PL165863B1

PL165863B1 - Sposób wytwarzania dimeru rybonukleazy PL PL

Info

Publication number: PL165863B1
Application number: PL90288268A
Authority: PL
Inventors: Peter Herrmann; Peter Klein
Original assignee: Nika Health Products Ltd
Priority date: 1990-01-08
Filing date: 1990-12-14
Publication date: 1995-02-28
Also published as: SG47607A1; FI923124L; LV10118A; RU2067617C1; FI923124A0; FI100724B; BG60685B1; WO1991010730A1; ATE136056T1; DE69026275D1; DE69026275T2; HK166796A; ES2086403T3; EP0509989B1; EP0509989A1; KR920703802A; LT3424B; LV10118B; AU645252B2; KR0142172B1

Abstract

1. Sposób wytwarzania dimeru rybonukleazy, znamienny tym, ze sporzadza sie roztwór rybonukleazy przez wprowadzenie rybonukleazy w postaci monomerycznej do roztworu buforowego o pH doprowadzonym do wartosci co najmniej okolo 9, do roztworu tego dodaje sie suberimidanowy odczynnik sprzegajacy, dla spowodowania dimeryzacji monomerów rybonukleazy, utrzymujac wartosc pH roztworu na poziomie co najmniej okolo 9, przerywa sie reakcje dimeryzacji w wybranym momencie przez obnizenie pH roztworu do wartosci okolo 7, filtruje sie roztwór zdimeryzowanej rybonukleazy prowadzac filtracje dwuetapowo, przy czym w pierwszym etapie eluuje sie ten roztwór przez zywice jonowymienna zbierajac frakcje zawierajace glównie zdimeryzowana postac rybonukleazy, a w drugim etapie przez zywice jonowymienna eluuje sie jedynie frakcje zebrane w pier- wszym etapie filtracji i odbiera sie roztwór dimeru rybonukleazy o wysokim stopniu oczysz- czenia z drugiego etapu filtracji. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania dimeru rybonukleazy.

Wzrastająca ilość chorób wywoływanych przez wirusy i szczepy bakterii odporne na znane antybiotyki sprawia, że zachodzi potrzeba opracowywania i wprowadzania nowych typów leków pozwalających na leczenie ludzi i zwierząt. Wśród współczesnych sposobów leczenia znane jest podawanie, obok innych leków, enzymów w postaci monemerycznij celem poprawienia stanu pacjentów dotkniętych różnorakimi chorobami. Jest to często konieczne, ponieważ pewne stany chorobowe powodują obniżenie aktywności niektórych enzymów. Enzymy to białka o własnościach katalitycznych, odpowiedzialne za wszystkie podstawowe procesy życiowe w organizmach żywych. Dlatego wyodrębniono szereg enzymów, w czystej postaci lub w pewnych kombinacjach, ze względu na ich fizjochemiczne, fizjologiczne lub biologiczne działanie.

Do grupy różnorodnych enzymów o znanym działaniu terapeutycznym lub które podlegają zmniejszeniu aktywności w pewnych stanach chorobowych, należą rybonukleazy. Rybonukleazy stanowią grupę enzymów nukleinowych powszechnie występujących w wielu organizmach zwierzęcych i roślinnych.

Badania własności rybonukleazy i sposobów wyodrębniania tego enzymu zapoczątkowane zostały w połowie lat pięćdziesiątych przez Schmidta i McDonalda. Wśród wielu ustaleń dotyczących tego enzymu stwierdzono, że tkanki rakowe cechują się znacznie obniżoną aktywnością zawartych w nich rybonukleaz. W jednym z badanych przypadków odkryto, ze myszy dotknięte białaczką cechowały się znacznym spadkiem aktywności kwasowej rybonukleazy, co obserwowano w szczególności w mitochendrlach i frakcjach mikroyomowych otrzymanych z tkanek śledziony tych zwierząt. Badania, jak wyżej omówione, wskazały, ze podawanie rybonukleazy mogłoby byt wykorzystane w celu zapobiegania występowaniu lub zwalczania objawów związanych z wirusową białaczką

Niestety, potencjonalnie dobroczynne skutki działania rybonukleazy nie zostały osiągnięte przede wszystkim na skutek cytolekyycznego działania menomiwyczniC postaci tego enzymu. Przykładowo, w badaniach przeprowadzonych na kulturach ^b^blastów, obserwowano wystąpienie efektu cytetokyycznego na skutek działania rybonukleazy w postaci uonemiΓycznwj, nawet wówczas gdy podawana dawka miała niezwykle niski poziom. Konieczne stało się zatem znalezienie sposobów maksymalizacji potencjalnie dobroczynnego działania rybonukleazy przy jednoczesnej minimalizacji potencjalnie szkodliwych efektów cyletoksycznych wywoływanych przez monomeryczną postać tego enzymu.

Ostatnio stwierdzono, że możliwe jest otrzymanie kompozycji o działaniu ewzecewwiruyowyu lub erzeciwbaktiwyjnym, na bazie rybobukleazy, niepwzejαweającej efektów cytotoksycznych, jeżeli wykorzystana zostanie zdimeryzowana postać tego enzymu. Skuteczne okazało się, zastosowanie kompozycji zawierających dii^r rybonukleazy w leczeniu szeregu chorób infekcyjnych.

165 863

Jednocześnie stwierdzono, że kompozycje te nie powoduję wysoce cytotoksycznych skutków. Jakie zazwyczaj towarzyszy zastosowaniu rybonukleazy w postaci monomerycznej. Wykorzystanie dimeru rybonukleazy w szeregu zastosowań terapeutycznych ujawnione zostało we wcześniejszym zgłoszeniu patentowym, dokonanym w Stanach Zjednoczonych w trybie PCT, za numerem US88/01785.

Chociaż znane są sposoby wytwarzania dimeru rybonukleazy z monomerycznej postaci tego enzymu, istnieje obecnie zapotrzebowanie opracowanie sposobu wytwarzania dużych ilości zdimeryzowanej formy rybonukleazy, o wysokiej sprawności i nie wymagającego zbyt dużych nakładów.

Celem wynalazku jest opracowanie sposobu wytwarzania i badania dużych ilości oczyszczonego dimeru rybonukleazy, o minimalnej ilości zanieczyszczeń takich jak monomery i dimery rybonukleazy oraz innych kontaminantów.

Sposób wytwarzania dimeru rybonukleazy, prowadzący-do uzyskania produktu o wysokiej czystości, według wynalazku polega na tym, że sporządza się roztwór rybonukleazy przez wprowadzenie rybonukleazy w postaci monomerycznej do roztworu buforowego o pH doprowadzonym do wartości co najmniej około 9, do roztworu tego dodaje się suberimidanowy odczynnik sprzęgający celem spowodowania dimeryzacji monomerów rybonukleazy, utrzymując wartość pH roztworu na poziomie co najmniej około 9, przerywa się reakcję dimeryzacji w wybranym momencie przez obniżenie pH roztworu do wartości około 7, filtruje się roztwór zdimeryzowanej rybonukleazy prowadząc filtrację dwuetapowo, przy czym w pierwszym etapie eluuje się ten roztwór przez żywicę jonowymienną zbierając frakcje zawierające głównie zdimeryzowaną postać rybonukleazy, a w drugim etapie przez żywicę jonowymienną eluuje się jedynie frakcje zebrane w pierwszym etapie filtracji i odbiera się roztwór dimeru rybonukleazy o wysokim stopniu oczyszczenie z drugiego etapu filtracji.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku, pH roztworu rybonukleazy w postaci monomerycznej doprowadza się do wartości około 10, stosując, zwłaszcza, wodorotlenek sodu, NaOH. Korzystnie, również, jako roztwór buforowy do sporządzenia roztworu rybonukleazy w postaci monomerycznej, stosuje się roztwór buforowy na bazie dwuwodzianu jednokwaśnego fosforanu sodu.

W sposobie według wynalazku, przy dodawaniu odczynnika sprzęgającego do roztworu rybonukleazy w postaci monomerycznej, korzystnie, pH roztworu utrzymuje się na poziomie około 10.

Korzystnie, jako suberimidanowy odczynnik sprzęgający stosuje się dwumetylową pochodną imidu kwasu suberynowego.

Korzystnie, dimeryzację prowadzi się w temperaturze pokojowej, przy ciągłym mieszaniu roztworu.

Zgodnie z wynalazkiem, reakcję dimeryzacji przerywa się dodając kwas solny, HCl.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku, roztwór zdimeryzowanej rybonukleazy przed filtracją zatęża się, wykorzystując zasilaną stycznie instalację przepływową. Korzystnie, stosuje się roztwór rybonukleazy w postaci monomerycznej zawierający 40-60 g monomeru rybonukleazy oraz 4-6 1 buforu i do roztworu tego dodaje się odczynnik sprzęgający w ilości od około 4 - 6 g.

Korzystnie, pierwszy etap filtracji prowadzi się stosując żywicę jonowymienną Sephadex. Frakcje zbierane w pierwszym etapie filtracji poddawane są analizie, przy czym stosuje się metodę elektroforezy żelowej. Korzystnie, również, frakcje zebrane w pierwszym etapie filtracji poddaje się liofilizacji, a frakcje zawierające przede wszystkim monomeryczną postać rybonukleazy zawraca się i ponownie poddaje procesowi dimeryzacji.

Korzystnie, drugi etap filtracji prowadzi się również przy zastosowaniu żywicy jonowymiennej Sephadex, przy czym etap ten prowadzi się przy wartości pH około 5. Wartość tę osiąga się stosując bufor na bazie octanu sodu. Podobnie jak w pierwszym etapie filtracji, w drugim etapie - zbierane frakcje poddaje się analizie metodą elektroforezy żelowej. Korzystnie, po drugim etapie filtracji przeprowadza się dodatkowo odsalanie, wykorzystując kolumnę Saphadex G25, a następnie tak oczyszczony roztwór poddaje się zabiegowi usuwania endotoksyn. Korzystnie, endotoksyny usuwa się stosując kolumnę Detoxigel.

Sposób według wynalazku pozwala na wytwarzanie dużych ilości dimeru rybonukleazy w po165 863 staci produktu o wysokim stopniu czystości. Produkt ten cechuje niezwykła przydatność w leczeniu różnorodnych chorób wirusowych i bakteryjnych.

W sposobie wytwarzanie zdimeryzowanej postaci rybonukleazy według wynalazku, stosować można jako materiał wyjściowy dowolną, dostępną rybonukleazę w postaci monomerycznej. W badaniach prowadzących do dokonania obecnego wynalazku stosowano monomeryczną rybonukleazę firmy Serva Feine Biochemica, GmbH z Heidelberga, nr katalogowy 28260. W sposobie według wynalazku monomeryczny surowiec stanowić może Rybonukleaza A, bądź dowolna inna spośród różnych dostępnych rybonukleaz.

Przystępując do przeprowadzenia reakcji sprzęgania, sporządza się roztwór rybonukleazy w postaci monomerycznej przez rozpuszczenie monomeru rybonukleazy w buforze fosforanowym w temperaturze pokojowej. Korzystnie stosuje się 0,1 M roztwór buforowy na bazie dwuwodzianu jednokwaśnego fosforanu sodu. Monomer ulega rozpuszczeniu gdy roztwór miesza się w sposób ciągły przez co najmniej około dwie godziny. Roztwór buforowy przygotowuje się przez rozpuszczenie około 70 g dwuwodzianu jednokwaśnego fosforanu sodu w około 1.000 ml wody. W około 5 litrach buforu na bazie dwuwodzianu jednokwaśnego fosforanu sodu rozpuszcza się około 40-60 g monomeru rybonukleazy. Należy jednak podkreślić, że faktycznie stosowane ilości reagentów mogą być zmieniane, bez wykroczenia poza zakres wynalazku. Wartość pH otrzymanego roztworu doprowadza się do około 9, korzystnie do około 10, stosując 0,1 N roztwór wodorotlenku sodu, NaOH.

Reakcję dimeryzacji prowadzi się dodając proporcjonalną ilość suberimidanowego odczynnika sprzęgającego do roztworu rybonukleazy w postaci monomerycznej, przy czym utrzymuje się wartość pH mieszaniny na poziomie co najmniej około 9, korzystnie - 10 z tolerancją ± 0,2. Korzystnie stosuje się dwumetylową pochodną imidu kwasu suberynowego, choć inne znane suberimidanowe odczynniki sprzęgające mogą być również wykorzystywane w sposobie według wynalazku.

Do roztworu rybonukleazy w postaci monomerycznej przygotowanego w wyżej opisany sposób dodaje się korzystnie 4-6 g pochodnej dwumetylowej imidu kwasu-·subarynowego. Odczynnik sprzęgający rozpuszcza się w ciągu około jednej minuty. Mieszając mieszaninę reakcyjną przy użyciu mieszadła magnetycznego lub innego równocennego środka, prowadzi się reakcję dimeryzacji przez około 30-60 minut w pokojowej temperaturze około 25°C, z tolerancją - 5°C. Reakcję można przerwać obniżając pH roztworu do wartości 7 ± 0,2. Obniżenie pH osiąga się przez dodanie 1 M roztworu kwasu solnego. Korzystnie, otrzymaną mieszaninę zatęza się, wykorzystując zasilaną stycznie instalację przepływową, bliżej opisaną poniżej.

Pomocne jest pobieranie z mieszaniny reakcyjnej próbek do badań w różnych momentach po rozpoczęciu reakcji sprzęgania i poddawanie ich analizie metodą elektroforezy żelowej. Wyniki analizy prowadzonej tą metodą wykazują, że pomimo obecności monomerycznej postaci enzymu w niemal każdej badanej trakcji, można rozpoznać pasmo odpowiadające zdimeryzowanej postaci rybonukleazy po około 10 minutach prowadzenia reakcji. Pasmo odpowiadające zdimeryzowanej postaci ryoonukleazy staje się wyraźnie zauważalne po około 15 minutach i staje się coraz bardziej widoczne w miarę postępu reakcji. Po około 30 minutach od dodania odczynnika sprzęgającego można zaobserwować pasmo odpowiadające oligomerycznym postaciom enzymu. Monomeryczna postać rybonukleazy ma względną masę cząsteczkową 15.000, a dimer jest dwukrotnie większy.

W celu otrzymania dużej ilości -produktu, który jest głównie oczyszczonym dimerern rybonukleazy, korzystnie roztwór zdimeryzowanej rybonukleezy poddaje się co najmniej dwuetapowej filtracji w celu wyodrębnienia dimeru rybonukleazy i oddzielenia rybonukleazy w postaci monomeru i multimerów.-Dzięki temu można zebrać niezdimeryzowane monomery rybonukleazy i korzystnie zawrócić je do ponownego zdimeryzowania, co pozwala na dalsze podwyższenie sprawności wytwarzania dimeru rybonukleazy w sposobie według wynalazku.

W celu wydzielenia oligomerów z roztworu dimeru rybonukleazy korzystnie mieszaninę reakcyjną poddaje się filtracji przez żywicę jonowymienną. W korzystnym przykładzie realizacji wynalazku filtrację prowadzi się wykorzystując kolumnę wypełnioną materiałem jonowymiennym Sephadex. Korzystnie przygotowuje się kolumnę o średnicy około 25 cm i wysokości około 120 cm i przemywa się ją 50 mM roztworem kwaśnego węglanu amonu o pH około 8,6 w ilości około 60 li6

165 863 trów.Taki bufor węglanowy przygotowuje się przez rozpuszczenie około 4 g kwaśnego węglanu amonu w około 1.000 ml wody. Cały, otrzymany Jak wyżej, roztwór rybonukleazy wprowadza się na kolumnę przygotowany w powyższy sposób i eluuje buforem równowagowym. Frakcje eluatu zbiera się przy użyciu kolektora frakcji, takiego jak model LKB 2211 Suprec, przy czym szybkość wypływu roztworu wynosi w przybliżeniu 80 ml na minutę. Wykres wymywania można rejestrować stosując urządzenie rejestrujące, takie jak model LKB 2210, z szybkością przesuwu 0,5 mm/min., przy czym mierzy się absorpcję przy 280 nm stosując analizator model LKB 2238 UVICOR SII.

Wykres eluowania otrzymany w tym etapie filtracji, przedstawiony jest na załączonym rysunku. Fig. 1 i jak widać występują w tym wykresie zasadniczo trzy piki: pierwszy z nich odpowiada multimerom ryoonukleazy, drugi - dimerowi, a ostatni - monomerycznej postaci enzymu.

Zalecane jest również prowadzenie analizy poszczególnych zbieranych frakcji eluatu stosując metodę elektroforezy żelowej. Analizę taką można przeprowadzić stosując proces elektroforezy żelowej w układzie siarczan sodowo-dodscylowy SOS - poliakryloamid lub SDS-PAGE, opisany przez Thomasa i współautorów, PNAS, 72:2626 /1975/. W tych badaniach elektroforetycznych, korzystnie, około 50 pl każdej z zbieranych frakcji miesza się z około 50 pl roztworu buforowego i całość ogrzewa się przez około 10 minut w temperaturze około 95°C. Następnie około 25 pl tej mieszaniny nanosi się na żel i prowadzi się elektroforezę przez około 4 godziny przy natężeniu prądu 20-35 mA w celu rozdzielenia różnych postaci enzymu rybonukleazy. Pasma białkowe barwi się barwnikiem takim jak Coomassie-Blue R25O firmy Merck, przez co stają się one widoczne.

Wykorzystując metody elektroforezy żelowej w układzie SDS-PAGE, identyfikuje się i rozdziela frakcje zawierające rybonukleazę w postaci monomerycznej, dimerycznej lub oligomerycznej. Jak też zawierające mieszaninę tych postaci enzymu. Po zidentyfikowaniu frakcji, które po tym etapie filtracji zawierają głównie dimer rybonukleazy oddziela się je i zbiera. Zebrane frakcje roztworu dimeru, korzystnie zatęża się do objętości około 800 ml w instalacji przepływowej ze stycznym zasilaniem. Membranową przeponę instalacji można następnie spłukać odpowiednim rozpuszczalnikiem, tak aby możliwe było zatrzymanie większej ilości dimeru w roztworze. Roztwór ten, korzystnie, poddaje się liofilizacji i w tej postaci produkt może być przechowywany w temperaturze około 4°C aż do czasu przeprowadzenia następnych etapów sposobu według wynalazku. Najkorzystniej, liofilizację prowadzi się w ten sposób, że 200 ml porcje roztworu w kolbach okrągłodennych umieszcza się w atmosferze ciekłego azotu w wyparce rotacyjnej. Kolby zamyka się szczelnie i pozostawia na 30 minut w temperaturze -30°C, po czym materiał liofilizuje się.

Z uwagi na częstokroć wysoki koszt materiału wyjściowego, monomeryczną postać rybonukleazy oddzieloną w pierwszym etapie filtracji zawraca się, korzystnie, do etapu dimeryzacji sposobu według wynalazku. Operację tę prowadzi się tak, że frakcje, w których stwierdzono występowanie istotnych ilości rybonukleazy w postaci monomerycznej zbiera się, poddaje zatężaniu w instalacji przepływowej z zasilaniem stycznym w stosunku do przepony, a następnie do zatężonego roztworu dodaje się odczynnik sprzęgający, zidentyfikowany powyżej. Zachodzi reakcja dimeryzacji, którą prowadzi się we wcześniej opisany sposób, po czym mieszanina reakcyjna poddawana Jest pierwszemu etapowi filtracji. Po liofilizacji produktu powstałego w wyniku zawrócenia rybonukleazy w postaci monomerycznej do etapu dimeryzacji, nowy rzut dimeru miesza się dokładnie ze zdimeryzowanym produktem otrzymanym w pierwszym cyklu dimeryzacji. Oziękl takiemu zawracaniu nieprzereagowanej monomerycznej rybonukleazy do ponownej dimeryzacji osiąga się wzrost wydajności dimeru do około 30%.

Roztwory dimeru wyodrębnione po pierwszym etapie filtracji poddaje się dalszemu oczyszczaniu prowadząc drugi etap filtracji mający na celu dokładniejsze rozdzielenie postaci zdimeryzowanej od monomeru i oligomerów rybonukleazy i otrzymanie produktu finalnego o wyższym stopniu czystości. W tym etapie, otrzymaną wyżej mieszaninę zliofilizowanych rzutów enzymu eluuje 6ię przez żywicę jonowymienną. Przykładowo stosuje się kolumnę Sephadex G 50 F. W tym etapie, pH w kolumnie jonowymiennej ustala się na poziomie około 5, co osiąga się stosując 0,2 M bufor na bazie octanu sodu. Bufor na bazie octanu sodu o pH 5 przygotowuje się roz165 863 puszczając około 27 g trójwodzianu octanu sodu w 1.000 ml wody.

Frakcje zebrane w pierwszym etapie filtracji, odpowiadające drugiemu pikowi na wykresie wymywania, wyodrębnione na podstawie prowadzonych analiz, wprowadza się na kolumnę wypełnioną jonowymienną żywicą Sephadex, przygotowaną do prowadzenia drugiego etapu filtracji. Korzystnie, stosuje się warunki i materiały opisane wyżej przy omawianiu pierwszego etapu filtracji. Ponownie rejestruje się wykres wymywania. Wyniki wykorzystuje się do identyfikacji wyodrębniania pożądanych frakcji, które stanowią produkt drugiego etapu filtracji. W tym etapie, na wykresie wymywania, przedstawionym na załączonym rysunku fig. 2, występuje jeden główny pik oraz dwa słabe piki wtórne.

Korzystnie, i w tym etapie prowadzi się analizę metodą elektroforezy żelowej w układzie SDS-PAGE, na obecność różnych postaci enzymu w zbieranych frakcjach. Analizę prowadzi się w sposób opisany wyżej. Wyniki analizy wykazują, ze frakcje odpowiadające głównemu pikowi na wykresie wymywania zawierają zdimeryzowany produkt o wysokim stopniu oczyszczenia. Frakcje te wyodrębnia się i zbiera, po czym, korzystnie, zatęża się w instalacji przepływowej z zasilaniem stycznym do przepony. Korzystnie również, przeprowadza się odsalanie frakcji zebranych w drugim etapie filtracji metodą przepuszczenia ich przez kolumnę Sephadex G25. Kolumna ma średnicę około 25 cm i wysokości 65 cm. w celu przeprowadzenia odsalania kolumnę przemywa się 32 l zasadowego roztworu z szybkością przepływu 15 litrów na godzinę. Ponadto, stosuje się 50 mM bufor na bazie kwaśnego węglanu amonu.

Tak otrzymany produkt stanowi roztwór dimeru rybonukleazy o wysokim stopniu oczyszczenia. Jednakże, aby możliwe było zastosowanie zliofilizowanego dimeru rybonukleazy do przygotowywania farmaceutycznie przydatnych preparatów, zalecane jest uprzednie poddanie dimeru zabiegowi usuwania endotoksyn. Korzystnie, dimer oczyszczony w sposób opisany powyżej jest dodatkowo eluowany przy zastosowaniu środka chromatograficznego, takiego jak Detoxigel, cechującego się wysoką zdolnością wiązania endotoksyn. Pojemność preparatu Detoxigel wynosi około mg/ml. Z uwagi na niespecyficzne wiązanie innych komponentów przez ten preparat, takich jak dimery białkowe, dąży się do maksymalnego odzyskania zdimeryzowanego enzymu. Osiąga się to stosując jako eluent roztwór buforowy o fizjologicznym zakresie wartości pH. Dodatek 0,1-0,5M roztworu soli /przykładowo chlorku sodu NaCl/ pozwala na osiągnięcie zakresu pH, niezbędnego dla otrzymania dimeru z maksymalną wydajnością. Zazwyczaj, roztwór zawierający 1.500 E.U./ml /jednostek endotoksyn/ml/ po schromatografowaniu na kolumnie detoksyflkującej może osiągnąć stężenie endotoksyn niższe niż 1,0 E.U./ml.

Po usunięciu endotoksyn roztwór dimeru rybonukleazy zbiera się, poddaje filtracji z zachowaniem warunków sterylności i następnie liofilizuje się w sterylnej kolbie okrągłodennej . Zawartość endotoksyn w końcowym preparacie ustalić możne stosując zestaw diagnostyczny, taki jak Coatest /R/ firmy Kabi-Vitrum z Monachium, RFN. Test przeprowadza się przed skierowaniem roztworu do liofilizacji. Test oparty jest na aktywowaniu przez endotoksyny lizatu Limulus-Amoebocyten-Lysat /LAL/. Zaktywowany lizat LAL powoduje wydzielenie żółtego barwnika p-nitroaniliny z chromogenicznego substratu /S-2423/. Pomiaru ekstynkcji będącej miernikiem zawartości endotoksyn, dokonuje się za pomocą fotometru spektralnego przy długości fali 405 nm. Jeśli zawartość endotoksyn jest na poziomie poniżej 0,1 ng/mg roztwór dimeru umieszcza się w kolbie okrągłodennej i poddaje liofilizacji.

Wyżej opisane postępowanie powtarzać można wielokrotnie, aż do otrzymania pożądanej ilości dimeru rybonukleazy. Poszczególne rzuty dimeru można po oczyszczeniu poddawać sterylizacji lub dalszej liofilizacji, stosownie do potrzeb, otrzymując szarże dimeru rybonukleazy homogeniczne, co do własności, które mogą być wysoce przydatne w leczeniu wielu chorób wirusowych i bakteryjnych takich jak wspomniane we wskazanym wyżej zgłoszeniu patentowym PCT/US88/01785. Poza działaniem przeciwwirusowym i przeciwbakteryjnyrn, dimer rybonukleazy przejawia i inne dobroczynne skutki terapeutyczne, dzięki czemu może być stosowany, między innymi. Jako środek przeciwzapalny, przeciwhistaminowy, bez obawy wywołania groźnych skutków ubocznych towarzyszących zwykle cnyotoksycznej, monomeenczneJ postaci enzymu. Szczególną zaletą, zatem, opracowanego sposobu wytwarzania dimeru enbonukleazy według wynalazku, jest

165 863 to, że pozwala on na otrzymywania dużych ilości dobroczynnej, zdimeryzowanej formy rybonukleazy, ekonomicznie i sprawnie. Produkt wytwarzany sposobem według wynalazku poddawać można próbie na jego aktywność enzymatyczny. Test polega na badaniu wpływu enzymu na roztwory kwasu rybonukleinowego. Po wprowadzeniu dimeru rybonukleazy aktywność mierzy się przy użyciu fotometru spektralnego. Wynalazek pozwala więc nie tylko na wytworzenie dimeru rybonukleazy o wysokim stopniu czystości, lecz także wskazuje sposób ustalenia jego aktywności.

Poniższe przykłady bliżej ilustruję obecny wynalazek nie stanowiąc jednak ograniczenia jego zakresu.

Przykłed I. Wytwarzanie dimeru rybonukleazy. 50 g monomeru rybonukleazy rozpuszczono w 5 1 0,1 M roztworu dwuwodzianu jednokwaśnego fosforanu sodu, umieszczonego w zlewce, pod przykryciem, którego pH doprowadzono do wartości 10,0 stosujęc 0,1 N roztwór wodorotlenku sodu, NaOH. Bufor na bazie dwuwodzianu jednokwaśnego fosforanu sodu przygotowano rozpuszczając 70,98 g dwuwodzianu jednokwaśnego fosforanu sodu w 1.000 ml wody. Następnie, w temperaturze pokojowej 25 “C dodano 5 g dwumetylowej pochodnej imidu kwasu suberynowego /Sigma Batch Nr 29^3687/ stanowiącej odczynnik sprzęgający, który uległ rozpuszczeniu w przeciągu 1 minuty. Wartość pH roztworu stale kontrolowano i utrzymywano na poziomie 10, stosując 0,1 N roztwór wodorotlenku sodu, NaOH. Całość mieszano nieprzerwanie za pomocą mieszadła magnetycznego. Reakcję prowadzono w ten sposób przez około 45 minut w temperaturze około 25°C. Reakcję przerwano poprzez obniżenie wartości pH do poziomu około 7,0 stosując 1 M roztwór kwasu solnego HCl.

Podczas prowadzenia reakcji dimeryzacji, w różnych momentach po wprowadzeniu odczynnika sprzęgającego, pobierano próbki mieszaniny reakcyjnej i poddawano je analizie metodą elektroforezy żelowej. Monomery, dimery i oligomery rybonukleazy, zawarte w badanych próbkach poddawane były rozdzielaniu na żelu SDS /siarczanu dodecylowo-sodowego/. Monomeryczna postać rybonukleazy miała względną masę cząsteczkową 15.000, zaś postać zdimeryzowana była około dwukrotnie większa. Analiza elektroforetyczna wykazała, ze pasmo dimeru pojawiało się wyraźnie po 15 minutach od wprowadzenia odczynnika sprzęgającego. Pasmo to stawało się coraz silniejsze w miarę postępu reakcji. Stwierdzono ponadto, ze oligomeryczne formy rybonukleazy powstawały po 30 minutach od dodania odczynnika sprzęgającego.

Zdimeryzowaną rybonukleazę, w postaci roztworu poreakcyjnego wprowadzono do instalacji przepływowej z zasilaniem stycznym w stosunku do przepony /Milipore/ w celu zatęzenia roztworu do objętości 800 ml. Instalacja Milipore wyposażona była w filtr Filtron Ausschluss

10.000d oraz pompę Verder o mocy 8OW typ 20-30 / 6OO79, jak również w membranę olefinową,

5 od odporności na rozerwanie 7 x 10 5askali /7 barów/. Ciśnienie wejściowe wynosiło 2 x 10 paskali /2 bary/, a wyjściowe - przy najnizszej wartości niższe niż 0,2 x 10 paskali /0,2 bara/. Pojemność robocza wynosiła w przybliżeniu 1 litr/godzinę. Instalacja miała martwą strefę o objętości 400 ml. Dlatego po zakończeniu zatężania urządzenie przemyto 400 ml roztworu, otrzymując zatężony roztwór o objętości 1.200 ml.

Zatęzony roztwór rybonukleazy poddano następnie filtracji. W pierwszym etapie zastosowano jonowymienną żywicę Sephadex G 50 F /Pharmacia/ aby oddzielić różne oligomery powstałe w procesie dimeryzacji. Celem przeprowadzenia filtracji kolumnę o średnicy 25,2 cm i wysokości 120 cm przemyto 60 litrami 50 mM roztworu kwaśnego węglanu amonu o pH 8,6. Bufor o stężeniu 50 mM na bazie kwaśnego węglanu amonu przygotowano uprzednio przez rozpuszczenie 3,95 g kwaśnego węglanu amonu w 1.000 ml. Następnie cały zatęzony roztwór zawierający substancje białkowe, o objętości 1.200 ml wprowadzono na złoże żelowe i kolumnę eluowano buforem równowagowym, zebrano frakcje o objętości około 1.000 ml stosując kolektor frakcji /LKB 2211 Suprec/ w ciągu około 15 minut, co odpowiadało szybkości przepływu około 80 ml/min. Wykres wymywania rejestrowano za pomocą rejestratora LKB 2210 przy prędkości przesuwu 0,5 mm/minutę, przy czym absorpcję mierzono przy długości fali 280 nm stosując analizator LKB 2238 UVICOR SII. Wykres ten przedstawiony jest na rysunku fig. 1. Wykres wymywania ma trzy piki, z których pierwszy odpowiada multimerom rybonukleazy, drugi dimerowi a trzeci - ostatni monomerycznej postaci rybonukleazy. Na rysunku fig. 1 gruba linia przedstawia wykres absorpcji w roztwo165 863 rach rybonukleazy. Detekcja w oparciu o ten wykres jest bardziej dokładna niż w oparciu o wykres wykonany cienkę linię znajdujęcę się poniżej wykresu absorpcji.

Mieszaniny różnych postaci rybonukleazy występujące w poszczególnych frakcjach poddawano następnie analizie metodą elektroforezy żelowej w układzie SDS-poliakryloarnid, zgodnie z postępowaniem opisanym przez Thomasa i wsp. w PNAS 72:2626 /1975/. W tym postępowaniu /SDS-PAGE/ próbka 50 /l pobrana z każdej frakcji mieszana była z 50 >j1 roztwuru buforowego. Całość ogrzewano przez 10 minut w temperaturze 95°C. Następnie 25 pl otrzymanej mieszaniny nanoszono na żel. Jako układ odniesienia stosowano w prowadzonych analizach mieszaninę białek - Standard IV firmy Merk, obejmującą ciężary cząsteczkowe 12.300, 30.000,

45.000, 66.200 oraz 76.000. Stosowano roztwór buforowy o następującym składzie:

0,72 g buforu TRIS-HCl /0,06ty

0,136 g EDTA /III/ /5mM/

0,18 g gliceryny /10%/ g SDS, pH doprowadzone do wartości 7,2 /dodać 90 ml wody/ ml beta merkaptoetanolu /10%/.

Do prowadzenia elektroforezy żelowej przygotowano 18¹% żel rozdzielający, który następnie pokryto 3,9% żelem zbierającym. Roztwór żelu rozdzielającego, o zawartości 18% akryloamldu, miał następujący skład:

g akryloamidu 0,045 g dwuakryloamidu

0,136 g buforu TRIS-HCl o pH 8,8 /0,325 M/

0,03 g SDS

200 pl 10% roztworu nadsiarczanu amonu 20 pl preparatu TEMED.

Roztwór żelu zbierającego, o zawartości 3,9% akryloamidu, miał następujący skład:

0,39 g akryloamidu

10,4 mg dwuakryloamidu

0,125 m buforu TRIS-HCl o pH 6,8 mg SDS

100 pl 10% roztworu nadsiarczanu amonu 10 pl preparatu TEMED.

Żel SDS - poliakryloamid przygotowano w następujący sposób. Przygotowano dwie płytki szklane o wymiarach 20 x 20 cm. Przemyto je dokładnie i spłukano etanolem, a następnie umieszczono jedną na drugiej. Dwie przekładki w postaci pasków o grubości 1 mm /długość 20 cm i szerokość 1 cm/ uformowały przestrzeń pomiędzy płytkami, do której wlano żel. Przekładki umieszczono na lewej i prawej krawędzi płytek. Dolną krawędź uszczelniono stosując taśmę przylepną z tkaniny, po czym wszystkie trzy krawędzie dodatkowo ściśnięto zaciskami, uszczelniając je ponadto 1% roztworem agarozy. Po zestaleniu agarozy, do szczeliny wprowadzono żel rozdzielający, przygotowany w wyżej opisany sposób, wypełniając przestrzeń między płytkami szklanymi ustawionymi w pozycji pionowej do poziomu około 3 cm poniżej górnej krawędzi płytek szklanych. Żel ten pokryto warstwą wody, którą wprowadzono za pomocą pipety typu Pasteur. Żel spolimeryzował po około 30 minutach. Warstwę wody zlewa się znad żelu i krawędź żelu spłukuje się raz roztworem żelu zbierającego, przygotowanego w wyżej opisany sposób.

Następnie, pozostałą przestrzeń szczeliny wypełnia się roztworem żelu zbierającego aż po krawędź szczeliny. Następnie wprowadzono teflonowy grzebień do zbierania próbek i umieszczono go tak, że dolna krawędź wgłębienia na próbkę leży w przybliżeniu 1 cm ponad przednią krawędzią warstwy żelu rozdzielającego. Po upływie około 15 sinut, żel zbierający uległ poli meryzacji i można było usunąć grzebień teflonowy. Następnie usunięto taśmę przylepną z tkaniny z dolnej krawędzi płytek i dokonano podłączenia żelu do aparatu do elektroforezy, zachowując pionową pozycję płytek z żalem. Komory buforowe wypełniono buforem do elektroforezy o następującym składzie:

g buforu TRIS-zasada /0»05M/

165 863

28,5 g glicyny /0,38M/ g SDS /0,1%/

1000 ml. wody, a następnie wgłębienia żelowe spłukano raz rozpylonym buforem. Próbki roztworów dimeru rybonukleazy ogrzewano przez około 10 minut z dodatkiem buforu w temperaturze 95°C i wprowadzono do pojemnika, bądź przestrzeni we wgłębieniu na badaną próbkę odpowiadającej wgłębieniu żelowemu.

Elektroforezę prowadzono przez około 4 godziny stosujęc pręd o natężeniu około 20 mA. Możliwe jest jednak, także, prowadzenie elektroforezy w ciągu nocy, wówczas, jednakże, należy stosować prąd o niższym natężeniu 6-8 mA. Przesuwający się front może być śledzony, jeżeli do buforu, z którym ogrzewa się badaną próbkę roztworu rybonukleazy wprowadzi się 0,02% błękitu bromotenolowego. Elektroforezę zakończono, gdy przesuwający się front doszedł do dolnej krawędzi żelu. Żel rozdzielający został odcięty, wybawiony przez około 30 minut w roztworze utrwalającym, a następnie ponownie oddzielony w ciągu 2 godzin w roztworze wybielającym o składzie 400 ml metanolu, 140 ml kwasu octowego i 2.000 ml wody. Roztwór utrwalający otrzymano łącząc 500 ml roztworu wybielającego z 12 ml roztworu barwnika o składzie 1 g barwnika Coomassie-blue R250 firmy Merck, 50 ml wody i 50 ml metanolu. Pasma białek zostały następnie uwidocznione przez wybarwienie wyżej opisanym roztworem barwnika. Z odczytu wyników analizy wykonanej metodą elektroforezy żelowej w układzie SDS-pollakrnloamid, SDS-PAGE, wynikało, że w analizowanych próbkach wzrastała zawartość dimeru rybonukleazy, przy czym wśród próbek w końcu pojawiały się frakcje zawierające również multimery erbonukleazr.

Wszystkie frakcje, w których rybonukleaza występowała głównie w postaci zdimeeyzowaney zostały zebrane i zatęzone do objętości 800 ml przy zastosowaniu instalacji przepływowej z zasilaniem stycznym w stosunku do przepony /Milipore/. Membranową przeponę spłukano następnie 400 ml środka przenikającego uzyskując ostatecznie 1.200 ml roztworu zawierającego dimer eybonukleazn. Następnie roztwór ten poddano liofilizacji i pozostawiono w temperaturze 4°C do następnego etapu postępowania. Liofilizację przeprowadzono w ten sposób, że rozprowadzono porcje 200 ml roztworu do kolb okeągłodenmnch o pojemności 500 ml. Kolby te umieszczono w ciekłym azocie i zamrożono w wyparce obrotowej /Heidolph VV60/. Następnie kolby szczelnie zamknięto i pozostawiono na 30 minut w temperaturze -30°C. W końcu materiał poddano liofilizacji zgodnie ze standardową procedurą.

Przed przystąpieniem do następnego etapu, oddzielono z pierwszego etapu filtracji frakcje zawierające momomerycznę postać rybonukleazy i połączony roztwór zawrócono do procesu dimernzacji. Przeprowadzono to w ten sposób, że frakcje uzyskane w pierwszym etapie filtracji, w których występowała przede wszystkim monomeryczna postać rybonukleazy zebrano i zatężono do objętości 4 litrów wykorzystując opisaną wyżej instalację przepływową z zasilaniem stycznym do przepony. Następnie przeprowadzono ponowną dimeryzację dodając wyżej opisany odczynnik sprzęgający. Po zakończeniu dimeenzacJi zawróconego roztworu momomeeyczneJ rybonukleazy mieszaninę reakcyjną poddano filtracji w wyżej opisany sposób i wydzielono dimer rybonukleazy otrzymany z zawróconego roztworu postaci monomeenczney typu enzymu. Zliofilizowariy produkt pierwszego rzutu procesu dlmernzacyi połączono ze zliofilizowanym drugim rzutem produktu uzyskanym w wyniku zawrócenia nieprzereagowanej monomeeyczmeJ postaci enzymu do procesu dimeeyzacJl.

Połączone zliofilizowane mieszaniny rybonukleazy, otrzymane po pierwszym etapie filtracji, poddano następnie chromatograficznemu rozdzielaniu na żywicy jonowymiennej sephadex G5OP, w celu dokładniejszego oddzielenia dimeru od momomeryczmeJ i oligomernczneJ postaci eybonukleazy. Stosowano kolumnę wypełnioną żywicą Sephadex G50F /Pharmacia/, zalaną 0,2 M buforem na bazie octanu sodu o pH 5. Bufor 0,2 M na bazie octanu sodu przygotowano rozpuszczając 27,22 g trójwodzianu octanu sodu w 1.000 ml wody. Warunki chromatografii oraz urządzenie były identyczne jak w pierwszym etapie filtracji.

W tym etapie uzyskano wykres wymywania zilustrowany na załączonym rysunku Fig. 2. Na tym rysunku gruba linia przedstawia wykres absorpcji roztworów enbomukleazy otrzymany przy zastosowaniu czulszych detektorów niż wykorzystane do sporządzenia wykresu wykonanego cien165 863 kę linię. W środkowej części wykresu wymywania sporządzonego przy użyciu czulszych detektorów występuje wyraźny, duży pik odpowiadający rdimewyzowanej postaci oraz dwa słabe piki drugorzędne. Wyniki analizy przeprowadzonej metodę elektroforezy żelowej w układzie SDS-PAGE dla frakcji odbieranych w obszarze wystąpienia na wykresie wymywania wyraźnego głównego piku, wykazuję, że we frakcjach tych jest znacznie większe stężenie dimeru rybonukleazy niż we frakcjach odpowiadających głównemu pikowi na wykresie wymywania sporządzonym dla pierwszego etapu filtracji.

Frakcje, odpowiadające obszarowi występowania głównego piku, z drugiego etapu filtracji zebrano i zatęzono przy zastosowaniu instalacji przepływowej z zasilaniem stycznym w stosunku do przepony, opisanej wcześniej. W celu przeprowadzenia odsalania, frakcje te przepuszczono przez kolumnę wypełniony żywicą jonowymienną Sephadex G25. Kolumna miała średnicę 25,2 cm i wysokość 65 cm i przemyta została zasadowym roztworem w ilości 32 1 z prędkością przepływu 15 l/min. Wszystkie frakcje roztworu rybonukleazy z drugiego etapu filtracji z obszaru występowania na wykresie wymywania głównego piku, do maksymalnej objętości 5 l zostały wyprowadzone na tę kolumnę wypełnioną preparatem Sephadex. Odsalanie przeprowadzono stosując 50 mM roztwór buforowy na bazie kwaśnego węglanu amonu. Cykl odsalania trwał 90 minut. Przez ten czas zebrano 5 litrów eluatu. I w tym etapie wykonano wykres wymywania. Frakcje odpowiadajęce jedynemu pikowi widocznemu na wykresie zebrano do kolby Schotta o pojemności 5 l. rrzeprowadzono rnalizę rróbek rczyszczooneo rinalnego -roduktu w środowwsku redukcyjnym beta-merkaptoetanolu oraz postaci niezredukowanej. Wyniki analizy przeprowadzonej metody elektroforezy żelowej w układzie SDS-PAGE, wykazały, że w końcowym oczyszczonym produkcie występuje jedynie rdimewyzozana postać rybonukleazy.

W celu przeprowadzenia otrzymanego białka w formę przydatny farmaceutycznie, konieczne jest uwolnienie dimeru rybonukleazy od endotoksyn. Oczyszczony dimer oddzielono chromatograficznie na kolumnie wypełnionej preparatem Detoxigel od niepożędanych endotoksyn. Aby zagwarantować maksymalny odzysk pożydanego dimeru rybonukleazy konieczne było stosowanie w charakterze eluentu roztworów buforowych o fizjologicznym zakresie pH. Osięgnięto to dzięki dodatkowi roztworów soli. Roztwór zawierający pożądany enzym wprowadzono na kolumnę wypełniony preparatem Detoxigel i usunięto endotoksyny w ilości do 1.500 E.U./ml. Przed każdym cyklem Detoxigel regenerowany był 1% roztworem dezoksycholanu, po czym przemywany starannie wody aż do momentu nieobecności endotoksyn w przesyczu. Kolumna miała objętość 750 ml /średnica 9,5 cm, wysokość 14 cm/ i doprowadzana była do stanu równowagi 0,1 M roztworem kwaśnego węglanu amonu. Bufor wolny od endotoksyn zmieszano ze sterylną wody. Roztwór rybonukleinianu, o objętości 2 1, wprowadzono na złoże żelu i pozostawiono do wsiąknięcia w żel. Następnie wyeluowano białko stosując bufor równowagowy i zbierając eluat do sterylnej zlewki. Roztwór ten następnie skierowano do liofilizacji w sterylnej kolbie okrągłodennej.

Zawartość endotoksyn w preparacie ustalono za pomocy zestawu diagnostycznego o nazwie Coatest /R/ firmy Kabi^^r^ z Monachium, RFN. Test ten jest oparty na zjawisku aktywacji lizatu Llmulus-Amoebocyoen-LasaO /LAL/ przez endotoksyny. Zaktywowany LAL wydziela żółty barwnik p-nitroanilinę z chromogenicznego substratu /S-2423/. Dokonuje się pomiaru redukcji barwy będycej miernikiem zawartości endotoksyn. Pomiar prowadzi się przy użyciu spek^r^tometru przy 405 nm. Oczyszczony dimer rybonukleazy o zawartości endotoksy poniżej 0,1 ng/mg przenoszono do okrągłodennej kolby i poddawano liofilizacji.

Otrzymano roztwór dimeru rybonukleazy w postaci zlioflllztzaneJ, o wysokim stopniu czystości. Produkt ten mógł być przechowywany aż do momentu, gdy stał się potrzebny do dalszego wykorzystania.

Przykład II. Badanie aktywności enzymu. Enzymatyczny aktywność rybonukleazy w postaci zdimeryzowanej, otrzymanej sposobem według wynalazku, badać można wykorzystujęc test aktywności opisany przez Kunitza w J.Gen.Physiol. , 24:15 /1940/. Test ten oparty jest na zjawisku polegającym na tym, ze pod wpływem oddziaływania rybonukleazy na kwas rybonukleinowy, jego widmo absorpcyjne przesunięte jest w nadfiolecie w stronę fal krótszych. W przedziale 290-305 nm stężenie kwasu nukleinowego obniża się na skutek rozkładu spowodowanego

165 863 przez rybonukleazę. W tej początkowej fazie reakcji obniżenie przebiega liniowo, co może wykorzystane być do pomiaru aktywności enzymatycznej. W obecnych badaniach spadek ilości kwasu nukleinowego mierzono przy 300 nm.

Test przeprowadzano w stałej temperaturze 25°C, stosując termostatyzowaną kuwetę, co pozwoliło, aby wszystkie roztwory mogły przed użyciem w ciągu 5 minut osiągnąć temperaturę 25°C. Pomiary wykonywano przy 300 nm stosując spektrofotornert. Objętość mieszaniny reakcyjnej wynosiła 3 ml. Reakcję prowadzono w kuwecie o objętości 3 ml, w której grubość warstwy mieszaniny wynosiła 1 cm.

Mieszaninę reakcyjną sporządzano biorąc 1,5 ml roztworu kwasu rybonukleinowego,

0,05-0,5 ml próbkę do badań, zawierającą frakcje roztworu rybonukleazy i wodę do sumarycznej objętości 10 ml. Roztwór kwasu rybonukleinowego przygotowano stosując 80 mg kwasu rybonukleinowego i sól sodowy /Boehringer/ rozpuszczony w 50 ml buforu octanowego. Stosowano bufor octanowy 0,1 M o pH 5, otrzymany przez zmieszanie 0,57 ml lodowatego kwasu octowego i około 80 ml destylowanej wody i doprowadzenie pH do 5 1 N roztworem wodorotlenku sodu, NaOH, a następnie uzupełnienie objętości roztworu do 100 ml wodę destylowaną i przesączenie w warunkach sterylności. Roztwory do badań zawierające dimer rybonukleazy przygotowano z 5 mg próbek dimeru rybonukleazy rozpuszczonych w 5 ml destylowanej wody, przez rozcieńczenie w takim stosunku aby mierzone wartości mieściły się w korzystnym przedziale.

Kwas rybonukleinowy i próbki badanych roztworów mieszano w kuwecie i śledzono redukcję kwasu nukleinowego stosując spektrofotometr model Spectronic 1001 /Bausch + Lomb/. Wykres absorpcji rejestrowano i przez 8 minut prowadzono obserwację w zakresie zmian linearnych. Reakcje prowadzono w temperaturze 25°C aż do ich całkowitego zakończenia, co następuje po około 3 godzinach. Następnie dokonywano ponownego pomiaru, celem ustalenia końcowej wartości. Pomiary powtarzano dwukrotnie i obliczano średni wynik.

Aby obliczyć aktywność enzymu należy wyznaczyć wartość ekstynkcji w momencie rozpoczęcia reakcji /E^ i ekstynkcję końcowy /Ee/ po zakończeniu reakcji oraz zmiany δ E/min w początkowym, liniowym przedziale. Rozcieńczenie próbek dimeru rybonukleazy, przeznaczonych do badań, należy tak dobrać aby zmiana Δ E/min nie przekraczała wartości 0,007. Ślepy próbę dla pomiarów stanowi mieszanina reakcyjna zawierająca rybonukleazę i wodę. Wartość ślepej próby należy odjąć od wartości faktycznie zmierzonej. Jako jednostkę enzymatyczny zdefiniowano taky ilość enzymów, jaka w warunkach testu powoduje 100% spadek w ciągu minuty wartości

E-E substratu w temperaturze 25^OC. Najwyższa możliwa wartość ekstynkcji obserwowana przy

300 nm wynosi E_Q-E_e. Aktywność właściwy enzymu oblicza się następująco* /3 x Δ E/min/ Współczynnik rozcieńczenia /E_o - Eg/ x objętość /ml/ roztworu badanego

Dimer enzymu rybonukleazy, wytwarzany sposobem według wynalazku wykazywał w przeprowadzonych testach wyraźny aktywność enzymatyczny.

165 863

F/G.1

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 1,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania Oimeru rybonukleazy, znamienny tym, że sporządza się roztwór rybonukleazy przez wprowadzenie rybonukleazy w postaci monomerycznej do roztworu buforowego o pH doprowadzonym do wartości co najmniej około 9, do roztworu tego dodaje się suberimidanowy odczynnik sprzęgający, dla spowodowania dimeryzacji monomerów nybonukleazy, utrzymując wartość pH roztworu na poziomie co najmniej około 9, przerywa się reakcję dimeryzacji w wybranym momencie przez obniżenie pH roztworu do wartości około 7, filtruje się roztwór zdimeryzowanej rybonukleazy prowadząc filtrację dwuetapowo, przy czym w pierwszym etapie eluuje się ten roztwór przez żywicę jonowymienny zbierając frakcje zawierające głównie zdimeryzowaną postać rybonukleazy, a w drugim etapie przez żywicę jonowymienny eluuje się jedynie frakcje zebrane w pierwszym etapie filtracji i odbiera się roztwór dimeru rybonukleazy o wysokim stopniu oczyszczenia z drugiego etapu filtracji.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, żepH roztworu rybonukleazy w postaci monomerycznej doprowadza się do wartości około 10.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, żepH roztworu rybonukleazy w postaci monomerycznej doprowadza się do wartości 10 dodając wodorotlenek sodu NaOH.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako roztwór buforowy do sporządzenia roztworu rybonuklEsay w postaci monomerycznej stosuje się roztwór buforowy na bazie dwuwodzianu jednokwaśnego fosforanu sodu.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przy odczynnika sprzęgającego do roztworu rybonukleazy w postaci monomerycznej wartość pH roztworu utrzymuje się na poziomie około 10.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako suberimidanowy odczynnik sprzęgający stosuje się dwumetylową pochodną imidu kwasu suberynowego.
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że dimeryzację prowadzi się w temperaturze pokojowej.
8. Sposób według zastrz. 1, przy ciągłym mieszaniu roztworu.
9. Sposób wedłdg gastrz. 1, rywa się dodając kwas solny HCl.
10. Sposób wewług gastrz. 1, znamienny tym, że Olmaryzację prowadzi się znamienny tym, że reakcję dlmeIyzβyaS pizet y m, że roztwór zdlmerzziwenyz znamienny nybonuklEsay zatęza się przed filtrację wykorzystując zasilaną stycznie instalację przepływowy.
11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, zż pierwszy etap filtracji j^i^o wadzi się przy zastosowaniu żywicy jonowymiennej Sepi^eM.
12. Sposób według 1, znamienny tym, iż roztwór rybonuklnybo w postaci wonomEnycanej zawiera 40-60 g monomeru rybonuklEszy oraz 4-6 1 buforu, zaś odczynnik sprzęgający dodaje się w ilości od około 4-6 g.
13. Sposób według 1, znamienny tym, że frakcje zbizbien n pwe rwsaym etapie filtracji są poddawane analizie metodę elektroforezy żelowej.
14. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że frakcje zaebnae p pPse-wwszy etapie filtracji poddaje się liofilizacji.
15. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że frakcje zbierana w pierwszym etapie filtracji, zadIErającE przede wszystkim monomenycaną postać nybonuklEszy zawraca się 1 ponownie poddaje procesowi ^we^scCI.
16. SposSP sób Pwe ług pzas R, z namSθnny t ym, że dże pd eti p taP prictr pd· wadzi się pnay zastosowaniu żywicy jonodymIEnnEp SephadeM.

165 863
17. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym. że c^r^uc^i etap flltrecj i prowadzi się przy wartości pH około 5.
18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, wa wortośH pH w Cruget etapia filtracji osiąga się stosując bufor na bazie octanu sodu.
19. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że fraCcJg zbieraeg w drdgiu etapie filtracji poddaje się analizie metodą elektroforezy żelowej.
20. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, pe dr drugit piegli tric^ecji następuje odsalanie.
21. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, zh odlβlaeie prowadzg się wykorzystując kolumnę SephadeK G25.
22. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, eg oczyscczony roztwóH dineru rybonukleazy poddajc się dodatkowo zabiegowi usuwania endotoksyno
23. Sposób według zastrz. 22, znamienny t m ^m· żh eneleoysyny usuwa się stosując kolumnę DetoK^^.