PL162962B1 - Sposób wprowadzania egzogennego DNA do somatycznych i rozrodczych komórek PL PL PL - Google Patents

Abstract

1. Sposób wprowadzania egzogennego DNA do somatycznych i rozrodczych komórek zwierzecych, znamienny tym, ze wprowadza sie wspomniany DNA, egzogenny lub zmodyfiko- wany zgodnie ze znanymi technikami rekombinantowego DNA, do plemników zwierzecia, które zamierza sie zmodyfikowac, oraz stosuje sie wspomniane plemniki do zaplodnienia jaj zgodnie ze zwyklymi technikami sztucznego zapladniania. PL PL PL

Description

Wynalazek dotyczy sposobu wprowadzania egzogennego DNA do somatycznych i rozrodczych komórek zwierzęcych. W szczególności, sposób ten polega na wprowadzaniu DNA, egzogennego lub zmodyfikowanego zgodnie ze znanymi technikami rekombinantowego DNA, do plemników zwierzęcia, które mają być zmodyfikowane, oraz zastosowania tych plemników do zapłodnienia jaja zgodnie ze znanymi technikami sztucznego zapładniania.

Tworzenie zwierząt transgenicznych, to jest zwierząt, w których w sposób trwały zintegrowane są informacje genetyczne obce w stosunku do ich własnego genomu i pochodzące z innych układów genetycznych, było i ciągle jeszcze jest celem o zasadniczym znaczeniu dla badań regulacji genetycznej, tak w zamierzeniach chemicznych jak i terapeutycznych, oraz w hodowli zwierząt domowych będących ssakami, ryb, szkarłupni i gadów.

W rzeczywistości jest rzeczą możliwą tworzenie zwierząt o szczególnych, korzystnych cechach charakterystycznych, takich jak np. szybkość wzrostu lub oporność na pewne choroby w przypadku zwierząt przeznaczonych do hodowli, albo odwrotnie, predyspozycja do pewnych chorób w przypadku zwierząt stosowanych do eksperymentalnych badań nad nowymi lekami. Pierwsze usiłowania otrzymania zwierząt transgenicznych sięgają wstecz do połowy lat siedemdziesiątych. Usiłowania te bazowały głównie na manipulacjach z mysimi embrionami lub komórkami w

162 962 hodowli i na bezpośrednim wprowadzaniu DNA (np. SV40) do jam blastocystowych myszy, jak to opisali Μ. H. L. i A. Mc Laren w Experimental Celi Research, 86,1-8 (1924) oraz R. Jaenisch i B. Mintz w Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71, 1250-1254 (1974).

Uzyskane rezultaty okazały się jednakże zawodne, w szczególności dlatego, że zastosowane techniki były trudne.

W 1980 roku John W. Gordon i in. opisali w Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77X12, 7380-7384 (1980), nową technikę transformacji genetycznej embrionów mysich na drodze mikroiniekcji klonowanego DNA do przedjądrza zapłodnionych oocytów.

Poddane takiemu działaniu zygoty reimplantowano do macicy pseudociężamej matki i ciążę doprowadzano do rozwiązania.

Za pomocą tej techniki, która została udoskonalona w ostatnich latach, wykazano, że możliwe jest wprowadzenie egzognnego DNA do somatycznych i rozrodczych komórek mysich, w wyniku czego otrzymuje się zwierzęta transgeniczne.

Typowym przykładem zwierząt transgenicznych otrzymanych techniką mikroiniekcji egzogennego DNA do zapłodnionych jaj i zastosowanych do eksperymentalnego leczenia przeciwnowotworowego, są myszy opisane w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 376 866, które wykazują w swoich komórkach somatycznych i rozrodczych obecność sekwencji onkogennej.

Technika mikroiniekcji jest obecnie w trakcie eksprementowania w dziedzinie hodowli, tym niemniej jednak nie ma informacji co do ostatecznie osiągniętych rezultatów.

Mikroiniekcja DNA do zapłodnionych oocytów stanowi w każdym przypadku technikę skomplikowaną i kosztowną, o niskiej wydajności z powodu wysokiego wskaźnika poronień, wysokiego wskaźnika mozaikowatości u otrzymanych zwierząt i znacznej ich bezpłodności.

Zasadniczym porblemem technicznym rozwiązanym przez wynalazek jest wprowadzenie DNA, na który podziałano zgodnie ze znanymi technikami rekombinantowego DNA, do komórek zwierzęcia należącego do gatunku zwierząt, w którym aktualnie nie występują typowe sekwencje wprowadzanego egzogennego DNA, w wyniku czego doprowadza się do trwałej integracji informacji genetycznych zawartych we wspomnianym rekombinantowym DNA z genomem osobnika, na którego podziałano, a informacje te mogą zatem być przeniesione na zstępne potomstwo tego osobnika.

Sposób według wynalazku wprowadzania klonowanego DNA do komórek różnych gatunków oparty jest na eksperymentalnej obserwacji, a mianowicie na zaskakującej łatwości, z jaką cząsteczki, nawet dużych rozmiarów, z powodzeniem wnikają do główki plemnika. Tę właściwość, typową dla plemników tak ssaków jak i innych gatunków zwierząt, wykorzystano do modyfikowania plemników przez wprowadzenie do nich klonowanego DNA, który ma być przeniesiony.

Następnie zapładnia się odpowiednie oocyty zmodyfikowanymi plemnikami z wykorzystaniem technik sztucznego zapładniania, stosowanych odnośnie do plemników nie zmodyfikowanych.

Zgodnie z zasadniczymi cechami charakterystycznymi wynalazku, plemników gatunku, do którego chce się wprowadzić informację genetyczną obcą w stosunku do jego własnych genomów i pochodzącą z innych układów, używa się jako wektorów do przeniesienia obcego DNA.

Jedna z możliwych dróg przeprowadzenia procesu sposobem według wynalazku obejmuje następujące etapy: a) sporządzenie wodnej zawiesiny plemników, b) transformowanie plemników klonowanym DNA, c) zapłodnienie zmodyfikowanymi plemnikami ooctyów „in vitro“, d) implantowanie zapłodnionych oocytów pseudociężarnym samicom wybranego gatunku.

Zgodnie z inną możliwą drogą przeprowadzenia procesu sposobem według wynalazku, zmodyfikowanych plemników można użyć bezpośrednio do zapłodnienia zwierzęcia z pominięciem zapłodnienia oocytu „in vitro“ z następującym po tym implantowaniem go pseudociężarnym samicom. Ten sposób realizacji wynalazku jest szczególnie użyteczny gdy stosuje się go do hodowli.

Sposób według wynalazku jest znacznie prostszy, znacznie szybszy i mniej kosztowny niż technika mikroiniekcji i nie doprowadza on do poronień, bardzo częstych w przypadku techniki mikroiniekcji.

162 962

Wynalazek zostanie obecnie szczegółowo opisany w przykładzie poniżej.

Przykład . Przykład ten dotyczy modyfikacji w konkretnym odniesieniu do plemników mysich. Zastosowano to zwierzę, ponieważ co do wszystkich technik laboratoryjnych odnoszących się do jego zapłodnienia „in vitro“ i badania integracji i ekspresji jego genów istnieją obszerne doniesienia w piśmiennictwie naukowym.

Zastosowanym egzogennym DNA jest pSV2 CAT, Polyoma i gen ludzkiego hormonu wzrostu, ponieważ ich mapy restrykcyjne zostały opisane w piśmiennictwie i zawierają sekwencje zasad, które nie są w naturalny sposób obecne w genomie mysim.

Identyfikacja tych sekwencji w „pozytywnej myszy, to jest myszy otrzymanej z jaja zapłodnionego plemnikami poddanymi działaniu, pozwala na stwierdzenie bez cienia wątpliwości, że klonowany DNA został rzeczywiście wprowadzony do plemników poddanych działaniu, a przez nie do zapłodnionych jaj i jest więc zintegrowany z genomem powstających osobników transgenicznych.

a) Preparaty plemników. Zawiesinę plemników otrzymuje się za pomocą wyciśnięcia najądrza samca myszy do 1 ml buforu PM (otrzymanego w sposób opisany przez D. G. Whittingama, Culture of Mouse - ove, J. Reprod. Fert Supp., 14, 7-21 /1971/).

Zawiesinę plemników wiruje się tak, aby oddzielić plemniki, które zostają ponownie zawieszone w 1 ml buforu.

Powyższą obróbkę powtarza się pięciokrotnie, tak aby „przemyć plemniki przez zapewnienie całkowitego wyeliminowania płynu nasiennego.

Modyfikuje się bufor za pomocą wyeliminowania mleczanu sodowego, penicyliny i sterptomycy i zastąpienia fosforanu monosodowego 0,15 mM fosforanem disodowym oraz zmiany ilości chlorku sodowego na 120 mM. Następnie zawiesinę plemników rozcieńcza się do 1-2 milionów/ml i inkubuje w ciągu od 30 minut do 3 godzin w temperaturze od 20 do 37°C w atmosferze powietrza zawierającego ponad 5 do 10% ditlenku węgla.

b) Transformacja plemników za pomocą DNA. Roztwór klonowanego, kolistego DNA, który ma być wprowadzony do plemników, dodaje się do rozcieńczonej zawiesiny plemników (w 500 μ! frakcjach) i otrzymaną mieszaninę dalej inkubuje w ciągu co najmniej 30 minut w temperaturze od 0 do 37°C w atmosferze powietrza zawierającego ponad 5 do 10% ditlenku węgla.

W temperaturze niższej wprowadzanie DNA do plemników jest łatwiejsze, a to z powodu zmniejszonej aktywności endogennej nukleazy plemników, ale czas inkubacji jest w tym przypadku dłuższy od 30 minut.

Klonowany kolisty DNA dodaje się w takiej ilości, aby uzyskać końcowe stężenie klonowanego DNA w mieszaninie mieszczące się w zakresie 0,4-2pg/ml.

c) Zapłodnienie jaj. U dojrzałych samic mysich indukuje się superowulację za pomocą ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej i wydziela się jaja z jajowodu po upływie 14,5 godziny od wstrzyknięcia (według metody opisanej przez B. Hogana i in. w „Manipulating the Mouse Embryo. A Laboratory Manual, CsM, New York, 1986).

Jaja wydzielone z jajowodów wprowadza się do 500 μ! frakcji transformowanych plemników i inkubuje w ciągu 5 do 10 godzin w temperaturze od 20 do 37°C w atmosferze powietrza zawierającego ponad 5 do 10% ditlenku węgla. Przy końcu tego okresu jaja przemywa się buforem M16 otrzymanym jak opisał Whittingam (patrz p. a/ wyżej) i pozostawia na całą noc w 50 μ! tego samego buforu.

Po upływie 24 godzin embriony przenosi się chirurgicznie, w stadium dwóch komórek, do jajowodów pseudociężarnych samic.

Potomstwo pochodzące z tych implantów w wieku trzech tygodni poddaje się amputacji końcowego fragmentu ogona, z którego ekstrahuje się DNA i analizuje stosując „blotting techniką Southerna opisany w książce „Molecular Cloning: A Laboratory Manuał przez T. Maniatisaiin., CSM, New York, 184.

Analiza ta pozwala zidentyfikować osobniki „pozytywne, to jest te, w których genomach znajduje się, zintegrowany albo w postaci episomów, w jednej, lub w większej ilości kopii, ten sam klonowany DNA, który został wprowadzony do wyjściowych plemników.

162 962

Wydajność uzyskania w procesie prowadzonym sposobem według wynalazku „pozytywnych osobników jest zawsze wyższa od 30%, do 70%, a co więcej, nie ma wśród nich osobników niepłodnych.

Następującą potem charakterystykę genetyczną zwierząt pozytywnych prowadzi się dwiema metodami analitycznymi: analizą restrykcyjną i analizą sekwencji.

Analizę genomowego DNA myszy pozytywnych prowadzi się dwiema metodami.

Analiza restrykcyjna. Do analizy restrykcyjnej DNA stosuje się specyficzne enzymy restrykcyjne pozwalające na podzielenie genomowego DNA na fragmenty. Otrzymane fragmenty frakcjonuje się następnie za pomocą elektroforezy i przenosi na filtr celulozowy zgodnie ze znaną techniką blottingu Southerna. Następnie na filtr działa się sondą specyficzną wobec wyjściowego klonowanego DNA, zastosowanego do transformowania plemników, nadaje się promieniotwórczość przy użyciu 3²P i eksponuje na błonę fotograficzną wrażliwą na promieniowanie X.

Błona fotograficzna zostaje eksponowana odpowiednio do miejsc, gdzie promieniotwórcza sonda została związana z filtrem, to jest odpowiednio do każdego promieniotwórczego pasma DNA, pozostawiając sygnał dla każdego fragmentu DNA.

Obecność jednego, lub większej ilości sygnałów, ich ilość i wymiary fragmentów DNA, które one reprezentują, pozwalają wnioskować, że istnieją sekwencje analogiczne do sondy dla genomu myszy pozytywnej i określić mapę restrykcyjną.

Analogia między tą mapą, a mapą klonowanego DNA wprowadzonego do plemników, z których pochodzi mysz „pozytywna, zapewnia, że wyjściowe sekwencje klonowe są zintegrowane z genomem myszy transgenicznej.

Analiza sekwencji. W celu zanalizowania sekwencji zasad tworzących genom myszy „pozytywnej poddaje się restrykcji enzymem EcoRI takie same (15/yg) ilości genomowego DNA myszy pozytwnej i plazmidu pUC13 opornego na ampicylinę.

Następnie miesza się dwa DNA poddane restrykcji, przeprowadza ponownie w postać kolistą i wprowadza do bakterii Escherichia coli HB101, które hoduje się następnie na agarze z ampicyliną.

Kolonie pozytywne, to jest kolonie zawierające klonowany fragment, oddziela się, amplifikuje i oczyszcza. Następnie oddziela się klonowany fragment od wektora pUC13 z wykorzystaniem restrykcji EcoRI i poddaje z tego sekwencjonowaniu 626 zasad z użyciem metody Langera.

Jest więc możliwe stwierdzenie, że wyjściowy klon został przeniesiony z plemników do zapłodnionego jaja i następnie zintegrowany z genomem powstałego osobnika.

Oprócz dwóch metod podanych powyżej przeprowadza się analizę plemników po ich transformacji klonowanym DNA w celu stwierdzenia umiejscowienia egzogennego DNA. W tym celu stosuje się DNA znakowany ³H i różne próbki roztworów z plemnikami po ich inkubacji ze znakowanym DNA poddaje się autoradiografii w mikroskopie optycznym i elektronowym. Otrzymane wyniki dowodzą, że klonowany DNA jest specyficznie umiejscowiony w główce plemnika w pozycji podrównikowej. Ślady promieniotwórczości w innych regionach plemników są nieistotne.

Tak jak to jest wiadome, że reakcja akrosomalnej fuzji między plemnikiem a oocytem w momencie zapłodnienia (z przeniesieniem materiału genetycznego z plemnika do jaja) zachodzi w tym szczególnym regionie, uważa się, że również egzogenny DNA przenoszony jest w tym samym czasie i tą samą drogą, co DNA właściwy dla gatunku. Mechanizm ten może wyjaśniać zaskakującą wydajność procesu prowadzonego sposobem według wynalazku.

Claims (6)

1. Sposób wprowadzania egzogennego DNA do somatycznych i rozrodczych komórek zwierzęcych, znamienny tym, że wprowadza się wspomniany DNA, egzogenny lub zmodyfikowany zgodnie ze znanymi technikami rekombinantowego DNA, do plemników zwierzęcia, które zamierza się zmodyfikować, oraz stosuje się wspomniane plemniki do zapłodnienia jaj zgodnie ze zwykłymi technikami sztucznego zapładniania.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że a) sporządza się wodną zawiesinę plemników, b) modyfikuje się plemniki klonowanym DNA, c) zapładnia się zmodyfikowanymi plemnikami oocyty „in vitro“, d) implantuje się zapłodnione oocyty pseudociężarnym samicom wybranego gatunku.

3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że wspomnianą wodną zawiesinę plemników buforuje się buforem FM, rozcieńcza do stężenia plemników l-2milionów/ml i inkubuje w temperaturze 20 do 37°C w ciągu od 30 minut do 3 godzin w atmosferze powietrza zawierającego ponad 5 do 10% ditlenku węgla.

4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że roztwór klonowanego, kolistego DNA, który ma być wprowadzony do plemników, dodaje się do wspomnianej, inkubowanej wodnej zawiesiny plemników i dalej inkubuje w ciągu co najmniej 30 minut w temperaturze od 0 do 37°C, przy czym wspomniany roztwór dodaje się w takiej ilości, aby uzyskać końcowe stężenie klonowanego DNA w mieszaninie od 0,4 do 2pg/ml.

5. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że oocyty, które mają zostać zapłodnione, dodaje się do wodnej inkubowanej zawiesiny plemników i mieszaninę inkubuje w ciągu 5 do 10 godzin w temperaturze od 20 do 37°C w atmosferze powietrza zawierającego ponad 5 do 10% ditlenku węgla.

6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że embriony otrzymane z zapłodnionych oocytów jak opisano, gdy osiągną stadium rozwojowe dwóch komórek chirurgicznie przenosi się do jajowodów pseudociężamych samic.