PL154336B1 - Method for manufacturing peptides - Google Patents

Description

OPIS PATENTOWY

Patent dodatkowy do patentu nr-Zgłoszono: 86 09 17

Pierwszeństwo 85 09 86 07 /P. 261419/

41a zastrz.l Stany Zjednoczone Ameryki dla zastrz, 2-8 Stany Zjednoczone Ameryki

Zgłoszenie ogłoszono: 87 07 27

154 336

Int. Cl.⁵ C12N 15/18 czrnuw s & u a

Opis patentowy opublikowano: 1991 11 29

Twórca wy rn lazku: Uprawiiony z patentu: Monsanto Comany, St. Louis /Stany Zjednoczone Ameryk/

SPOSÓB WTTAAZANIA PEPTYDÓW

Przedmiotem wyralazku jest sposób wytwrzania peptydów będących bydlęcymi czynnikami wzrostu.

W organizmach różnych gatunków zwierząt zidentyfikołano issulSno-podobnr czynniki wzrostu /IGF/. Są to peptydy wylkzujące aktywność biologiczną w procesach wzrostu, między innymi poprzez proliferację komórek. Uwtża się, że pośredniczą one w działaniu soratotropin i przypuszczalnie innych hormonów. Termin insulSno-podkbsy czynnik wzrostu stosuje się dla wyrażania podobieństwa struktury i aktywnońci biologicznej tych peptydów do insuliny. IGF w^k-zuJą prawie 50% b^rmoc^^ii z insuliną. W strukturze tróJwroiarowej przypomirają one proinsiuLlnę, gdyż są to peptydy o pojedyńczych łańcuchach trzema mostkami dwusiarczkowyM, zawierające łańcuch A /domena A/, łańcuch B zakończony grupą aminową /domena B/ oraz łańcuch łączący łańcuchy A i B /domena C/. PrzynajmU.ej w niektórych IGF występuje również przedłużenie łańcucha z końcową grupą karboksylową /domena b/, którego nie ma w proirn5tu.inie.

W organizmach zwierząt zidrntyfikooano kilka klas insuLlnno-podobnych czynników wzrostu, do których należy IGF-I, IGF-II i inne. Wykkyto, że poziom tych peptydów w obiegu jest w pewnym zakresie regulowany przez somiaotropinę, przy czym IGF-I podlega regulacji somtotropiną w większym stopniu niż IGF-II. W różnych układach hkdow01 komórkowych wykazano działanie pobierające mitozę, oznaczone np. przez pomiary zwiększonego waudowywnia znaczonej tryttem tymidyny.

Wylckzano, że u niektórych zwierząt istnieją co najmnej dwe grupy receptorów dla IGF, przy czym jedna grupa tych receptorów preferencyjnie wiąże IGF-I,a druga grupa - preferencyjnie wiąże IGF-II, co wskazuje na inne funkcje IGF-I i IGF-II. Otaziu}e się jednak, że biologiczne funkcje IGF-II są różne u różnych gatunków ssaków. I tak, np. poziom IGF-II

154 336

154 336 w obiegu płodu szczura Jest 20 - 100-krotnie wyższy niż w obiegu mtki, podczas gdy u ludzi, poziom IGF-II w surowicy płodu jest niższy niż u dorosłych.

Dla potencjalnej aktywiości biologicznej i użyteczności w pobudzaniu pożądanego «rostu komórek u zwierząt prowadzono długotrwałe badania sekwencji aminokwsowej bydlęcego IGF-II /bUF-II/ oraz batonie zmierzające do bardziej szczegółowego wjaśnienia działania pobudzającego «rust i innych działań, jak rówiież aktywnych biologicznie fragmentów tego peptydu. Dotychczas nie była opisana ani ta sekwencja ani sekwencja DNA genu dla byd lęcego IGF--I.

Badania banków genomów szczura 1 człowieka ^tazują, że geny IGF-II zawierają co najmnnej cztery egzony. Bardzo duże rozmiary i złożoność genów dla ludzkiego i szczurzego IGF-II sprawiają, że ich ^oddrbnnenie i identyfikacja są tak trudne, że nie oznaczono w pełni sekwennji DNA tych genów. Jednak dla celów wytwarzania i batonia bydlęcego IGF-II niezbędne Jest ^odrąbin-enie i oznaczenie pełnej sekwencji DNA genu bydlęcego IGF-II.

Obecnie otrzmano w wysokim stopniu oczyszczone i/lub syntetyczne peptydy wykazujące aktywność biologiczną bydlęcego IGF-II w jednym lub w.ęcej kierunkach, a bardziej ogólnie, tego rodzaju peptydy, złożone głównie z aminokwisów oatojących im tę aktywność lub peptydy, które mogą być łatwo przeprowadzone w peptydy posiadające tę aktywrość.

Peptydy te stosuje się w celu zwiększania pożądanego wzrostu lub funkcjonalności komórek u zwierząt, w tym rówiież zwiększania wrastu komórek mięśni i/m komórek nabłonkowych sutka.

Wyynaazek w dużej merze opiera się na opisanych odkryciach sekiwncj|i aminok w βοwych bydlęcego iGF-II i różnych jego prekursorów oraz sekwennci n^k^eot^y^^wych DNA kodującego bydlęcy IGF-II oraz jego prekursory, opisanych poniżej.

Sposobem według wm lazku ^yt^rza się nowe peptydy o budowie, która zasadniczo odpowiada rastępującej sekwencji aminokwasów /odczyt od końca z grupą aminową sekwencji do końca z grupą karboksylową/, przy czym sekwencja ta koresponduje z nie oznaczoną przed dokonaniem niniejszego ^y^lazku sekwencją am-nokw^iBową bydlęcego IGF-II:

Ala-Tyr-Arg-Pro-Ser-G lu-T hr-Leu-C ys-GlyGly-Glu-Leu-Val-Asp-Thr-Leu-Gin-Phe-VaaCys-Gly-Asp-Arg-Gly-Phe-Tyy-Pkhi-Ser-ArgPro-Ser-Ser-Arg-Ile-Asn-Arg-Arg-Ser-Arglly-Ile-VallίlulϊluCysCys-Phe Arg-SerCyε-AspeLeu-AlaeLeu-Leu-Glu-Tln'-eyyΓ-CysAla-Thn-Pro-Ala-Lys-Ser-Glu.

Opracowano różne sposoby wzimgania «rostu i/lub innych pożądanych czynności komórek u zwierząt przez podanie tym zwierzętom nowych peptydów w ilościach wystarczających do wy wołania takiego działania. Przykładowo, rożna zwiększyć rosę mięśni zwierząt przez podanie tym zwierzętom tego peptydu /plptyd.ói/ w ilości potrzebnej do wywOłania proliferacji komórek towarzyszących mięśni u zwierząt. Innym przyk&idem jest podanie takiego peptydu żeńskim osobnikom ssaków w ilościach skutecznych do spowodowania proliferacji i/lub stymuulcci wybielania mleka w komórkach nabłonkowych sutka u tych ssaków, osiągając wzmożoną laktację.

Zgodnie z ^Miazkiem, wykluje się ekspresję nowych sekwencji nUkllotydowych /Dna/ zawierających kod dla no^ch peptydów. Na ogół, ten DNA zasadniczo zawiera następującą sekwencję cukllotrdói /lub ich funkcjonalnych równo waników dla ekspresji peptydu/:

5- GCT TAC CGG CCC AGG GAG ACT CTG TGC GGC

GGG GAG GTG CTG GAC ACC CTC CAG TTT GTC

TG-T GGG GAC CGC UC TTC TAC TTC ACC CGA

CCA TCC ACC OGC ATA AAC CGA CGC ACC CGT

GGC ATC GGG GAA GAG TCT TGC TTC CGA AGC

154 336

TGC GAC CTG GCC CTG CTG GAG ACT TAC TGT GCC ACC CCC GCC AGG TCC GAG-3'.

Tak więc sposób wtw rzania tych peptydów polega na dokonaniu ekspresji DNA, wyodrębnieniu i ewentteanie dalszym oczyszczeniu otrzymanych peptydów do zasadniczo czystej postaci.

W niniejszym opisie użyte są ogólnie przyjęte symbole oznaczające aminokrnsy /np. Ala dla alaniny,/ i nułkLeotydy /C, A, G lub T/, patrz Lehninger /1976/.

Użyty w niniejsym opisie termin peptyd syntetyczny oznacza peptyd wytworzony na drodze technicznej /np. syntezy chemicznej lub ekspresji rekombinantowego DNA/ innej niż jego naturalne ^yswirrzinie w org^ntźmLe żywego zwierzęcia. Tak więc, syntetyczne peptydy należy odróżnić od peptydów ^tMrzanych w żywych organizmach przez ekspresję DNA zachodzącą w stanie naturalnym u tych zwierząt. Takie, wtworzone syntetycznie peptydy są na ogól wolne od peptydów pochodzenia bydlęcego /lub peptydów pochodzących od innych zwierząt/.

Jednakże, nowe peptydy można otrzymać przez ^ocdrbnneniś z mieszanin peptydów wytwarzanych w żywych organizmach zwierząt, jak np. opisano w przykładzie I. Stosując dowolny sposób preparowała, zgodnie z peptyd oddziela się od innych peptydów pochodzenia bydlęcego lub peptydów pochodzących z innych zwierząt, zwkle prowdzi się następną izolację, otrzymując peptyd zasadniczo wolny od tych innych peptydów, to Jest, zmieszany z tak młą ich ilością, która nie zaburza w widoczny sposób pożądanej aktywności biologicznej peptydu.

Stosowane w opisie określenie peptydy o budowie, która zasadniczo odpowiada sekwencji bydlęcego IGF-II /jako takiej lub przedłużonej na końcu z grupą aminową lub karboksylową lub na obydwu tych końcach/ odnosi się do peptydów zawierających podaną sekwencję lub jedynie taką część tej sekw^nj!, jaka w znacznej mierze potrzebna Jest dla uzyskania aktywności biologicznej bydlęcego IGF-II w jednym lub więcej niż jednym kierunku działania /na ogół, najmilej 0,1 %, korzystnie co najmmej około 1 % lub nawet bardziej korzystnie - co najmnnej 10 % aktywnooci czystego, ittakttego bydlęcego IGF-II/. Ta aktywność biologiczna bydlęcego IGF-II obejmuje aktywność itsuitśo-śodobną oraz zdolność /czystego peptydu lub łącznie z innymi substancjami aktywnymi biologicznie/ stymulowania proliferacji komórek zwierzęcych lub stymulowania laktacji wspominanych wżej komórek nabłonkowych sutka /lecz nie ogranicza się do tej aktywnośc/. Aminokwasy, które są w zasadzie zbędne w odniesieniu do tego rodzaju aktywn^ci mogą być pominięte. Otrzymuje się w;edy peptydy o mnnejszej liczbie aminokwasów od tej jaka jest zawrta w podanej powyżej sekwan^i.

Określeniem tym objęte są również peptydy, które wrlnzują powrżej aktywność, pomimo, iż w podanej w opisie sekwencji αmitśkwsowej bydlęcego IG^^II lub występujących w stanie naturalnym jego prekursorów jeden lub więcej niż jeden aminokwas został zastąpiony innym aminokwasem. Przykładowo, zakłada się, że peptydy, w których alanina z końcową grupą amnową w podanej powżej sekwencji bydlęcego IGF-II zastąpiona jest meliom-ną - będą wykazywły aktywność biologiczną podobną do bydlęcego IGF-II i będą moo^y być w łatwy sposób wytwarzane na drodze rekom^imcji DNA, w komórkach bakteryjnych lub innych mikroorgantsmch, które niś usuwają N-terminalnej reszty meśiśtiny. W zakres tśj definicji wchodzą również większe peptydy zawierające cytowaną sekwencję /lub jśj waiarit otrzymany przez delicję lub podstawienńe/ łącznie z jednym lub więcej niż jednym dodatkowym aminokwasem przylącocnym bezpośrednio do końca aminowego i/lub karboksylowego tśj sśkwentji, jak również peptydy moodflkowane w inny sposób na końcach lub w innych miejscach, na przykład, przez glikozylownie, fosforylowaniś, amidownie lub podobne procesy w takim zakresie, aby podanie tych peptydów /po dalszym ich przetwarzaniu lub bez/ wyw^ło w znaczącej mierze działanie biologiczne bydlęcego IGF-II.

W jednym z rozwiązań, sastośiwanym do identyfikacji ujawnionej w opisie sekwencji cmItśkwsśiej bydlęcego IGF-II, bydlęcy IGF-II izoluje się i oczyszcza z surowicy byd4

154 336 lęcej. Jakkolwiek u większości zwierząt miejscem, gdzie wytarzana jest większa część IGF jest wątroba^a IGF wykryitóny jest również w wielu tkankach, takich jak mięśnie, chrząstka, mózg, płyn m<5zgowoonizeniowy, to z^kle korzystnym źródłem IGF, a IGF-II w szczególności jest surowica. Sposoby ^odrębrd.ania i izolowania IGF zostały opisane w literaturze, na przykład przez Svoboda'ę i wsp., Van Wyka i wsp., Liberri*ego, Bała*ego i «ρ. oraz Zumsteina i wsp.

Aktywny bydlęcy IGF-II wyizolowany i oczyszczony z surowicy bydLęcej okazał się pojedynczym peptydem o mal.e cząsteczkowej około 7400 daltonów o przedstawionej powyżej sekwencji 67 aminokwisów. skriningowe badania aktywiości biologicznej bydlęcego

IGF-II połączone z pomiarami iJ^oścow^mi przeprowadzono stosując opisaną przez Daughadaya i wsp. próbę radioreceptorów łożyska szczura.

Ozraacenie pełnej seRwe^j aminokMsornj bydlęcego KG--II mi duże znaczenie, daje ono bowiem podstawę do prod^c,}! peptydów wk^ujących aktywność bydlęcego IGGfII.

Taką produkcję można prowadzić dowolnym znanym sposobem. Przykładowo, mae ilości /na przykład do celów badawczych/ można ^y^^j~zać stosując Cśn^wnojoralną aparaturę do syntezy peptydów. Na większą stolę, produkcję tę rożna prorndzić na drodze syntezy chemicznej lub w sposób na ogół bardziej zadawlający, w mikroorganizmach jako gospodarzu lub w hodowlach komórkowych, z zastosowaniem reCombiolntśwego DNA kod^ą^go nowe peptydy. Stosując taki DNA w połączeniu z technikami inżynierii genetycznej można produkować znacznie większe ilości takich peptydów od tych, które rożna byłoby praktycznie uzyskiwać z surowicy bydlęcej lub tkanek.

Jak to bardziej szczegółowo opisano poniżej, sekwencję amlnok^sową bydlęcego IGG--II potwierdzono przez izolację i charakterystykę odcinków genu dla bydlęcego IGF-II z genomowego DNA z nerki przed charakteryzacją tego genu, w oparciu o oznaczenie sek^ncj! lminokmsooej bydlęcego IGFfII można wytwtozać nowe syntetyczne peptydy podobne strukturalnie do byd.ęcego np. znanymi technikami z zastosowaniem rekśmbiolotśwego

DNA kodującego tę sekwencję amiośk«sów. Tak więc, jeśli te peptydy mją być wkwirzant w mikroorganizmach jako gpspodarzu, takich jak bakkerit lub drożdże, z zlstośoolniem rekombinn^nego DNA, to można lkoostluś0oać sekwencję DNA kodującą tę sekwencję lmiooCwιlową i składającą się eoen0lulnie z kodonów bydlęcego IGF-II preferowanych przez wybranego gospodarza i w^t^rzać je syntetycznie /patrz opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 356 270/.

Procesy wtw rzania peptydów oi drodze rtkśmmrraaji DNA c/lub syntetycznej, rogą proMdzić do niewielkich zmian w składzie aminokwasową. Przykładowo, wyważanie tych peptydów w komórkach bakteryjnych może dawać produkty z dodatkową N-terminalną metioniną, a w woIRu syntezy chemcznej otrzymuje się wrianty ze zmianami przy końcu z grupą karboksylową, a więc, w produktach syntezy mogą wstąpić rodniki -COOR-j, CR-0, CONHNR.-,

-COKRjRg lub -CHgOR /Rj i Rg oznaczają niezależnie od siebie niższą grupę alkilową lub atom oodaśu/. Takie peptydy wchodzą w zakres wmlazku tak długo, jak długo ich aktywność biologiczna podobna do bydlęcego IGF--II nit spadnie do poziomu poniżej tolerancji.

W niektórych przypadkach, nowe peptydy można wdrębniać lub wywarzać w formie zdenaturotonej, nieaktywnej biologicznie. W swej οογμΙπθ}, biologicznie aktywnej /niezdenaturo-wnej/ formie, bydlęcy IGF--II jest lsieciowlny trzema mostkami awl3iaΓCzkowymi. Przyjmuje się, że analogicznie do ludzkich IGF-II i IGF-I mootki te znajdują się pomiędzy aminokwasem /cysteiną/ w pozycjach 9 i 47, 21 i 60 oraz 46 i 51 /patrz Yamahiro i wsp./ lecz zakres wynnlazku nit jest ograniczony do tych pozycci. Peptydy, w których brak tych wml^any^ch rostków można aktywować stosując dobrze znane techniki οβΙ^^ο^ peptydów, zw^lt przez poddanie tych peptydów warunkom /pH, temperatura, ^i-hO^ćl utleniające itp./, w których przyjmują one biologicznie aktywną konfigurację tΓÓOwrailΓśoą i tworzą wiązania dw^l^lΓc^klwe /mooski/ podobne do tych, które wstępują w biologicznie aktywnym, bydlęcy IGFfII. Dla celów wn lazku, konkretna zastosowana technika nie

154 336 jest istotna tak długo, jak długo nadaje ona aktywność biologiczną w wymaganym zakresie.

Różnice w sekwencji aminokwasów między ludzkim, szczurzym i bydlęcym IGF-II wstępują głównie w obszarach ogólnie charakteryzowanych jako domeny C. Analiza bydlęcego IGF-II wykonana dla celów niniejszego ^ralazku wylizała N-termicalną alaninę, Jak to przedstawiono w tablicy 1. Jest to zgodne z doniesieniem Hummela o obecności N-termimlcej alaniny w ludzkim i szczurzym IGF-II lecz niezgodne z doniesieniami o N-termLnalnej tyrozynie /des Ala/ w ludzkim IGF-II /Rinderknecht i wsp./ i szczurzym IGF-II /Marąuardt 1 Takie

IGF-II posiadające N-terminalną tyrozynę mogą się tworzyć w wyniku różnic w allelach i/lub różnic w procesach wtwrzacia albo jako konsekwencja niezamierzonej delecji N-termirnlnej alaniny w czasie oczyszczania, natomiast nie wykrywa się ich w produkcie ze stosowanej surowicy bydlęcej. W każdym przypadku, takie wriacty z N-terminalną tyrozyną uznaJe się Jako produkty równorażne do no^ch peptydów, tak długo, Jak długo wrkazują one aktywność bio logiczną bydlęcego IGF-II.

Na podstawie podanej po^żej sekwencji aminokwsowej i aktywnooci biologicznej bydlęcego IGF-II stała się obecnie mooiiwa identyfikacja form alleiczcnych bydlęcego IGG-II i/hub ^y^wrjzanie syntetycznych jego wriantów posiadających aktywność biologiczną równą lub lepszą od aktywności bydlęcego IGF-II. PrzyjmtUe się zatem, że izolacja allelicnnych form bydlęcego IGF-II- oraz w^r;«r^c^r^C.e tego rodzaju «iriantów z delecją, przedstawieniem i/uub dodatkiem aminok^su /aminok^sów/ w stosirnku do bydlęcego IGF-II będzie stanowić różne, użyteczne realizacje ujawnionych peptydów. Identyfikacja takich altenMitwmych peptydów jest moiiwa do przepro^dzenia przez specjalistów.

Na podstawie podanej poniżej sekwencj DNA i analogii do ludzkiego IGF-II /hlGF-II/ przyjmuje się, że bydlęcy IGF-II jest pierwszym, zsfnteycoo¥tcnrm w komórkach peptyiem prekursortwym posiadającym sekwencję sygnalną /liderową/ złożoną z 24 amicok^sów, bezpośrednio poprzedzającą N-koniec dojrzałego, bydlęcego IGF-II, i że ta sekwencja sygnalna odszczepiana jest podczas ^Idżelania peptydu prekursorowego z komórek «rtWΓzających bydlęcy IGF-II. Peptydy zawierające tę sekwencję sygnalną /lub dowolną żądaną jej część/ magą być ^t^rzace przez ekspresję takiego DNA /przy początkowej delecji kodonu /kodonów/ dla aminokwasu /aminok^sów/ niepożądanego w tej sek^^j^c^^i i są użyteczne do produkcji peptydów, korespondujących jeśli chodzi o sekwencję aminok«ιsooą z dojrzałam, bydlęcym IGF-II przez usunięcie tej sek^^r^n^^:i sygnalnej, np. na drodze chemicznej, mikrośeologiczcej lub enzymtyczne j.

Z innych sekwencj DNA ujawnionych w opisie przyjmuje się Jako nowy prekursor peptydowy bydlęcego IGF-II posiadający przedłużenie końca karboksylowego zawierające około 89 tminokwιsóo. Ta now sekwencja pierwszych 68 aminok^sów tego przedłużenia /lccząc od końca karboksylowego bydlęcego IGG-II/ jest ujawniona w niniejctym opisie. Przez analogię do proinsuliny przyjmuje się, że nowe peptydy, zawierające takie przedłużenie grupy karboksylowej będą w znacz ącym stopniu aktywność biologiczną bydlęcego a zatem, te przedłużone peptydy również wchodzą w zakres wn-clazku.

Jak to opisano poniżej, izolacja i charakteryzacja bydlęcego IGF-II umożliwiła dokładniejszą jego identyfikację i zbadanie tCttwcości biologicznej.

Przykładowo, wyrażano aktywność bydlęcego IGF-II w próbie proliferacji zarodkowych komórek mięśniowych /mioblastów/ 16 szczura. Peptyd ten stymuluje również proliferację bydlęcych komórek nabłonkowych sutka i wzmiga laktację tych komórek in vitro. Zakłada się zatem, że peptydy wytwirzane sposobem wymlazku wykazują aktywność in vivo w zakresie proliferacji różnego typu komórek bydlęcych, np. komórek nabłonkowych sutka i komórek towarzyszących mięśni oraz w zakresie stymuacji in vivo nowo pow^l^iłjących komórek nabłonkowych sutka, zwiększając wytwarzanie Heka przez te komórk. Uważa się również, że peptydy te w>ływją ca wzrost mięśni i/uib wzrost stosuiCu mięsa do tłuszczu u różnych ga^u^cC^w zwierząt innych niż bydło np. u owiec, kóz, świń, ku^f^j^^l;, indyczek, kaczek i innego drobiu/ i że zwiększają laktację u ssaków innych niż bydło /np. u owiec, kóz i świń/

154 336 o ile wsypuje wystarczająca homologia między bydlęcym IGF-II a IGF-II danego gatunku zwierzęcia.

U zwierząt dorosłych ilość włókienek mięśniowych /to jest komórek mięśniowych/ jest stała,a wzrost umięśnienia następuje jedynie w wyniku przerostu komórek męśniowych i proliferacji komórek mięśniowych towarzyszących /sateliaarnych/. Włókienka mięśniowe tworzą się w racicy przez fuzję replkoowanych komórek mięśniowych zarodkowych. Replikujące się komórki mięśniowe, które utrzymują się w dorosłam organiźmie noszą nazwę komórek mięśniowych towarzyszących /scteliCarnych/. Te towarzyszące komórki męśniowe można stymulować wywołując ich rep^ikację,a następnie fuzję z istniejącymi włókienkami mięśniowymi, uzyskując powiększone Jądra włókienek mięśniowych. Oczekuje się, że taki wtrost w jądrach włókien mięśniowych będzie się ujawniał w zwiększonej raaie mięśniowej.

Próba proliferacji moblastów L6 stanowi wiarygodny wskaźnik in witii aktywności IGi jest stosowana jako próba modelowa dla czynników w^^y^Jących na zarodkowe kotórki mięśniowe i komórki towarzyszące osobników dorosłych. Czynniki aktywne w tym układzie zachowują się podobnie w pierwotnych hodowlach mioblastów bydlęcych /patrz Gospodarowicz i wp./. Zwiększenie proliferacji mioblastów L6 szczura In vitro przez peptyd rnkazuje na jego aktywność w zwiększaniu proliferacji mioblastów, a zatem, w zwiększaniu właściwej liczby włókienek mięśni owych w zarodku. Podobnie, wraagnie proliferacji mioblastów L6 szczura wskazuje na to, że nowe peptydy mogą być stosowane do zwiększania przerostu mięśni u osobników dorosłych, na przykład, poprzez stymulację proliferacji komórek mięśniowych tonrzyszących.

U zwierząt w okresie laktacji, ilość nabłonkowej tkanki sutka jest czynnikiem limitującym wydzielanie męka, jako, że są to komórki w^urujące i wdzzelające męko. Stosując układy in vitro ^ΐο^ηο, że komórki nabłonkowe otrzymane z gruczołów mlecznych zwierząt raźna stymulować bydlęcym IGF-II, powodując ich proliferację 1 zwiększone wytwarzanie składników męka. Wyyazano ponadto, że komórki nabłonkowe sutka stymulowane w kierunku proliferacji w Jednym z takich układów komórkowych in vitro można ponownie wszczepiać do oczyszczonej wyd^lki tłuszczowej sutka /patrz Yamg i Naind/, gdzie można je pobudzać do proliferacji i/lub wywarzana meka. Odkrycia te wskazują, że peptydy wywarzane sposobem według wynlazku są biologicznie aktywne in viro, zwiększając laktację u bydła, jeśli zostaną podane w dowolny dogodny sposób ciężarnym krowoa lub jałówkom.

Jedna z takich technik jest podana w opisie zgłoszenia patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr seryjny 837 477 z 7 rarca 1986 r.

Peptydy ^turzane sposobem według wyn lazku są zatem przydatne do poda! nia zwierzętom, zwłaszcza /lecz nie tylko/ nie ludziom, w celu zwiększania prodiukji m.eka i/hib zwiększania stosunku mięsa chudego do tłuszczu lub zawarości mięśni u zwierząt. Ola tego typu zastosowań, jeden lub większą liczbę peptydów /lub ich nietoksycznych soli/ raźna łączyć z nietoksycznym, dopuszczalnym fizjologicznie /ο10Λ]ρι lub stałym/ nośnikiem sporządzając kompozyCę. którą można podawać zwierzętom dowolną, dogodną drogą, która chroni peptyd przed rozkładem w przewdzie pokarmowym. KoιmθoicJe te można podawać zwierzętom przez iniekcje, wlewy lub inplamtację, korzystnie w ośrodku /np. zZysperglwαne w oleju lub polimerze/, co ułatwia dotarcie peptydu do komórek docelowych zwierzęcia w żądanym stężeniu. W kompozycjach tych można stosować dowlne, ułatWające pożądane działanie, proporcje nośnika do aktywnego biologicznie peptydu. Korzystne proporcje ragą być łatwo oznaczone przez specjalistów.

Wyraaane dawki będą różne, w zależności od zamierzonego konkretnego działania oraz czasu trwania traktowania. Ν,]1»ιτ1ζϊ^ skuteczną ilość lub dawkornnie dla osiągnięcia żarnie rzonego celu /np. zwiększonej produkkci męka/ raźna określić w próbach Korzyst ne dawWkotinie raże zależeć od takich czynników jak wielkość, ogólny stan zdrowia i wirunki karmienia danego zwierzęcia.

Aktywne biologicznie peptydy wkurzane sposobem według wynlazku raźna stosować w za154 336 sadnlczo czystej formie, to Jest, wolnej od innych peptydów /różnego pochodzenia/, wykazujących znaczny w>ływ na aktywność nowych peptydów. Nie jest to jednak istotne, gdyż nowe peptydy można w zadawaający sposób stosować /a w wielu przypadkach nawet korzystnie/ w mieszaninach lub innych kombiracjach z różnymi peptydam, np. z innymi zwierzęcymi czynnikami wzrostu, takimi jak bydlęcy IGF-I /lub IGF-I innych zwierząt/, czynnik wzrostu naskór ka fas?/ lub τ£ -transformujący czynnik wzrestu /TGF oC /·

Użyty w opisie termin syntetyczny w odniesieniu do DNA oznacza, że DNA ten został otrzymany dowolną techniką, inną niż naturalna replikacja w żywym organiźmie zwierzęcia. Wyyorrystując podane w opisie sekwncje nidkLeotydowe można wytarzać każdy DNA stosując różne znane techniki, np· zautomatyzowaną aparaturę do syntezy DNI, inne procedury syntezy chemcznej, cDNA lub klonowinie w mJ^or^t^i^^t^t^niśmie· Można tu stosować dowolną dogodną technikę.

Stosowany w opisie termin zawierający sekwencję /a/ nukleotydów oznacza, że w takim DNA cytowane nukLeotydy wstępują bez znajdujących się między nimi nukleotydów nie podlega jących translacji /tak zwanych intronów/. Ponieważ wstępujący w stanie naturalnym DNA dla bydlęcego IGF-II zawiera takie wstawki nie podlegających translacji nukleotydów, to DNA o sekwencjach nU01ertydnwy^ch ni® zawierających takich nie podlegających translacji nUkleotydów są w istocie syntetyczne.

TeΓmin¾asadnicyr czysty, użyty dla określenia sekwencji lub cząsteczek kwsu niudeinowego /DNA lub RNAA oznacza, że są one w zasadzie wolne od sekwennci kwasów nukleinowych, z którymi opisywane sekwencje lub cząsteczki są norimlnie związane w stanie naturalnym.

Dla celów niniejszego wynlazku, wizolowano i oyclczoco sekwencje odcinków DNA kodujących dojrzały peptyd bydlęcego IGF-II, peptydu prekursora zawierającego sekwencję lidero wą złożoną z 24 am-Uk^sów oraz 68 spośród 89 aminokwasów stanowiących rozwinięcie grupy karboksylowej /domena E/. Jak to opisano w przykładzie IV, odcinki zasadniczo czystego DNA kodujące te peptydy wyizolowano z gecomrwegr DNA nerki bydlęcej. W ^niku analizy tych odcirków otrzymano następującą sekwencję DNA i odpowiednią sekwencję aminokwasową dla białka prekursora bydlęcego IGF-II:

NH2--et-Gly--le-Prr-Met-Gly-Lyε-SeΓ-Met-Leu5'-ATG GGA ATC CCA ATG GGG AAG TCG ATG CTG Val-Leu-Leu-Thr-Phe-Leu-/ll-Phe-A la-SerGTG CTT CTC ACC TTC CTT GCC TTC GCC TCG Cys-Cys-11e-Ala-Ala-Tyr-Arg-Pro-Ser-GluTGC TGC ATT GCT GCT TAC CGC.CCG ACC GAG Ttar-Leu-Cys-Gly-Gly-Glu-Leu-Val-Asp-ThrACT CTG TGC GGC GGG GAG CTG GTG GAC ACC

Leu-Gln-Phe-Val Cys-Gly-Asp-Arg-kHy-PheCTC CAG TTT GTC TGT GGG GAC CCC CGC TTC

TyΓ-Phe-SeΓ-./Γg-Pro-Ser-Ser-A/g-Ile-/scTAC TTC AGC CGA CCA TCC AGC CGC ATA AAC

Arg-/rg-Ser-Arg-Gly-Ile-Vll-llu-llu-CysCGA CGC AGC CGT GGC ATC GTG GAA GAG TGT

Cys-Phe-Arg-Ser-Cys-Asp-Leu-Ala-Leu-LeuTGC TTC CGA AGC TGC GAC CTG GCC CTG CTG

Glu-Thr-T^-Cys-Ala-Tih-Ppo-Ala-Lys-SerGAG ACT TAC TGT GCC ACC CCC GCC AAG TCC

Glu-COOH GAG-3'

W podanym powrżej wzorze, podkreślona część seOiencJi DNA i odpowiadająca jej sekwencja aminokwasow, reprezentują dojrzały bydlęcy IGP--I, Jak to zidentyforiwcr do celów

154 336 niniejszego wnalazku. Jak widać w powyższej sekwencji białka prekursora bydlęcego IGF-II, trzy możliwe kodony sygnalne początku translacji /ATG/ są w fazie odczytu zgodnej z sekwencją DNA kodującą dojrzały byllęcy IGF-II. Przypuszcza się, że pierwszy z tych ATG stanowi operacyjny początek translacji dla prekursora bydlęcego IGF-II, ale niektóre komórki gospodarza mogą rozpozrawać jeden z alternatywnych kodonów sygnalnych początku translacji, będących w zgodnej fazie odczytu, co daje wzrost zawrtoóci prekursora bydlęcego IGF-II posiadającego alternatywną /krótszą/ sekwencję lidera. 0 ile to potrzebne, takie skrócone peptydy prekursorowe można wtrarzać w inny sposób, np. stosując syntetyczny DNA zaczynający się jednym z altematyidych, sygnalnych kodonów ATG początku translacji.

Ponadto, dzięki izolacji i sekwencjo^^mu odcinków genu, określono domenę E/rozwinięcie końca z grupą karboksylową/ dla innego prekursora dojrzałego peptydu bydlęcego IGG-II. Rozwinnęcie to i kodujący Je DNA rają następujące sekwencje:

NHg-ArgiA sp^al-Ser-Ala -Ser-T hriThr^aliLeui 5' iAGG GAR GTC TCT GCC TCT ACG ACC GTG CTT

ProiAspiAsp-Va1iThr-AlaiTyriProiVa1iGlyCCG GAC GAC GTC ACC GCA TAC CCC GTG GGC Ly8-Phe-Phe-GlnrTτytAsp-Ile-TtpILys·GlrI AAG TTC TTC CAA TAT GAC ATC TGG AAG GAG Ser-ThriG ln-Arg-LeuIArgIArg-GltILeu-PtOI TCC ACC CAG GCC CTG CGG AGG GGC CTG CCC AlrIPheILeuIArg-AlrIArgIArgIGltIArgIThΓI GCC TTC CTG CGA GCA GGG GCC GGT CGC ACG Leu-A la ^Lys iG lu-LeuG lu-Ala -Leu-ArgG lui CTG GCC AAG GAG CTG GAC GCC TCT AGA GAG AlrILys-Ser·His-Hi8-Pro-LeI-IIeCOH GCC AAG AGT CAC CAT CCC CTG ATG-3·

Ota-ycie i izolacja sekwencji DNA dla bydlęcego IGF-II mi znaczenie nie tylko dlatego, że umoożiwia weryfikację oznaczonej sek^^r^^c^:i rmirokw^owej oczyszczonego bydlęcego IGF-II, lecz rówiież dlatego, że ^oiSlLwla oznaczenie sekwenrCi DNA i odpowiteinich sekwenrJi am.nokwasowych dla peptydu liderowego bydlęcego IGF-II oraz rozwinięcia przy końcowej grupie karboksylowej peptydu /domeny E/. Poza tym, nowe sekwencje DNA dają specjalistom mooliwość identyfikacji, ^izolowania i/lub wywarzenia innych białek prekursorowych bydlęcego IGF-II i/lub biologicznie aktywnych ich fragmentów, łącznie z innymi pept^dami jącymi aktywność podobną do aktywności bydlęcego IGG-II lecz nie ograniczają się do nich. Aktywność bio logiczna tych peptydów, ich fragmentów i produktów je zawierających może obejimwać aktywność zwiększającą wrost i/lub laktację, znamienną dla bydlęcego IGF-II, lecz nie ogranicza się do tej aktyw-mści. Może ona być oznaczana metodą podaną w opisie lub inną metodą in vitro i/lub in vivo. Te aktywne biologicznie fragmenty i produkty nazwane są w riniejztmm opisie białkami pochodzącymi z genu IGF-ϋ i obejmując peptydy, które przynajmniej częściowo są kodowane przez DNA, jego wrianty alleUczne i/lub DNA, który hybrydiysuje z DNA.

Takie białka pochodzące z genu IGF-II, jako otrzymane z zrstooowrriem DNA lub jego wirimtów, wchodzą w zakres wynlazku.

Sekwencje DNA i geny według wnnlazku umooSiwiają obecnie specjalisoom barriziej efektywne badanie i/lub kontrolę biosyntezy IGF-II i regij^i^c^.ji biologicznych. Sekwenctje DNA można ponadto stosować do identyfikacji i izolacji innych sekwencji DNA dla IGF, genów IG- i białek pochodzących z genu IG- u innych gatunków zwierząt, takich jak IG- owczy, kozi, świński i ptasi, w których ^stępuje ^starczająca homoor^igia seCwenrJi DNA i/lub peptydu.

Wytrytie wpomTanej powyej sekwen^^ sygralnej /Uderowej/ umoiiwia skonstrurownie wektorów DNA do prod^c,)! peptydów podobnych do IGF-II w komórkach eukariotycznych /np. w komórkach ssaków i w drożdżach/ zdolnych do rozpoznania i usunięcia sekw^nj sygralnej.

154 336 albo do produkcji w organizmach gospodarzy prokariotycznych, takich jak balrterie, peptydów prekursorowych bydlęcego IGF-II, zawierających peptyd sygnalny i/lub domenę E.

Korzystnym sposobem w^wrzania syntetycznych peptydów jest technologia rekombimiaci DNA z zastosowaniem komórek gospodarza takich jak bakterie /np. E.coli/ lub komórek eukariotycznych, takich jak drożdże. Można dokonywać moddfilkcji tych sekwncji DNA, wpływjąc na ich wddjność przy wytwrzaniu peptydów w żądanej komórce gospodarza. Moodyikacje takie obejmują /lecz nie ograniczają się do nich/ podstawienie kodonu preferowanego przez organizm gospodarza, kor^trukcję DNA kodującego białka fuzyjne, w tym peptyd według ^nalazku, podstawienie kodonów dla eliminacji lub wzmoenia cech strukturalnych informacyjnego DNA w>ływjących na ich translację oraz inne modyffteicje ulepszające produkcję tych peptydów w wybranej koi^rce gospodarza.

Tak ^tworzone peptydy, które ^kziją aktywność biologiczną oczyszczonego bydlęcego IGF-II w znaczącej mierze, rależy rozpatrywać jako równowaniki peptydów wtwrzanych spo sobem według ^ralazku.

Wyraaazek ilustrują poniższe przykłady.

Przykład I. Jak opisano w tym przykładzie, pełny skład cmicdkwtdwy /AA/ i sekwencję bydlęcego IGF-II oznacza się posługując się peptydem wyizolowanym i oczyszczonym z surowicy dorosłego bydła, otrymanym z Sigma Chemicaas Co./St.Louis,Mo/.

Częściowo oczyszczone frakcje takiego bydlęcego IGF-II otrzymuje się stosując komminację technik izolacji opisanych przez Swoboda^ i wsp. oraz Zuimteina i wsp. Cłkowite oczyszczenie bydlęcego IGF-II do stanu zasadniczo wolnego od innych peptydów bydlęcych uzyskuje się stosując wysokosprawną chroimaoggaaię cieczową z odwóconymi fazami /HPLC.

Wssyytkie operacje ΗΡΙΓ prowdzi się z zcttodownieo kwsu trójfCdOdoocdowego /TFA/ i aceton^r-ylu. Rozpuszczani^ dostarcza się na kolumnę z szybkością 2 ml/minutę stosując system pomp PerkCn-Eloer /Horwlk, Conn./, serie 4 HPLC, a peptyd uwidacznia się stosując detektor Hewwett Packard /Greenly, Conn./ 1040A UV/VIS. Wstyrtkie operacje chromatograficzne prowdzi się w temperaturze otoczenia /23-28°c/.

Bydlęcy IGF-II stosowny do wstępnego oznaczania sekwencci przygotowuje się stosując kolumnę Chromega fludaddecyl o wmiarach 4,1 x 250 mm /E.S.Industriet, Marton, N.J./. Bydlęcy IGF-II eluuje się z kolumny Chromega w υπόο-τ! gradiencie stężenia acetonitrylu 15-50# /objętościowo/, w czasie 35 minut, utrzymując 40 mM stężenie T-A. Próbki bydlęcego IGF-II stosowne do całkowitej weryfikacji struktury przygotowuje się stosując kolumnę Nucceosil C-18 o w/mirach 4,1 x 250 mm /Altech Associated, Deerfield, IL/. Układem rozpuszczalników ttodownym do rozdziału na kolumnie jest linóowy gradient acetonitarlu 30-35# /objętościowo/, w czasie 15 minut, przy stałym stężeniu T-A równym 20 mM. Aktywny bydlęcy IGF-II identyfikuje się stosując próbę radCdreaeptorów łożyska szczura opisaną przez Daughadcrc i wsp. Próba ta pozwla również na oznaczenie ilości bydlęcego IGF-II w końcowych próbkach.

Oczyszczony metodą HPLC bydlęcy IGF-II poddaje się aradzie teiwencai aminokwasów /AA/ metodami opisanymi przez HuuCiCj-ilera i wsp. /1983 a i b/, stosując aparat do sekweccjdcdwacic białek, model 470 A fr^my Applied Bidtyttems, Inc. /-oster City, CA/. Skrótowo, 2,5 mcowIc oczyszczonego metodą HPLC bydlęcego IGF-II liofilzzuje się i analizuje w aparacie do teiwencjonownia białek, stosując reakcję degi^i^t^s^k^^ji Edmua polegającą cc deaywCy;ycai aminokwisu z końcową grupą aminową odczynnikiem, następnym odszczepieniu tego amicoiwsc i jego ostatezcn;m uwidnieciu w postaci jego pochodnej fenylotiohydactoicdwej /PTH/.

Ponieważ nie jest modliwr okreslenie całkowitej struktury peptydu poprzez N-terminalną airalizę seiwencai, przygotowuje się pochodną oczyszczonego IGF-II i hydrcoizuje się Ją enzymrtycznie stosując następującą procedurę: Próbkę 75 mg bydlęcego IGF-II po oczyszczeniu utlenia się kwasem cadmΓÓwkdwym, stosując do decatιcricji metodę Hirsa, przeprowadzając grupy sulhydaylowe w reszty kwasu cysternowego. Peptyd rozpuszcza się w 50 m. 88#

154 336 kwasu mrówkowego /Fisher Scientific, Spriifield, w/ i roztwór oziębia się do temperatury 0°C. Po godzinie utrzymywania w temperaturze pokojowej do roztworu peptydu dodaje się 5 ml odczynnika kwasu nadmrówkowego /0,5 ml 30% Η₂^Λί^1ιοο Sciennific/ w 9,5 m. 88% kwasu mrówkowego/. Otrzymaną mieszaninę utrzymuje się w temperaturze 10°C, śledząc przebieg reakcji z zastosowaniem drugiej procedury HPLC z odwróconymi fazami. Po zakończeniu reakcji /po 45 minutach/ do mieszaniny dodaje się 4 m. wody i usuwa się reagenty pod zmniejszonym ciśnieniem stosując wyparkę Speed Vac Concennrator /Sayant Instruments, Farminiaae, OT/.

Pozostałość po usun.ęciu rozpuszczalnika rozpuszcza się w 1 M NaHCOj zawierającym 1 mM CaCl₂ /obydwa odczynniki firmy Fisher Sciennific/. Hyddooizę enzymtyczną rozpoczyna się przez dodanie 2 m. roztworu 0,1 M HCC/ 2 nM CaCl₂ zawierającego 8 i^/ml oC -chymotrypsyny /Sigma Chemicals Co/. /16 mg białka;/. Po 45 m.nutach utrzymywania w temperaturze pokojowej chymotrypsynę usuwa się stosując aparat do ultrawirowania Cen^icon-W /Amicon Corp., Danyers. mA. Przesącz /hydrolizat chymotrypsynowy O-IGF-Il/ poddaje się chromatografi z odwróconymi fazami na kolniie Hucciosil w określonym powyżej rozpuszczalniku 20 mM TFA/ acetonitryl. Kldownie kolumny Umownym gradientem acetom/trylu 10-7% /objętościowo/ w czasie 30 minut rozdziela hydrroizat na 10 większych pików zawierających peptydy.

AraUzę sekwannC! prowadzi się w sposób opisany powyżej w stracie do sekwencjonowania Mooel 470 A Soąuelnceo w połączeniu z analizatorem Mooel 120A PTH Arnlyzer firny Applied BioSystems Inc.

Analiza peptydów z trzech wyizolowanych pików że dwa z nich zawierają aminokwasy wymig^ane do całkowitego wyjaśnienia pieiwszorzędowej struktury bydlęcego IFF-II.

W tabeli 1 przedstawione są wynnki N-toomi]talcej analizy sekwencji raatriału z pików z kolumny HPLC łącznie z publikowanymi sekwencjami ludzkiego i szazcosoiOiO IFF-II.

Reszty 1-43 w bydlęcym IFF-II oznacza się N-terminalną nnlćzą sokwencai oczyszczonego bydlęcego IFF-II. Reszty 37-59 i 60-67 oznacza się przez N-terminalną unlizę sekwencji dw^ch oddzielnych fragmentów po hydaoSizie ahygoSr;ypsyną. Zawartość wolową kwsu cysteinowego w peptydach oznacza się stosując opisaną przez torsem 1 wsp. przea-koCwnlową aralizę aminokwasów z użyciem soto-ftalaadehyau. Jak to przedstawia tablica 1, wykazano trzy różnice między sekwencjami pochodzenia bydlęcego i ludzkiego oraz trzy różnice mędzy sekwencjami pochodzenia bydlęcego 1 szczurzego.

Tabela 1

Sekwencja aminokwasow bydlęcego IFF-II

10 15

Bydlęcy NH2-Ala-Tyr-Arg-Pos-SoΓFlc-Thr-Leu-Cyε-Fly-Fly-Flc-Lou-Val-Aip-Thr-Leu-Flc-PheLud zki NH2-All-Tyo-Aog-Pro-SoΓFlu-Thr-Lou-Cys-Fly-Gly-Flu-Leu-Val-Asp-T'ho-Leu-Flc-PheSzczurzy NH2-All-Tyr-Arg-Prs-Soo-Flu-Tho‘·LeucCyyiGly-<ϊly-;lc-Lec-Val-Aip-ThΓ-Loc-Fln-Phe20 25 30 x 35 x x

Bydlęcy Val-Cys-Gly-Asp-AΓg-Gly-Phe-TτΓoPheoSeΓ-AΓg-PΓO-SeΓ-Soo -Aoi-IOe-Acn-Arg-AΓgLudzki Yal-Cys-Gly-Asp-Arg-Gly-Phe-Tyr-Phe-Ser-Arg-Pro-Ala-Ser -ΑΓ2-ν3ΐ-3ε--ΑΓ£-ΑΓ£Szczurzy Val-Cys-SoΓ-Asp-Ari-Fly-Pho-Tyr-Phe-Ser-Arg-Pro-Ser-Fly/SeΓ-Arg-Ala-Asn-Arg-Aog40 45 50 55

Bydlęcy Seo-AΓg-Fly-IOe-Va-FϊCuFϊCuCyysCys-Phe-Aog-SerCys-Asp-Leu-Ala-Leu-Lec-Flc-ThΓLud zki Soo-AΓi-Fly-Ile-Va-^3CuFlCudysCys-Phe-AΓg-SerCys-Asp-Leu-Ala-Leu-Leu-Flc-ThΓSzczurzy Soo-AΓi-Fly-I0-vVa-FϊCuF3CuCyysCys-Phe-AΓg-SeΓC:ys-Asp-Leu-Ala-Leu-Leu-Flc-Thr60 65

Bydlęcy Tyr-Cyi-AlaT^,^r·-Ps--Ala-Lys-S-r-Glu-OOOH

Ludzki Tyr-Cys-Ala-Thr-rro-Ala-Lys-Ser-G-uOOOH

Szczurzy -yr-Uys-Ala-Thr-rro-Ala-Lys-S-r-F-uCOOH

Oznaczone x reszty lgCcsiwaiswe bydlęcego IFF-II różnią się od odpowiednich reszt w ludzkim ICF-II

Podkreślone reszty lgCcoiwlsoiO w bydlęcym IFF-II różnią się od odpowiednich reszt w IFF-II szczura

154 336

Przykład II.W przykładzie tym przedstawiona jest aktywność bydlęcego IGF-II w próbie proliferacji zarodkowych komórek mięśniowych /mioblastów/ L6 szczura. Dla wykazania aktywności fizjologicznej, w próbie tej porównano Matriał z piku HPLC z przykładu I z han· dlo«m preparatem ludzkiego IGF-I dostarczonego przez Arngen Inc. /Thousand Oaks, CA/.

Mioblasty L6 szczura opisane przez Yaffee'ego stosuje się w sposób opisany przez Kottsa. Wssysskie inkutecje prowdzi się w temperaturze 37°C, w atmosferze 10% COg, przy 100% wilgotności. Do liczenia komórek stosuje się licznik Coulter Cowiter /««olei ZMi «possażony w analizator C-1000 Chamieeyzer /Coulter Electronics, Hialeah, FL/. Hcolowle podstawowe utrzymuje się w minimalnym podłożu podstawowym, DiuLbecc^a Minimum Essential Medium /DMEM/ firny GIBCO, Grand Island N.Y, zawierającym 1Q% /objętościowo/ surowicy płodów cielęcych ^/^^^^*ka FCS/ i rutynowo ^posiewa si^ę na ^pł^ytki w stężeniu 12⁰⁰ komórek/cm? l.u^{b 600 kom}órek/cm , po czym «koruje się pasażownie hodowli odpowiednio po 3 lub 4 dniach. Pasażowanie prowdzi się dodając 3 M 0,0% /wagowlOotjjtościowo/ roztworu trypsyny /GIBCO/ w buforze do przemywnia o składzie: 0,8% /wg./obj./ NaCl, 0,04% /wg./obj./ KC1, 0,1% /wg./ obj./ glikozy, 0,05% /wg./obj./ NaHCO-j, 0,0% /wag./obj.EDIT/, /pH 7,4/ i utrzyraywnie przez 5 minut i temperaturze 37°C. Działanie trypsyny zatrzymuje się przez dotknie 7 M pożywki FCS.

Hodowle testowe sporządza się następująco: Hodowle podstawowe podtkje się działaniu trypsyny, puLuje się i liczy komórki i otrzymanej zawiesinie. W oparciu o ten pomiar,zawiesinę komórek rozcieńcza się do odpowiedniego stężenia i pożywce FCS i szybko posiewa p p się i kolbach o powierzchni 25 cm z gęstością optyczną 6Xil cm. Po 24 godzinach od posiewu usuwa się podłoże^ komórki przemywa się podłożem DMEM wolnym od suroW,cy. Do każdej kolby doda je się następnie podłoże testowe /4 M.I i prowdzi się inkubację w czasie następnych 24 godzin. Po tym czasie podłoże hodowli zastępuje się świeżym podłożem testowym. Hodowle Inkubuje się przez dalsze 48 godzin i liczy ilość komórek.

Do liczenia usuwa się podłoże testowe, komórki spłukuje się ilością 2 ml buforu do przemywana, dodaje się 1 M roztworu trypsyny i komórki inkubuje się przez 5 minut i temperaturze 37°C. Reakcję zatrzymuje się przez dodanie 3 mL zimnej pożyWsi FCS. Kolby potrzą sa się 10 razy dla ułatwienia usunięcia komórek i odwraca do pozycji pionowej w łaźni z lodem, do czasu aż ich zawrtość będzie mogła być przeniesiona do próbówek szklanych na lodzie. Każdą kolbę spłukuje się ilością 2-3 ml zimnego 0,5% /wg./obj./ roztworu NaCl i dodaje się do zawiesiny komórek. Każdą probówkę łagodnie się «.ruje 5 razy aby «eliminować zbrylanie się komórek, po czym zawirtość każdej próbóiki poddaje się liczeniu w liczniku Coulter C^i^r^nter.

Podłoża testowe do użycia i hodowlach testowych sporządza się przez rozcieńczenie próbki testowej do żądanego stężenia 2% /obj./obj./ pożywką FCS. ^^of^iżow^^ny mttriał z piku HPLC z przykładu I rozpuszcza się i 30 WM Tris HC1 o pH 7,4 /bufor Tris/ do określonego stężenia 2,6 //aM. W teście 1, ilość 0,2 ml tego roztworu dodaje się do 19,8 M 2% FCS /stężenie końcowe równe 26 im/, sterylizuje się przez filtrację na filtrze o średnicy porów 0,22 /a /Millipore Corp., Bedford, Maas./ i stosuje do hodowli eksperymennalnych. Dla porównania przygotowuje się próbkę kontrolną zawierającą 0,2 ML buforu Tris.

W teście 2, ilość 0,2 ml roztworu matriału z HPLC dodaje się do 9,8 ml 2%/obj./obj./ FCS /oznaczone stężenie końcowe równe 52 im/, filtruje jak poprzednio i stosuje się do hodowli eksperymennalnych. Podobnie przygotowuje się próbkę kontrolną zawierającą bufor Tris.

Pozytywną kontrolę dla każdego traktowania stanowi ludzki IGF-I w stężeniu 10 Z/mgen Biologicals, Thousand Oaks, CA/, patrz Koots i wsp., IGF-I rozcieńcza się 44 mM roztworem NaHCO-j /pH 7.4/ do stężenia 100 yus/M. Roztwór podstawowy o stężeniu 10-¾ sporządza się przez dodanie 0,015 ml IGF-I do 20 ml 2% /objętościowo/ pod-9 łoża FCS. Dla otrzymania roztworu o stężeniu 10 M, 2 ml tego roztworu do to je się do 18 ml 2% pożywki FCS, sterylizuje przez filtrację i stosuje do hodowli eksperymennalnych.

154 336

Kontrolę dla tych hodowli stanowi 2% /objętościowo/ pożywka FCS.

V teście 3, matriał piku z HPLC z przykładu I rozpuszcza się w 20% kwasie octowym do ustalonego stężenia 165 /uM. Przygotowuje się dwa roztwory podstawowe podłoża. Roztwór podstawowy o stężeniu O5 yuM sporządza się przez dodanie 0,091 ml /* roztworu do 30 m. 2% pożywki FCS. fH doprowadza się do wartości 7,4 dodając 60 yuM 10% NaOH. Roztwór podstawowy o stężeniu 0,1 /uM sporządza się dotując 0,018 m. 165 yuM roztworu do 30 mL 2% podłoża FCS. pH doprowadza się do wartości 7,4 przez dodanie 10 yu. 10% NaOH. Tak przygotowane roztwory podstawowe podłuż sterylizuje się przez filtrację i stosuje do przygotowania rozcieńczeń seryjnych /1:10, objętościowa/. Dla sporządzenia każdego rozcieńczenia seryjnego 3 mL odpowiedniego roztworu dodaje się do 27 m. 2% pożywki FCS. Przygotowuje się 4 próbki kontrolne. Próbka kontrolna A zawiera 0,091 m. 20% kwasu octowego-w 30 m. 2% pożywce PCS; pH doprowadza się do wrtości 7,4 dodając 60 yul 10% NaOH. Próbka kontrolna B zawiera 0,018 m. 20% kwasu octowego w 30 ml 2% pożywki FCS; pH doprowadza się do wrtości 7,4 dodając 10 yuL 10% NaOH, Próbka kontro.^na C zawiera 3 m. próbki kontrolnej A i 27 mL 2% pożywki FCS. Próbka kof^ro.^na D zawiera 30 ml 2% pożywki FCS. Próbkę kontrolną A stosuje się w teście o stężeniu 500 nM bydlęcego IGF-II, próbkę kontrolą B stosuje się w teście o stężeniu 100 nM bydlęcego IGFf-I, próbkę kontrolną C stosuje się w teście o stężeniu 50 nM bydlęcego IGF--II, a próbkę kontrolną D stosuje się w testach o stężeniach bydlęcego IGF-II równych 10 nM, nM, lNm, 0,5 nM i OH nM.

Jak to przedstawiają tabele 2a i 2b w testowanych stężeniach bydlęcy IGF-II w znaczący sposób stymuluje proliferację mioblastów L6.

Tabela 2a Test l/komórek/cm²)

Traktowanie	i Bydęcy IGF-II i 6rednia ' Ochylenie ' . a ' i standardowe J stężenie J j 1 1 1
Bufor Tris	i 1 ł	11508	11778	Γ	11643		♦ 135	»
Bydlęcy IG^-II	i i 26 nM	13401	12953		13177	1	±224
	L ..			. u		.. .		4
Ludzki IGF*I	1 1 1 nM	15519	15752		15635		±116
	.. L . .			Ł.		J
	i							I
2%owa pożywka FCS	1 1	12313	12691		12502	1	+ 189
		Test	2					” 1
						J
B^^or Tris	ł		8301		—	1 1	—-
	1							4
Bydlęcy IGF-II	1 ! 52 nM		10156		—	ł 1 t	—
				. _L_				__4
Ludzki IGF-I	_ ______ i ! 1 Nm	10869	11004	1	10731 10863	- I I I	+79
	Ł					I
	r			t		i
2%-owa pożywka		8930	9676	1	9109 9252	t	+121
FCS	i			1		I
	___I_______			1		I

154 336

Tabela 2b Test 3fkomórek/cm2)

Traktownie

Stężenie /a średnia

Oichylenie standardowe

Kontrola A

Bydlęcy IGF-II

Konnrola B

500 nM

6391

6306

6039

6245

Bydlęcy IGF-II

100 nM

Konnrola C

Bydlęcy IGF-II

Kontrola D Bydlęcy IGF-II

Ludzki IGF-I

11401

6558

11223

10948

11191

6558

-414037

8138

13505

13905

13816

8383

8276

8266 nM nM nM nM

0,5 nM

0,1 nM nM lO nM

12374

9596

12175

11414

9916

8739

8754

11419

13676

11781

8836

11630

11239

9380

9135

8885

10653

13335

12488

8338

11348

10871

9420

9030

8697

10857

13926

12214

8923

11718

11175

9572

8968

8779

10976

13646

150

186

226

100

310

517

343

226

244

167

324

242 a/ oznaczone metodą radioimmuioOogiczną lub w obszarze poi pikiem HPLC

Przykład III. Niniejszy przykład w&iziUie zdolność bydlęcego IGF-II do stymulowania proliferacji komórek nabłonkowych sutka bydlęcego. K^rnketr^ne, testuje się zdolność do stymulownia tej proliferacji bydlęcego IGF-II oczyszczonego w sposób opisany w przykładzie I, w układzie hodowli w żelu kolagenowym.

Tkankę sutka pochodzącą od 150-200-dniowych ciężarnych niemlecznych krów rasy Holstein pobiera się z uboju. Tkankę tę sieka się i umieszcza w kolbie Erlenmeyera z wyżłobieniami o pojemności 500 ml zawierającej: 0,1% /wg./obj./ kolagenazy /Batch 103-586; Boehringer Mrrnheim, Indiarnpoois, Ind./, 0,% /waa·/o^./ hialuronidazy /typ 1, Sigma Chemical Ct^/ oraz 5% /objętościowo/ surowicy płodów bydlęcych /FBS/ w podłożu Medium 199 /obydw odczynniki z firmy GIBCOO. Na 5 g tkanki stosuje się 90 m całkowitego roztworu. Dyspergujący roztwór wiruje się w wirującej łaźni wodnej z szybkością 60 obrotów na minutę w temperaturze 35°C przez 4 do 5 godzin dopóki większość bryłek nie zostanie zdyspegowanych. Dla uniknięcia dużych fragmentów, zdyspergowaną tkankę zmieszaną z 0,0% /wa./otbi./ D.’iA-zy, dezoksyryblntkleazy I /Sigma Chemical COo/ filtruje się przez tkaninę Nitex /o w^mi^arach 153 yum, Tetko Co., Elmsford, N.Y./. Niestrglilnt bryłki zbiera się, ponowiie zawiesza w 0,0% /wgi/obb./ roztworze prnszy /Calbiochem-Behring Coit·, LJoHa, Ct^f i wiruje z szybkością 40 obrotów na minutę w temperaturze 35°C przez dodatkowe 15 mimit. Następnie ponownie filtruje się tkankę sutka, zbiera ją przez wirownie, przemywa podłożem Medium 199 i przechowuje na lo14

154 336 dzie do rozdziału w gradiencie gęstości.

Po dysocjacji. enzymaycznej fragmenty sutka ponownie zawiesza się w 1 ml 0,02# DIRAzy i nawwrstwia na wstępnie uformowany gradient odczynnika Percoll /Pharmacia Fine Chemiiaas, Piscataway, N.Y./ w sposób opisany przez Richards'a i wsp. W skrócie, 30 i. 42# odczynnika Percoll wiruje się z szybkoócią 20000 g przez godzinę dla uzyskania ciągłego gradientu. Na wierzchu umieszcza się warstwę około 3 x 10 ' komórek i wiruje przez 10 imit z szybkością 800 g. Z wrstwy gradientu o gęstości 1,065 do 1,070 g/ϋ zbiera się organoidy nabłonka. Przed założeniem hodowli dokonije się obliczenia liczby komórek przez zmieszanie Jednej objętości zawiesiny komórek z dziewięcioma objętośchimi 0,2# /objętościowo/ fioletu krystalicznego w 0,1 M kwaie cytrynowym. Zabarwione jądra liczy się w hemooctometrze.

Podstawowe techniki dla układów hodowli w żelu kolagenowym zostały opisane przez Yanga i Nnni'ego. 2el kolagenowy przygotowuje się w sposób opisany przez Micłalopoiuiosa i wsp. z niewielką moddyikacją /Richards i «p./. Skrótowo, ilość 4 g steiylioiwnych włókienek kolagenowych z ogona szczura /głównie typ i/ rozpuszcza się w litrze sterylnego 0,017 M kwsu octowego w tem>eraturze 4°C w czasie 48 godzin. Po wirowaniu z szybkością 10000 g przez 60 m.nut zbiera się supernatant, który służy Jako podstawowy roztwór kolagenu. Każdą porcję kolagenu miareczkuje się obdUelnie do pR 7,4, stosując roztwory 10 x Medium 199 /bez dwuwglanu/ /GIBCO/ i 0,34 N NaOR w stosunku 2:1.

Dla celów hodowli komórek w kolagenowej substancji podstawowej zobojętnioną mieszaninę kolagenową utrzymuje się na lodzie aby zapobiec żelowniu. DotUje się następnie organoidy nabłonka w m.r^i.marn!j objętości /0,5 m./ Medium 199 otrzymując stężenie końcowe 4 - 6 x 10komórek/m mieszaniny żelującej. Zawiesinę kolagenowo-komórkową /0,5 θ' nawarstwia się na ilość 0,3 m. wstępnie zżelownego kolagenu w każdym wgłębieniu płytki o 24 wgłębieniach /Costar, Carnmridge, Mas.,/ i pozostawia do zżelownia w temperaturze pokojowej. Po zżelowaniu tej wrstwy hodowle zasila się ilością 0,5 ml mieszaniny pożywki Du^ecGO^ MoUfied Eagle /DM/ i Rams F-12 /D)ffi/F-12/ /GIBCO/ w stosunku /1:1/ plus 3# /objętościowo/ —BS, 10 ng/m mysiego czynnika wzrostu naskórka //GF/ /Collaboratiwe Research, Inc. Waltham, Mas·/ antybiotykami /GIBCO/ i odpowiednim, tesonaanym czynnikiem wzrostu. Hodowle inkubuje się w temperaturze 37°C w atmosferze 95# powietrza i 5# CO£ zmieniając podłoże hodowU co drugi dzień.

Jak przedstawiono w tabeli 3a i 3b, zdolność bydlęcego IGF-II do stymulownia komórek nabłonkowych sutka bydlęcego w próbie na żelu kolagenowym badano w potrójnym układzie w szerokim zakresie stężeń. Jednocześnie prowdzono ujemną kontrolę proliferacji na podłożu Basal Medium zawierającymi^^/--^ plus 35# /wg./obj./, -CS plus /GF /10 ng/ml/ oraz dodatnią kontrolę proliferacji z insuliną w różnych pomaiizjoLolicztsch stężeniach. Jak to przedstawia tablica 3a, bydlęcy IGF-ΙΙ stymuluje proliferację komórek nabłonkowych sutka bydlęcego na poziomie statystycznie znaczącym w stężeniach w zakresie od około 30 nM do około 100 nM.

Tabela 3a Test 1

! Traktownie	1	Stężenie	Ί—------------------------— tILość kooirit/wolłbrenie /χίΟμ	T 1 1	I Odchylenie j standardowe i 1 1	# wzrostu 1 w stosunku do kontroli J
1 1 -L	średnia
! I	1 1	2		i		3		t	4		5 i
J Bydlęcy IGF-II	1	0,1	nM	; 29,5	28,8	19,9	26,1	1 1	5,4
[ _t-	1 1	1,0	nM	i 30,1	24,4	29,4	27,9	t	3,1		— !
• -	1	3,3	nM	! 29,0	22,4	18,6	23,3	1 1	5,3		— !
| _«» _	1 1	10,0	nK	! 35,6	41,3	38,4	38,4	1	2,9		30,2 !
' -W -	1 »	33,0	nM	t 42,2	46,4	—	44,3	1	2,9		50,2 ;
1 _n -	1 1 I .u	100 nM	J 57,8 1	57,1	58,7	57,8	! 1 -L	0,8		95,9 !

154 336

Tabela 3a /c.d./

1	.---4__ 1 1	2		T			3		1 1	4		5
	—— -f- ·			“t· ·
Insulina	1 1	17,0	nM		31,5	35,9	34,7	34,1	1 1	2,3	t I	15,6
— H —	1 I	170,0	nM		51.2	45,4	57,4	51,4	1 «	6,0	1 1 |	74,2
-W -.	1 1 1	1700,0	Nm		38,7	56,9	68,5	54,7	1 1 1	15,0	1 1 1 ———U—.	85,4
a/ Kontrola	1 ł 1 1				29,4	29,7	—	29,5	1 ł 1 1 ._L—	0,25	1 1 1 9 ...u..	—

a/ podłoże podstawowe

W teście 2, maer^i^it z piku HPLC z przykładu I rozpuszcza się w 20% kwaie octowym w okreśoonym stężeniu 165 P ⁱ bezpośrednio dotdaje się do tego samego podłoża Bisal Medium przygotowując dwa roztwory podstawowe. Roztwór podstawowy 1 zawiera 33,6 yul roztworu bydlęcego IGF-II plus 11,1 m podłoża Basal Media /stężenie końcowe bydlęcego IGF-II równe 500 nM/. Roztwór podstawowy 2 zawiera 6,7 yil roztworu bydlęcego IGF-II oraz 11,1 m. podłoża Basel Media /stężenie końcowe bydlęcego IGG-II równe 100 nM/. Z roztworów tych wykonuje się rozcieńczenia seryjne i prowdzi się testy w zakresie stężeń od 0,1 nM do 100 nM. Podłoża kontrolne składają się z podłoża Basal Medium oraz, ewentualnie z odpowiedniej objętości kwsu octowego /odpowiednia kontrola jest potrzebna tam, gdzie dodanie czynnika wrostu obniża pH tesoowego podłoża/. Wszystkie podłoża doprowadza się do odczynu obojętnego przez dodanie 10% NaOH.

Tabela 3b Test 2

Stężenie IGF-II

Kontrola ^a, Ilo^ść tomóóe^/głłbienie AdLO^/

Odchyleniw standardowe % wzrostu w stosirnku do

	1 1 1		1 1				Średnia	1 ł		1 1 . 1	konnroli
100 nM	1 1	2	ł ł	37,9	43	34,8	38,6	ł 1 |	4,1	1 ł l	94,(%
50 nM	1 1	3	ł ł	35,9	38,9	37,9	37,5	ł ł	1.5	ł ł	76,1%
10 nM	1 1 1	1	1 1 ł	33,8	39,9	38,9	37,5	1 ł ł	3,3	ł 1	30,1%
5 nM	1 ł	1	ł ł	34,8	29,8	39,9	34,8	I ł	5,1	ł ł |	21,W
1 nM	1 1 1	1	ł 1	33,8	33,8	35.9	34,5	ł ł	1.2	ł 1	20,%
0,5 nM	ł t	1	ł ł |	22,7	25,7	30,8	26,4	ł ł ł	4,1	1 ł ł	—
0,1 nM	1 1	1	ł ł	26,7	29,8	—	28,2	i 1 -i.-	2.1	ł ł J	—
Próby kontrolne		ł i ł					ł ł t		1 ł ł
1			1 ł	29,8	31,8	24,7	28,7	ł 1	3,7	ł ł	--
2			1 ł 1	21,6	18,6	19,6	19,9	ł ł	1,6	ł ł	—
3			ł ł	19,6	24,7	19,6	21.3	ł ł	2,9	1 1	—

a/ odpowiednie próby kontrolne = podłoże podstawowe Basal Medium = podłoże podstawowe + 33,6 /ul 20 procentowego kw^su octowego; pH doprowdzone do wrtości 7,4 10 procentowy® NaOH = podłoże podstawowe + 6,7 /ul 20 procentowego kwsu octowego; pH doprowdzone do wrtości 7,4 10 procentwwym NaOH.

Przykład IV. Enzymy restrykcyjne i mooyfikujące DNA stosowane w operacjach opisanych w tym przykładzie pochodzą z frrmy New England Biolabs /Beverly, MA. Za ^Jątki^m przypadków, które są specjalnie zaznaczone, w etapach klonowania i sek^^ncjono^nia stosuje się opisane i/lub cytowane przez Maniatiza i wsp. /Manitts/ standardowe metody biologii mooekularnej.

Genomow DNA izoluje się z nerki cielęcej w sposób opisany przez Manaais'a, strony 280-281. Sondy DNA stosowane w analizie genomów Stutheeia i w opisanym poniżej skr^^ngu banku genomów bydlęcych izoluje się w sposób następujący: Klon cDNA dla ludzkiego IGF-II o ro16

154 336 dzaju struktury opisanym przez Bella i wsp. oraz Dulla i wsp. otrzymuje się Jako fragment Eco RI o wielkości 1,7 kilopar zasad zawierający cDNA przedstawiony schemaycznie na figurze 1, klonowany do wektora plazmidowego pUC18. Insert DMA oczyszcza się od sekwencji wektora przez trawienie enzymem restrykcynnym Eco RI i następnie frakcjonuje pod względem wielkości na drodze elektroforezy w 0,% /wg./obj./ agarozie /Manćiai^, strona 150-161/.

DNA barwi się bromkiem etidium /1 yug/m./, uwidacznia w śwetle UV o dłuższym zakresie fal i ^cina się pasmo zawierające fragment o wielkości 1,7 kilopar zasad. DNA wyodrębnia się przez lleCtrd>eiuownnil /tea^^ai^, strona 164/ i następnie oczyszcza na kolumnach z eluowaniem od wierzchołka kolumny /typ elutip/ dostarczanych przez fiimę SckLeicher and Sclhiell, Keene, MH// w sposób zalecany przez dostawcę. Ten fragment o długości 1,7 kilopar zasad trawi się następnie enzymem Rsa I Otrzymując odcinki przedstawione scheMa/oznie na fibrze 1. Każdy z tych odcinków oczyszcza się w sposób opisany powyżej dla fragmentu o długości 1,7 kilopar zasad. /Maanaais, str. 150-164/.

Uraża się, że odcinki o długości 340 i 515 per zasad zawierają całą sekwencję kodującą ludzki pre-peptyd IGF-II. Moinki te stosuje się w analizie genomów Southern'a i w skriningu banku genomów bydlęcych, tak jak opisano poniżej.

-igura 1

Eco R1 Rsa I Rsa I Eco R1

340 bp 515 bp 800 bp

5' i /_/_/ 3' ludzki IGG-II

Domeny B,C,A D,E 3' nie podlegające translacji

W oparciu o opisane przez DJ.la i w8p. regiony A i B ludzkiego IGF-II skonstruowano dwa syntetyczne oligomery, oznaczone odpowiednio jako IGF-IIA i IGF-IIb, przedstawione na figurze 2.

IGF-IIA

48

49

50

-igura 2

58

51

52

53

54

55

56

57

amino- kwasy:

Phe

Arg

Ser

Cys

Asp

Leu

Ala

Leu

Leu

Glu

Thr

ludzki 5'

TTC

CGC

AGC

TGT

GAC

CTG

CCC

CTC

CTG

GAG

ACG

3'

sonda 3*

AAG

GCG

TCG

ACA

CTG

GAC

OGG

GAG

GAC

CTC

TG

5'

IGF-IIb

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11 12

amino- kwasy:

Ala

Tys

Arg

Pro

Ser

Glu

Thr

Leu

Cys

Gly

Gly

Glu

ludzki 5*

GCT

TAC

CGC

CCC

AGT

GAG

ACC

CTG

TGC

GGC

GGG

GAG

3'

sonda 3*

CGA

ATG

GCG

GGG

TCA

CTC

TGG

GAC

ACG

CCG

CCC

C

5'

Oligomery te zsfntetyzoinco w aparacie do

syntezy DNA Moddl ;

380 A

lub B

produkcji

Applied Biosystems, Inc.^oster City, CA/ Oligomery te użyto do identyfikacji młych subklonów klonu genomowego, który zawiera sekwencje ezonu, a oligomer IGF-IIB użyto również jako primer do seCieccjocdianin DNA.

Plamy /biot/ genomowe DNA nerki bydlęcej wykonano stosując imodfikację metody Southerna. W modifikaαji tej, ilość 20 yug DNA nerki bydlęcej trawi się enzymami Eco R1, Bam HI lub Hind III, frakcjonuje na 0,% /w>a-/°bj·/ żelu agarozonym o wymiarach 20 x 13,5 cm, barwi bromkiem etMu™ /1 yig/ml/ i fotografuje. DNA poddaje się Οιμ^γτ^ϊ przez dwie godziny w temperaturze 37°C w roztworze 0,5 N Na(Ol/ 1,5 M NaCC, zobojętnia przez dalsze 2 godziny w temperaturze 37°C w roztworze o składzie: 0,5 M Tris HC1 /pH 8/ /1,5 M NaCl i przenosi w ciągu doby na filt^i-y nitrocelulozowe firmy Schleicher and SchuuH w roztworze 10 x SSPE /roztwór 1 x SSPE zawiera 180 nM NaCl, 10 mM fosforanu sodowego /pH 6,8/,

154 336 mM EDTA; wszystkie odczynniki z firmy Sigma Chemical Goj. Zamiast warstwy bibuły stosuje się gąbkę. Filtry przemywa się szybko w roztworze 10 x SSPE, suszy na powietrzu, wsiewa przez 2 do 3 godzin w temperaturze 80°C w piecu próżniowym i moczy przez godzinę w temperaturze 50°C w roztworze 5 x SSPE. Naatępnie dodaje się roztwór Denterdtn do uzyskania końcowego stężenia 5 x /1 x roztwór Denhardta zawiera-,0,0% /wg./obj./ albuminy surowicy bydlęcej, 0,0% odczynnika Ficoll, 0,0% poliwinylopirolidonu; wszystkie odczynniki z firny Sigma Chemical Go./ i filtry moczy się przez następną godzinę.

Filtry pre-hybrydyzuje się w ciągu doby w temperaturze 37°C w 25 m mieszaniny zawierającej: 50% formamidu /objętościowo/, 5 x SSPE, 5 x roztwór Denhardta, 0,% dodecylosiarczanu sodowego /SDS/ /«^./ο^./, i po 100 yig/ml DNA ze spermy łososia na nośniku /ST/ i informacyjn r RNA z drożdży. DNA ze spermy łososia i tRNĄ przed dodaniem denaturuje się przez gotowanie w ciągu 10 minut.

Sondy znakuje się radioaktywnie metodą translacji typu nick /Mniatis, str. 1^/ do em Λ aktywności właściwej 10' - 10° rozpadów/mimtę/ yug /dpm/ /ug/. Tak przygotowaną metodą traMacji ^typu niclc son^dę o ttaywności właśctoej ^m.^ędz^y ID? a 3 x ¹⁰® dpm ^dodaje s^{ię d}o mieszaniny pre-hybrydyzacyjnej i mieszaninę tę poddaje się inkubacji przez 48 godzin w temperaturze 42°C. Filtry przemywa się dwa razy po 15 minut w temperaturze 42°C w roztworze zawierającym 1 x SSPE /0,% SDS, po czym prowadzi się ostatnie przemywnie /10-15 mimu/ w tej stmej temperaturze w roztworze o składzie 0,1 x SSPE /01% SDS. Filtry suszy się nt powietrzu i poddaje ekspozycji nt błonie Kodak XAR w temperaturze -70^OG w czasie 2-3 dni z jednjm ekranem wzmagającym.

Wynnki aralizy Southerna genomu bydlęcego prowadzono z przygotowanymi przez translację typu nick sondami odcinków o długości 340 i 515 par zasad /fi^irt l/ przedstawione są w tablicy 4.

Tabela 4

	Sonda odcinka o długości 340 par zasad	i Sonda odcinka o > i dłu^oci 515 par * [ zasad *
Długość pasma /kilopnr zasad/		1 · i ! i i i i I J
Eco R1	4,4	: 4,4 ;
Barn HI	6,0	! 8,2 ,! t 1
Bind III	13,5	ί 13,5 : —χ.------,-------.... .4

Długość każdego hybrydyzującego ptsmr oznacza się przez pomiar odległości pasma od wierzchołka żelu porówn^^jąc ją z odległością oznaczoną dln starinrioweiś DNA o znanej długości, poddanego elektroforezie w tym samym żelu.

Wynnki że cała sekwencja kodująca bydlęcy IGF-II mpże się znajdować we fragmencie Eco R1 o długości 4,4 kiloptr zasad. Bank genomowy zawierający fragmenty Eco R1 o tej wielkości skonstruowano następująco: DNA nerki bydlęcej wyczerpująco trawi się enzymem Eco RI i poddaje frakcjonowaniu metodą elektroforezy w żelu tgarozoiym w sposób opisany powyżej Z żelu wcina się odcinki DNA o długości 3,8 do 4,8 kiloptr zasad i oczyszcza metodą elektroeuuowanit /Manńatis, str. 164/ i następnej nhroIraαośratiC na kolumnie elutip /Schleicher ^Schuull//. Ilość 100 monogramów tego wselekcjonowanego pod względem rozmiarów DNA poddaje się ligtcji z wektorem lambda gtlO śtizmaiym z Vector GlśiCig Systems /San Diego, GA/. Weetor ten stosuje się do klonowania odcinków DNA trawionych enzymem Eco RI o zakresie rozmiarów od zera do 7 kiloptr ztstd. Wekkor ten uzyskano w formie wstępnie ciętej enzymem Eco RI i gotowej do ligncji. Reakcję ligtcji prowadzi się stosując wnuki standardowe /fenńanis, str. 285/.

154 336

Otrzymany zligowany DNA upakowuje się in vitro stosując ekstrakty do upakowania uzyska* ne z fiimy Vector Cloning Systems. Miano otrzymanego banku «nosi 1,5 x 10 jednostek tworzących łysinki /pfu/ w yug zlioowanego DNAilkrij^ banku ^prgwa^dzgog nast^ujjo: Ilość 1,2 x ¹⁰^ ^pfu nanosi ^się na tomórki w ^sp^o2 sób opisany przez Mańaaisa str. 320. Fag nanosi się z gęstością 4000 pfu na 100 cm powierzchni płytki zawierającej Agar NZC /NZC mi skład: 10* /wag./obj./ aminy NZ, 0,5* /wg./ obj./ Na Cl, 0,2* /wag./obj./ Mgłg 1 0,W /«ι./ο^./ aminokwasów jasnmioo, wsz^ystkie odczynniki pochodzą z firmy Sigma Cheimccl, COo/. Płytki inkubuje się w ciągu doby w temperaturze 37°C, utrzymując w temperaturze 4°C przez kilka godzin i przenosi na nitrocelulozę w sposób opisany przez Mnńatisa, str. 320. Nstępnie prowdzi się hybrydyzację z przygotownymi przez translację typu nick sondami odcinków o długości 340 par zasad i 515 par zasad w sposób opisany po«żej dla aralizy genomów Southerna.

Klony dające reakcję dodatnią selekcjonuje się i przekazuje do drugiego cyklu skriningu, identycznego z pierwszym cyklem, z tym, że obniża się gęstość fagów do 100- 200 pfu/lOO 2 cm płytki. Klony dające reakcję docktnią w drugim cyklu poddaje się skriniigowi po raz t^rzeci w ten sam s^pos^ób, obniżając gęsto^ść ^fa^gów ^do ^{20 - 50} piu/HM cm^ płyt^ki. na płytkach z wgłębieniami klony dające dototnią reakcję w trzecim cyklu skriningu zbiera się i z tych łysinek przygotowuje się oczyszczony DNA metodą opisaną przez Ma^^at.sa, str.76.

Inserty uwlnia się z wktora lambda gtlO przez trawienie enzymem Eco RI i sub-klonuje do plazmidu pUC18 /New England Biolabs/, dla otrzymania dogodnego źródła dużych ilości insertu DNA. Plazmidowy DNA otrzymuje się w sposób opisany przez ManOaαisa, str. 90.

Dla otrzymania fragmentów DNA zawierających sekwncje egzonu, o długości dogodnej dla sekwencjonownia DNA /poniżej 500 par zasad/ stosuje się następującą procedurę:

DNA insertu trawi się endo^^l^^eaza^^ restrykcyjnymi Alu I, Hae III, Pst I lub Sau 3A.

W «niku tego trawienia powstają losowo fragmenty DNA o długości dającej się sekwncjonowaó. Każdy produkt trawienia poddaje się losowej ligać ji z sekwen^^jącymi wektorami M13m>18 i Μ3πφ!9 /uzyskanymi z New England Biolabs./. Otrzymane po transformcji do komórek JM101 łysinki /MnOanis, str. 250 i Messing i wp./ poddaje się skrioirig>wi przez hyb^-^t^^^^^ję z g].igM^l’^π IGF-IIA lub IGF-IIB dla identyfikacji żądanych klonów zawierających sek^ncje egzonu.

Do tych prób hybrrydyzzaji, syntetyczne oUgomery znakuje się na końcach w sposób opisany przez ManOaaisa, str. 122. Bufor prs-hybrzyyzacyjny zmienia się usuw jąc formamd,a stężenia SSPE i roztworu Denhardta zwiększa się odpowiednio do 6 x i 10 x, tak jak to opisał Meeinkoth i wsp. H^y^iTy^y^5^ć^<^,ię prowdzi się w temperaturze 30 - 37°C,a temperaturę przemywnia obniża się do 37°C. Filtry przemywa się krócej /5-10 mm^u^ w roztworze 6 x SSPE /0,1* SDS. Z łysinek hybΓydyzujączjh z jedną z sond «preparow^je się DNA w sposób opisany przez Messingt i wsp. Oczyszczony, jsyngnicio« DNA poddaje się ainlizie sekw^ji stosując yiyszokεy-technikę opisaną przez Sangera i wsp., z tym, że zamiast n^Λlsgtyyów znaczonych 2 p opisanych przez Sangera stosuje się nuklsotzyy znaczone siarką ''S /Amersham Coią)., Arlington Heights, IL/.

Połączenia - sgzgo/intΓgo identyfikuje się biorąc pod uwgę trzy kryteria: otwarte ramy odczytu, sekwencje połączenia — egzon/aotroo i analogię do sekwencji ludzkiego cDNA.

W następujących sekwencjach, ziysotyfikowoe połączenia - egzon/intrgo pokazano przez podkreślenie dwóch /sąsia^ich/ oιU^lsotydós z każdej strony takiego połączenia.

Przez tego typu sekwencjoogwnie oznaczono ustępującą sekwencję nιiklsotzyu kodującego dojrzały peptyd bydlęcego IGF-II:

-GCT	TAC	CGC	CCC	AGC	GAG	ACT	CTG	i uU	GGC
GGG	GAG	CTG	GTG	GAC	ACC	CTC	CAG	TTT	GTC
TGT	GGG	GAC	CGC	GGC	TTC	TAC	TTC	AGC	CGA
CCA	TCC	AGC	CGC	ATA	AAC	CGA	CGC	AGC	CGT
GGC	ATC	GTG	GAA	GAG	TGT	TGC	TTC	CGA	AGC

154 336

TGC GAC CTG GCC CTG CTG GAG ACT TAC TGT CCC ACC CCC GCC AAG TCC GAG-3'

Stosując opisaną poiyżej procedurę oznaczono również następującą sekweiteję DNA kodującego bydlęcy IGF-II połączony bezpośrednio poprzez jego koniec amLnowy z liderW złołotym z 24 dodatkowych aminokwasów:

ATG	GGA	ATC	CCA	ATG	GGG	AAG	TCG	ATG	CTG
GTG	CTT	CTC	ACC	TTC	CTT	GCC	TTC	GCC	TCG
TGC	TGC	ATT	GCT	GCT	TAC	CGC	CCC	AGC	GAG
ACT	CTG	TGC	GGC	GGG	GAG	CTG	GTG	GAC	ACC
CTC	CAG	TTT	GTC	TGT	GGG	GAC	CGC	GGC	TTC
TAC	TTC	AGC	CGA	CCA	TCC	AGC	CGC	ATA	AAC
CGA	CGC	ĄGC	CGT	GGC	ATC	GTG	GAA	GAG	TGT
TGC	TTC	CGA	AGC	TGC	GAC	CTG	GCC	CTG	CTC
GAG	ACT	TAC	TGT	GCC	ACC	CCC	GCC	AAG	TCC
GAG·	-3:

W ten sam sposób oznaczono ponadto inną, następującą sekwencję DNA kodującego dojrzały bydlęcy IGF-II połączony bezpośrednio poprzez jego grupę karboksylową z przedłużenie! składającym się z 68 aminokwasów:

GCT	TAC	CGC	CCC	AGC	GAG	ACT	CTG	TGC	GGC
GGC	GAG	CTG	GTG	GAC	ACC	CTC	CAG	TTT	GTC
TGT	CGC	GAC	GGC	GGC	TTC	TAC	TTC	AGC	CCA
CCA	TCC	AGC	CGC	ATA	AAC	CGA	CGC	AGC	CGT
GGC	ATC	GTG	GAA	GAG	TGT	TGC	TTC	CGA	AGC
TGC	GAC	CTG	GCC	CTG	CTG	GAG	ACT	TAC	TGT
GCC	ACC	CCC	GCC	AAG	TCC	GAG	AGG	GAT	GTG
TCT	GCC	TCT	ACG	ACC	GTG	CTT	CCG.	JJAC	GAC
GTC	ACC	GCA	TAC	CCC	GTG	GGC	AAG	TTC	TTC
CAA	TAT	GAC	ATC	TGG	AAG	CAG	TCC	ACC	CAG
CGC	CTG	CGC	AGG	GGC	CTG	CCC	GCC	TTC	CTG
CGA	GCA	CGC	CGG	GGT	CGC	ACG	CTC	GCC	AAG
GAG	CTG	GAG	GCG	CTC	AGA	GAG	GCC	AAG	AGT
CAC	CAT	CCC	CTG	ATC-3'·

Podobnie oznaczono również następującą sekweraję nukleotydów DNA kodującego prekursor bydlęcego IGF-II, w którym wytypuje opisany pow/żej lider N-terminalny i przedłużenie C-terminalne:

5'- ATG	GGA	ATC	CCA	ATG	GGG	AAG	TCG	ATG	CTG
GTG	CTT	CTC	ACC	TTC	CTT	GCC	TTC	GCC	TCG
TGC	TGC	ATT	GCT	GCT	TAC	CGC	CCC	AGC	GAG
ACT	CTG	TGC	GGC	GGG	GAG	CTG	GTG	GAC	ACC
CTC	CAG	TTT	GTC	TGT	GGG	GAC	CGC	GGC	TTC
TAC	TTC	ĄGC	CGA	CCA	TCC	AGC	CGC	ATA	AAC
CGA	CGC	AGC	CGT	GGC	ATC	GTG	GAA	GAG	TGT
TGC	TTC	CGA	AGC	TGC	GAC	CTG	GCC	CTG	CTG
GAG	ACT	TAC	TGT	GCC	ACC	CCC	GCC	AAG	TCC
GAG	AGG	GAT	GTG	TCT	GCC	TCT	ACG	ACC	GTG
CTT	CCG GAC	GAC	GTC	ACC	GCA	TAC	CCC	GTG
GGC	AAG	TTC	TTC	CAA	TAT	GAC	ATC	TGG	AAG
CAG	TCC	ACC	CAG	CGC	CTG	CGC	ACG	GGC	CTG
CCC	GCC	TTC	CTG	CGA	GCA	CGC	CGC	CGT	CGC

154 336

ACG CTC CCC AAG GAG CTG GAG GCG CTC AGA GAG GCC AAG AGT CAC CAT CCG CTG ATCC-'.

Peptydy bydlęcego IGF-II wytwarzane przez ekspresję trzech ostatnich, podanych powyżej sekwencji nukleotydlowych wizują w istoCnym stopniu aktywność biologiczną bydlęcego IGF-II /zwykle po usunięciu sekwencji liderowej z tych peptydów, które Ją zawierają i/lub po odpowiednim ich naturoraniu, Jeśli to potrzebne/ i ragą być stosowane zamiast krótszych /to jest złożonych z 67 aminokwsów/ peptydów według lazku /w pewnych przypadkach korzystnie/ wykazując działanie biologiczne u zwierząt podobne do bydlęcego IGG-II.

Literatura

1. Bila, R.M. i Bhaumick, B. /1979/ Can.J, Blochem. 57il289-98.

2. Bell, G.I., J.P., Sanchez-Pescador, R., Stsmpisn, MM., Priestley, L.,

Scott, J. i ROI, L.B. /1984/ Naturę 310:775-77

3. Daughaday, W.H. i wsp. /1981/ J .Clln. ETrioorlnol. i MeSab. 53:282-88

4. Ml, T.J., Cray, A., Hayyiick, J.S., i Ullrich, A. /1984/ Nłturę 310:777-81

5. Gospodorowicz, D., Wessran, J., Mooan, J.S. i LinOstrom, J. /1976/ J.Cell Biol, 70:395-405.

6. .Hirs, C.H.W., /1956/ JBlotoChem. 219:611-621

7. Humee, R.E., /1984/ w Hormomnl Proteins yc0 Peptides, ^yd. Choh Hao Li, Acadsmic Press,

Inc., XII:66-68

8. Hunnapiller i wsp. /1983a/ Methods in En^znmo., C.H. W.Hirs 1 wsp., WydL. /Academic Press, Now York, OT/ 91:399-413

9. HuCapillsr i wsp. /1983b/ Method3 In Enzyrao., C.H.W.Hirs i wsp., Wyd. /Academic Press, New York, OT/ 91:486-493

10. Koots, C.E. /1984/ Ph.D. D^serta^^, UnCy.ol Minesota, St.Paul, Minnesoty

11. KAts, C.E. i Bile, C.A. /1985/ FsO Proc. 44/3/:484

12.1arsen, B.R. i Wsi;, F.G. /1981/ J Chromy o. Sci. 19:259*65

13. Lehninger, A.L. /1976,/ Biochsinlstry, II wi., Worth BAbishers, Inc. Nsw York, NY, str. 72-75, 315-322

14. Liberti /1975/ Biochem i B^pt^s^es. Comn. 67:1226-1233

15. Maacayts, T., Eritsch, E.F. i Sambrock, J. /1982/ w Mooecular Clocing: A totboratory Mami /Cold Springs Harbor Laboratory, Cold Spridgs tortur, OT/ ló.Myrąmardt, H. i wsp. /1981/ J.^Bi^t:^L —h^m. 256:6859-63

17-Meickoth. J.i Wałil, G. /1984/ Anaa.Bitchsmistr^y 138:267-84 lS.Messicg. J., Crea, R. i Sssburg, P.H. /1981/ Nuci. Acids Res. 9:4173-88

19. Mictoiapoulos, G. i Pitot, H.C. /1975/ EsypCeSl Res. 94:70-78

20. Richards i wsp. /1983/ J.Tissus CiHt.Methods 8:31-39

21. R:^^^^:rkn^^ht i HurnmbS, E.E. /1978/ FEBS Lettsrs 89:283-86.

22.Sy^er, F., Nicklsn, S. i Coulson, A.R. /1977,/ Proc.Natl.Acy0.Scj.USA 74:5463-67 23.Stutherc, E.M./1975/ JMUlol. 98:503-17

24.Strain, A.J., Hill, D.J., Swenne, I., i Milnsr, R.D.G. /1986,/ British Endocrins Society Abstracts, Abs 142

25.SvobcOy i wsp. /1980,/ Bitchslnlstry 19:790-97

26. Van Wyk., J.J. i w3p. /1975/ Adv.MeSab.DistrdeΓS 8:127-50

27. Woo, S.L.C. /1979,/ Methods in Enzymo,, R.Wu. Wyd. /Acadsmic Press, New York,

68:389-95

28. Yaflse, D. /1968/ Proc. Naa'1. Acad.Sci, U.S.A. 61:477

29. Yang, J. i NaCO, S. /1983/ IntRey. ol C^tol 81:249-86 dOiYaraysiro, D., i Li, C.H. /1985/ Int. J.Psptids Protein Res, 26:299-304

31. Zunmteic, P.P. i HuiAbS, R.E. /1985/ Methods in Enzyraoogy. L.Bimbaumer i wsp., Wyd.

/4^0:01^ Press, Nsw York, NlY 109:782-98.

154 336

Claims (7)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wrtrnrzania peptydu wykazującego aktywność biologiczną bydlęcego czynnika wzrostu /IGF--I/, znamienny tym, że wywo^Ue się ekspresję syntetycznego DNA kodującego peptyd zawierający w swoim łańcuchu odcinek o następującej sekwencji aminokwasów, czytanej od końca z grupą aminową do końca z grupą karboksylową!

   Ala -Tyr-Arg-Pro-Ser-Glu-Thr-Lito-Cya-GlyGly-Glu-Leu-Val-Asp-ThrhiLeu-Gln-Plhi-VaaCys-Gly-Asp-Arg-Gly-Phe-Tyr-Phe-^r-ArgPro-Ser-Ser-Arg-IleA(sn-Arg-Arg-Ser-ArgGly-IlevVa-GlluGllu-CysC;ys-Ih»e-Arg-SerCys-Asp-Leu-Ala-Leu-Leu-Glu-Thr-Tyr-CysAla-·ThΓuProuAla-LysuSeruGlu.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że dla wytwOr^na wymówionego IGF-II wywołuje się ekspresję DNA o następującej sakra ncji nuULeotjdoweji

   5 -CCT TAJ CGC CGC ACC GTC ACT CTC TGC GGG GCC GAG CTC GTG GAC AGC CTC CAG TT^ ATG TCT GCG GAC CCC GGC ΏΆ TTC TTC AGC CGA CCA TCC AGC CCG ATT TTC CCA CGG TGC CCT GCC ATC GTG GAA GAG TCT TCC nc CGT ACG TGC CAC CTC GCG CTC CTC GAG ACT TTC TGT GCC ACC CCC GCC AAG TCC cag-': lub ich funkcjonalnych równo, wżn ików 3. Sposób według zas trz. 1. z c a m i e η n y t y m, że wywone się ekipnej DNA

   kodującego peptyd, w którym końcowa grupa aminowa zasadniczej sekw^j aminokwasów według zastrz. 1 połączona jest z końcową grupą karboksylową następującej sekwannc! aminokwasów

   Mee-Gly-InupProMIetGly-Lys-SeΓMnt-LnlVal-LnluLnu-ThLr-Phe-Leu-Ala-Phe-Ala-SeΓCys^-CcsslE-Alalub z częścią tej sekrancji.
3. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że dla wywarzenia wymienionej sekwa^i aminokwasów wywłuje się ekspresję DNA o następującej sekraM^ cιUtlnotydowJt
4. 5'- ATG GGA AAT CCA AAG GGG JAG TCG ATG CTG

   GTG CTT CCC ACC TTC CTT GCC TTC CCC TCG

   TGC TGC ATT GCT GCT TAG OJC CCC AGC GAG

   ACT CTC TCG GCC (CC GTC CTC GTG GAC ACC

   CTC CAG m GTC TCG CGC GGC AGC GGC TTC

   TTA TTC ATG CCA CCA TCC JAJC CGC ATT AAC

   CGA CGC ATG CCT GGG ATC GGT GAA GTG TCT

   TGC TTC CGG TGC 'ICCJ GAC (CTC GCC CTC CTC

   GTG ACT TTA TCT GCC ACC CCC GCC AAG TCC

   GAA}-' .

   lub ich funkcjonalnych równowżników.

   5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wywłul|n się ekspresję DNA kodującego peptyd, w którym końcowa grupa karboksylowa za&adnCczej sekwo^i aminokwasów wmług zastrz. 1, połączona jest z grupą aminową następującej sekwo^i aminokwasów:

   -Arg-T sp^al-Ser-Tla -SeΓ-ThΓ-ChruVal-LnuPro-Asp-AAp-Wl-Thr-ATa-Tpr-Pro-Yal-ClyLys-Phe-PhenGCnn-τr-AAp-Ule-Trp-Lys-GlnSer-T hr-C ln -A rg-Leu -Arg-Arg-Cly-Lm-Pro22

   154 336

   Ala-Phe-Leu-Arg-Ala-Arg-Arg-Gly-Arg-ThrLeu-A la -Lys -G lu-Leu-G lu-A la-Leu-Arg-G luAla-Lys-Ser-His-His-Pro-Leu-Ile lub z częścią tej sekwencji.
5. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że dla «tworzenia wynieniocej sekwncji aminokwasów «ywOuje się ekspresję DNA o następującej sekwencji mudeotydowe j:

   5'- GCT TAC CCG CCC AGC GAG AAT CTG TGC GGC

   GGG GAG CCT GTG GAC ACC CTC CAG TTT GTC

   TGT GGG GGC CGC GGC TTC TAC TTC ACC CGA

   CCA TCC AAC CGC ATA AAC CCA CGC. AGC CGT

   GGC ATC GGT GGA Gd TGT TTG TTC CGA AGC

   TGC GAC CCT Gd CTG CTG Gd ACT TAC TCT

   GCC ACC CCC CCC AAG TCC Gd AG GAT GTC

   TCT GCC TCT ACG ACC CTG CCT CCG GAC GAC

   GTC ACC GGC TAC CCC GTG Gd AAG TTC TTC

   CAA TAT Gd ATC T(W Ad CAG TCC ACC CAG dC CTG GK AGG Gd CTC CCC GCC TTC CTC

   CGA GCA CG CGG dT CGC ACG CTC GCC AAG

   GAG CTG GGA GCG CTC AGA GGG GCC AAG AGT

   CAC CAT CCC CTC ATC-3'.
6. 7. Sposób według zastrz.1, znamienny tym, że «wouje się ekspresję DNA kodującego peptyd, w którym końcowa grupa aminowa zasadniczej sekwencji ammokwsowej jest połączona z końcową grupą karboksylową następującej sekweroji aminokwasów:

   Mee-GGy jle-Pro-Met-dy-Lys-Ser-Met-LeuVal-Leu-Leu-T^h*-Phe-Leu-AGl-Plte-AAi-Serlub jej części, a końcowa grupa karboksylowa zasadniczej —^επ^ϊ aminokwsowj jest połączona z końcową grupą aminową następującej s^wenn j aminokwasów:

   -AΓg-Gsp-Val-S-r-Cla-S-Γ-Ghr-ThΓ-Val-L-uPro-Gsp-Gsp-Val-Gl·h·-AGa-TyΓ-PΓo-Val-GlyLys-Phe-Phe-Cln-T>s--AG--Il--GΓ·p-Lys-GlnS-r-Thr-Cln-Arg-L-u-Crg-Crg-Gly-Leu-PΓOAla-Ph--L-u-CΓg-Cla-Grg-Crg-Cly-Crg-ThΓLeu-Cla-Ly--Clu-L-u-Clu-Cla-L-u-GΓg-CluAla-Lys-Ser-His-His-Pro-Leu-Ile lub jej części.
7. 8. Sposób w<eiług zastrz. 7, znamienny tym, że dla wytworzenia «mienionej --kwenCJi aminokwisów «woouje się ekspresję DNA o następującej --kwencji nukleotydów:

   5'- ATG dA ATC CCA ATC dG Ad i j ATG CTC CTG CTT CTC ACC TTC CTT dC TTC GCC TCG TGC TGC ATT GCT GCT TAC Cd ccc AGC GAG ACT CTC TGC dC Gd GAG CTG GGC GAC ACC CTC CAG TTT GTC TGT dG Gd CGC dC TTC TAC TTC AGC CGA CCA TCC Ad dC ATA AAC CGA dC AGC dT dC ATC CGC CAC GAG TGT TGC TTC CGA TGC TGC GAC GTC CGG CTG CTC GAG ACT TAC TGT GCC ACC CCC GCC AAC TCC GAC Ad GAT CTC TCT GCC TCT ACG ACC GTG CTT Cd GAC GAC GTC ACC GCA TAC CCC GTO

   154 336

   CGC AAG TTC TTC GAA TAT GAC ATC TGG AAG CAG TCC ACC CAG CGC OTO CGC AGG GCC CTG CCC GCC TTC CTG CGA GCA CCG CGC CGT CGC ACG CTG CCC AAG CAC CTG GAG GCG CTC AGA GAG GCC AAG AGT CAC CAT CCG CTG ATC- 3'· lub ich funkcjonalnych równoleżników.

   154 336

   Zakład Wydawnictw UP RP. Nakład 100 egz. Cena 3000 zł