PL163608B1 - Sposób wydzielania glberelln z roztworów wodnych - Google Patents

Abstract

Sposób wydzielania giberelin z roztworów wodnych powstałych w procesie wytwarzania metodą fermentacyjną na drodze sorpcji giberelin na niejonowych sorbentach syntetycznych, a następnie desorpcji, znamienny tym, że desorpcję przeprowadza się wodnym roztworem substancji alkalicznych o pH nie mniejszym niż 10, ewentualnie z dodatkiem soli nieorganicznej w ilości 5-20% wagowych w stosunku do ilości roztworu, otrzymany eluat zakwasza się do pH 2-3 i ekstrahuje rozpuszczalnikami organicznymi słabo rozpuszczającymi się w wodzie, a z ekstraktu wydziela się gibereliny przez częściowe odparowanie rozpuszczalnika i wychłodzenie.

Description

Wynalazek dotyczy sposobu wydzielania giberelin na drodze sorpcji z roztworów wodnych, a głównie z roztworu powstającego w procesie wytwarzania tych substancji metodą fermentacji.

Gibereliny, a w tej liczbie głównie kwas giberelinowy, zwany również gibereliną A-3, wytwarzane są w skali przemysłowej metodą fermentacyjną, jako płynna kultura grzyba Fusarium monoliforme. Wspólną cechą giberelin jest stymulowanie wzrostu roślin, co przy odpowiednim nawożeniu może w bardzo dużym stopniu zwiększyć wydajność produkcji roślinnej. Znane są przypadki nawet 2-3-krotnego zwiększenia wydajności, na przykład w przypadku winorośli bezpestkowych. Po zakończeniu procesu fermentacyjnego powstałe gibereliny odsącza się od biomasy i klarowany przesącz poddawany zostaje szeregowi procesów w celu wydzielenia znajdujących się w nich giberelin. W roztworze po biosyntezie gibereliny znajdują się w ilości od 0,01 do 0,05% w zależności od aktywności szczepu, składu pożywki oraz sposobu prowadzenia procesu fermentacji. Stężenie te są w sumie bardzo niskie i wydzielenie giberelin z dużą wydajnością, natrafia na bardzo znaczne trudności techniczne.

Nowoczesne metody wydzielenia giberelin opierają się głównie na stosowaniu sorpcji i desorpcji. Znana jest metoda adsorpcji giberelin na węglu aktywnym i następnej desorpcji ich acetonem lub metanolem. Wadą tej metody jest niemożność całkowitego odzysku zasorbowanych giberelin oraz fakt, że węgiel może być użyty tylko jednokrotnie. Inna, bardziej efektywna metoda polega na sorbowaniu giberelin na sorbentach syntetycznych, które można stosować wielokrotnie.

Według polskiego opisu patentowego nr C12P 27/00 126 043 do sorpcji giberelin stosowane są syntetyczne żywice makroporowate niepolarne lub średniopolarne, a następnie desorpcję giberelin przeprowadza się wodnymi roztworami rozpuszczalników organicznych takich jak aceton, metanol czy etanol. W dalszym etapie produkcyjnym z uzyskanych eluatów należy odparować rozpuszczalnik organiczny i dopiero z pozostałości wodnej wydzielać gibereliny. Metoda ta pozwala na ilościową sorpcję giberelin i prawie ilościową desorpcję. Jednakże bardzo poważną jej wadą jest konieczność odparowania rozpuszczalnika z eluatów. W procesie odparowywania, w podwyższonej temperaturze następuje znaczny, nawet do 20% sięgający rozkład giberelin. Gibereliny zawierają pierścień laktonowy, który jest niestabilny i w podwyższonej temperaturze ulega pękaniu (hydrolizie), skutkiem czego produkt traci całkowicie aktywność. Ponadto wadą tej metody jest

163 608 słaba selektywność desorpcji. Znaczy to, że wraz z giberelinami desorbuje się znaczna ilość zanieczyszczeń.

Sposób według wynalazku w znacznym stopniu usprawnia tę metodę i umożliwia uzyskiwanie wydajności wydzielania wyższej o 10 do 20%, poprzez wyeliminowanie z procesu sorpcji i desorpcji rozpuszczalników organicznych, co równocześnie eliminuje konieczność późniejszego ich odparowywania.

Stwierdzono nieoczekiwanie, że zasobrowany na syntetycznych sorbentach niejonowych gibereliny dają się efektywnie desorbować rozcieńczonymi roztworami substancji alkalicznych, korzystanie z dodatkiem soli nieorganicznych.

Sposób według wynalazku polega na tym, że zasorbowane na niejonowych sorbentach syntetycznych gibereliny desorbuje się wodnym roztworem substancji alkalicznych o pH nie mniejszym niż 10, korzystnie z dodatkiem soli nieorganicznej w ilości 5-20% wagowych w stosunku do ilości roztworu, a najkorzystniej 8-12% wagowych.

Stosowanie mniejszego stężenia soli powoduje rozciąganie desorpcji giberelin przy równoczesnym zmniejszeniu selektywności. Otrzymany eluat zakwasza się do pH 2-3 i ekstrahuje polarnymi rozpuszczalnikami organicznymi słabo rozpuszczającymi się w wodzie, takimi jak octan etylu lub alkohol n-butylowy, a z esktraktu wydziela się gibereliny przez częściowe odparowanie rozpuszczalnika i wychłodzenie.

Jako substancje alkaliczne do desorpcji korzystnie jest stosować wodorotlenek sodu lub potasu, a jako dodatek soli nieorganicznych - chlorki lub siarczany sodu i potasu.

Pomimo, że gibereliny są nie trwałe w środowisku silnie alkalicznym i silnie kwaśnym, stwierdzono, że stosowanie rozcieńczonych roztworów alkaliów, ewentualnie z dodatkiem soli, przeprowadzone w krótkim czasie nie powoduje zauważalnych strat spowodowanych hydrolizą pierścienia laktonowego. W przypadku jeżeli wydzielanie giberelin nie przeprowadza się od razu, przechowywane eluaty po desorpcji zakwasza się do ph około 8.

Sposób według wynalazku pozwala na osiągnięcie odzysku giberelin z wydajnością nawet powyżej 90% w stosunku do ilości zawartej w roztworze przed sorpcją.

Przykład I. W przykładzie użyto klarowny roztwór wodny po biosyntezie o zawartości 0,035% giberelin. Roztwór ten przepuszczano, do obsadzenia znanym sposobem, przez niejonowy, niepolarny sorbent syntetyczny typu Amberlit XAD-16. Następnie od góry kolumny przepuszczono na jedną objętość sorbenta w kolumnie około 4,5 objętości 0,2% wodnego roztworu wodorotlenku sodowego o pH 11,5. Po ukazaniu się ciemniejszego wycieku, zaczęto odbierać główną frakcję eluatów. Po odebraniu 1,5 objętości eluatów, w stosunku do ilości sorbenta w kolumnie, stwierdzono w wycieku znaczny spadek giberelin. W tabeli 1 przedstawiono wyniki desorpcji z podaniem objętości i stężenia giberelin.

Tabela 1

Wyniki desorpcji giberelin 0,2% wodnym roztworem wodorotlenku sodu

Nr frakcji	Objętość frakcji w obj /obj	Zawartość giberelin %	pH
1	3/4	0,055	4.18
2	1/2	0,302	4,95
3	1/2	0,578	8,57
4	1/2	0,345	9,85
5	1/2	0,191	11,37
6	1/2	0,064	11,52
7	1/2	ślad	11,58
8	1/2	brak	11,76

W frakcjach 2, 3 i 4 znajduje się większość zasorbowanych giberelin. Stanowią one 1,5 objętości sorbenta w kolumnie. Frakcje 5 i 6 zawierające gibereliny w dużym rozcieńczeniu zawracano jako eluat do desorpcji w następnym cyklu wydzielania. Frakcje dalsze nie zawiei ają już giberelin. Frakcje 2, 3 i 4 zmieszano razem i od razu po desorpcji przeprowadzono wydzielenie giberelin. W tym celu eluaty zakwaszono kwasem solnym do pH 2,5 i ekstrahowano octanem etylu

163 608

3-krotnie, stosując za każdym razem octan etylu w ilości 1/2 objętości eluatu. Z ekstraktów octanowych odparowano część octanu etylu, pod zmniejszonym ciśnieniem, aż do momentu pojawienia się pierwszych kryształów giberelin. Po ochłodzeniu oddzielono krystaliczne gibereliny. Z ługów wydzielono następną porcję, znanym sposobem. Uzyskano gibereliny zawierające 93% gibereliny A-3 z wydajnością 76% w stosunku do ilości znajdującej się w cieczy po fermentacji.

Przykład II. W przykładzie użyto roztwór po biosyntezie identyczny jak w przykładzie I z tą różnicą, ze do desorpcji użyto wodny roztwór o zawartości 0,5% wodorotlenku sodowego, wykazującego pH \\,8. Frakcję główną rozpoczęto odbierać po ukazaniu się ciemniejszego wycieku z kolumny. Przebieg tej desorpcji obrazuje tabela 2.

Tabela 2

Wyniki desorpcji giberelin 0,5% wodnym roztworem wodorotlenku sodowego

Nr frakcji	Objętość frakcji w obj./obj	Zawartość giberelin %	PH
1	4/5	0,080	4,4
2	1/2	0,720	6,16
3	1/2	0,258	10,4
4	1/2	0,073	11,6
5	1/2	ślad	11,6
6	1/2	brak	11,6

Główna ilość giberelin znajdowała się we frakcjach 2 i 3 stanowiących jedną objętość w stosunku do ilości sorbentu w kolumnie. Do zawrotu skierowano tylko frakcję 4. Frakcje 2 i 3 zmieszano razem i zakwaszono do pH8. Wydzielenie giberelin przeprowadzono po 24 godzinach. Przed wydzieleniem giberelin eluaty zakwaszono do ph 2,8 i ekstrahowano alkoholem n-butylowym. Wykonano trzy kolejne ekstrakcje stosując przy pierwszej ekstrakcji alkohol w ilości \,\, a przy dwóch następnych w ilości \:2. Ekstrakty zmieszano razem i wydzielono z nich gibereliny w sposób zbliżony jak w przykładzie I. Uzyskano gibereliny z wydajnością 89% w stosunku do ilości znajdującej się w cieczy do sorpcji.

Przykład III. Przykład wykonano w sposób podobny jak w przykładzie I z tą różnicą, że do desorpcji giberelin użyto 0,2% wodny roztwór wodorotlenku potasowego. Przebieg desorpcji i wydzielania giberelin praktycznie nie odbiegał od przebiegu i wyników uzyskanych w przykładzie I.

Przykład IV. Obsadzanie sorbenta giberelinami przeprowadzono podobnie jak w przykładzie I z tą różnicą, że do desorpcji giberelin stosowano jako eluat 8% wodny roztwór chlorku sodowego z dodatkiem 0,5% wodorotlenku sodowego. Roztwór ten o pH \\,4 przepuszczano przez kolumnę od góry, tak jak w przykładzie I. Frakcje główne rozpoczęto odbierać po ukazaniu się ciemniejszego wycieku. Przebieg desorpcji przedstawiono w tabeli 3.

Tabela 3

Wyniki desorpcji giberelin, 8% wodnym roztworem chlorku sodowego alkalizowanym 0,5% wodorotlenkiem sodu

Nr frakcji	Objętość frakcji w obj /obj	Zawartość giberelin %	pH
1	1/2	0,045	4,57
2	1/2	0,625	4,45
3	1/2	0,286	11,56
4	1/2	0,209	11,57
5	1/2	ślad	11,57
6	1/2	brak	11,57

Praktycznie cała ilość giberelin znajdowała się we frakcjach 2, 3 14, a więc w ilości równej \,5 objętości sorbenta. Dalsze frakcje nie zawierały już giberelin. Przeprowadzono bardzo ostrą desoipcję. Ponadto eluaty wykazywały wyższą czystość niż uzyskiwane przy desorpcji roztworem wodorotlenku sodowego bez dodatku chlorku sodu. Do wydzielenia giberelin zlano frakcje 2,3 i 4 i zakwaszono je do ph 2,6. Wydzielenie dokonywano przez ekstrakcję octanem etylu w sposób identyczny jak w przykładzie I. Uzyskano gibereliny z wydajnością 92% w stosunku do ich ilości w roztworze do sorpcji.

Przykład V. Przykład wykonano podobnie jak w przykładzie IV, z tą różnicą, że do desorpcji stosowano \5°/o wodny roztwór siarczanu sodowego alkalizowany 1% wodorotlenku sodowego. Uzyskano wynik zbliżony do przykładu IV.

163 608 zakwaszono je do pH 2,6. Wydzielenie dokonywano przez ekstrakcję octanem etylu w sposób identyczny jak w przykładzie I. Uzyskano gibereliny z wydajnością 92% w stosunku do ich ilości w roztworze do sorpcji.

Przykład V. Przykład wykonano podobnie jak w przykładzie IV, z tą różnicą, że do desorpcji stosowano 15% wodny roztwór siarczanu sodowego alkalizowany 1% wodorotlenku sodowego. Uzyskano wynik zbliżony do przykładu IV.

Claims (5)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wydzielania giberelin z roztworów wodnych powstałych w procesie wytwarzania metodą fermentacyjną na drodze sorpcji giberelin na niejonowych sorbentach syntetycznych, a następnie desorpcji, znamienny tym, że desorpcję przeprowadza się wodnym roztworem substancji alkalicznych o pH nie mniejszym niż 10, ewentualnie z dodatkiem soli nieorganicznej w ilości 5-20% wagowych w stosunku do ilości roztworu, otrzymany eluat zakwasza się do pH 2-3 i ekstrahuje rozpuszczalnikami organicznymi słabo rozpuszczającymi się w wodzie, a z ekstraktu wydziela się gibereliny przez częściowe odparowanie rozpuszczalnika i wychłodzenie.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku przechowywania eluatów po desorpcji zakwasza się je do pH około 8..
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się dodatek soli nieorganicznej w ilości 8-12% wagowych w stosunku do ilości roztworu.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako substancje alkaliczne do desorpcji stosuje się wodorotlenek sodu lub potasu.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako dodatek soli nieorganicznych stosuje się chlorek lub siarczan sodu albo potasu.