PL161444B1

PL161444B1 - Sposób transformowania komórek roslinnych w celu nadawania roslinom opornoscina srodek chwastobójczy PL PL PL

Info

Publication number: PL161444B1
Application number: PL1989278448A
Authority: PL
Original assignee: Rhone Poulenc Agrochimie
Priority date: 1988-03-23
Filing date: 1989-03-23
Publication date: 1993-06-30
Also published as: IE20001005A1; US5559024A; EP0337899B1; DK144689A; ZA892146B; NZ228458A; KR19990030697A; AU3159189A; KR890014742A; EP0894865A2; KR100218855B1; RO107001B1; EP0337899A1; DD294040A5; DK144689D0; PH31569A; ES2139565T3; BR8901499A; AU629539B2; DE68929125T2

Abstract

1. Sposób transform owania kom órek roslinnych w celu nadaw ania roslinom opornosci na srodek chwastobójczy oparty na 3,5-dichlorowco-4-hydroksy-benzonitrylu, znamienny tym, ze doprow adza sie do integracji genu chimerycznego obejmujacego co najmniej jeden gen kodujacy opornosc na ten herbicyd, obcy prom otor pochodzacy z genu ulegajacego naturalnej ekspresji w kom órkach roslinnych, który jest wybrany z grupy obejmujacej prom otor 35S RNA z wirusa mozaiki kalafiora (CaM V 35S) i prom otor malej podjednostki (SSU) karboksylazy/oksygenazy rybulozo-1,5-dwufosforanu (RubisCO) slonecznika (Helianthus annuus) oraz region sygnalowy poliadenylacji, z materialem genetycznym komórki. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób transformowania komórek roślinnych w celu nadawania roślinom oporności na środek chwastobójczy.

Bardziej szczegółowo, wynalazek dotyczy sposobu transformowania komórek roślinnych w celu nadawania roślinom oporności na środek chwastobójczy na bazie 3,5-dichlorowco-4-hydroksybenzonitrylu.

Z opisu europejskiego zgłoszenia patentowego nr 229 042 znany jest sposób nadawania roślinom oporności na środek chwastobójczy typu powyżej wspomnianego, w szczególności 3,5dibromo-4-hydroksybenzonitryl, czyli bromoksynil, polegający na wprowadzaniu do genomu rośliny genu kodującego nitrylazę, specyficznie rozkładającą środki chwastobójcze tego rodzaju. Mimo, że technika ta daje pożyteczne wyniki, wymaga ona ulepszenia w celu zwiększenia szans powodzenia i wzmożenia korzyści ekonomicznych, zwłaszcza pod względem poziomu ekspresji w roślinach, a także stosownie do tego, charakteru oporności roślin na te środki chwastobójcze.

W niniejszym opisie jako „rośliny¹* rozumie się każdy zróżnicowany organizm wielokomórkowy zdolny do fotosyntezy, a jako „komórkę roślinną każdą komórkę pochodzącą z rośliny i zdolną do wytworzenia tkanek niezróżnicowanych, takich jak kalusy i zarodki, albo tkanek zróżnicowanych, takich jak części roślin, rośliny, względnie nasiona.

161 444

Celem niniejszego wynalazku jest zaspokojenie tego zapotrzebowania.

Sposób transformowania komórek roślinnych według wynalazku polega na tym, że materiał genetyczny komórki doprowadza się do integracji z genem chimerycznym obejmującym co najmniej jeden gen kodujący oporność na dany herbicyd, obcy promotor pochodzący z genu ulegającego naturalnej ekspresji w komórkach roślinnych, który jest wybrany z grupy obejmującej promotor 35S RNA z wirusa mozaiki kalafiora (CaMV 35S) i promotor małej podjednostki (SSU) karboksylazy) oksygenazy rybulozo-l,5-dwufosforanu (RubisCo) słonecznika (Heliothus annuus) oraz region sygnałowy poliaidenylacji.

Promotor genu chimerycznego stosowanego w sposobie według wynalazku pochodzi z genu, który ulega naturalnej ekspresji w roślinach, to jest genu typu nieroślinnego, np.typu wirusowego, takiego jak gen 35S RNA wirusa mozaiki kalafiora (35S CaMV), lub alternatywnie i korzystnie, typu roślinnego, z roślin jednoliściennych lub dwuliściennych, zwłaszcza genu małej podjednostki karboksylazy/oksygenazy rybulozo-l,5-dwufosforanu (RubisCO) słonecznika (Helianthus annuus). Możliwe jest zastosowanie tych promotorów samych albo w kombinacji. Wybór ten zależy od charakteru roślinny, która ma być transformowana (roślina jednoliścienna lub dwuliścienna). I tak do transformacji rośliny dwuliściennej korzystne jest zastosowanie promotora małej podjednostki RubisCO słonecznika.

Promotory te można otrzymać następującymi sposobami.

Promotor 35 S RNA wirusa mozaiki kalafiora (35 S CaMV).

Wyodrębnianie tego promotora opisali Odęli i in. (1985). Do opisanej konstrukcji wybrano klon (pJ05-2) zawierający około 850 par zasad w górę od miejsca inicjacji transkrypcji. Wyodrębniono fragment EcoRI-Hindlll, końce przeprowadzono w tępe z użyciem polimerazy Klenowa i klonowano ten fragment do wektora pUC 19 (Yannish - Perron i in., 1985) w miejscu Hincll. Klon ten strawiono działaniem Xbal i Pstl i na otrzymany fragment podziałano polimerazą faga T4 w celu przeprowadzenia końców w tępe. Fragment ten klonowano do pUC19 Cm (Buckley, 1985), przecięto Smal i Xbal i poddano działaniu polimerazy Klenowa. Tak otrzymany klon oznaczono pRPA-BL 145. Za pomocą działania na 3'-końcowe miejsce AccI polimerazą Klenowa i ligowania go z miejscem EcoRl, poddanym działaniu polimerazy Klenowa, z fragmentów położonych w dół od tego promotora odtwarza się miejsce EcoRI, a otrzymana w wyniku tego sekwencja, zaczynająca się od miejsca inicjacji transkrypcji, jest następująca:

ACACGCTGACAAGCTGACTC. AGCTAG

A G T C G A A T T C

EcoRI

2/ Promotor małej podjednostki rybulozo-l,5-bisfosforanowej karboksylazy/oksygenazy (RubisCO) słonecznika (Helianthus annuus).

Gen, z którego otrzymuje się promotor, wyodrębnili Wacksimni in. (1987). Fragment EcoRI zawierający promotor tego genu klonowego do mp 18,3'-część promotora bezpośrednio w górę od polilinkera tego wektora. Następnie przeprowadzono ten klon w postać liniową BstXI i poddano działaniu egzonukleazy Ba 131. Na mieszaninę tak otrzymanych fragmentów podziałano Sali, a następnie polimerazą Klenowa, a w końcu ligowano przy niskim stężeniu DNA. Klony otrzymane w wyniku tego postępowania sekwencjonowano i wybrano jeden z nich, mający w dół od domniemanego miejsca inicjacji transkrypcji następującą sekwencję:

...5' ATTGGATTC3'...

Linker Ciał (A T C G A T) wprowadzono w miejscu Pstl w tym klonie. Tak więc, przez działanie na to miejsce Ciał polimerazą Klenowa i ligowanie z miejscem EcoRI, poddanym działaniu polimerazy Klenowa, z fragmentów umieszczonych w dół od tego promotora odtwarza się miejsce EcoRI, a otrzymana w wyniku tego sekwencja, zaczynająca się od domniemanego miejsca inicjacji transkrypcji, jest następująca:

ATTGGATrCTGGACCATC G A A T T C

EcoRI

W innym sposobie realizacji wynalazku, gen chimeryczny obejmuje nie ulegający translacji region pośredni (linker) między genem kodującym a promotorem, który można wybrać z grupy złożonej:

- z jednej strony z linkera pUC 19, zmodyfikowanego przez klonowanie i mającego następującą sekwencję:

G A A T T C GAGCTCGGTACC C C A T G G

EcoRI NccI

- z drugiej strony, z nie ulegającego translacji regionu małej podjednostki RubisCO kukurydzy; region ten pochodzi z DNA odpowiadającego genowi opisanemu przez Lebrun'a i in. (1987). Jest to fragment EcoRI-Ncol o następującej sekwencji:

G A A T T C CCAGCAAGCAAGCAGCGAGT

EcoRI

ACATACATACTAC-GCAGCCAGGCAG

C C A T G

NccI

- z innej strony, z nie ulegającego translacji regionu małej podjednostki RubisCO słonecznika; region ten pochodzi z cDNA wyodrębnionego przez Waksmana i Freyssineta (1987). Nie został on wyodrębniony jako taki i zawsze jest, jak stwierdzono, poprzedzony peptydem przejściowym RubisCO słonecznika. Sekwencja ta jest następująca:

G A A T T C CGAAAGACAAAGATTATCG

EcoRI

TAATG

Met

Gen chimeryczny wytworzony sposobem według wynalazku ewentualnie obejmuje region, lub miejsce, poliadenylacji, które może stanowić np.:

1/ Miejsce poliadenylacji genu syntezy nopalinowej pTi 37 (Bevan i in., 1983). Miejsce to znajduje się we fragmencie Mbol o 260 parach zasad, (Fraley i in., 1983, zgłoszenie patentowe PCT 84/02913), na który podziałano polimerazą Klenowa i klonowano do miejsca Smal M13mpl8 w celu wprowadzenia miejsc BamHI i EcoRI, odpowiednio, na końcach 5' i 3'. Na miejsce BamHI podziałano nukleazą Vigna radiata i klonowano w miejscu Sali, po podziałaniu polimerazą Klenowa, pUC 19. Fragment ten obecnie zawiera przy swoim końcu 5' miejsce HindlH, które może podlegać ligowaniu przy końcu 3' genu nitrylazy.

2/ Miejsce poliadenylacji genu małej podjednostki RubisCO kukurydzy. Miejsce to wyodrębniono w postaci fragmentu Smal-BgUI o 540 parach zasad z genu opisanego przez Lebrtin'a i in. (1987). Wprowadzono linker Ciał (ATCGAT) przy miejscu Smal. Po rozszczepieniu Ciał i wypełnieniu z użyciem polimerazy Klenowa, fragment ten klonowano do pUC19 przeciętego Pstl, a następnie podziałano na niego polimerazą faga T4 i ponownie przecięto BamHI. Postępowanie to umożliwiło wprowadzenie miejsca HindlH przy końcu 5' miejsca poliadenylacji. Otrzymana sekwencja jest następująca:

' A A G C T T GCATGCCCGATGGGCAG ....

Hindlll

1/SmaI

161444 5

W jeszcze innym sposobie realizacji wynalazku, gen chimeryczny może ewentualnie i korzystnie obejmować, między regionem pośrednim, a genem nitrylazy, region kodujący peptyd przejściowy, wybrany z grupy złożonej z peptydu przejściowego małej podjednostki RubisCO kukurydzy i peptydu przejściowego małej podjednostki RubisCO słonecznika. Funkcją peptydu przejściowego w genie naturalnym jest pozwalanie na wnikanie małej podjednostki RubisCO do strony chloroplastów. Peptydy te powinny, podobnie, kierować nitrylazę do tego kompartmentu w przypadku, gdy zostaną wprowadzone między region pośredni opisany powyżej i gen struktury nitrylazy:

1/ Peptyd przejściowy małej podjednostki RubisCO kukurydzy: fragment ten pochodzi z cDNA odpowiadającego genowi opisanemu przez Lebrun'a i in. (1987). Jest on fragmentem Ncol-SphI o 141 parach zasad, przy czym miejsce Ncol pokrywa kodon inicjacji translacji i miejsce SphI, miejsce rozszczepiania peptydu przejściowego. Za pomocą podziałania na koniec SphI tego fragmentu polimerazą faga T4 i ligowania go z poddanym działaniu polimerazy Klenowa końcem Ncol genu nitrylazy, odtwarza się sekwencję pozwalającą na wytwarzanie nie zmodyfikowanej nitrylazy w stromie chloroplastów.

2/ Peptyd przejściowy małej podjednostki RubisCO słonecznika: fragment ten pochodzi z cDNA wyodrębnionego przez Waksmana i Freyssineta (1987). Sekwencja ta nie ma, wyjściowo, miejsca SphI przy miejscu rozszczepiania peptydu przejściowego. Sekwencja w tym zakresie jest następująca:

5'CAATGCATGA*AG3'

Za pomocą C zastąpiono na drodze bezpośredniej mutagenezy A wskazaną gwiazdką, w wyniku czego utworzono miejsce SphI. W celu przeprowadzenia tego postępowania użyto metody Zollera i Smitha (1984). Fragment EcoRI-Sall o 270 parach zasad klonowano do M13mpl9am4. Wektor ten, wywodzący się z M13mpl9, zawiera mutację amber w genie 4 przy zasadzie 5327 i nie można go namnażać w szczepach nie zawierających supresora mutacji tego typu. Po oczyszczeniu jednoniciowej postaci tego faga rekombinantowego, hybrydyzowano trzy oligonukleotydy w pojedynczym stadium. Sekwencji tych fosforylowanych oligonukleotydów jest następująca:

SphI : 5 GTTCAA.T GCA i G C AoGTGTGGCCAC3 : 5' AAGAGTGTGTCCATCAC3' : 5' GTAAAACGACGGCCAGT3'

Umożliwiają one, odpowiednio: 1: mutację fragmentu przy miejscu rozszczepiania peptydu przejściowego; 2: skorygowanie mutacji amber; 3: prymowanie sekwencji w górę od fragmentu, w którm następuje mutageneza.

Po jednoczesnym działaniu polimerazą Klenowa w obecności czterech nukleotydów i ligazą faga T4 otrzymaną mieszaniną transformowano szczep HB2154, a następnie umieszczono na murawie HB2I51 (Carter i in., 1985). Spośród otrzymanych klonów sekwencjonowano te, które miały dodatkowe miejsce SphI, w celu potwierdzenia tej struktury, i jednego z nich użyto do wytworzenia genu chimerycznego. W zakresie miejsca rozszczepiania peptydu przejściowego, sekwencja jest obecnie jak następuje:

' CAATGCATGC

Fragment ten stosuje się w sposób identyczny do wykorzystanego w przypadku fragmnetu kodującego peptyd przejściowy małej podjednostki RubisCO kukurydzy.

Montowanie genów chimerycznych prowadzi się według schematu na Figurach 1-4 z uwzględnieniem elementów powyżej opisanych. Tak utworzone rozmaite geny umieszczono w jednym lub dwóch typach wektorów i każdą konstrukcję oznaczono numerem odnośnikowym. Tak wytworzone różne wektory opisano w tabeli 1.

Tabela 1

Montowanie rożnach T DNA zawierających gen\ chimeryczne do nadawania oporności na bromoks^ml

Identyfikacja pRPA-BL	Wektor	Promotor	Region łącząc	Peptyd przejściowy	BRXN	NOS poliA	Kukurydza ssu' poliA
35S CaMV	ssu słonecznika	Kukurydza 5'	. * Słc Linker	tnecznik 5	Kukurydza	Słonecznik
r-o	l'0\ 1	+		4-					T	+
	151)4 1	r		+			1		-r	+
:o?	1504 1		T	+					+	T
208	150A 1		X	+			τ		τ	+
217	1504 1	+			4-				T	T
218	1504 1	X						X	X	+
221	1504 1		+		T				-	+
222	I50A 1		X						4-	+
225	142	+		+					+	+
236	142	f				+			X	+
237	142		+	1-					+	+
238	142					-i-			X	+
249	142	T		-i-					+		+
250	142	T			-r				+		+
251	142		+	+					+		+
252	142								+		+
44?	142		+			+		T	1		+

Użyte wektory: Różne konstrukcje chimeryczne, które prowadzą do wektorów pRPA-BL-142 i pRPA-BL-150A a 1 pokazanych na Figurach 1-4 wprowadzono do roślin stosując układ przenoszący Agrobacterium tumefaciens.

Wektory przenoszące skonstruowane w tym celu mają następujące cechy znamienne:

- początek replikacji i przenoszenia pochodzący z pBR 322,

- gen do selekcji w bakteriach, np. oporność na gentamycynę,

- miejsce COS pochodzące z faga λ,

- obydwa, prawy i lewy, brzegi T DNA pTiAó,

- ewentualnie, eukariotyczny gen selekcyjny, taki jak oporność na kanamycynę,

- ewentualnie, fragment zawierający gen lac a komplementacyjny pUC18.

Konstrukcja pRPA-BL-142 (Figury 1-4).

Prawy i lewy brzeg (Fig. 1) lewoskrętnego T DNA pTiA6 najpierw subklonowano:

- prawy brzeg: Fragment BamHI-EcoRI rozciągający się od 13774 do 16202 w systemie numerowania Barkera i tn. (1983) klonowano do pGEM 1 (Promega Biotech) w odpowiednich miejscach, w wyniku czego otrzymano pBL-17. Plazmid ten strawiono Nrul (14276 i 14475) oraz EcoRI (16202) i poddano działaniu polimerazy Klenowa. Ligacja miejsca Nrul i wypełnionego miejsca EcoRI regeneruje miejsce EcoRI przy 14276, w wyniku czego otrzymuje się plazmid pBL-19.

- lewy brzeg: F ragment HindIII rozciągający się od 602 do 3390 w systemie Barkera i in. (1983) klonowano do odpowiedniego miejsca pGEM 1, w wyniku czego otrzymuje się pBL-21, w którym lewy brzeg znajduje się po stronie przeciwnej od polilinkera. Plazmid ten strawiono Acc 1 (1161 i 2687) i poddano działaniu polimerazy Klenowa przed ligowaniem. Powstały plazmid, pBL-26, zawiera fragment rozciągający się od 602 do 1161 między miejscami Hindlll i Xbal.

Tworzenie T DNA: Przez wprowadzenie fragmentu EcoRI-BamHI z pBL-19 do odpowiednich miejsc pBL-26 został ponowanie utworzony T DNA, mając prawy i lewy brzeg z pTiA6 w ich naturalnej orientacji. Otrzymany plazmid oznaczono pBL-70.

Wprowadzenie T DNA dp pBR 322 (Fig. 2): Po przecięciu pBL-70 z użyciem Hindlll, miejsce to poddano działaniu polimerazy Klenowa i plazmid ponownie przecięto EcoRI. Otrzymany fragment klonowano do pBR 322 przeciętego PruII-EcoRI. Powstały klon oznaczono pRPA-BL-112.

Ί

Klonowanie genu oporności na gentamycynę (Fig. 3): Gen oporności na gentamycynę otrzymano z pPHl Jll (Hirsh i Bringer, 1984). Plazmid ten strawiono BamHI i Hindlll, a zbiór fragmentów klonowano do pUC 19 przeciętego tymi samymi enzymami. Po selekcji na ampicylinie + gentamycynie wyodrębniono kilka klonów zawierających fragment o 2,45 kiloparach zasad. Klon wybrany do dalszej obróbki nazwano pRPA-BL-133. Wprowadzono w miejsce BamHI tego klonu fragment Bgl II o 1,6 kiloparach zasad wyodrębniony z pHC 79 (Hohn i Collins, 1980) i zawierający miejsce COS faga λ. Ten fragment wprowadzony w dwóch orientacjach, umożliwia otrzymanie dwóch klonów: pRPA-BL-134 o pRPA-BL-135.

Wytwarzanie wektora integracyjnego (Fig. 3): W celu połączenia w jeden i ten sam wektor różnych powyżej opisanych części, plazmidy pRPA-BL-134 i pRPA-BL-135 strawiono Smal i Hindlll i insert zawierający gen oporności na gentamycynę i miejsce COS faga λ poddano działaniu polimerazy Klenowa. Plazmid pRPA-BL-112 strawiono Pstl i EcoRI i poddano działaniu polimerazy faga T4. Obydwa fragmenty ligowano i wyselekcjonowano klony zawierające jednocześnie gen oporności na gentamcynę, miejsce COS, T DNA i początek replikacji pBR 322. Plazmid pRPA-B L-134 doprowadził do powstania pRPA-BL-141 i pR PA-Bl- 142, a pRPA-BL-135 doprowadził do powstania pRPA-BL-143 i pRPA-BL-144. pRPA-BL-142 wybrano do wprowadzania genów chimerycznych, które miano przenieść do roślin. Z tego wektora otrzymano konstrukcję zawierającą gen markerowy NOS-NPTII-NOS (Fig. 4). Plazmid pRPA-BL-142 strawiono Xbal, a końce zmniejszono działaniem nukleazy Vigna radiata. Oddzielnie, pEND4 K (Klee i in., 1985) strawiono EcoRI i poddano działaniu polimerazy Klenowa. Wyodrębniono fragment o 1,6 kilopary zasad zawierający gen chimeryczny nadający oporność na kanamycynę i wprowadzono do pRPA-BL-142. Plazmid będący wynikiem jednej z tych fuzji nazwano pRPA-BL-150 A i wybrano go do dalszego postępowania. W celu ułatwienia klonowania do tego wektora, fragment HacII poddany działaniu polimerazy faga T4 i zawierający gen lac a komplementacyjny wyodrębniony z pUC18 (Yannish-Perron i in., 1985), wprowadzono przy miejscu BamHI, które poddano działaniu nukleazy Vigna radiata. Otrzymane dwa wektory nazwano pRPA-BL-150A a 1 i pRPA-BL-150A al.. pRPA-BL-150A a 1 był wektorem użytym jako podstawa do wprowadzania genów do roślin.

Zastosowanie pRPA-BL-142 i pRPA-BL-150A a 1. Wektorów tych nie utrzymywano jako takich w Agrobacterium. Aby mogły one być utrzymywane, muszą zostać zintegrowane na drodze pojedyńczej rekombinacji w plazmidzie stale istniejącym w tej bakterii. Może to zachodzić za pośrednictwem jednego z fragmentów, takiego jak miejsce obecne w kosmidach, takich jak pVK 102, lub podobnych, albo fragment pBR 322 dla plazmidów mających te sekwencje. Jest tak w przypadku plazmidu Ti szczepu GV3850 (Zambryski i in., 1983), który jest również gospodarzem pRPA-BL-142 i pRPA-BL-150A a 1. Przy użyciu początku replikacji pBR 322, plazmidy te przenosi się do Agrobacterium, stosują trzyczęściowy układ opisany przez Ditte'a i in. (1980).

Transformacja materiału roślinnego.

W celu zbadania skuteczności tych genów chimerycznych, przeniesiono je do materiału według sposobów postępowania opisanych poniżej:

A. Sposoby transformacji.

1. Tytoń. Wektor wj^row^i^;^on(i do nieonkogennego EHA 101 (Hood i in., 198Ί) niosącego kosmid pTVK 291 (Komari i in., 1986). Podstawą techniki transformacji jest sposób postępowania Horscha i in. (1985). Sposób regeneracji przemysłowego tytoniu PBD6 (źródło: SEITA, Francja) jak opisano poniżej.

Regenerację tytoniu PBD6 z eksplantów liści prowadzi się na podłożu podstawowym Murashige i Skoog (MS) zawierającym sacharozę w stężeniu 30 g/litr. Eksplanty liści podbiera się z roślin hodowanych w szklarni lub in vitro i transformowanych zgodnie z techniką krążków liściowych [Science, 22Ί, 1229-1231 (1985)] w trzech kolejnach stadiach.

Stadium pierwsze obejmuje indukcję pędów na MS + 30g sacharozy zawierającym 0,05 mg NAA i 2mg/litr BAP w ciągu 15 dni.

Stadium drugie umożliwia rozwój pędom utworzonym w stadium pierwszym; pi owadzi się je na MS + 30 g/litr sacharozy, nie zawierającym jakiegokolwiek hormonu, w ciągu 10 dni.

Stadium trzecie umożliwia pędom, pobranym indywidualnie, wytworzenie korzeni. To podłoże, w którym tworzą się korzenie, zawiera sole, witaminy i cukier w dwukrotnym rozcieńczeniu, a nie zawiera hormonów. Po upływie 10 do 15 dni, implantowane pędy wprowadza się do gleby.

Ustalenie równowagi hormonalnej. Optymalną częstość regeneracji uzyskuje się przez badanie 25 stanów równowagi hormonalnej BAP 0,2-0,5-1-1,5-2 i NAA 0-0,5-0,05 obserwowanych dla BAP 1,5 i 2 mg/litr i NAA 0,05 i 0,1 mg/litr. Przyjmuje się mieszaninę NAA 0,05i BAP 2mg/litr.

2. Inne rośliny dwuliścienne. Rośliny dwuliścienne przedstawione w Tabeli 2 transformowano z użyciem onkogennego szczepu Agrobacterium A281 niosącego kosmid z odpowiednim wektorem i stosując materiał roślinny jak wskazano w Tabeli 2.

B. Pomiar oporności na bromoksynil.

1. Tytoń. Odporność oceniono in vitro na podstawie wzrostu kalusów w obecności bromoksynilu w stężeniu 20 mg/litr w postaci oktawianu i in vivo za pomocą opryskiwania liści bromoksynilem lub joksynilem w dawkach reprezentujących 10-krotną dawkę polecaną w działaniu w otwartym polu. Otrzymane wyniki zreasumowano w Tabeli la.

2. Inne rośliny dwuliścienne. Oporność oceniano in vitro na podstawie wzrostu kalusów w obecności bromoksynilu (w postaci oktanianu) w stężeniu 10 mg/litr podłoża. We wszytkich przypadkach wyniki były pozytywne (tabela 2).

Tabela la

Oporność tiansformowanego tytoniu n bromoksynil

identyfikacja pRPA-BL	Oporność tytoniu
Kalus	Rośliny
203	+	+
204	4-	+
207	+	4_
208	+	+
217	+	+
218	T	4
221	+	-r
222	-r	-T
235	ł-	+
236	+	“Γ
237	+	+
238	+	+
249	4.	T
250	T	4-
251	4-	ł-
252	+	+

Tabela 2

Oporność różnych roślin dwuliściennych na bromoksynil

Rośliny	Materiał roślinny _	pRPA-BL
203	235	249
Licopcrsicom esculentum	hipokotyl	4-	+	+
Solanum tuberosum	bulwa	+		+
Glycine max	hipokotyl	4-	+	+
Bela vulgaris	korzeń	_L	+
Helianthus annuus	hipokotyl	+	+	-t-
Pisum sativum	międzywęźle	+	4-	+
Brassica campestris olcacera	hipokotyl	+	+	+
Daucus carota	korzeń	+	+	+
Phascolus vulgans	hipokotyl	+	+	+

FIG-.1

FIG. 2 lacot ΗΒΕ

Bam HI-Hind ΠΙ ligaza TA

HindlD

Klenow

'Bglll

Smal <^Sma!HindDI '

Klenow λ ligaza TA /\lb^4S

Pstl. EcoRI TA poi

FIG.3

FIG.4

COS

Departament Wydawnictw UP RP Nakład 90 egzi

Cena 10 000 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób transformowania komórek roślinnych w celu nadawania roślinom oporności na środek chwastobójczy oparty na 3,5-dichlorowco-4-hydroksy-benzonitrylu, znamienny tym, że doprowadza się do integracji genu chimerycznego obejmującego co najmniej jeden gen kodujący oporność na ten herbicyd, obcy promotor pochodzący z genu ulegającego naturalnej ekspresji w komórkach roślinnych, który jest wybrany z grupy obejmującej promotor 35S RNA z wirusa mozaiki kalafiora (CaMV 35S) i promotor małej podjednostki (SSU) karboksylazy/oksygenazy rybulozo-l,5-dwufosforanu (RubisCO) słonecznika (Helianthus annuus) oraz region sygnałowy poliadenylacji, z materiałem genetycznym komórki.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się gen chimeryczny obejmujący nie ulegający translacji region pośredni (linker) między promotorem i genem kodującym oporność na herbicyd, wybrany z grupy obejmującej nie ulegający translacji region pUC 19 modyfikowany przez klonowanie, nie ulegający translacji region małej podjednostki RubisCO kukurydzy i nie ulegający translacji region małej podjednostki RubisCO słonecznika.
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stosuje się gen chimeryczny, który dodatkowo zawiera między regionem pośrednim i regionem kodującym oporność na herbicyd, region kodujący peptyd przejściowy zdolny do wprowadzenia białka do chloroplastu transformowanych roślin.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się gen chimeryczny, w którym region kodujący peptyd przejściowy pochodzi z małej podjednostki RubisCO kukurydzy.
5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się gen chimeryczny, w którym region kodujący peptyd przejściowy pochodzi z małej podjednostki RubisCO słonecznika.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się gen chimeryczny, w którym region poliadenylacji pochodzi z genu syntazy nopalinowej.
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się gen chimeryczny, w którym region poliadenylacji pochodzi z genu małej podjednostki RubisCO kukurydzy.
8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się gen chimeryczny obejmujący gen kodujący oporność na bromoksynil lub joksynil lub jedną z ich pochodnych, soli lub estrów.