli II.
10. 10. śr^{odek w}ed^ług rastra. 9, ^zntrienny ^tym, że zawiera ^układ ^kapsułki bim^lranej , w ^który^{m dru}gi mararlał ^po^h^^^^r^^^a brologicznego sranow^ mrozki ^z martwych komórek Ba^ha^^ces ΜΓ8ν1^^.
11. 11. śr*^{odek w}ed^ług rastra. 1°, zn^amienny tym, ^że zawiera dru^gi maaerrał pochodzenia biologicznego tetnoóiąny otoczki martwych komórek Sancharomycłt ceres/islas

    GRF 18, uprzednio tΓansCormoótnł plasridΘr pK 36, zdeponowany pod numerem rejestracyjnym DSM 3668.

    154 252

    154 252

    Zakład Wydawnictw UP RP. Nakład 100 egz. Cena 3000 zł