PL165934B1 - Sposób wydzielania giberelin z roztworów w rozpuszczalnikach organicznych - Google Patents

Abstract

Sposób wydzieltrnia giberelinzroztworów w rozpuszczalnikach organicznych na drodze soepoji aiberelin nc cmonitcoh z obysną grupą funkcyjną c następnie óesoepoji, bdcmiegga tym, że roztwór oracniozny lub wodso-OΓgyninzna aiberelin roboieńorc się wodą do stężenie poniżej 60% rozpusrobclnikc organiczneio i przepuszozc się przez żywioe ygiosowanienne, desorpoję aiberelin z jonitu prowcdzi się zc pomocą wodnego roztworu soli nieoracnicznaoh o zcwcrtośoi nie mniej niż 2%, ewegtuylgie z dodctkiem substc^oji ylkclinbnanh w ilośoi nie większej niż 1%, po ozymjonit przemywc się wodnym roztworem substynnji ylkclinznaoh o stężeniu nie mniejszym niż 3%, zcś wydzielcnie aiberelin z eluctu prowyóbi się w znygy sposób przez zykwysbesie kwcsem minerylsym do pH 1 -2,5, systępnie ekstrahuje o^tcnem etylu lub clkoholem n-butylowym i krastalizyoję.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wydzielania giberelin z roztworów w rozpuszczalnikach organicznych lub wodno organicznych metodami sorpcyjnymi. Roztwory te powstają głównie jako eluaty w sorpcyjnej metodzie wydzielania giberelin wytwarzanych metodą fermentacyjną.

Gibereliny tworzą dużą grupę związków o nieco zbliżonej budowie i działaniu. Najbardziej znaną i występującą w największych ilościach jest giberelina A-3 nazywana również kwasem giberelinowym. Wspólną cechą tych związków jest stymulowanie wzrostu roślin wyższych oraz ich rozwoju. Gibereliny znajdują coraz szersze zastosowanie w agrotechnice. Odpowiednio stosowane wraz z prawidłowym nawożeniem, umożliwiają bardzo znaczny wzrost plonów niektórych roślin.

Znany z polskiego opisu patentowego nr 126 043 sposób sorpcyjnego wydzielania giberelin polega na tym, że bulion po biosyntezie przepuszcza się przez kolumnę wypełnioną niejonową wysokoporowatą żywicą sorpcyjną, niepolarną lub średniopolarną, natomiast zasorbowane gibereliny desorbuje się wodnymi roztworami rozpuszczalników organicznych silnie polarnych takich jak metanol czy aceton. Z uzyskanych eluatów oddestylowuje się rozpuszczalnik organiczny i z pozostałości wodnej ekstrahuje się powtórnie gibereliny octanem etylu i z takiego roztworu wydziela się je w postaci krystalicznej.

Mankamentem tego sposobu jest konieczność odparowywania rozpuszczalników organicznych z eluatów zawierających gibereliny. Obecność rozpuszczalników organicznych w eluatach uniemożliwia stosowanie bezpośredniego wydzielania giberelin w postaci krystalicznej. Z kolei proces odparowywania wymaga grzania, nawet wówczas jeżeli prowadzi się go pod zmniejszonym ciśnieniem. Grzanie natomiast powoduje rozpad giberelin. Wszystkie znane do tej pory gibereliny posiadają w swojej cząsteczce pierścień laktonowy. Pierścień laktanowy natomiast jest nietrwały i w podwyższonej temperaturze dość łatwo pęka, hydrolizując na hydroksykwas, który nie wykazuje aktywności biologicznej. Podczas odparowywania rozpuszczalników z eluatu rozkłada się przeciętnie 15-20% giberelin.

165 934

Znany i stosowany jest sposób wychwytywania substancji o charakterze kwaśnym na anionitach. Jednakże gibereliny, pomimo, że są kwasami, rozpuszczone w stężonych rozpuszczalnikach organicznych nie są wychwytywane na anionitach, słabo czy silnie zasadowych w sposób efektywny.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że można przeprowadzić sorpcję giberelin na anionitach z dobrą wydajnością według wynalazku, jeżeli roztwory organiczne giberelin lub wodno-organiczne o dużym stężeniu rozcieńczy się wodą do stężenia poniżej 60% rozpuszczalnika organicznego. Desorpcję giberelin prowadzi się wówczas wodnym roztworem soli nieorganicznych o zawartości nie mniej niż 2%, ewentualnie z dodatkiem substancji alkalicznych w ilości nie większej niż 1%. Jako sól nieorganiczną korzystnie jest stosować siarczan lub chlorek sodu lub potasu, a jako substancję alkaliczną - wodorotlenek sodu lub potasu albo węglany sodu lub potasu.

Tą metodą uzyskuje się eluaty o dużym stężeniu giberelin, nie zawierające rozpuszczalników organicznych. Sole lub solno alkaliczne roztwory giberelin zakwasza się następnie kwasem mineralnym do pH 1 -2,5 i ekstrahuje się, na przykład, octanem etylu lub alkoholem n-butylowym i wydziela w postaci krystalicznej znaną metodą przez krystalizację. Desorpcję zanieczyszczeń smolistych z anionitów oraz regenerację grup funkcyjnych przeprowadza się wodnym roztworem substancji alkalicznych o stężeniu powyżej 3%.

Przykład I. W przykładzie użyto roztwór wodno-metanolowy o zawartości 85% metanolu i 0,31 % gibereliny A-3, uzyskany w wyniku przepuszczenia roztworu po biosyntezie, przez złoże niepolarnego sorbentu syntetycznego i następną desorpcję giberelin metanolem. Użyto roztwór (eluat) rozcieńczono wodą do zawartości 60% metanolu. Rozcieńczony roztwór przepuszczano przez układ dwóch kolumn pracujących szeregowo, do momentu aż wyciek po kolumnie pracującej jako pierwsza, wykazywał stężenie giberelin w ilości około 2/3 stężenia wyjściowego. Wyciek z kolumny pierwszej kierowany był na kolumnę drugą. Kolumny wypełnione były słabo zasadową żywicą anionowymienną w formie wodorotlenowej o nazwie handlowej Wofatyt AD-41. Przez kolumny przepuszczono ogółem 27 objętości roztworu, licząc na objętość sorbentu w jednej kolumnie. Po zakończeniu sorpcji kolumnę, która pracowała jako pierwsza odłączono i przemyto 1 objętością wody. Następnie ciecz spuszczono do poziomu sorbenta i rozpoczęto dozowanie 2,5% wodnego roztworu chlorku sodowego. Po ukazaniu się ciemniejszego wycieku rozpoczęto odbierać główną frakcję giberelinową. Frakcję główną odbierano do chwili wyraźnego spadku stężenia giberelin. Ogółem odebrano 2,5 objętości eluatu, o stężeniu średnim 1,65% kwasu giberelinowego. Następnie odebrano jeszcze 1,5 objętości wycieku o średniej zawartości giberelin 0,21%. Wyciek ten użyto jako eluat przy desorpcji w następnym cyklu. Uzyskane 2,5 objętości eluatu zakwaszono kwasem solnym do pH 1,8 i ekstrahowano octanem etylu w stosunku 1:1. Ekstrakcję prowadzono dwukrotnie. Ekstrakty zlano razem i oddestylowano z nich część octanu etylu, pod zmniejszonym ciśnieniem. Octan oddestylowywano do momentu ukazania się pierwszych kryształów.

Następnie roztwór ochłodzono i odsączono wydzielone gibereliny. Po wysuszeniu uzyskano produkt o zawartości 93% kwasu giberelinowego. Sorbent po desorpcji poddano regeneracji, to jest odmyciu od substancji zanieczyszczających, które nie desorbują się razem z giberelinami i blokują sorbent zmniejszając jego pojemność sorpcyjną. Regenerację przeprowadzono przepuszczając przez kolumnę 3 objętości 3% wodnego roztworu NaOH, a następnie przemyto wodą do momentu aż wyciek posiadał pH poniżej 10,5. Po tej operacji sorbent był gotów do następnego cyklu sorpcji.

Przykład Π. W przykładzie użyto roztwór acetonowo-wodny zawierający 45% acetonu i około 0,41% gibereliny A-3. Roztwór ten bez wstępnego rozcieńczania wodą, przepuszczono przez układ dwóch kolumn, podobnie jak w przykładzie I. Kolumny wypełnione były anionitem silnie zasadowym typu Amberlit IRA-900 w formie wodorotlenowej. Roztwór przepuszczano do momentu wyraźnego przebicia sorbentu w pierwszej kolumnie, podobnie jak w przykładzie I. Ogółem przez kolumnę przepuszczono 21 objętości roztworu. Następnie kolumnę tę odłączono do desorpcji giberelin i regeneracji sorbenta.

Desorpcję giberelin przeprowadzano podobnie jak w przykładzie I, z tą różnicą, że jako eluenta użyto 4% wodny roztwór chlorku sodowego z dodatkiem 0,5% wodorotlenku sodowego.

165 934

Ogółem odebrano 2 objętości frakcji głównej o średniej zawartości 1,92% giberelin i 1,5 objętości frakcji do zawrotu, to znaczy jako eluenta do następnego cyklu desorpcji. Po przepuszczeniu przez kolumnę 3,5 objętości eluenta zaczęto dozować 4% wodny roztwór NaOH i przepuszczono go 4 objętości. Następnie sorbent przemyto wodą do pH około 10. Gibereliny wydzielano z frakcji głównych. Przed wydzielaniem eluat zakwaszono kwasem siarkowym do pH ^2,1 i ekstrahowano alkoholem n-butylowym, dwa razy w stosunku 1:1 i 1 raz w stosunku 2 części eluatu na jedną cześć butanolu.

Z ekstraktu butanolowego wydzielono gibereliny podobnie jak w przykładzie I, przez odparowanie butanolu do momentu pojawienia się pierwszych kryształów. Uzyskano suchy produkt o zawartości 70% gibereliny A-3.

Przykład III. W przykładzie użyto roztwór wodno-metanolowy, taki sam jak w przykładzie I. Roztwór ten rozcieńczono wodą do zawartości 45% metanolu. Tak przygotowany roztwór przepuszczano przez kolumnę wypełnioną słabo zasadowym anionitem w formie OH o nazwie handlowej Amberlit IRA-47. Roztwór przepuszczano do momentu aż w wycieku ukazały się śladowe ilości giberelin co określano znanym sposobem analitycznym. Desorpcję giberelin przeprowadzano identycznie jak w przykładzie I z tą różnicą, że jako eluenta użyto 2% wodny roztwór siarczanu sodowego z dodatkiem 1,5% wodorotlenku sodowego. Uzyskano 1,6 objętości, głównej frakcji eluatu o zawartości 2,1% giberelin. Gibereliny zaś wydzielano tak samo jak w przykładzie I, przez zakwaszanie i ekstrakcję octanem etylu. Uzyskano suchy produkt o zawartości 91% gibereliny A-3.

Przykład IV. W przykładzie użyto etanolowo-wodny roztwór giberelin o zawartości 35% etanolu i 0,385% giberelin. Z roztworu tego, bez dodatkowego rozcieńczania wodą, przeprowadzono sorpcję giberelin w sposób identyczny jak w przykładzie I. Desorpcję giberelin przeprowadzono podobnie jak w przykładzie I z tą różnicą, że jako eluenta użyto 5% wodny roztwór siarczanu sodowego, bez dodatku substancji alkalicznych. Po przeprowadzeniu desorpcji giberelin, regenerację grup funkcyjnych dokonano 3% wodnym roztworem NaOH i następnie odmyto wodą do pH około 10. Z eluatów po zakwaszeniu, wydzielono gibereliny tak samo jak w przykładzie I. Uzyskano wyniki podobne jak w przykładzie I.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 1,00 zł.

Claims (4)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wydzielania giberelin z roztworów w rozpuszczalnikach organicznych na drodze sorpcji giberelin na anionitach z czynną grupą funkcyjną a następnie desorpcji, znamienny tym, że roztwór organiczny lub wodno-organiczny giberelin rozcieńcza się wodą do stężenia poniżej 60% rozpuszczalnika organicznego i przepuszcza się przez żywice anionowymienne, desorpcję giberelin z jonitu prowadzi się za pomocą wodnego roztworu soli nieorganicznych o zawartości nie mniej niż 2%, ewentualnie z dodatkiem substancji alkalicznych w ilości nie większej niż 1 %, po czym jonit przemywa się wodnym roztworem substancji alkalicznych o stężeniu nie mniejszym niż 3%, zaś wydzielanie giberelin z eluatu prowadzi się w znany sposób przez zakwaszenie kwasem mineralnym do pH 1-2,5, następnie ekstrahuje octanem etylu lub alkoholem n-butylowym i krystalizację.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako rozpuszczalniki organiczne stosuje się alkohole C1-C3 oraz aceton.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako substancje alkaliczne stosuje się wodorotlenek sodu lub potasu, albo węglany sodu lub potasu.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako sole nieorganiczne stosuje się siarczany lub chlorki sodu lub potasu.