PL164209B1

PL164209B1 - A method of producing new pentapeptides containing alpha-methylserine

Info

Publication number: PL164209B1
Application number: PL28539190A
Authority: PL
Inventors: Miroslaw Leplawy; Aleksandra Olma; Zbigniew S Herman; Krzysztof S Golba; Ewa Obuchowicz
Original assignee: Politechnika Lodzka
Priority date: 1990-05-28
Filing date: 1990-05-28
Publication date: 1994-06-30
Also published as: PL285391A1

Abstract

Sposób wytwarzania nowych pentapeptydówzawierających alfa-metyloserynę, o wzorze ogólnym 1, w którym Tyr oznacza tyrozyny, alfaMeSer oznacza R- lub S-alfa-metyloserynę, Gly oznacza glicynę, Phe oznacza fenyloalaninę, A oznacza resztę aminokwasu białkowego, X oznacza garupę OH, NH2 lub grupę O-alkilową, znamienny tym, że dipeptyd tyrozylo-alfametyloserynę, w którym grupa aminowa tyrozyny jest blokowana za pomocą grupy tert-butoksykarbonylowej, zaś grupa hydroksylowa alfa-metyloserynyjest chroniona w postaci eteru tert-butylowego, poddaje się kondensacji z estrem alkilowym, korzystnie metylowym tripeptydu o wzorze ogólnym 2, w którym wszystkie symbole mają wyżej podane znaczenie, w obecności odczynnika peptydotwórczego, korzystnie mieszaniny 1,3-dicykloheksylokarbodiimidu i 1-hydroksybenzotriazolu oraz w obecności N-metylomorfoliny, w środowisku mieszaniny dimetyloformamidu i chlorku metylenu, po czym w otrzymanym N-, O- i C-blokowanym pentapeptydzie uwalnia się C-terminalną grupę karboksylową na drodze hydrolizy alkalicznej lub otrzymuje C-terminalny amid na drodze amonolizy za pomocą ciekłego amoniaku oraz zdejmuje N-terminalną grupę ochronną tert-butoksykarbonylową z tyrozyny oraz grupę tert-butylową z alfametyloseryny przy użyciu kwasu trifluorooctowego.A method for the preparation of new pentapeptides containing alpha-methylserine, of the general formula 1, wherein Tyr denotes tyrosine, alphaMeSer denotes R- or S-alpha-methylserine, Gly denotes glycine, Phe denotes phenylalanine, A denotes the residue of a protein amino acid, X denotes OH, NH2 or an O-alkyl group, characterized in that the dipeptide tyrosyl-alphamethylserine, in which the amino group of tyrosine is blocked by a tert-butoxycarbonyl group, and the hydroxyl group of alpha-methylserine is protected in the form of a tert-butyl ether, is condensed with an alkyl ester, preferably a methyl ester, of a tripeptide of the general formula 2, in which all symbols have the above-mentioned meaning, in the presence of a peptide-forming reagent, preferably a mixture of 1,3-dicyclohexylcarbodiimide and 1-hydroxybenzotriazole and in the presence of N-methylmorpholine, in a mixture of dimethylformamide and methylene chloride, after which the C-terminal carboxyl group in the obtained N-, O- and C-blocked pentapeptide is released by alkaline hydrolysis or the C-terminal amide is obtained by ammonolysis using liquid ammonia and the N-terminal tert-butoxycarbonyl protecting group is removed from tyrosine and the tert-butyl group from alphamethylserine using trifluoroacetic acid.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych pentapeptydów zawierających alfa-metyloserynę, o wzorze ogólnym 1, w którym Tyr oznacza tyrozynę alfaMeSer oznacza R-lub S-alfa-metyloserynę, Gly oznacza glicynę, Phe oznacza fenyloalaninę, A oznacza resztę aminokwasu białkowego, X oznacza grupę OH, NH 2 lub grupę O-alkilową. Peptydy te wykazują silne, długotrwałe działanie analgetyczne i w związku z tym mogą znaleźć zastosowanie w lecznictwie.The present invention relates to a process for the preparation of new alpha-methylserine-containing pentapeptides of general formula I, in which Tyr is tyrosine, alphaMeSer is R- or S-alpha-methylserine, Gly is glycine, Phe is phenylalanine, A is a protein amino acid residue, X is a group OH, NH 2 or an O-alkyl group. These peptides have a strong, long-lasting analgesic effect and therefore can be used in medicine.

Sposób wytwarzania nowych pentapeptydów zawierających alfa-metyloserynę, o wzorze ogólnym 1, w którym wszystkie symbole mają wyżej podane znaczenie, według wynalazku polega na tym, że dipeptyd tyrozylo-alfa-metyloserynę, w którym grupa aminowa tyrozyny jest blokowana za pomocą grupy tert-butoksykarbonylowej, zaś grupa hydroksylowa alfa-metyloseryny jest chroniona w postaci eteru tert-butylowego, poddaje się kondensacji z estrem alkilowym tripeptydu o wzorze ogólnym 2, którym wszystkie symbole mają wyżej podane znaczenie, w obecności odczynnika peptydotwórczego, korzystnie mieszaniny 1,3-dicykloheksylokarbodiimidu i 1-hydroksybenzotriazolu oraz w obecności N-metylomorfoliny, w środowisku mieszaniny dimetyloformamidu i chlorku metylenu, po czym w otrzymanym N-, O- i C-blokowanym pentapeptydzie uwalnia się C-terminalną grupę karboksylową na drodze hydrolizy alkalicznej lub otrzymuje się C-terminalny amid na drodze amonolizy za pomocą ciekłego amoniaku oraz zdejmuje Nterminalną grupę ochronną tert-butoksykarbonylową z tyrozyny oraz grupę tert-butylową z alfametyloseryny przy użyciu kwasu trifluorooctowego.According to the invention, the invention comprises a tyrosyl-alpha-methylserine dipeptide in which the tyrosine amino group is blocked with a tert-butoxycarbonyl group for the preparation of new alpha-methylserine-containing pentapeptides of the general formula I, in which all symbols have the above meanings and the alpha-methyl serine hydroxyl group is protected as a tert-butyl ether, is condensed with the alkyl ester of a tripeptide of general formula II, all symbols of which are as defined above, in the presence of a peptide-forming reagent, preferably a mixture of 1,3-dicyclohexylcarbodiimide and 1 -hydroxybenzotriazole and in the presence of N-methylmorpholine, in the medium of a mixture of dimethylformamide and methylene chloride, then in the obtained N-, O- and C-blocked pentapeptide the C-terminal carboxyl group is released by alkaline hydrolysis or the C-terminal amide is obtained on by ammonolysis with liquid ammonia and removes the N-terminal ocher group Another tert-butoxycarbonyl group from tyrosine and a tert-butyl group from alpha-methylserine using trifluoroacetic acid.

Sposobem według wynalazku otrzymuje się nowe pentapeptydy z bardzo dobrą wydajnością powyżej 95% oraz o wysokiej czystości.The method according to the invention produces new pentapeptides with a very good yield above 95% and with high purity.

Sposób według wynalazku ilustrują bliżej niżej podane przykłady.The process according to the invention is illustrated in the following examples.

Przykład I. Do roztworu 0,72g (1,7 mM) tyrozylo-(R)-alfa-metyloseryny, w której grupa aminowa tyrozyny była blokowana za pomocą grupy tert-butoksykarbonylowej, zaś grupa hydroksylowa alfa-metyloseryny była chroniona w postaci eteru tert-butylowego, 0,77 g (2 mM) chlorowodorku estru metylowego glicylo-fenyloalanylo-leucyny, 0,31 g (2 mM) 1-hydroksybenzotriazolu 10,22 ml (2 mM) N-metylomorfoliny w 1,8 ml dimetyloformamidu, schłodzonego do temperatury 0°C, dodano 1ml 2M roztoworu 1,3-dicykloheksylokarbodiimidu w chlorku metylenu, po czym kontynuowano mieszanie w czasie 1 godziny w temperaturze 0°C, a następnie 4 doby w temperatu164 209 rze pokojowej. Roztwór poreakcyjny odparowano, a pozostałość rozpuszczono w octanie etylu. Frakcję nierozpuszczalną tj. dicykloheksylomocznik odsączono, a z pozostałości wyodrębniono, w sposób standardowy dla związków obojętnych, surowy oleisty pentapeptyd, który oczyszczono na żelu do szybkiej chromatografii stosując układ rozpuszczalników chloroform/aceton 6:1, a następnie 3:1. Otrzymano 0,83 g N- i O-blokowanego estru metylowego tyrozylo-(R)-alfametyloserylo-glicylo-fenyloalanylo-leucyny w postaci chromatograficznie jednorodnego, oleistego produktu, dla którego wartość jonu molekularnego w analizie masowej MH+ = 770 (obliczono M = 769).Example I. For a solution of 0.72 g (1.7 mM) tyrosyl- (R) -alpha-methylserine, in which the tyrosine amino group was blocked with a tert-butoxycarbonyl group and the alpha-methyl serine hydroxyl group was protected as tert-ether -butyl, 0.77 g (2 mM) glycyl phenylalanyl leucine methyl ester hydrochloride, 0.31 g (2 mM) 1-hydroxybenzotriazole 10.22 ml (2 mM) N-methylmorpholine in 1.8 ml dimethylformamide, chilled to 0 ° C, 1 ml of a 2M solution of 1,3-dicyclohexylcarbodiimide in methylene chloride was added, followed by further stirring for 1 hour at 0 ° C, and then for 4 days at room temperature. The reaction solution was evaporated and the residue was dissolved in ethyl acetate. The insoluble fraction, i.e. dicyclohexylurea, was filtered off, and the crude oily pentapeptide was isolated from the residue in a standard manner for neutral compounds, which was purified on a flash chromatography gel using chloroform / acetone 6: 1 and then 3: 1. 0.83 g of N- and O-blocked tyrosyl- (R) -alfamethylseryl-glycyl-phenylalanyl-leucine methyl ester was obtained in the form of a chromatographically homogeneous oily product, for which the molecular ion value in mass analysis MH + = 770 (calculated M = 769 ).

150 mg otrzymanego estru pentapeptydu rozpuszczono w 2 ml metanolu, po czym dodano 1 ml 2 N NaOH i mieszano w czasie 20 godzin. Po zakończeniu za pomocą chromatografii cienkowarstwowej) odparowano metanol, pozostałość rozcieńczono wodą, przemyto eterem etylowym, a warstwę wodną zakwaszono 1 N kwaśnym siarczanem sodowym. Produkt ekstrahowano octanem etylu, warstwę organiczną przemyto solanką, wysuszono bezwodnym siarczanem magnezowym i zatężono. Otrzymano 140 mg chromatograficznie czystej N- i Oblokowanej tyrozylo-(R)-alfa-metyloserylo-glicylo-fenyloalanylo-leucyny, co stanowiło 95,2% wydajności teoretycznej.150 mg of the obtained pentapeptide ester was dissolved in 2 ml of methanol, and then 1 ml of 2N NaOH was added and stirred for 20 hours. After completion by thin layer chromatography, the methanol was evaporated, the residue was diluted with water, washed with diethyl ether, and the aqueous layer was acidified with 1 N sodium acid sulfate. The product was extracted with ethyl acetate, the organic layer was washed with brine, dried over anhydrous magnesium sulfate, and concentrated. 140 mg of chromatographically pure N- and O-blocked tyrosyl- (R) -alpha-methylseryl-glycyl-phenylalanyl-leucine were obtained, which was 95.2% of theory.

Do otrzymanego N- i O-blokowanego pentapeptydu dodano 4 ml schłodzonego kwasu trifluorooctowego. Po 1 godzinie mieszania w temperaturze pokojowej roztwór odparowano. Otrzymany trifluorooctan tyrozylo-(R)-alfa-metylo-serylo-glicylo-fenyloalanylo-leucyny przeprowadzono w chlorowodorek za pomocą chromatografii jonowymiennej (wypełnienie Amberlyst, forma Cl^_, eluent-metanol). Otrzymano 110 mg chlorowodorku tyrozylo-(R)-alfa-metyloseryloglicylo-fenyloalanylo-leucyny, co stanowiło 95,6% wydajności teoretycznej. Skręcalność otrzymanego peptydu[a]D²⁰ = -9,2° (c = 0,5, metanol), zaś wartość jonu molekularnego w analizie masowej mH+ = 600 (obliczono M = 599).To the obtained N- and O-blocked pentapeptide, 4 ml of cooled trifluoroacetic acid were added. After 1 hour of stirring at room temperature, the solution was evaporated. The obtained trifluoroacetate tyrozylo- (R) -alpha-methyl-L-seryl-glycyl-phenylalanyl-leucine was converted to the hydrochloride by ion exchange chromatography (Amberlyst fill, form Cl ^_, eluent: methanol). 110 mg of tyrosyl- (R) -alpha-methylserylglycyl-phenylalanyl-leucine hydrochloride were obtained, which was 95.6% of theory. The rotation of the obtained peptide [a] D ²⁰ = -9.2 ° (c = 0.5, methanol), and the value of the molecular ion in the mass analysis mH + = 600 (calculated M = 599).

Przykład II. 200 mg otrzymanego jak w przykładzie I estru metylowego tyrozylo-(R)-alfametyloserylo-glicylo-fenyloalanylo-leucyny, w którym grupa aminowa tyrozyny była blokowana za pomocą grupy tert-butoksykarbonylowej, zaś grupa hydroksylowa alfa-metyloseryny była chroniona w postaci eteru tert-butylowgo, rozpuszczono w metanolu i po schłodzeniu w łaźni aceton-suchy lód dodano 10 ml amoniaku świeżo destylowanego znad sodu. Reakcję prowadzono · 48 godzin, po czym odparowano amoniak i metanol i po wysuszeniu całości powtórzono amonolizę, gdyż otrzymany produkt zawierał nieprzereagowany ester. Produkt wyodrębniono w sposób charakterystyczny dla związków obojętnych. Otrzymano 190 mg chromatograficznie jednorodnego N- i O-blokowanego amidu ryrozylo-(R)-alfa-metylose^'lo-glicylio-fenyloalanylo-leucyny, z którego w sposób opisany w przykładzie I, usunięto grupy N- i O-blokujące. Otrzymano, z wydajnością 95% wydajności teoretycznej, amid tyrozylo-(R)-alfa-metyloserylo-glicylo-fenyloalanylo-leucyny, którego skręcalność [α]ο²⁰ = -4,4° (c = 0,5, metanol), zaś wartość jonu molekularnego w analizie masowej MH+ = 599 (obliczono M = 598).Example II. 200 mg of tyrosyl- (R) -alfamethylseryl-glycyl-phenylalanyl-leucine methyl ester prepared as in Example 1, in which the tyrosine amino group was blocked with a tert-butoxycarbonyl group, and the alpha-methyl serine hydroxyl group was protected as tert-ether. butyl alcohol, dissolved in methanol, and after cooling in an acetone-dry ice bath, 10 ml of freshly distilled sodium ammonia were added. The reaction was carried out for 48 hours, then the ammonia and methanol were evaporated and after drying it all, the ammonolysis was repeated because the obtained product contained unreacted ester. The product was isolated in a manner characteristic for neutral compounds. 190 mg of chromatographically homogeneous N- and O-blocked ryrosyl- (R) -alpha-methylose-2 -lglycylphenylalanyl-leucine amide were obtained, from which the N- and O-blocking groups were removed as described in Example 1. The tyrosyl- (R) -alpha-methylseryl-glycyl-phenylalanyl-leucine amide was obtained with an efficiency of 95% of theory, the rotation of which [α] ο ²⁰ = -4.4 ° (c = 0.5, methanol), and molecular ion value by mass analysis MH + = 599 (calculated M = 598).

Tyr-ocMeSer-6ly-Phe-A-X wzór 1Tyr-ocMeSer-6ly-Phe-A-X formula 1

Gly - Phe - A-O-Alkil wzar 2Gly - Phe - A-O-Alkyl wzar 2

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 10 000 złPublishing Department of the UP RP. Circulation of 90 copies. Price: PLN 10,000

Claims

Patent claim

A method for the preparation of new pentapeptides containing alpha-methylserine, of the general formula I, in which Tyr is tyrosine, alphaMeSęr is R- or S-alpha-methylserine, Gly is glycine, Phe is phenylalanine, A is a protein amino acid residue, X is OH garpa, NH 2 or an O-alkyl group, characterized in that a tyrosyl alpha-methyl serine dipeptide in which the tyrosine amino group is blocked with a tert-butoxycarbonyl group and the alpha-methyl serrium hydroxyl group is protected as tert-butyl ether is condensed with an alkyl ester of a tripeptide of general formula II, in which all symbols have the above meanings, in the presence of a peptide-forming reagent, preferably a mixture of 1,3-dicyclohexylcarbodiimide and 1-hydroxybenzotriazole, and in the presence of N-methylmorpholine, in a mixture of dimethylformamide and methylene chloride, then in the obtained N-, O- and C-blocked pentapeptide the C-terminal group k arboxylic acid by alkaline hydrolysis or obtains the C-terminal amide by ammonolysis with liquid ammonia and removes the N-terminal tert-butoxycarbonyl protective group from tyrosine and the tert-butyl group from alpha-methylserine using trifluoroacetic acid.