PL165934B1

PL165934B1 - The method of separating gibberellins from solutions in organic solvents

Info

Publication number: PL165934B1
Application number: PL28824390A
Authority: PL
Inventors: Ryszard Heropolitanski; Julianna Kominiak; Jolanta Gajewska; Marian Sykula; Jacek Ostapczuk
Original assignee: Inst Chemii Przemyslowej; Kutnowskie Zakl Farma
Priority date: 1990-12-13
Filing date: 1990-12-13
Publication date: 1995-03-31
Also published as: PL288243A1

Abstract

Sposób wydzieltrnia giberelinzroztworów w rozpuszczalnikach organicznych na drodze soepoji aiberelin nc cmonitcoh z obysną grupą funkcyjną c następnie óesoepoji, bdcmiegga tym, że roztwór oracniozny lub wodso-OΓgyninzna aiberelin roboieńorc się wodą do stężenie poniżej 60% rozpusrobclnikc organiczneio i przepuszozc się przez żywioe ygiosowanienne, desorpoję aiberelin z jonitu prowcdzi się zc pomocą wodnego roztworu soli nieoracnicznaoh o zcwcrtośoi nie mniej niż 2%, ewegtuylgie z dodctkiem substc^oji ylkclinbnanh w ilośoi nie większej niż 1%, po ozymjonit przemywc się wodnym roztworem substynnji ylkclinznaoh o stężeniu nie mniejszym niż 3%, zcś wydzielcnie aiberelin z eluctu prowyóbi się w znygy sposób przez zykwysbesie kwcsem minerylsym do pH 1 -2,5, systępnie ekstrahuje o^tcnem etylu lub clkoholem n-butylowym i krastalizyoję.A method for isolating gibberellins from solutions in organic solvents by combining gibberellins with other compounds with a specific functional group and then undergoing an electrolysis, which involves the following: an organic or water-soluble gibberellins solution is dissolved in water to a concentration below 60% with an organic solvent and passed through a suitable organic solvent; the gibberellins are desorpted from the ion exchanger using an aqueous solution of inorganic salts of not less than 2%, possibly with the addition of alkylbenzene substances in an amount of not more than 1%; after the ion exchanger is washed with an aqueous solution of alkylbenzene substances of not less than 1%. concentration of not less than 3%, while the separation of aberrelin from the eluate is carried out in a simple way by treating it with mineral acid to pH 1-2.5, then extracting it with ethyl alcohol or n-butyl alcohol and crystallizing.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wydzielania giberelin z roztworów w rozpuszczalnikach organicznych lub wodno organicznych metodami sorpcyjnymi. Roztwory te powstają głównie jako eluaty w sorpcyjnej metodzie wydzielania giberelin wytwarzanych metodą fermentacyjną.The subject of the invention is a method of separating gibberellins from solutions in organic or aqueous-organic solvents by sorption methods. These solutions are mainly formed as eluates in the sorption method of separating gibberellins produced by the fermentation method.

Gibereliny tworzą dużą grupę związków o nieco zbliżonej budowie i działaniu. Najbardziej znaną i występującą w największych ilościach jest giberelina A-3 nazywana również kwasem giberelinowym. Wspólną cechą tych związków jest stymulowanie wzrostu roślin wyższych oraz ich rozwoju. Gibereliny znajdują coraz szersze zastosowanie w agrotechnice. Odpowiednio stosowane wraz z prawidłowym nawożeniem, umożliwiają bardzo znaczny wzrost plonów niektórych roślin.Gibberellins form a large group of compounds with somewhat similar structure and action. The best known and most abundant is gibberellin A-3, also known as gibberellic acid. The common feature of these compounds is stimulating the growth of higher plants and their development. Gibberellins are increasingly used in agrotechnics. Properly used together with proper fertilization, they enable a very significant increase in the yields of some plants.

Znany z polskiego opisu patentowego nr 126 043 sposób sorpcyjnego wydzielania giberelin polega na tym, że bulion po biosyntezie przepuszcza się przez kolumnę wypełnioną niejonową wysokoporowatą żywicą sorpcyjną, niepolarną lub średniopolarną, natomiast zasorbowane gibereliny desorbuje się wodnymi roztworami rozpuszczalników organicznych silnie polarnych takich jak metanol czy aceton. Z uzyskanych eluatów oddestylowuje się rozpuszczalnik organiczny i z pozostałości wodnej ekstrahuje się powtórnie gibereliny octanem etylu i z takiego roztworu wydziela się je w postaci krystalicznej.The method of sorptive separation of gibberellins known from Polish Patent No. 126,043 is based on the fact that the biosynthetic broth is passed through a column filled with a non-ionic, high-porosity, non-polar or medium-polar sorption resin, while the absorbed gibberellins are desorbed with aqueous solutions of strongly polar and acetone organic solvents. . The organic solvent is distilled off from the eluates obtained, and the gibberellins are re-extracted from the aqueous residue with ethyl acetate and separated from this solution in a crystalline form.

Mankamentem tego sposobu jest konieczność odparowywania rozpuszczalników organicznych z eluatów zawierających gibereliny. Obecność rozpuszczalników organicznych w eluatach uniemożliwia stosowanie bezpośredniego wydzielania giberelin w postaci krystalicznej. Z kolei proces odparowywania wymaga grzania, nawet wówczas jeżeli prowadzi się go pod zmniejszonym ciśnieniem. Grzanie natomiast powoduje rozpad giberelin. Wszystkie znane do tej pory gibereliny posiadają w swojej cząsteczce pierścień laktonowy. Pierścień laktanowy natomiast jest nietrwały i w podwyższonej temperaturze dość łatwo pęka, hydrolizując na hydroksykwas, który nie wykazuje aktywności biologicznej. Podczas odparowywania rozpuszczalników z eluatu rozkłada się przeciętnie 15-20% giberelin.The drawback of this method is the necessity to evaporate organic solvents from gibberellin-containing eluates. The presence of organic solvents in the eluates makes it impossible to use the direct separation of gibberellins in a crystalline form. The vaporization process in turn requires heating, even when carried out under reduced pressure. Heating, on the other hand, causes the gibberellins to break down. All known gibberellins so far have a lactone ring in their molecule. The lactan ring, on the other hand, is unstable and breaks quite easily at elevated temperatures, hydrolyzing it into a hydroxy acid that has no biological activity. During the evaporation of the solvents from the eluate, on average 15-20% of the gibberellins decompose.

165 934165 934

Znany i stosowany jest sposób wychwytywania substancji o charakterze kwaśnym na anionitach. Jednakże gibereliny, pomimo, że są kwasami, rozpuszczone w stężonych rozpuszczalnikach organicznych nie są wychwytywane na anionitach, słabo czy silnie zasadowych w sposób efektywny.The method of capturing acid substances on anion exchangers is known and used. However, gibberellins, although they are acids, dissolved in concentrated organic solvents are not captured on weakly or strongly basic anion exchangers in an effective manner.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że można przeprowadzić sorpcję giberelin na anionitach z dobrą wydajnością według wynalazku, jeżeli roztwory organiczne giberelin lub wodno-organiczne o dużym stężeniu rozcieńczy się wodą do stężenia poniżej 60% rozpuszczalnika organicznego. Desorpcję giberelin prowadzi się wówczas wodnym roztworem soli nieorganicznych o zawartości nie mniej niż 2%, ewentualnie z dodatkiem substancji alkalicznych w ilości nie większej niż 1%. Jako sól nieorganiczną korzystnie jest stosować siarczan lub chlorek sodu lub potasu, a jako substancję alkaliczną - wodorotlenek sodu lub potasu albo węglany sodu lub potasu.It has surprisingly been found that sorption of gibberellins on anion exchangers can be performed with good yield according to the invention if the organic gibberellins or high-concentration aqueous-organic solutions are diluted with water to a concentration below 60% of the organic solvent. The desorption of gibberellins is then carried out with an aqueous solution of inorganic salts with a content of not less than 2%, possibly with the addition of alkaline substances in an amount not greater than 1%. As inorganic salt it is preferable to use sodium or potassium sulfate or chloride and as alkaline substance sodium or potassium hydroxide or sodium or potassium carbonates.

Tą metodą uzyskuje się eluaty o dużym stężeniu giberelin, nie zawierające rozpuszczalników organicznych. Sole lub solno alkaliczne roztwory giberelin zakwasza się następnie kwasem mineralnym do pH 1 -2,5 i ekstrahuje się, na przykład, octanem etylu lub alkoholem n-butylowym i wydziela w postaci krystalicznej znaną metodą przez krystalizację. Desorpcję zanieczyszczeń smolistych z anionitów oraz regenerację grup funkcyjnych przeprowadza się wodnym roztworem substancji alkalicznych o stężeniu powyżej 3%.This method produces eluates with a high concentration of gibberellins, which do not contain organic solvents. The gibberellin salts or saline-alkaline solutions are then acidified with mineral acid to a pH of 1-2.5 and extracted, for example, with ethyl acetate or n-butyl alcohol and separated in the crystalline form by a known method by crystallization. Desorption of tar from anion exchangers and regeneration of functional groups is carried out with an aqueous solution of alkaline substances with a concentration of more than 3%.

Przykład I. W przykładzie użyto roztwór wodno-metanolowy o zawartości 85% metanolu i 0,31 % gibereliny A-3, uzyskany w wyniku przepuszczenia roztworu po biosyntezie, przez złoże niepolarnego sorbentu syntetycznego i następną desorpcję giberelin metanolem. Użyto roztwór (eluat) rozcieńczono wodą do zawartości 60% metanolu. Rozcieńczony roztwór przepuszczano przez układ dwóch kolumn pracujących szeregowo, do momentu aż wyciek po kolumnie pracującej jako pierwsza, wykazywał stężenie giberelin w ilości około 2/3 stężenia wyjściowego. Wyciek z kolumny pierwszej kierowany był na kolumnę drugą. Kolumny wypełnione były słabo zasadową żywicą anionowymienną w formie wodorotlenowej o nazwie handlowej Wofatyt AD-41. Przez kolumny przepuszczono ogółem 27 objętości roztworu, licząc na objętość sorbentu w jednej kolumnie. Po zakończeniu sorpcji kolumnę, która pracowała jako pierwsza odłączono i przemyto 1 objętością wody. Następnie ciecz spuszczono do poziomu sorbenta i rozpoczęto dozowanie 2,5% wodnego roztworu chlorku sodowego. Po ukazaniu się ciemniejszego wycieku rozpoczęto odbierać główną frakcję giberelinową. Frakcję główną odbierano do chwili wyraźnego spadku stężenia giberelin. Ogółem odebrano 2,5 objętości eluatu, o stężeniu średnim 1,65% kwasu giberelinowego. Następnie odebrano jeszcze 1,5 objętości wycieku o średniej zawartości giberelin 0,21%. Wyciek ten użyto jako eluat przy desorpcji w następnym cyklu. Uzyskane 2,5 objętości eluatu zakwaszono kwasem solnym do pH 1,8 i ekstrahowano octanem etylu w stosunku 1:1. Ekstrakcję prowadzono dwukrotnie. Ekstrakty zlano razem i oddestylowano z nich część octanu etylu, pod zmniejszonym ciśnieniem. Octan oddestylowywano do momentu ukazania się pierwszych kryształów.Example 1 The example uses a water-methanol solution containing 85% methanol and 0.31% of gibberellin A-3, obtained by passing the biosynthetic solution through a bed of non-polar synthetic sorbent and subsequent desorption of gibberellins with methanol. The solution (eluate) used was diluted with water to 60% methanol. The diluted solution was passed through a two-column system in series until the runoff from the first column showed a gibberellin concentration of about 2/3 of the starting concentration. The leak from the first column was directed to the second column. The columns were filled with a weakly basic anion-exchange resin in the hydroxide form, under the trade name Wofatyt AD-41. A total of 27 volumes of solution were passed through the columns, based on the volume of sorbent in one column. After the end of sorption, the column that was operated first was disconnected and washed with 1 volume of water. The liquid was then drained to the level of the sorbent and dosing of 2.5% aqueous sodium chloride solution was started. After the darker spill appeared, the main gibberellin fraction was started. The main fraction was collected until the concentration of gibberellins clearly decreased. In total, 2.5 volumes of eluate were collected, with an average concentration of 1.65% gibberellic acid. Then another 1.5 volumes of the effluent with an average gibberellin content of 0.21% were collected. This effluent was used as the desorption eluate for the next cycle. The resulting 2.5 volumes of eluate were acidified with hydrochloric acid to pH 1.8 and extracted with 1: 1 ethyl acetate. Extraction was performed twice. The extracts were pooled and some ethyl acetate was distilled off under reduced pressure. The acetate was distilled off until the first crystals appeared.

Następnie roztwór ochłodzono i odsączono wydzielone gibereliny. Po wysuszeniu uzyskano produkt o zawartości 93% kwasu giberelinowego. Sorbent po desorpcji poddano regeneracji, to jest odmyciu od substancji zanieczyszczających, które nie desorbują się razem z giberelinami i blokują sorbent zmniejszając jego pojemność sorpcyjną. Regenerację przeprowadzono przepuszczając przez kolumnę 3 objętości 3% wodnego roztworu NaOH, a następnie przemyto wodą do momentu aż wyciek posiadał pH poniżej 10,5. Po tej operacji sorbent był gotów do następnego cyklu sorpcji.The solution was then cooled and the separated gibberellins were filtered off. After drying, the product was obtained with a content of 93% gibberellic acid. After desorption, the sorbent was regenerated, i.e. washed away from contaminants that do not desorb along with gibberellins and block the sorbent, reducing its sorption capacity. Regeneration was performed by passing 3 volumes of 3% aqueous NaOH through the column, followed by washing with water until the effluent had a pH below 10.5. After this operation, the sorbent was ready for the next sorption cycle.

Przykład Π. W przykładzie użyto roztwór acetonowo-wodny zawierający 45% acetonu i około 0,41% gibereliny A-3. Roztwór ten bez wstępnego rozcieńczania wodą, przepuszczono przez układ dwóch kolumn, podobnie jak w przykładzie I. Kolumny wypełnione były anionitem silnie zasadowym typu Amberlit IRA-900 w formie wodorotlenowej. Roztwór przepuszczano do momentu wyraźnego przebicia sorbentu w pierwszej kolumnie, podobnie jak w przykładzie I. Ogółem przez kolumnę przepuszczono 21 objętości roztworu. Następnie kolumnę tę odłączono do desorpcji giberelin i regeneracji sorbenta.Example Π. The example uses an acetone / aqueous solution containing 45% acetone and approximately 0.41% gibberellin A-3. This solution, without pre-dilution with water, was passed through a two-column system as in Example 1. The columns were packed with a strong base anion exchanger of the Amberlite IRA-900 type in hydroxide form. The solution was passed through until the sorbent was clearly broken down in the first column, similar to Example 1. A total of 21 volumes of solution were passed through the column. The column was then disconnected for gibberellin desorption and sorbent regeneration.

Desorpcję giberelin przeprowadzano podobnie jak w przykładzie I, z tą różnicą, że jako eluenta użyto 4% wodny roztwór chlorku sodowego z dodatkiem 0,5% wodorotlenku sodowego.The desorption of gibberellins was carried out as in Example 1, except that a 4% aqueous sodium chloride solution with 0.5% sodium hydroxide was used as the eluent.

165 934165 934

Ogółem odebrano 2 objętości frakcji głównej o średniej zawartości 1,92% giberelin i 1,5 objętości frakcji do zawrotu, to znaczy jako eluenta do następnego cyklu desorpcji. Po przepuszczeniu przez kolumnę 3,5 objętości eluenta zaczęto dozować 4% wodny roztwór NaOH i przepuszczono go 4 objętości. Następnie sorbent przemyto wodą do pH około 10. Gibereliny wydzielano z frakcji głównych. Przed wydzielaniem eluat zakwaszono kwasem siarkowym do pH ^2,1 i ekstrahowano alkoholem n-butylowym, dwa razy w stosunku 1:1 i 1 raz w stosunku 2 części eluatu na jedną cześć butanolu.A total of 2 volumes of the main fraction with an average content of 1.92% gibberellins and 1.5 volumes of the fraction for recycling were collected, i.e. as eluent for the next desorption cycle. After 3.5 volumes of eluent had passed through the column, 4% aqueous NaOH was added and 4 volumes were passed through. The sorbent was then washed with water to a pH of about 10. Gibberellins were separated from the main fractions. Prior to isolation, the eluate was acidified with sulfuric acid to pH ^2.1 and extracted with n-butyl alcohol twice in a ratio of 1: 1 and once in a ratio of 2 parts of eluate to one part of butanol.

Z ekstraktu butanolowego wydzielono gibereliny podobnie jak w przykładzie I, przez odparowanie butanolu do momentu pojawienia się pierwszych kryształów. Uzyskano suchy produkt o zawartości 70% gibereliny A-3.The gibberellins were isolated from the butanol extract, as in Example 1, by evaporating the butanol until the first crystals appear. A dry product with 70% gibberellin A-3 was obtained.

Przykład III. W przykładzie użyto roztwór wodno-metanolowy, taki sam jak w przykładzie I. Roztwór ten rozcieńczono wodą do zawartości 45% metanolu. Tak przygotowany roztwór przepuszczano przez kolumnę wypełnioną słabo zasadowym anionitem w formie OH o nazwie handlowej Amberlit IRA-47. Roztwór przepuszczano do momentu aż w wycieku ukazały się śladowe ilości giberelin co określano znanym sposobem analitycznym. Desorpcję giberelin przeprowadzano identycznie jak w przykładzie I z tą różnicą, że jako eluenta użyto 2% wodny roztwór siarczanu sodowego z dodatkiem 1,5% wodorotlenku sodowego. Uzyskano 1,6 objętości, głównej frakcji eluatu o zawartości 2,1% giberelin. Gibereliny zaś wydzielano tak samo jak w przykładzie I, przez zakwaszanie i ekstrakcję octanem etylu. Uzyskano suchy produkt o zawartości 91% gibereliny A-3.Example III. The example uses a water-methanol solution, the same as in example 1. This solution was diluted with water to 45% methanol. The solution prepared in this way was passed through a column filled with a weakly basic anion exchanger in the OH form under the trade name Amberlite IRA-47. The solution was passed through until trace amounts of gibberellins appeared in the effluent, which was determined by a known analytical method. The gibberellin desorption was carried out in the same way as in Example 1, except that a 2% aqueous sodium sulfate solution with 1.5% sodium hydroxide was used as the eluent. The obtained was 1.6 volumes of the main eluate fraction with 2.1% gibberellins. The gibberellins were isolated as in Example 1 by acidification and extraction with ethyl acetate. A dry product with 91% gibberellin A-3 was obtained.

Przykład IV. W przykładzie użyto etanolowo-wodny roztwór giberelin o zawartości 35% etanolu i 0,385% giberelin. Z roztworu tego, bez dodatkowego rozcieńczania wodą, przeprowadzono sorpcję giberelin w sposób identyczny jak w przykładzie I. Desorpcję giberelin przeprowadzono podobnie jak w przykładzie I z tą różnicą, że jako eluenta użyto 5% wodny roztwór siarczanu sodowego, bez dodatku substancji alkalicznych. Po przeprowadzeniu desorpcji giberelin, regenerację grup funkcyjnych dokonano 3% wodnym roztworem NaOH i następnie odmyto wodą do pH około 10. Z eluatów po zakwaszeniu, wydzielono gibereliny tak samo jak w przykładzie I. Uzyskano wyniki podobne jak w przykładzie I.Example IV. The example uses an ethanol-water solution of gibberellins with 35% ethanol and 0.385% gibberellins. From this solution, without additional dilution with water, sorption of gibberellins was carried out in the same way as in Example 1. Gibberellin desorption was performed similarly to Example 1, with the difference that 5% aqueous sodium sulfate solution was used as eluent, without addition of alkali. After desorption of gibberellins, regeneration of functional groups was done with 3% aqueous NaOH solution and then washed with water to a pH of about 10. The gibberellins were isolated from the acidification eluates in the same way as in Example 1. The results were similar to those in Example 1.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 1,00 zł.Publishing Department of the UP RP. Circulation of 90 copies. Price PLN 1.00.

Claims

Patent claims

The method of separating gibberellins from solutions in organic solvents by sorption of gibberellins on anion exchangers with an active functional group and then desorption, characterized in that the organic or aqueous-organic solution of gibberellins is diluted with water to a concentration below 60% of an organic solvent and passed through the resins anion exchange, desorption of gibberellins from ion exchanger is carried out with an aqueous solution of inorganic salts with a content of not less than 2%, possibly with the addition of alkaline substances in an amount not greater than 1%, then the ion exchanger is washed with an aqueous solution of alkaline substances with a concentration of not less than 3 %, and the separation of gibberellins from the eluate is carried out in a known manner by acidification with mineral acid to pH 1-2.5, then extraction with ethyl acetate or n-butyl alcohol and crystallization.

2. The method according to p. The process of claim 1, wherein the organic solvents are C1-C3 alcohols and acetone.

3. The method according to p. The process of claim 1, wherein the alkaline substances are sodium or potassium hydroxide, or sodium or potassium carbonates.

4. The method according to p. The process of claim 1, wherein the inorganic salts are sodium or potassium sulfates or chlorides.