PL162446B1 - Sposób otrzymywania preparatu diagnostycznego do wykrywania czynnika reumatologicznego w surowicy krwi - Google Patents

Abstract

Sposób otrzymywania preparatu diagnostycznego do wykrywania czynnika reumatologicznego w surowicy krwi z wykorzystaniem mikrosferycznych nośników polistyrenowych, na powierzchni których adsorbuje się ludzką albuminę oraz immobilizuje się ludzką immunoglobulinę G, znamienny tym, że nośnik polistyrenowy otrzymuje się na drodze wodnoemulsyjnej polimeryzacji styrenu w obecności nadsiarczanu potasu oraz estru alkanolu i kwasu di-p-toluilo-karbinolo-orto-fenylenokarboksylowego, a następnie produkt poddaje się dodatkowemu naświetlaniu promieniami gamma do całkowitej konwersji monomeru, na polimer, po czym do zawiesiny wodnej tak otrzymanego nośnika wprowadza się albuminę ludzką w ilości 1-10 mg/ml w środowisku buforowego roztworu fosforanowego o pH 7,4, po przemyciu dodaje roztwór aldehydu glutarowego i wprowadza uprzednio ogrzaną ludzką immunoglobulinę G w ilości 0,2-10 mg/ml, po czym przemywa się buforem glicynowym i ewentualnie konserwuje.

Description

Przedmiotem wynalazku Jest sposób otrzymywania preparatu diagnostycznego, służącego do wykrywania choroby reumatycznθj, poprzez określanie czynnika rruπmtotogiczergo /RF/ w surowicy krwi.

Podstawę otrzymywania preparatu diagnostycznego Jeet wykotzyttenlr mikrosfer polistyrenowych jako nośnika albuminy 1 lmmmneogol:nłUley G. Mikrosfery polietyren<Mr etanowi polistyren w postaci bardzo drobnego ziarna o kształcie ku^Lief^m. Preparat diagnostyczny przedstawia sobę wodnę zawiesinę /emiulję/, której podstawowymi składnikami sę: mikrosfery polistyrenowe i naniesiona /zaadsorbowana/ na ich powierzchnię albumina ludzka oraz zwięzans z nię wiązaniami kowalencyjnymi immuuetg©buliea G.

Metoda określania czynnika reumatologicznego /RF/ w surowicy krwi polega na wykorzystaniu zjawiska aglutynacji czyli zlepiania się mikrosfer pollstyretowych wskutek reakcji zachodzącej pomiędzy składnikami preparatu diagnostycznego i surowicy krwi chorego człowieka.

Zjawisko aglutynacji Jeet obserwowane wizualnie jako w^^tιr^t^^e^r się mikrosfer polistyrenowych z rmuUoJi w postaci kłaczkowatego osadu.

Preparaty diagnostyczne /testy/ maję duże znaczenie w medycynie klinicznej. W tym celu wykorzystuje się obecnie różnorodne mlkrosferoidalne nośniki polimerowe. W opisie petitowym USA nr 3 658 982 przedstawiono praparat zewierajęcy mikrosfery poliβtyrnnowe o wielkości ziarna °,15 /jm, na powierzchni ^których immutillzoeana jest ^-gibulia w iodowisku buforu boranowego o pH 8,6. W opisie patentewym USA nr 3 781 414 opisano preparat zew-erajęcy na nośniku poliθtyrθtewym o wielkości ziarna 0,15 - 0,25 urn iumutilizoeaeę orgoteinę wobec buforu glicenowegt o pH 8,2. Z amerykańskiego patentu nr 3 862 303 znene Jest nanoszenie immunoglobuliny G na powierzchnię nośnika polistyrnnowrgo o wielkości ziarna 0,109 /um z zastosowaniem wyjściowego roztworu białka o stężeniu 0,5 mm/ml. Reakcja aglutynacji zachodzi podczas odwirowywania reagenta 1 surowicy krwi w obecności sacharozy. W patencie holenderski 7 508 139 opisano sposób obróbki nośników poHstyrntewych o wielkości ziarna 0,8 /ju okeyetylenewnnym n^onowNym środkiem powierzchniowo-czynnym. Reakcja aglutynacji mikrosfer poli8tyrntewych nie

162 446 zachodzi w rozcieńczonych roztworach surowicy krwi, Z Japońskiego patentu nr 4 026 327 znane jest stosowanie nośników polistyennowych o rozmiarach ziarna 1,1 jum, na których osadzona została Y-globulina przy stężeniu wyjScnowym białka wynoszęcym 100 - 500 mg/ml, Jako stabilizatora do nośnika dodaje się 2,5% sacharozy ι/uub chlorku choliny, Testowaną surowicę krwi przy użyciu tego preparatu uprzednio należy zdezaktywować,

Z japońskiego patentu nr 8 034 361 znany jest preparat, który zawiera nośnik otrzymany z monomerów winylowych, zawierający na pot^w^rzchn:! nieoonowe środki powiarzchniowoczynne, W charakterze reagenta illlnoOoglcznegn zastosowano mieszaninę poliadenozyny i dwufosforanu rybozy, Nanoszenie białka przeprowadzono w obecności mmtylowanej albuminy surowicy krwi bydlęcej,

Zastosowanie nośników polimerycznych do wytwarzania tego rodzaju preparatów Jest niemożlwwe bez dokładnego sprawdzenia i określenia wymagań jakmm muszę odpowiadać stosowane środki, Zatem cząstki powinny charakteryzować się określoną wielkością ziarna, odpowiednią dla danego obszaru zastosowań jednorodnością, dużą trwałością podczas przechowywwaia, a także wykazywać odporność na działanie elektrolitów w okreśoDnym obszarze pH oraz oddziaływań ładunków elektrycznych środowiska na granicy faz, Cząstki nośnika powinny również posiadać specyficzną powierzchnię tj. zawierać na p^werz^ni funkcjonalne grupy,

Nieoczekiwanie okazało się, że można otrzymać bardzo stabilny diagnostyczny preparat do oznaczania czynnika reumatologicznego - RF, jeżeli jako nośnik mlkrosfernidalnt zastosuje się nośnik pnllstrΓinowy otrzymany na drodze emusyjnej polimeryzacji styrenu w obecności nadsiarczanu potasu, jako inicjatora polimeryzacci i estru alkanolu i kwasu di-p-toluiOokarolnnlo-orto-finylnnotyrnoksyOowego jako emill^etora, a następnie poddany dodatkowemu naśwOetlaiiu promieniami gamma dla uzyskania całkowitej k^row^Ji monomeru na polimer, Do zawiesiny wodnej tak ot^manego nośnika, korzystnie o stężeniu 10%, wprowadza się albuminę ludzką w ilości 1-10 mg/im, za pomocą buforowego roztworu fnsfotanowego o pH 7,4, Po przemyciu dodaje roztwór aldehydu glut^nowegn i wprowadza uprzednio ogrzaną ilmlunogonbllię G w ilości 0,2-10 mg/m, po czym przemywa się buforem glCcinowym o pH 8,2 i ewennualnie konserwuje się, korzystnie roztworem azydku sodowego, Jako bufor foJfotanowy korzystnie jest stosować PBS, który zawiera w 1 litrze roztworu wodnego 8 g NaCL, 0,2 g KH2P04, 0,2 g KCL i 1,15 g NagHPC^,

Otrzymany sposobem według wynalazku preparat charakteryzuje się wysoką specyficznością, dzięki wykorzystaniu pokerowych cząstek o wydarach ziarna zawartych w wąskim zakrssie 0,3 - 0,9 /im, Odznacza się ponadto dużą stabilnością oraz pozwala na przeprowadzenie w sposób szybki określenia czynnika RF, W tym celu miesza się otrzymany preparat z taką samą ilością pełnej surowicy pacjenta; po 3-4 minutach stwierdza się obecność, względnie brak aglutynacci,

Przykład. I. W przykładzie użyto 10% zawiesinę wodną nośnika poli8tyrinowegn otrzymanego na drodze wodnioellsJtπβj polimeryzacji styrenu w obecności nadsiarczanu potasu oraz estru alkanolu i kwasu dwUlp-tnlli0o-ayrbinolo-ontOeiynyinnokarboJyylowegn jako emuugatora, a tak otomany produkt poddano następnie w czasie 17 godzin naśwwet laniu promieniami f o mocy 1 Mrad/h,5 /m powwzszej zawiesiny przemyto trzykrotnie 50/ul wody destylowanej i wprowadzono do roztworu buforowego PBS /pH 7,4/ zawierającego w 1 litrze roztworu wodnego 8 NaCL, 0,2 g KCL, 0,2 g KHgPO^ i 1,15 g NagHPO^. mość zawiesiny nośnika w roztworze bufooDwym doprowadzono do 25,0 /u, Oo otrzymanej za^esiny wprowadzono 100/g albuminy ludzkiej w roztworze PBS w ilości 25 /1, Po 45 minutach przemywano trzykrotnie 500 /1 PBS doprowadzyjąc do objętości 50 yu, Następnie dodano 1,0 /1 25%-owego roztworu aldehydu glutarowego, Po godzinie trzykrotnie przemyto 530 /1 PBS docTo^^dza jąc ilość zawiesiny do 25.0 /u, Następnie wprowadzono w roztworze 25 ul PBS zawierającego 25 ug immllioloonliiy G uprzednio ogrzewanej w ciągu 30 minut w tel^^I^ittlrre 5S⁰C, Po godzinie zawiesinę przemyto trzykrotnie 500 >j1 morowego roztworu glcynoowego o pH 8,2 doprowadzając ilość do 50 ul z dodatkiem 5 /1 0,5% roztworu azydku sodowego. Preparat przechowywano w temperaturze +4°C,

Oznaczenie yellatologicznego czynnika RF polega na wprowadzeniu do 50/1 tak otrzymanego preparatu takiej samej ilości nierozcleńczonej surowicy krwi ludzkiej, W przypadku obecności czynnika RF w ciągu 3 minut zachodzi aglutynacja w badanej surowicy krwi,

162 446

Zakład Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 10 000 zł

Claims (3)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób otrzymywania preparatu diagnostycznego do wykrywania czynnika reumatologicznego w surowicy krwi z wykorzystaniem rnikroeferycznych nośników polietyeenowych, na powierzchni których adsorbuje się ludzkę albuminę oraz immmoblizuje się ludzkę immmunogobolinę G, znamienny t y m, że nośnik poli8tyeeoowt otrzymuje się na drodze w^t^r^t^^r^mu^s/jnej polimeryzacji styrenu w obecności nadsiarczanu potasu oraz estru alkanolu 1 kwasu dl-p-tolullokarbinolo-orto-fetyletoaarbokβylowego, a następnie produkt poddaje eię dodatkowemu naświetleniu promieniami gamma do całkowitej konwersji monomeru na polimer, po czym do zawiesiny wodnej tak otrzymanego nośnika wprowadza się albuminę ludzkę w ilości 1-10 mg /ml w środowisku buforowego roztworu fosforanowego o pH 7,4, po przemyciu dodaje roztwór aldehydu glutarowego 1 wprowadza uprzednio ogrzanę ludzkę im^unnoo^bu^nę G w ilości 0,2 - 10 mg/ml, po czym przemywa się buforem glitetewym 1 ewentualnie konserwuje.
2. 2. Sposób według zaetrz. 1, znamienny tym, że jako środek konserwujęcy stosuje się azydsk sodowy.
3. 3. Sposób według zaetrz. 1, znamienny tym, że do wprowadzenia albuminy stosuje się roztwór buforowy zewierajęcy w Jednym li itrze roztworu wodnego 8 g chlorku sodowego,

   0,2 g chlorku potasowego, 0,2 g kwaśnego fosforanu potasowego 1 1,15 g kwaśnego fosforanu sodowego.