PL166096B1 - pochodnej kwasu 5,6(R lub S), 7,8-tetrahydrofoliowego PL PL PL PL PL PL - Google Patents
pochodnej kwasu 5,6(R lub S), 7,8-tetrahydrofoliowego PL PL PL PL PL PLInfo
- Publication number
- PL166096B1 PL166096B1 PL90288204A PL28820490A PL166096B1 PL 166096 B1 PL166096 B1 PL 166096B1 PL 90288204 A PL90288204 A PL 90288204A PL 28820490 A PL28820490 A PL 28820490A PL 166096 B1 PL166096 B1 PL 166096B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- acid
- ester
- salt
- tetrahydrofolic acid
- tetrahydrofolic
- Prior art date
Links
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 75
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims abstract description 61
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 42
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 27
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 25
- 102000002686 Formate-Tetrahydrofolate Ligase Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 108010080982 Formate-tetrahydrofolate ligase Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 15
- MSTNYGQPCMXVAQ-KIYNQFGBSA-N 5,6,7,8-tetrahydrofolic acid Chemical compound N1C=2C(=O)NC(N)=NC=2NCC1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 MSTNYGQPCMXVAQ-KIYNQFGBSA-N 0.000 claims abstract description 12
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 61
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 46
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 claims description 30
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 16
- 239000005460 tetrahydrofolate Substances 0.000 claims description 15
- 230000022244 formylation Effects 0.000 claims description 11
- 238000006170 formylation reaction Methods 0.000 claims description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 10
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 9
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 9
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 claims description 9
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims description 8
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 8
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 6
- KIUPCUCGVCGPPA-UHFFFAOYSA-N (5-methyl-2-propan-2-ylcyclohexyl) carbonochloridate Chemical compound CC(C)C1CCC(C)CC1OC(Cl)=O KIUPCUCGVCGPPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 241000193464 Clostridium sp. Species 0.000 claims description 5
- 150000002224 folic acids Chemical class 0.000 claims description 5
- 229910052712 strontium Inorganic materials 0.000 claims description 5
- CIOAGBVUUVVLOB-UHFFFAOYSA-N strontium atom Chemical compound [Sr] CIOAGBVUUVVLOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 claims description 4
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 claims description 4
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 2
- FFBHFFJDDLITSX-UHFFFAOYSA-N benzyl N-[2-hydroxy-4-(3-oxomorpholin-4-yl)phenyl]carbamate Chemical compound OC1=C(NC(=O)OCC2=CC=CC=C2)C=CC(=C1)N1CCOCC1=O FFBHFFJDDLITSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- MSTNYGQPCMXVAQ-NEPJUHHUSA-N 6R-Tetrahydrofolic acid Chemical class C([C@@H]1CNC=2N=C(NC(=O)C=2N1)N)NC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 MSTNYGQPCMXVAQ-NEPJUHHUSA-N 0.000 abstract description 9
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 abstract 1
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical group OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 54
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 46
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 16
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- VVIAGPKUTFNRDU-ABLWVSNPSA-N folinic acid Chemical compound C1NC=2NC(N)=NC(=O)C=2N(C=O)C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 VVIAGPKUTFNRDU-ABLWVSNPSA-N 0.000 description 11
- LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N Uric Acid Chemical group N1C(=O)NC(=O)C2=C1NC(=O)N2 LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N Uric acid Natural products N1C(=O)NC(=O)C2NC(=O)NC21 TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229940116269 uric acid Drugs 0.000 description 10
- VVIAGPKUTFNRDU-UHFFFAOYSA-N 6S-folinic acid Natural products C1NC=2NC(N)=NC(=O)C=2N(C=O)C1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 VVIAGPKUTFNRDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 235000008191 folinic acid Nutrition 0.000 description 9
- 239000011672 folinic acid Substances 0.000 description 9
- 229960001691 leucovorin Drugs 0.000 description 9
- 241000193165 Clostridium cylindrosporum Species 0.000 description 7
- VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N ammonium formate Chemical compound [NH4+].[O-]C=O VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 6
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 6
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 6
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 244000303040 Glycyrrhiza glabra Species 0.000 description 4
- -1 alkaline earth metal salts Chemical class 0.000 description 4
- KVUAALJSMIVURS-ZEDZUCNESA-L calcium folinate Chemical compound [Ca+2].C1NC=2NC(N)=NC(=O)C=2N(C=O)C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC([O-])=O)C([O-])=O)C=C1 KVUAALJSMIVURS-ZEDZUCNESA-L 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- QYNUQALWYRSVHF-OLZOCXBDSA-N (6R)-5,10-methylenetetrahydrofolic acid Chemical compound C([C@H]1CNC=2N=C(NC(=O)C=2N1C1)N)N1C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 QYNUQALWYRSVHF-OLZOCXBDSA-N 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OBQMLSFOUZUIOB-UHFFFAOYSA-N Glycinamide ribonucleotide Natural products NCC(=O)NC1OC(COP(O)(O)=O)C(O)C1O OBQMLSFOUZUIOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 3
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 235000008207 calcium folinate Nutrition 0.000 description 3
- 239000011687 calcium folinate Substances 0.000 description 3
- BJDCWCLMFKKGEE-CMDXXVQNSA-N chembl252518 Chemical compound C([C@@](OO1)(C)O2)C[C@H]3[C@H](C)CC[C@@H]4[C@@]31[C@@H]2O[C@H](O)[C@@H]4C BJDCWCLMFKKGEE-CMDXXVQNSA-N 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 3
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 3
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 3
- OBQMLSFOUZUIOB-SHUUEZRQSA-N glycineamide ribonucleotide Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O OBQMLSFOUZUIOB-SHUUEZRQSA-N 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 229960002293 leucovorin calcium Drugs 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 2
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000186530 Gottschalkia acidurici Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 2
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 2
- OZRNSSUDZOLUSN-LBPRGKRZSA-N dihydrofolic acid Chemical compound N=1C=2C(=O)NC(N)=NC=2NCC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OZRNSSUDZOLUSN-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 230000007247 enzymatic mechanism Effects 0.000 description 2
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 229940091250 magnesium supplement Drugs 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 2
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000000707 stereoselective effect Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HBENZIXOGRCSQN-VQWWACLZSA-N (1S,2S,6R,14R,15R,16R)-5-(cyclopropylmethyl)-16-[(2S)-2-hydroxy-3,3-dimethylpentan-2-yl]-15-methoxy-13-oxa-5-azahexacyclo[13.2.2.12,8.01,6.02,14.012,20]icosa-8(20),9,11-trien-11-ol Chemical compound N1([C@@H]2CC=3C4=C(C(=CC=3)O)O[C@H]3[C@@]5(OC)CC[C@@]2([C@@]43CC1)C[C@@H]5[C@](C)(O)C(C)(C)CC)CC1CC1 HBENZIXOGRCSQN-VQWWACLZSA-N 0.000 description 1
- MSTNYGQPCMXVAQ-NWDGAFQWSA-N (2r)-2-[[4-[[(6s)-2-amino-4-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-1h-pteridin-6-yl]methylamino]benzoyl]amino]pentanedioic acid Chemical compound C([C@H]1CNC=2N=C(NC(=O)C=2N1)N)NC1=CC=C(C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 MSTNYGQPCMXVAQ-NWDGAFQWSA-N 0.000 description 1
- MEANFMOQMXYMCT-OLZOCXBDSA-M (6R)-5,10-methenyltetrahydrofolate Chemical compound C([C@H]1CNC=2N=C(NC(=O)C=2[N+]1=C1)N)N1C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC([O-])=O)C([O-])=O)C=C1 MEANFMOQMXYMCT-OLZOCXBDSA-M 0.000 description 1
- VVIAGPKUTFNRDU-STQMWFEESA-N (6S)-5-formyltetrahydrofolic acid Chemical compound C([C@H]1CNC=2N=C(NC(=O)C=2N1C=O)N)NC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 VVIAGPKUTFNRDU-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AUFGTPPARQZWDO-YPMHNXCESA-N 10-formyltetrahydrofolic acid Chemical compound C([C@H]1CNC=2N=C(NC(=O)C=2N1)N)N(C=O)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 AUFGTPPARQZWDO-YPMHNXCESA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GJMPSRSMBJLKKB-UHFFFAOYSA-N 3-methylphenylacetic acid Chemical compound CC1=CC=CC(CC(O)=O)=C1 GJMPSRSMBJLKKB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710188260 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase Proteins 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001112695 Clostridiales Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940123414 Folate antagonist Drugs 0.000 description 1
- 206010016880 Folate deficiency Diseases 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N Hydrogen bromide Chemical compound Br CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006933 Hydroxymethyl and Formyl Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108010072462 Hydroxymethyl and Formyl Transferases Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 244000199866 Lactobacillus casei Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241001147684 Micrococcus aerogenes Species 0.000 description 1
- 241000193459 Moorella thermoacetica Species 0.000 description 1
- FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylacetamide Chemical compound CN(C)C(C)=O FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- IGBSGKOLQRKFIU-UHFFFAOYSA-N O.O.O.O.O.[Ca] Chemical compound O.O.O.O.O.[Ca] IGBSGKOLQRKFIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003916 acid precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002152 alkylating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002456 anti-arthritic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000729 antidote Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001527 calcium lactate Substances 0.000 description 1
- 235000011086 calcium lactate Nutrition 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- ZNEWHQLOPFWXOF-UHFFFAOYSA-N coenzyme M Chemical compound OS(=O)(=O)CCS ZNEWHQLOPFWXOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 239000002178 crystalline material Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N dTMP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000007872 degassing Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 229940111685 dibasic potassium phosphate Drugs 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 150000004675 formic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 1
- JVGAFNMTSUZSBL-UHFFFAOYSA-H hexapotassium;diphosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O JVGAFNMTSUZSBL-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 150000002462 imidazolines Chemical class 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 159000000014 iron salts Chemical class 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 229940050906 magnesium chloride hexahydrate Drugs 0.000 description 1
- DHRRIBDTHFBPNG-UHFFFAOYSA-L magnesium dichloride hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[Cl-].[Cl-] DHRRIBDTHFBPNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940061634 magnesium sulfate heptahydrate Drugs 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- CXKWCBBOMKCUKX-UHFFFAOYSA-M methylene blue Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 CXKWCBBOMKCUKX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960000907 methylthioninium chloride Drugs 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002135 phase contrast microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 238000010926 purge Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 206010038038 rectal cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- RWWYLEGWBNMMLJ-YSOARWBDSA-N remdesivir Chemical compound NC1=NC=NN2C1=CC=C2[C@]1([C@@H]([C@@H]([C@H](O1)CO[P@](=O)(OC1=CC=CC=C1)N[C@H](C(=O)OCC(CC)CC)C)O)O)C#N RWWYLEGWBNMMLJ-YSOARWBDSA-N 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- GNBVPFITFYNRCN-UHFFFAOYSA-M sodium thioglycolate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)CS GNBVPFITFYNRCN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940046307 sodium thioglycolate Drugs 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 229940117957 triethanolamine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/93—Ligases (6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D475/00—Heterocyclic compounds containing pteridine ring systems
- C07D475/02—Heterocyclic compounds containing pteridine ring systems with an oxygen atom directly attached in position 4
- C07D475/04—Heterocyclic compounds containing pteridine ring systems with an oxygen atom directly attached in position 4 with a nitrogen atom directly attached in position 2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
- C12P17/182—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/842—Clostridium
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
1. Sposób wytwarzania zasadniczo czystego diastereoizomeru (6R lub 6S ) pochodnej kwasu 5,6(R lub S),7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru, znamienny tym, ze obejm uje etapy (a) enzymatycznego formylo- wama formy 6S mieszaniny diastereoizomerów 6R i 6S kwasu tetrahydro- foliowego lub podstawionego kwasu tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru, przy uzyciu form ylazy tetrahydrofolianowej wytworzonej przez C lo- stridium sp. A TCC nr 7905 lub jego mutant i albo (b) (1) oddzielania kwasu 10-formylo-5,6S, 7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru od kwasu 5,6R, 7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru i nastepnie cyklizacji i hydrolizy kwasu 10-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru, przy uzyciu kwasu siarkowego lub (2) cyklizacji i hydrolizy kwasu 10-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru przy uzyciu kwasu siarkowego w obecnosci kwasu 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru; i nastepnie albo (i) derywatyzacji kwasu 5,6R,7,8-tetrahydro- foliowego lub jego soli lub estru przy uzyciu mentylochloromrówczanu i wówczas rozdzielania skladników; lub alternatywnie (ii) oddzielania którego- kolwiek kwasu 5,10-metenylo-5,6S,7,8- tetrahydrofoliowego i kwasu 5-for- m ylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliow ego lub ich soli lub estrów od kwasu 5 ,6R,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru, i po rozdzieleniu w razie potrzeby (3) chemicznego formylowania przy uzyciu kwasu mrówkowego w obecnosci karbodiimidu, cyklizacji i hydrolizy nieprzereagowanego kwasu 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego lub je g o soli lub estru przy uzyciu kwasu siarkowego lub alternatywnie derywatyzacji kwasu 5,6R,7,8-tetrahydrofolio- wego lub jego soli lub estru z innymi grupami funkcyjnymi przy uzyciu mentylochloromrówczanu i w razie potrzeby (c) konwersji zasadniczo czyste- go kwasu 5-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru lub kwasu 5-formylo-5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru do odpowiedniego kwasu, soli lub estru. WZÓR 1a W ZÓR 1b PL PL PL PL PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest nowy sposób wytwarzania optycznie czystych diastereoizomerdw związków tetrahydrofolianowych obejmujący przekształcenie tylko komponenta kwasu
5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego mieszaniny racemicznej kwasu 5,6,7,8-tetrahydrofoliowego w kwas 10-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowy w obecności syntetazy formylotetrahydrofolianowej pochodzenia bakteryjnego.
Leukoworyna i jej sole są uważane za farmaceutycznie skuteczne, patrz Remington's Pharmaceutical Services, Mack Publishing Co., Easton, PA 1985 /Remington's/ str. 1023.
Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 746 662 ujawnia, że przeciwartretyczną skuteczność metotreksate można zwiększyć przez iniekcję wodnego roztworu leukoworyny lub jej soli. Publikacja patentowa EPO nr 0 266 042 z 4 maja 1988 opisuje zastosowanie czystych izomerów do wytwarzania leków do wspomagania metotreksate dla leczenia raka okołoodbytniczego w kombinacji z 5-fluorouracilem i dla leczenia niedoboru folianu. W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 500 711 opisane jest oczyszczanie leukoworyny i jej soli.
Leukoworyna jest zwykle podawana w postaci soli takich jak sole z metalami alkalicznymi lub metalami ziem alkalicznych, takich jak sól wapniowa leukoworyny, przy czym korzystny jest izomer-1.
Pentahydrat soli wapniowej /1:1/ kwasu N-/ [/2-amino-5-formylo-3,4,5,6,7,8 -heksahydro-4okso-6-pterydynylometylo/amino/benzoilo/-L-glutaminowego /Leucovorin Calcium USP/ jest sprzedawany jako sól wapniowa mieszaniny związków o wzorze 1a i 1b /1:1/, w której związki mają stereochemię odpowiednio /R/ i /S/ przy węglu C-6.
Jest on stosowany głównie jako odtrutka dla antagonistów kwasu foliowego takich jak metotreksata, które blokuję konwersję kwasu dihydrofoliowego do kwasu tetrahydrofoliowego. Sole leukoworyny zestawia się w wodzie do iniekcji z odpowiednimi środkami konserwującymi, jak opisano pod hasłem Leucovorin Calcium Injection w Physician's Dask Reference, wyd. 43, Medical Economics Company, Dradell, NJ 1989 /PDR 34rd Ed./ str. 1124.
Farmakokinetyczne zachowanie się dwóch izomerów różni się tym, że izomer /S/ - związek o wzorze 1b jest selektywnie absorbowany z przewodu żołądkowo-jelitowego i ma krótszy półokres życia osocza w stosunku do izomeru /R/ - związku o wzorze 1a.
Naturalnie występujący izomer o wzorze 1b, który jest diastereoizomerem 6S, jest opisany przez C. Temple, Jr, J.P. Rose, W.R. Laster i J.A. Montgomery, Cancer Treatment Reports,
65. 1117 - 1119 /1981/, jako ważny do leczenia ze względu na jego skuteczność w przywracaniu metabolizmu jedno-węglowego.
Doniesienie R.P. Leary, Y. Gaumont i R.L. Kisliuk, Biochem. and Biophys. Res. Commun.,
56. 484-488 /1974/, że synteza tymidylanu z L. casei jest hamowana przez nie-naturalny izomer tetrahydrofolianu 5,10-metylenu i doniesienie V.F. Scott i K.O. Donalddson, Biochem. and Biophys. Res. Commun., 14, 523-526 /1964/, że dehydrogenaza 5,10-metylenotetrahydrofolianowa z E. Coli jest również hamowana przez ten sam diastereoizomer, skojarzone z obserwacją G.K. Smith, P.A. Benkovic i S.J. Benkovic, Biochem., 20, 4034-4036 /1981/, że ten sam diastereoizomer 10-formylotetrahydrofolianu jest silnie konkurencyjnym inhibitorem formylotransferazy rybonukleotydu glicynamidu /GAR/ z ostrego końca wątroby kurczęcia do hamowania biosyntezy pirymidyny i puryny i tym samym biosyntezy ONA przez nie-naturalne diastereoizomery pochodnych jednowęglowych tetrahydrofolianów. Dlatego więc postacie nie-naturalne nie mogą być uważane za biologicznie obojętne. Jeżeli takie hamowanie występuje w układach ssaków, wówczas istnieje potencjalna kliniczna potrzeba tylko dla naturalnej formy /6S/ tetrahydrofolianu, zwłaszcza leukoworyny.
Diastereoizomeryczne składniki o wzorze 1a i 1b są rozdzielane /D.B. Cosulich, J.M.
Smith, Jr. i H.P. Proglist, J. Am. Chem. Soc., 74, 4215 /1953// przez krystalizację frakcyjną i przez chromatografię /J. Feeney, B. Birdsall, J.P. Albrand, G.C.K. Roberts, A.S. Bungen, P.A. Charlton i D.W. Young. Biochem., 20, 1837 /1981//. Stereospecyficzna redukcja dihydrofolianu katalizowana przez reduktazę dihydrofolianową opisana przez L. Rees, E. Valente·,
C.J. Suckling i H.C.S. Wood, Tetrahedron, 42, 117 /1986/, prowadzi do stereospecyficznego izomeru 6/S/.
Praca naukowa L. Rees, E. Valente, C.J. Suckling i H.C.S. Wood, Tetrahedron, 42. 117-136
166 096 /1986/ opisuje syntezę chiralnych pochodnych tetrahydrofolianu, włącznie z leukoworyną.
Układ wymagał stosowania reduktazy dihydrofolianowej z E. coli i rozległego i kosztownego zawracania ko-czynnika redukującego NADPH. Inna praca L. Rees, C.J. Suckling i H.C.S. Wood,
J. Chem. Soc. Chem. Commun. 470 /1987,/, /europejskie zgłoszenie patentowe nr 0 266 042 A2/ opisuje acylowanie 6/R,S/-tetrahydrofolianu chloromrówczanem /-/-mentylu z wytworzeniem N-5 pochodnych jako mieszaniny diastereoizomerycznej, którą rozdzielano przez wytrącanie frakcyjne. Późniejsze traktowanie każdego diastereoizomeru kwasem mrówkowym i bromowodorem w kwasie octowym i następnie hydroliza dała każdy izomer 5-formylotetrahydrofolianu.
Odkryto, że optycznie czynne diastereoizomery związków tetrahydrofolianowych można wytwarzać łatwiej zgodnie z wynalazkiem. Główną zaletę tego procesu w porównaniu z uprzednio opublikowanymi i opatentowanymi procedurami jest jego zadziawiająca prostota, ponieważ kluczowy etap wymaga tylko stosowania jednego enzymu, formylazy tetrahydrofolianowej, inaczej zwanej enzymem aktywującym mrówczan lub syntetazą formylotetrahydrofolianową /FTHFS/, która również dodaje potrzebną grupę formylową tylko do diastereoizomeru 6S przy stosowaniu racemicznej mieszaniny kwasu 5,6/R,S/,7,8-tetrahydrofoliowego /o wzorze 1a i 1b/. Ponadto wykorzystanie tego enzymu ma wyraźną przewagę nad stosowaniem enzymu reduktazy dihydrofolianowej w tym, że wymaga stosowania obszernego układu regeneracji dla ko-czynników.
Formylaza tetrahydrofolianowa może być wytwarzana przez Micrococcus aerogenes, Clostridium cylindrosporum, Clostridium acidi-urici, Clostridium thermoaceticum i przez inne mikroorganizmy, rośliny i zwierzęta /D.H. Butlaire, Methods In Enzymology, 66, 585-599 /1988//.
Stosując znakowany radioaktywnie mrówczan amonu lub inny związek, włącznie z wytworzonymi in situ w enzymatycznym formylowaniu, znakowanymi radioaktywnie solami lub pochodnymi kwasu mrówkowego, można otrzymać znakowany związek o wzorze 3b i przekształcać go w znakowany związek o wzorze 4b lub znakowany związek o wzorze 1b. Z pomocą enzymu dehydrogenazy 5,10-metylenotetrahydrofolianowej dowolne ze znakowanych radioaktywnie 5,6S,7,8-tetrahydrofolianów niosących grupę formylowę /związki o wzorze 1b, 3b lub 4b/, korzystnie związek o wzorze 4b, można przekształcać w znakowany kwas 5,l0-metyleno-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowy, który z kolei pod wpływem enzymu reduktazy 5,10-metylenotetrahydrofolianowej można przekształ cać w znakowany radioaktywnie kwas 5-metylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowy. Tak więc znakowany radioaktywnie związek o wzorze 1b generowany przez zastosowanie wynalazku jest użytecznym związkiem do wytwarzania znakowanych radioaktywnie pochodnych kwasu 5,68,7,8-tetrahydrofoliowego.
Odkryty sposób również nieoczekiwanie pozwala na wyodrębnienie kwasu 5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego o wzorze 2a, który nie jest formylowany przez enzym. Wyodrębniony związek o wzorze 2a można następnie sprzedawać jako taki /skomercjalizowany jako związek rzadki/ lub można wykorzystywać jako związek wyjściowy do wytwarzania na przykład kwasu 5-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego o wzorze la analogicznie do procesu opisanego przez R.G.Moran i P.D. Colman, Anal. Biochem. 122, 70-78 /1982/, z wykorzystaniem kwasu mrówkowego razem z lub bez rozpuszczalnego w wodzie karbodiimidu, l-etylo-3-/3'-dimetyloaminopropylo/karbodiimidu. Jednakże korzystnie wyodrębnienie związku o wzorze 2a jest zakończone po konwersji związku o wzorze 3b do związku o wzorze 4b i/lub lb. Pozwala to na łatwiejsze rozdzielanie składbików przez chromatografię z odwróconymi fazami. Również związek o wzorze 2a można modyfikować w obecności związku o wzorze 4b i/lub lb, ponieważ pozycja 5 w związku o wzorze 2a jest jeszcze reaktywna, podczas gdy w związku o wzorze 4b lub lb nie jest reaktywna, otrzymując pochodną o wzorze 2a, na przykład kwas 5-karboksymentylo-5,6R,7,8-tetrahydrofoliowy, który można oddzielać od związku o wzorze 4b lub lb w prostym etapie adsorpcji.
Ponadto wydzielony związek o wzorze 2a można poddawać reakcji, jak podano przez C. Temple, Jr., L.L. Bennett, Jr., J.D. Rosę, R.D. Elliott, J.A. Montgomery i J.H. Mongum, J. Med. Chem., 25, l6l-l66 /l982/, w celu otrzymania różnych 5- i l0-podstaviionych, 5,l0-dipodstawionyąh i 5,10-mostkowo-podstawiObych pochodnych kwasu 5.6R.7.8-tetrahydrofoliowego.
W szczególności można syntetyzować 5-metylo-5,6R-7,8-tetrahydrofolian ze związku o wzorze 2a z formaldehydem i borowodorkiem sodu w warunkach zasadowych, jak opisano w metodzie A.A. Blair i K.J. Saunders, Anal. Biochem., 34, 376 /l970/. Alkilowanie związku o wzorze
166 096
2a dimatylosiarczanem w N,N-dimetyloacetamidzie w temperaturze 55°C uzyskuje się stosujęc metodę opisaną w japońskim patencie 7 332 120 /1973,/} Chem. Abst., 80.· 2792Χ /1974/.
Zastępując kwas mrówkowy lub czynniki alkilujące we wskazanych powyżej reakcjach znakowanym radioaktywnie kwasem mrówkowym lub jego pochodnymi lub radioaktywnymi czynnikami alkilującymi, otrzymuje się znakowane radioaktywnie pochodne kwasu 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego.
Według wynalazku zarówno znakowane radioaktywne pochodne kwasu 5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego jak i znakowane radioaktywne pochodne kwasu 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego i ich sole można wytwarzać oddzielnie i są one użytecznymi związkami do testowania, na przykład do badania mechanizmów enzymatycznych.
Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania żądanego, zasadniczo czystego diastereoizomeru /6R lub 6S/ pochodnej kwasu tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru, który obejmuje etapy;
/a/ enzymatycznego formylowania formy 6S mieszaniny diastereoizomerów 6R i 65 kwasu tetrahydrofoliowego lub podstawionego kwasu tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru przy użyciu formylazy tetrahydrofolianowej wytworzonej przez Clostridium sp. ATCC nr 7905 lub jego mutant tak, aby otrzymać mieszaninę zawierającą kwas 10-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowy lub jego sól lub ester oraz nieprzereagowany kwas 5,6S,7,8-tetrahydrofoliowy lub jego sól lub ester oraz nieprzereagowany kwas 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowy lub jego sól lub ester; i albo /b/ /1/ oddzielania kwasu 10-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru od kwasu 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru i następnie cyklizacji i hydrolizy kwasu 10-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru przy użyciu kwasu siarkowego tak, aby otrzymać kwas 5,10-metenylo-5,6S,7,3-tetrahydrofoliowy lub kwas 5-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowy lub ich sole lub estry lub oba poprzednie związki; lub /2/ cyklizacji i hydrolizy kwasu 10-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru przy użyciu kwasu siarkowego tak, aby otrzymać kwas 5,10-metenylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowy lub kwas 5-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowy lub ich sole lub estry lub oba poprzednie związki, w obecności kwasu 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru; i następnie albo /i/ derywatyzacji kwasu 5,aR,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru przy użyciu mentylochloromrówczanu tak, aby otrzymać 5-podstawiony 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowy lub jego sól lub ester i wówczas rozdzielania składników lub alternatywnie, /ii/ oddzielanie któregokolwiek kwasu 5,10-metenylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego i kwasu 5-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego lub ich soli lub estrów od kwasu 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru i po rozdzieleniu, gdy to jest pożądane, /3/ chemicznego formylowania, przy użyciu kwasu mrówkowego w obecności karbodiimidu, cyklizacji i hydrolizy nieprzereagowanego kwasu 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru przy użyciu kwasu siarkowego tak, aby otrzymać kwas 5-formylo-5,6R,7,8-tetrahydrofoliowy lub jego sól lub ester lub.alternatywnie derywatyzacji kwasu 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru z innymi grupami funkcyjnymi przy użyciu mantylochloromrówczanu tak, aby otrzymać kwas 5-podstawiony 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowy lub jego sól lub ester; i w razie potrzeby /c/ konwersji zasadniczo czystego kwasu 5-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru lub kwasu 5-formylo-5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru w odpowiedni kwas, sól lub ester, przy czym konwersja obejmuje konwersję pochodnej kwasu foliowego do soli wapnia, magnezu, strontu, żelaza lub mieszaniny tych soli a enzymatyczny preparat wytwarza się w mieszaninie reakcyjnej zawierającej znakowany radioaktywnie kwas mrówkowy lub chemiczny odpowiednik.
Produkty z tego procesu same są cenne, na przykład w terapii i jako związki pośrednie do wytwarzania innych cennych produktów oraz gdy są znakowane radioaktywnie mogą być stosowane do badania na przykład mechanizmów enzymatycznych. Dla fachowców w tej dziedzinie oczywiste jest stosowanie takich związków do takich celów.
Korzystnie proces stosuje się do otrzymania żądanego, zasadniczo czystego kwasu 5-formylo6
166 096
-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru i polega na tym, że obejmuje etapy /a/ enzymatycznego formylowania formy 6S mieszaniny diastereoizomerów 6R i 6S kwasu 5,6,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru przy użyciu formylazy tetrahydrofolianowej wytworzonej przez Clostridium sp. ATCC nr 7905 lub jego mutant tak, aby otrzymać mieszaninę zawierającą kwas 10-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowy lub jego sól lub ester, nieprzereagowany kwas 5,6S,7,8-tetrahydrofoliowy lub jego sól lub ester i nieprzereagowany kwas 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowy lub ich sole lub estry i /b/ cyklizacji i hydrolizy kwasu 10,formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru przy użyciu kwasu siarkowego w obecności kwasu 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru tak, aby otrzymać kwas 5,10-metenylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowy lub 5-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowy lub ich sole lub estry lub oba powyższe związki i następnie /c/ oddzielania kwasu 5,10-metenylo5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego lub Jego soli lub estrów od kwasu 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru; i po rozdzieleniu w razie potrzeby /d/ konwersji zasadniczo czystego kwasu 5-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru do odpowiedniego kwasu, soli lub estru, przy czym /c/ obejmuje konwersję pochodnej kwasu foliowego do soli wapnia, magnezu, strontu, żelaza lub mieszaniny tych soli. Takie związki mają cenne własności jako środki odtruwające. Zwłaszcza korzystny jest sposób, w którym enzym stosowany do selektywnego formylowania obejmuje formylazę tetrahydrofolianową. Proces jest również uzyteczny do wytwarzania żądanego, zasadniczo czystego diastereoizomeru /6R lub 6S/ pochodnej /znakowanego radioaktywnie/ kwasu tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru. Takie substancje można stosować do badania mechanizmów enzymatycznych.
Związki wyjściowe stosowane w sposobie według wynalazku można wytwarzać technikami dobrze znanymi dla fachowców w dziedzinie biochemicznych przekształceń. Mieszaninę związków o wzorze 2a /izomer R/ i 2b /izomer S/ można wytwarzać przez redukcję kwasu foliowego borowodorkiem sodu z zastosowaniem procedury C.Temple, Jr., R.D. Elliott, J.D. Rose i J.A. Montgomery, J.Med.Chem., 222 , 731 /1979/.
Wychodząc z tych związków, reakcja według wynalazku jest pokazana na schemacie 1.
Jak pokazano na schemacie 2, związek o wzorze 2a, który może być oddzielony od związku o wzorze 3b przez chromatografię, formyluje się kwasem mrówkowym, aby uzyskać przy okresowym tworzeniu się związku o wzorze la, soli imidazoliniowej o wzorze 4a, którą po krystalizacji hydrolizuje się otrzymując czysty nienaturalny izomer leukoworyny o wzorze 1a. Alternatywnie, mieszaninę związków o wzorze 3b i 2a można doprowadzić do konwersji związku o wzorze 3b do związku o wzorze 4b i/lub 1b, otrzymując w ten sposób mieszaninę związku o wzorze 4b i/lub 1b oraz 2a. Składniki tej mieszaniny łatwo oddziela się chromatograficznie, to jest związek o wzorze 2a od 4b i/lub 1b.
Procedura wyodrębniania stanowi również w rzeczywistości rozdzielanie diastereoizomerów 6R i 6S kwasu tetrahydrofoliowego. Ponieważ związek o wzorze 2a można przekształcać w związek o wzorze 1a chemicznie, wynalazek formalnie dotyczy sposobu skutecznego rozdzielania związku o wzorze 1b od związku o wzorze 1a, które są bardziej powszechnie oznaczane jako naturalne i nienaturalne formy leukoworyny.
Następujęce przykłady ilustruję wynalazek lecz nie ograniczają w jakikolwiek sposób zakresu zastrzeżeń patentowych.
Procedura A. Przeprowadza się wyodrębnianie i wzrost Clostridium cylindrosporum /zwanego również Clostridium sp. ATCC nr 7905/.
Ponieważ Clostridium jest beztlenowcem, wszystkie operacje wytwarzania kultury, utrzymywania i obsługiwania prowadzi się w warunkach, które minimalizują narażenie szczepów na działanie tlenu. Podobnie, ze względu na ekstremalną nietrwałość tlenu tetrahydrofolianu i jego pochodnych, wszystkie procesy obejmujące te związki są prowadzone w nieobecności tlenu. Do tego celu stosuje się beztlenowy aparat workowy z tworzywa sztucznego połączony ze źródłem azotu nie zawierającego tlenu.
1. Wytwarzaarz pożywki wziostooet kwasu aouzmoezo. Pożywka z kwzsk mouzmocgo jest wytwarzana jak spieano w ATCC Media Handbkok - przepis nr 519:
166 O96
Skład pożywki z kwasu moczowego
| kwas moczowy | 3,0 | g, |
| ekstrakt drożdży | 1,0 | g, |
| dwuzasadowy fosforan potasu | 4,0 | 9. |
| heptahydrat siarczanu magnezu | 0,1 | g, |
| siarczan żelazawy | 5,0 | 9. |
| 0,04% roztwór czerwieni fenolowej* | 1,0 | g, |
| tioglikolan sodu | 0,5 | g, |
| woda destylowana | 1.0 | 1 |
x 14,9 ml 0.01N wodorotlenku sodu potrzebne do 0,.1 g indykatora.
Rozcieńcza się do 250 ml wodę destylowaną dla uzyskania 0,04% roztworu. Przy wytwarzaniu pożywki kwas moczowy zawiesza się w niemal całej objętości cieczy, ogrzewa do temperatury wrzenia i doprowadza do stałej barwy różowej czerwieni fenolowej /pH 7,6/ za pomocą wodorotlenku sodu. pH Sprawdza się papierkiem. W celu otrzymania stałej pożywki, dodaje się do niej 20,0 g agaru. Pożywkę wylewa się do kolby z nakrętkę prawie do pełna, następnie ogrzewa się do wrzenia przeczyszczając gazowym azotem nie zawierającym tlenu. Przy następującym po tym bezpośrednio autoklewowaniu, nakrętkę kolby całkowicie uszczelnia się. Pożywkę przechowuje się w temperaturze pokojowej, aby zapobiec wytrącaniu się kwasu moczowego w niższych temperaturach.
2. Posiew kultury Clostridium cylindrosporum na pożywce wzrostowej.
Wszystkie operacje przeprowadza się w warunkach beztlenowych w komorze rękawicowej. Porcję 1,0 ml ciekłej pożywki z kwasu moczowego dodaje się do liofilizowanych granulek bakterii otrzymanych z ATCC. Granule rozpuszczają się i sterylną jednorazową pętlę do szczepienia stosuje się do tworzenia smug ponownie zawieszonej kultury na płytce z pożywką z kwasu moczowego. Płytki umieszcza się w beztlenowym słoju zawierającym powłokę generującą H2-CO2 i pasek wskaźnika błękitu metylenowego. Słój zawierający zaszczepione płytki inkubuje się w temperaturze 37°C. W ciągu 24 godzin wzrost jest widoczny na płytkach jako jasne, przezroczyste, podobne do palca rzuty promieniujące z kolonii. Próbka reprezentatywnej kolonii, jak zobaczono pod mikroskopem z kontrastem fazowym, wykazuje typową morfologię komórki Clostridium i tworzenie się zarodników.
3. Wytwarzanie trwałej hodowli macierzystej Clostridium cylindrosporum.
Pożywkę z kwasu moczowego na płytkach wytwarza się w rurkach Hungate /Bellco Glass Co./
- 10 ml pożywki/rurkę i służy ona jako źródło trwałej hodowli macierzystej Clostridium cylindrosporum. Próbkę pojedyńczej kolonii komórek z opisanej powyżej kolonii wybiera się sterylną pętlą do szczepienia i wkłuwa do pożywki w rurce Hungate. Procedurę przeprowadza się w worku beztlenowym zawierającym gazowy azot. Rurki umieszcza się w beztlenowym słoju i inkubuje w temperaturze 35°C. Po pięciu dniach rurki usuwa się ze słoja i nakrętki dokładnie uszczelnia się parafilmem. Rurki przechowuje się w temperaturze pokojowej do dalszego ich wykorzystania .
4. Wytwarzanie materiału do szczepienia dla ciekłej pożywki wzrostowej.
Rurki półstałej pożywki z kwasu moczowego /2,5 g/l Bacto-Agar/ zaszczepia się kolonią Clostridium cylindrosporum inkubowaną w temperaturze 35°C i przechowywaną w temperaturze pokojowej, jak podano powyżej. Te kultury służą jako źródło materiału do szczepienia dla wzrostu ciekłej pożywki, jak opisano w następnym punkcie.
5. Wzrost ciekłej pożywki Clostridium cylindrosporum.
Jedną miękką kulturę agarową /całe 10 ml/ dodaje się do jednego litra ciekłej pożywki z kwasu moczowego. Wszystkie operacje przeprowadza się w worku beztlenowym i całą kulturę inkubuje się w beztlenowym słoju przez 4 dni w temperaturze 35°C.
Procedura B. Przeprowadza się wytwarzanie surowego ekstraktu syntetazy formylotetrahydrofolianowej Clostridira cylindrosporum.
Jak w procedurze A, wytwarzanie kultury, utrzymywanie i obsługiwanie prowadzi się w warunkach, które minimalizują narażenie szczepów na działanie tlenu, ponieważ Clostridium jest beztlenowcem. Podobnie, z powodu ekstremalnej nietrwałości tlenu tetrahydrofoliani
166 096 i jego pochodnych, wszystkie operacje obejmujące te związki przeprowadza się w nieobecności tlenu. Do tego celu stosuje się beztlenowy aparat workowy połączony ze źródłem gazowego azotu nie zawierającego tlenu. Jeden litr kultury staje się mętny i jednorodny materiał osadza się w pożywce. Kulturę dzieli się na podwielokrotności 4 x 250 ml i dodaje do 4 x 250 ml butelek wirówki. Kultury wiruje się w temperaturze 4°C z szybkością 8000 obrotów na minutę przez 15 minut w wirówce Beckman J2-21.
Chociaż pożywka jest ochłodzona do 4°C, kwas moczowy nie wytrąca się z powodu jego konsumpcji przez bakterie. Granulki komórek ponownie zawiesza się w 4 x 25 ml chłodzonej lodem wody destylowanej i odwirowuje, jak powyżej. Granulki wymraża się w temperaturze -20°C przez 5 dni przed oznaczaniem na syntetazę formylotetrahydrofolianową.
Zamrożone granulki rozmraża się w całych 4,0 ml buforu /0,05M bifosforan potasowy,
0,05M 2-merkaptoetanol /pH 7,5 przez dodanie 1M wodorotlenku potasu//. Granulki miesza się i pozostawia do rozpuszczenia przez okresowe wirowanie w temperaturze pokojowej przez 60 minut. Dostrzegalnie granulki komórek stają się lepkie z powodu rozpadu komórek. Autorozpad następuje w temperaturze pokojowej. Lizat komórek odwirowuje się z szybkością 17000 obrotów na minutę przez 30 minut i nadsącz zachowuje się na lodzie, i oznacza na syntetazę formylotetrahydrofolianową.
Procedura C. Oznaczanie syntetazy formylotetrahydrofolianowej prowadzi się metodę opisaną w Buttlaire “Purification and Properties of Formyltetrahydrofolate Synthetase, Enzymology Vol. 66, str. 585, 1980/
Przykład I. Redukcję kwasu foliowego do kwasu 5,6/,S/,7,8-tetrahydrofoliowego prowadzi się stosując ostatnią metodę literaturową /C. Temple, Jr., R.D. Elliott, J.D. Rose i J.A. Montgomery, J. Med. Chem. 22_, 731 /1979//, wykorzystujacą borowodorek sodu.
Przyk ład II. Sposób wytwarzania kwasu lO-formylo-5,K,7,8-tetrahydrofoliowego. Wytwarza się następującą mieszaninę reakcyjną odpowiednią do enzymatycznego formylowania kwasu 5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego do wytwarzania kwasu 10-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego 100 ml 1,0M chlorodoworku trietanoloaminy /pH 8,0/, 100 ml 0,5M trifosforanu adenozyny /pH 8,0/, 100 ml chlorku potasu, 100 ml 0,1M heksahydratu chlorku magnezu i 200 ml 0,2 M mrówczanu amonu /pH 8,0/. Zawartość całej 5 g fiolki kwasu 5,6/R,S/,7,8-tetrahydrofoliowego /Sigma; 69% czystości, partia nr 117F-5013/ zawiesza się w 200 ml 0,2M tris-HCl/0,05M 2-merkaptoetano1u /pH 7,0/ i rozpuszcza przez dodanie około 15 ml 1M wodorotlenku potasu. Przezroczysty roztwór wylewa się do uprzedniej mieszaniny i dodaje się około 200 ml wody destylowanej otrzymując 1,0 litr całej mieszaniny reakcyjnej w 2 litrowej szklanej butli.
Reakcję rozpoczyna się przez dodanie 4 ml surowego ekstraktu enzymu zawierającego syntetazę formylotetrahydrofolianowę” /FTHFS/ i pozwala się na przebieg reakcji w temperaturze 22°C. Próbki okresowo usuwa się kontrolując postęp reakcji przez HPLC stosując kolumnę z odwróconymi fazami /C-18/ eluowaną 0,1M kwasem mrówkowym i modyfikowaną metanolem z liniowym gradientem od 12 do 25% przez 30 minut. Eluat z kolumny kontroluje się przy 282 nm wykrywając kwas 5,6/R,S/7,8-tetrahydrofoliowy przy 12 minutach i kwas 5,l0-netenylotetrahydrofoliowy przy 16 minutach. Reakcja jest zakończona po 18 godzinach. W tym czasie 48% początkowej ilości kwasu 5,6/R,S/7,8-tetrahydrofoliowego pozostaje, co oznaczono przez powierzchnię pod krzywą. Równoważnik 1585 mg kwasu 10-fornylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego z mieszaniny reakcyjnej oblicza się z chromatogramu HPLC przedstawiającego 5,10- metenylotetrahydrofolian. Ta ocena dla konwersji 92% teoretycznej wskazuje, że tylko 1725 mg z wyjściowych 3450 mg kwasu 5,6/R,S/,7,8-tetrahydrofoliowego było przyswajalne dla enzymatycznej reakcji konwersji. 50% Wydajności teoretycznej jest przekształcane po 5 godzinach.
Przykład III. Konwersja kwasu 10-fomylo-5,6S, 7,8-tetrahydrofoliowego w kwas 5-fo rmylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowy.
Mieszaninę reakcyjną z przykładu II kontroluje się przez dalszy dzień nie stwierdzając zmian w składzie. Porcję 100 ml mieszaniny przenosi się do kolby trójszyjnej i pH roztworu doprowadza się do wartości 6,5 za pomocą kwasu siarkowego. Podczas odgazowania azotem, kolbę zanurza się w łaźni wodnej i ogrzewa w temperaturze 90 - 95°C przez 2 godziny. Następnie reakcję kontynuuje się w atmosferze azotu w temperaturze 4O°C przez noc. Mieszanina reakcyj166 036 o
na jest brązowa po 16 godzinach. Próbkę analizuje się przez HPLC stosując kolumnę z odwróconymi fazami /C-18/ eluowaną 0,1M kwasem mrówkowym i modyfikowaną metanolem w liniowym gradiencie od 12 do 25% przez 30 minut. Eluat kolumny monitoruje się przy 282 nm. Analiza HPLC wskazuje stopień konwersji 90,2% gdy rozpatruje się powierzchnię pod krzywą, dla pików 5,10-11^tenylo-5,6S,7,-ttttaahydaofolianu i kwasu S-formylo-S^S,7,8-tetrahydrofoliowego. Powierzchnia dla kwasu 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego, który nie powinien ulegać zmianie, jest zmniejszona do 33,1% w stosunku do powierzchni dla substancji wyjściowej /48%/.
Próbki mieszaniny reakcyjnej podaje się za pomocą pompy do kolumny z odwróconymi fazami preparatywnej HPLC /Dynamax 60A-C18, 8/J, 2,1 x 30 cm/ i następnie rozwija z gradientem 0,1M wodnego roztworu kwasu mrówkowego i metanolu z szybkością przepływu 13 ml na minutę przez 60 minut. Otrzymuje się nieco żółtego kwasu 5tformylo-5»6S,7,8-tttaahydrofoliowego w 82% całkowitej wydajności produktu, który w warunkach kwasowego eluowania /0,1M wodny roztwór kwasu mrówkowego i metanol/ przekształca się w kwas 5,10-mtttnylot5,6S,7,--tetaahydrofoliowy, który następnie po odstaniu w stężeniu 3 do 6 mg/ml tworzy żel w zbiorczej fiolce. Enancjomerycznę czystość próbki oznaczono przez HPLC stosując kolumnę chiralną /Diacel Chiracel 00/, eluując izokratycznie 0,5% mrówczanu amonu, pH = 3,8 i 25% metanolu. Rejestruje się czas retencji 15,2 minut z następującą skręcalnością optyczną w kwasie mrówkowym:
| r-—— J Związek 1— __ ___________. | 1 J Stężenie /%/ i /88% roztwór kwasu J mrówkowego/ | ---r- 1 1 i 1 I f | Skręcalność i /alfa D w 26°C/ J |
| i kwas 5,1Otmtttnylo- | 1 f 1 | 1 1 1 | |
| • 5,6S ^^-tetrahydrofoliowy | ! 0,611 | 1 I | +42 J |
| --.-„.Λ. | ---U- | 1 |
P rzykłdd IV. Knnwersja wwasu 5l0t-ttteny0--5,5S77,8-ttarahydΓofoliowego do ww-~ su 5-foamylot5,6S,7,--tttaayydaofoliowego i kwasu 5 ^R^^-tetrahydrof oliowego.
pH Pozostałości mieszaniny reakcyjnej otrzymanej z przykładu II doprowadza się od wartości 8,0 do wartości 5,0 za pomocą kwasu siarkowego, zapoczątkowując szybką cyklizację kwasu 10tfoamylo-5,6S,7,--tetrahydaofoliowtgo do kwasu 5,10tmettnylo-5,6S,7,8ttetrahydaofoliowego, który następnie po odstaniu w temperaturze pokojowej powoli hydrolizuje do kwasu 5tfoamylo-5,6S,7,8ttetaayydrofollowtgo. Ten ostatni nie jest wykrywany w mieszaninie reakcyjnej przed nastawieniem pH.
Po reakcji prowadzi się HPLC stosując kolumnę z odwróconymi fazami /C-18/ eluowaną 0,1K kwasem mrówkowym i modyfikowaną metanolem w liniowym gradiencie od 12 do 25% przez 30 minut. Kontrolowanie reakcji przez HPLC ujawnia, że więcej niż 70% początkowego kwasu 5,10mtttnylot5,6S,7,--tttaahydaofoliowego przekształciło się w kwas 5tformylo-5,6S,7,--tetaahydrofoliowy po 5 dniach w temperaturze pokojowej, podczas których stężenie kwasu 5,65,7,8tttaayydaofollowtgo pozostaje niezmienione. Produkty formylowane, otrzymane jako kwas 5-formylot5,6S,7,-ttetrayydaofoliowy i kwas 5,l0t5,10-mttenylo-5,6S,7,-ttttaayydrofoliowy oraz nieformylowany kwas 5,6R,7,--tttaahydaofoliowy wyodrębnia się następnie przez preparatywną HPLC na kolumnie z odwróconymi fazami /Dynamex 6OA-C18, 8 J, 2,1 x 30 cm/, rozwijanej z gradientem 0,1M wodnego roztworu kwasu mrówkowego i metanolu, z szybkością przepływu 13 ml/min. przez 60 minut. Oznaczone wydajności dwóch preparatów /każdy odpowiada 50 ml mieszaniny reakcyjnej/ są następujące;
| r* ........................ ' J J “ ,H 1 j Wyodrębniony związek /mg/ | i Wydajność /%/ | 1 Wydajność względna | i i - J |
| — —— — — — — — — — — — — — - — - — “ — — — “ — “ — — { kwas 5,10-mttenylo-5,&5 ^^-tetra- | ' 12,9 | j 6,5 | 1 1 |
| ihydrofoliowy /22,6/ | 1 | I | 1 1 |
| [ kwas 5-formylo-5,6S ^^-tetrahydro- | 1 | 1 | I |
| •foliowy /118,2/ | ! 67,5 | ! 33,8 | 1 |
| jkwas 5,6R,7,--tetrahydrofoliowyX /145,5/ | I 83,1 » - _ | ί 41,6 ł | J |
| Xwyodrębniony kwas 5,6R,7,--tttrahydrofoliowy kowym /jak opisano poniżej/ tworząc kwas 5,10- | natychmiast suszy metenylo-5,6R,7,8- | się i formyluje kwasem tetrahydrofoliowy, który | mrów |
166 096 odmiennie od formy 6S, krystalizuje z rozcieńczonego kwasu mrówkowego.
Przykład V. Formylowanie kwesu 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego z wytworzeniem kwasu 5,10-metenylo-5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego.
Próbkę 253 mg chromatograficznie oczyszczonego i liofilizowanego kwasu 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego rozpuszcza się w 50 ml 97% kwasu mrówkowego zawierającego 2% kwasu trifluorooctowego i pozostawia w temperaturze otoczenia w kolbie reakcyjnej w atmosferze azotu bez mieszania. Mieszaninę reakcyjną analizuje się metodę HPLC stosując kolumnę z odwróconymi fazami /C-18/ eluowaną 0,1M wodnym roztworem kwasu mrówkowego i modyfikowaną metanolem w liniowym gradiencie od 12 do 25% przez 30 minut oraz kontrolowany przy 282 nm. Po trzech godzinach cały kwas 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowy reaguje, sądząc z pojawienia się nowego piku odpowiadającego kwasowi 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowemu w chromatogramie HPLC. Następnie kwas mrówkowy usuwa się przez odparowanie i powoli dodaje się 30 ml 0,1M wodnego roztworu kwasu mrówkowego sporadycznie wirując mieszaninę. Następnie roztwór przechowuje się w wychładzalni przez noc. Tworzą się drobne żółte igły dając roztwór o wyglądzie ciała stałego. Kryształy zbiera się w lejku ze spiekanego szkła, przemywa acetonem i suszy pod próżnią otrzymując 218 mg żółtej krystalicznej substancji.
Enancjomeryczną czystość krystalicznego kwasu 5,10-metenylo-5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego oznacza się stosując chiralną kolumnę /Diacel Chiracel OD/ eluowaną izokratycznie 0,5% mrówczanem amonu, pH 3,8 i 25% metanolem. Produkt, kwas 5,10-metenylo-5,6R,7,8-tetrahydrofoliowy eluuje przy 18,2 minutach.
Skręcalność optyczna oznaczana dla roztworu w 88% kwasie mrówkowym jest następująca:
| 1———— — — — ——— — — — — — - — [ Związek J 1 i | Stężenie /%/ /88% roztwór kwasu mrówkowego/ | -r· I I i t I _ __JL. | Skręcalność /alfa D w 26°C/ | — — — | |
| Ł .... . . ... | 1 Jl | ||||
| i kwas 5,10-metenylo-5,6R,7,8• tetrahydrofoliowy | 1 1 t i 1 I | 0,619 | 1 I ł I 1 ! | -47 |
Przykład VI. Derywatyzacja kwasu 5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego w obecności kwasu 5-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego i/lub kwasu 5,10-metenylo-5,6S ,7,8-tetrahydrofoliowego.
Modyfikując procedurę przedstawioną przez L, Rees, C.J. Suckling i H.C.S. Wood, J.Chem. Commun. 470 /1987/, /-/mentylochloromrówczan dodaje się do próbki mieszaniny reakcyjnej z przykładu IV, doprowadza do pH 7, co powoduje karboksymentylowanie tylko kwasu 5,6R,7,8tetrahydrofoliowego i pozostawia kwas 5-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowy nieprzereagowany. Reakcję kontroluje się przez HPLC. Skuteczne oddzielanie kwasu 5-mentyloksykarbonylo-5,6R,
7,8-tetrahydrofoliowego od nieprzereagowanych składników prowadzi się przepuszczając mieszaninę reakcyjną przez kolumnę wypełnioną XAD-2. Kwas 5-mentyloksykarbonylo-5,6R„7,8-tetrahydrofoliowy jest absorbowany przez żywicę i kwas 5-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowy lub kwas 5,10-metenylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowy przepuszcza się przez nią.
Przykład VII. Oczyszczanie kwasu 5-forrnylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego, kwasu 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego i innych pochodnych przez preparatywną HPLC.
Porcje /50 lub 100 ml/ mieszaniny reakcyjnej z przykładu IV ładuje się bezpośrednio do kolumny z odwróconymi fazami. /Dynamax 60A-C18/ 5 μ, 2,1 x 30 cm/ za pomocą pompy podającej i następnie rozwija z gradientem 0,1M wodnego roztworu kwasu mrówkowego i metanolu z szybkością przepływu 13 ml/min. przez 60 minut. Stosowany gradient wychodzi ze stężenia metanolu 5%, aby osiągnąć 10% po 12 minutach przebiegu. Następnie stężenie 10% metanolu utrzymuje się stałe przez dalsze 10 minut i w tym czasie /22 minuty przebiegu/ poziom metanolu liniowo rośnie osiągając 18% po 38 minutach i od tej chwili rośnie dalej osiągając 25% po 52 minutach przebiegu. Stężenie nie jest dalej zwiększane, aż do końca przebiegu. Czynnik wypływal66 095 ll jący z kolumny monitoruje się przy 3l9 na, ponieważ 5,10-metebylo-5.6S ,7,8-tetrahydrofolian i kwas S-formylo-S^S^^-tetrahydrofoliowy mają taki sam współczynnik absorpcji przy tej długości fali.
W tych preparatywnych warunkach kwas 5t6S.7,8-tetrahydrofoliowy eluuje między ll i l7,5 minutę, podczas gdy kwas 5-form^lι^-^ί5.6S ,7t8-tetrahydrofoliowy eluuje między 39,5 i 44,5 minutą. Eluacja pasma 5,10-metebyio-5,6S.7.8-tetrahydrofol3nu jest silnie zależna od stężenia pojawiając się między 20 i 30 minutę jako śladowy pik. Pasma kwasu 5,61^,7,8-tetrahydrofoliowego i pasmo 5,l0-rnetenylo-5,6S,7,8-tetrahydrofolianu nie mogę być całkowicie oddzielone, gdy więcej niż l40 ml mieszaniny reakcyjnej równoważnej z 700 mg materiału wprowadza się.
Eluowane pasma kwasu 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego i kwasu 5-formylo-5.6S.7.8-tetrahydrofoliowego zbiera się do szklanych butelek, które zanurza się w suchym lodzie tak, aby ciecz mogła natychmiast zamarznąć. Następnie zamrożone frakcje liofilizuje się otrzymując szarawo-biały proszek w przypadku kwasu 5,6R.7,8-tetrahydrofoliowego i żółtawo-biały proszek w przypadku kwasu 5-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego. Na tych proszkach przeprowadza się analizę HPLC stosując kolumnę z odwróconymi fazami /Dynamax 60A-Cl8, 8 μ, 2,l x 30 cm/, rozwijaną z gradientem 0,lM wodnego roztworu kwasu mrówkowego i metanolu. Okazuje się, że kwas 5-formylo-5.6S.7,8-tetrahydrofoliowy ma 97% i kwas 5.6R.7.8-tetrahydrofoliowy ma 93% czystości, co widać z obszaru pod krzywą. Ze względu na niestabilność kwasu 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego, przekształca się go przez chemiczne formylowanie w bardziej stabilny kwas 5.10-metenylo-5,6R.7.8-tetrahydrofoliowy. Aby przeciwdziałać problemowi stabilności kwasu 5-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliotwego, związek ten przekształca się w jego sól wapniową, jak opisano w przykładzie VIII.
Przykład VIII. Sposób wytwarzania 5-formylo-5,6St7.8-tetrahydrofolianu wapnia lub 5-formylo-5,6R,7.8-tetrahydrofoliabu wapnia.
W modyfikacji procedury publikowanej przez C. Tempie, Jr. , R.O. Elliott, J.D. Rose i J.A. Montgomery, J. Med. Chem. 22, 73l /l979/ wytwarzania racemicznego 5-formylo-5,6/R.S/.
7,8-tetrahydrofoliabu wapnia, otrzymany kwas 5-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowy przemywa się eterem aby usunąć ewentualny mrówczan amomu. Następnie 62 mg przemytego materiału rozpuszcza się w 32 ml odgazowanego metanolu /nie zawierający soli kwas foliowy jest dobrze rozpuszczalny w metanolu/, do którego dodaje się około l ml metanolowego roztworu chlorku wapnia /72mg chlorku wapnia na ml metanolu/. Dodanie soli powoduje natychmiastowe utworzenie białawego osadu, który zbiera się na lejku ze spiekanego szkła i suszy pod próżnią. Wydajność po wysuszeniu wynosi 60,5 mg /90% wydajności teoretycznej/.
Jeżeli ten proces powtarza się z izomerem 6R, otrzymuje się 5-formylo-5,6R,7,8-tetrahydroftalan wapnia.
Czystość otrzymanych związków oznacza się przez UV/HPLC nie zważając na obecność materii nie absorbującej UV. Czystość ebabcjomeryczną oznacza się w tym etapie dla pochodnych 5,l0metebylo-5,6/R,S/,7.8- tetrahydrofolianu przez HPLC stosując kolumnę chiralną /Diacel Chiracel OD/, eluowaną izokratycznie 0,5% mrówczanem amonu pH 3,8 i 25% metanolem. Kwas 5,l0-metenylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowy eluuje najpierw z czasem retencji l5,2 minut, podczas gdy kwas 5,10-metebylo-5.6R.7,8-tetrahydrofoliowy eluuje z czasem retencji l8,2 minut.
Roztwory otrzymanych związków o kwasie mrówkowym, a nie w l0M lub l2M kwasie solnym, jak podawano w literaturze, stosowano do rejestrowania ich rotacji optycznych, ze względu na zmniejszoną kwasowość kwasu mrówkowego i jego zwiększoną moc rozpuszczania dla folianów. Próbki powyższych preparatów wykazywały następującą skręcalność optyczną;
166 095
| Związek _ __________ ___________ | i Stężenie /%/ 'i /88% roztwór kwasu J mrówkowego/ | ! Skręcalność j • /alfa D w 26°C/ J 1 1 | ||
| kwas 5,10-metenylo-5,6S,7,m-tetrαhodrofoliowy x | 1 ! 0,611 | 1 1 ł 1 | +42 | |
| kwas 5,10-metenylo-5,6R,7,8tonrαhodrkfoliowy xx | J 0,619 ------------- | 1 1 1 1 | -47 | ___J |
^Wyodrębniony chromatograficznie jako kwas 5-fornylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowy, który po odstaniu w eluowanej mieszaninie 0,1M kwasu mrówkowego przekształcono w kwas 5,10-metenylo5.65.7.8- tetrahydrofoliowy i następnie zestalono do postaci żelu, który liofilizowano. xxPoczętkowo wyodrębniony jako nieprzekształcony kwas 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowy, który po liofilizowaniu natychmiast formylowano kwasem mrówkowym, jak opisano uprzednio. Uzyskany kwas 5,10-metenylo-5,6R,7,8-tetrahydrofoliowy, który krystalizował z mieszaniny rozcieńczonego kwasu mrówkowego zbiera się, przemywa acetonem i suszy w próżni. Z 253 mg kwasu 5,6R,
7.8- tetrahydrofoliowego /w/wawow /bżbie się 218 mg krystaliczczno kwawu 5jlO-rnemenylo-S^R,
7,8-tetrahydrofoliowego /wagowo/.
Przykład IX. Sposób wytwarzania znakowanego radioaktywnie kwasu fkrnolkfklikwego i pochodnych.
Jeżeli powtarza się procedurę opisaną w przykładzie II zastępując mrówczan amonu znakowanym radioaktywnie mrówczanem amonu lub inną znakowaną radioaktywnie pochodną kwasu mrówkowego, otrzymuje się znakowany radioaktywnie kwas l0-fornolo-l,6S,7,8-netrahodrkfkliowy. Jeżeli poddaje się go procedurom z przykładów III - VIII, otrzymuje się odpowiednie znakowane radioaktywnie kwasy i sole.
Wymienione powyżej patenty, publikacje i metody badań sę wprowadzone do opisu jako odnośniki literaturowe.
Powyższy szczegółowy opis sugeruje wiele oczywistych wariantów dla fachowców w tej dziedzinie. Na przykład zamiast leukoworyny wapnia można otrzymać sól strontową lub sodową leukoworyny. Formylaza nonrahydrkfolialkwę można wypreparować z Clostridium acidi-urici. Wszystkie takie oczywiste modyfikacje wchodzę w zakres załączonych zastrzeżeń patentowych.
166 096
WZÓR 1 a
„CO2H
-H
WZÓR Ib
166 096
SCHEMAT 1(1)
166 096
WZÓR Ib
SCHEMAT 1(2)
166 096
WZÓR 2 a
H
C02H
H 'rCH2)2CO2H
WZÓR 4 a
WZÓR 1a
SCHEMAT 2
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 1,00 zł.
Claims (5)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób wytwarzania zasadniczo czystego diastereoizomeru /6R lub 6S/ pochodnej kwasu 5,6/R lub S/, 7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru, znamienny tym, że obejmuje etapy /a/ enzymatycznego formylowania formy 6S mieszaniny diastereoizomerów6R i 6S kwasu tetrahydrofoliowego lub podstawionego kwasu tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru, przy użyciu formylazy tetrahydrofolianowej wytworzonej przez Clostridium sp.ATCC nr 7905 lub jego mutant i albo /b/ /1/ oddzielania kwasu 10-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru od kwasu 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru i następnie cyklizacji i hydrolizy kwasu 10-formylo-5,KS,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru, przy użyciu kwasu siarkowego lub /2/ cyklizacji i hydrolizy kwasu 10-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru przy użyciu kwasu siarkowego w obecności kwasu 5,6R,7-8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estruj i następnie albo /i/ derywatyzacji kwasu 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru przy użyciu mentylochloromrówczanu i wówczas rozdzielania składników; lub alternatywnie /ii/ oddzielania któregokolwiek kwasu 5,10-netenylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego i kwasu 5-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego lub ich soli lub estrów od kwasu 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estruj i po rozdzieleniu w razie potrzeby /3/ chemicznego formylowania przy użyciu kwasu mrówkowego w obecności karbodiimidu, cyklizacji i hydrolizy nieprzereagowanego kwasu 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru przy użyciu kwasu siarkowego lub alternatywnie derywatyzacji kwasu 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru z innymi grupami funkcyjnymi przy użyciu mentylochloromrówczanu i w razie potrzeby /c/ konwersji zasadniczo czystego kwasu 5-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru lub kwasu 5-formylo-5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru do odpowiedniego kwasu, soli lub estru.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap konwersji /c/ obejmuje konwersję pochodnej kwasu foliowego do soli wapnia, magnezu, strontu, żelaza lub mieszaniny tych soli.
- 3. Sposób 1, znamienny tym, że enzymatyczny preparat wytwarza się w mieszaninie reakcyjnej zawierajęcej znakowany radioaktywnie kwas mrówkowy lub chemiczny odpowiednik.
- 4. Sposób wytwarzania zasadniczo czystego kwasu 5-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru, znamienny tym, że obejmuje etapy /a/ enzymatycznego formylowania formy 6S mieszaniny diastereoizomerów 6R i 6S kwasu 5,6,7,8-tetrahydrofoliowsgo lub jego soli lub estru przy użyciu formylazy tetrahydrofolianowej wytworzonej przez Clostridium sp. ATCC nr 7905 lub jego mutant i /b/ cyklizacji i hydrolizy kwasu 10-formylo-5,6S,7,8-tetraaydrof oliowego lub jego soli lub estru przy użyciu kwasu siarkowego w obecności kwasu 5,6R,7,8-tttΓahydaofoliowego lub lub estru przy użyciu kwasu siarkowego w obecności kwasu 5^R^^-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru i następnie /c/ oddzielania kwasu 5,l0tfπtttnylot5,6S,7,8ttttaayydrofot liowego lub jego soli lub estrów od kwasu 5,6R,7,--tttaayydrofoliowego lub jego soli lub estruj i po rozdzieleniu w razie potrzeby /d/ konwersji zasadniczo czystego kwasu 5tformylot5,6S,7,-ttetrayydaofoliowtgo lub jego soli lub estru do odpowiedniego kwasu, soli lub estru.
- 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że etap konwersji /c/ obejmuje konwersję pochodnej kwasu foliowego do soli wapnia, magnezu, strontu, żelaza lub mieszaniny tych soli.166 096
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US44966289A | 1989-12-11 | 1989-12-11 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL288204A1 PL288204A1 (en) | 1991-12-16 |
| PL166096B1 true PL166096B1 (pl) | 1995-03-31 |
Family
ID=23785009
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL90288204A PL166096B1 (pl) | 1989-12-11 | 1990-12-11 | pochodnej kwasu 5,6(R lub S), 7,8-tetrahydrofoliowego PL PL PL PL PL PL |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5334535A (pl) |
| EP (1) | EP0432441B1 (pl) |
| JP (1) | JP3027613B2 (pl) |
| KR (1) | KR0172118B1 (pl) |
| CN (1) | CN1031804C (pl) |
| AR (1) | AR245134A1 (pl) |
| AT (1) | ATE139799T1 (pl) |
| AU (1) | AU641710B2 (pl) |
| CA (1) | CA2031784C (pl) |
| CZ (1) | CZ279998B6 (pl) |
| DE (1) | DE69027585T2 (pl) |
| DK (1) | DK0432441T3 (pl) |
| ES (1) | ES2090075T3 (pl) |
| FI (1) | FI103804B1 (pl) |
| GR (1) | GR3021060T3 (pl) |
| HU (1) | HU209761B (pl) |
| IE (1) | IE904439A1 (pl) |
| IL (1) | IL96265A0 (pl) |
| NO (1) | NO177541C (pl) |
| NZ (1) | NZ236370A (pl) |
| PL (1) | PL166096B1 (pl) |
| PT (1) | PT96120B (pl) |
| SK (1) | SK610390A3 (pl) |
| ZA (1) | ZA909899B (pl) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CH681303A5 (pl) * | 1991-01-16 | 1993-02-26 | Eprova Ag | |
| DE4136921A1 (de) * | 1991-11-11 | 1993-05-13 | Knoll Ag | Verfahren zur trennung von 5-methyl-tetrahydrofolsaeure |
| CH683262A5 (it) * | 1992-01-22 | 1994-02-15 | Applied Pharma Res | Procedimento per la separazione dei diastereomeri del sale di calcio dell'acido (6(R,S)-N-formiltetraidrofolico). |
| IT1254635B (it) * | 1992-02-20 | 1995-09-28 | Bracco Spa | Processo per la separazione degli stereoisomeri dell'acido folinico |
| CH686369A5 (de) * | 1994-05-09 | 1996-03-15 | Eprova Ag | Stabile kristalline (6S)- und (6R)-Tetrahydrofolseure. |
| CH693255A5 (de) * | 1997-06-13 | 2003-05-15 | Eprova Ag | Verwendung von Tetrahydrofolaten in der natürlichenstereoisomeren Form zur Herstellung einer pharmazeutischenZubereitung geeignet zur Beeinflussung des Homocystein-Spiegels. |
| CH694251A5 (de) * | 1999-07-14 | 2004-10-15 | Eprova Ag | Herstellung von Tetrahydropterin und Derivaten. |
| AU2001259039A1 (en) * | 2000-04-05 | 2001-10-23 | Edward V Quadros | Radioenzymatic assay for methylenetetrahydrofolate reductase |
| CH696699A5 (de) * | 2006-01-19 | 2007-10-15 | Cerbios Pharma Sa | Verfahren zur regioselektiven N(5) -Formylierung von (6S) -5, 6, 7, 8-Tetrahydropteroinsäure und Derivaten davon. |
| WO2010017526A1 (en) * | 2008-08-08 | 2010-02-11 | The Scripps Research Institute | Purine nucleotides isotopically labeled in the purine base, methods of making thereof and uses thereof |
| US9382251B2 (en) * | 2012-07-27 | 2016-07-05 | Chemic Laboratories Inc. | Compositions comprising folic acid derivatives, their preparations and methods of use |
| CN115656372B (zh) * | 2022-10-27 | 2024-10-11 | 北京斯利安药业有限公司 | 一种s-四氢叶酸异构体手性分析方法 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4500711A (en) * | 1977-03-21 | 1985-02-19 | Burroughs Wellcome Co. | Synthesis of leucovorin |
| US4148999A (en) * | 1977-08-22 | 1979-04-10 | The Government Of The United States Of America | Preparation and purification of citrovorum factor |
| GB8621268D0 (en) * | 1986-09-03 | 1986-10-08 | Univ Strathclyde | Separation of substances |
| US4746662A (en) * | 1987-02-20 | 1988-05-24 | American Cyanamid Company | Treatment of arthritis with 3,5-dichloromethotrexate |
| DE3821875C1 (pl) * | 1988-06-29 | 1990-02-15 | Eprova Ag, Forschungsinstitut, Schaffhausen, Ch | |
| FR2643081B1 (fr) * | 1989-02-14 | 1991-06-07 | Panmedica Sa | Folates de magnesium, procede de preparation et compositions pharmaceutiques |
| CH680731A5 (pl) * | 1990-04-12 | 1992-10-30 | Sapec Fine Chemicals | |
| JPH07332120A (ja) * | 1994-06-08 | 1995-12-22 | Sanshin Ind Co Ltd | 多気筒エンジン |
-
1990
- 1990-11-05 DE DE69027585T patent/DE69027585T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-05 EP EP90121120A patent/EP0432441B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-05 ES ES90121120T patent/ES2090075T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-05 DK DK90121120.1T patent/DK0432441T3/da active
- 1990-11-05 AT AT90121120T patent/ATE139799T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-11-06 IL IL96265A patent/IL96265A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1990-11-27 CN CN90109616A patent/CN1031804C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-06 NZ NZ236370A patent/NZ236370A/xx unknown
- 1990-12-07 CZ CS906103A patent/CZ279998B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1990-12-07 PT PT96120A patent/PT96120B/pt not_active IP Right Cessation
- 1990-12-07 CA CA002031784A patent/CA2031784C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-07 SK SK6103-90A patent/SK610390A3/sk not_active IP Right Cessation
- 1990-12-10 FI FI906072A patent/FI103804B1/fi active IP Right Grant
- 1990-12-10 IE IE443990A patent/IE904439A1/en not_active IP Right Cessation
- 1990-12-10 JP JP2407190A patent/JP3027613B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-10 KR KR1019900020269A patent/KR0172118B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1990-12-10 AR AR90318584A patent/AR245134A1/es active
- 1990-12-10 ZA ZA909899A patent/ZA909899B/xx unknown
- 1990-12-10 AU AU67932/90A patent/AU641710B2/en not_active Expired
- 1990-12-10 NO NO905325A patent/NO177541C/no not_active IP Right Cessation
- 1990-12-11 PL PL90288204A patent/PL166096B1/pl unknown
- 1990-12-11 HU HU908159A patent/HU209761B/hu unknown
-
1992
- 1992-09-18 US US07/947,641 patent/US5334535A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-09-18 GR GR960402428T patent/GR3021060T3/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Stokstad et al. | Folic acid metabolism. | |
| US5350851A (en) | Intermediates and a process for synthesis of tetrahydropteridine C6-stereoisomers, including (6S)-tetrahydrofolate and N5-formyl-(6S)-tetrahydrofolate | |
| EP0608002B1 (en) | Optically active compounds | |
| Kuttan et al. | Inhibition of inosinate dehydrogenase by metabolites of 2-β-D-ribofuranosylthiazole-4-car☐ amide | |
| PL166096B1 (pl) | pochodnej kwasu 5,6(R lub S), 7,8-tetrahydrofoliowego PL PL PL PL PL PL | |
| EP0295724A2 (en) | Biosynthesis of unnatural cephalosporins | |
| US4510246A (en) | Isolation of cyclase, epimerase and a ring expansion enzyme for producing unnatural cephalosporins | |
| EP0457735B1 (en) | Biocatalytic process for the production of L-(-)-carnitine from crotonobetaine and strains of Proteeae for use in said process | |
| Gal et al. | Biopterin: II. Evidence for cerebral synthesis of 7, 8-dihydrobiopterin in vivo and in vitro | |
| Vogel et al. | l-Histidinol, a precursor of l-histidine in Escherichia coli | |
| Arnstein et al. | The biosynthesis of penicillin. 8. Investigation of cyclic cysteinylvaline peptides as precursors | |
| Akers et al. | Hydroxamic acid present in Rhodotorula pilimanae cultures grown at low pH and its metabolic relation to rhodotorulic acid | |
| US4929551A (en) | Process for producing L(-)-tetrahydrofolic acid | |
| US7259276B2 (en) | Polyenecarboxylic acid derivatives, processes for preparing them, and their use | |
| US2483248A (en) | Process for preparing compounds having folic acid activity | |
| US4579818A (en) | Biosynthesis of unnatural cephalosporins | |
| Zygmunt et al. | Formation of folic acid related compounds by Bacillus subtilis | |
| Gajendiran et al. | Biotechnological production of high specific activity L‐35 S‐cysteine and L‐35 S‐methionine by using a diploid yeast Saccharomyces cerevisiae | |
| Lipman et al. | Stereospecificity of folate binding to DNA photolyase from Escherichia coli | |
| CA1206901A (en) | Biosynthesis of unnatural cephalosporins | |
| JPH09168393A (ja) | 同位体を有する５−アミノレブリン酸の製造方法 | |
| Xu et al. | [9] Preparation of optically pure isotopically labeled l-glutamate | |
| Crouch et al. | The mechanism of the enzymatic ring expansion of penicillin N to deacetoxycephalosporin C | |
| HK1005888B (en) | Biocatalytic process for the production of l-(-)-carnitine from crotonobetaine and strains of proteeae for use in said process | |
| Slieker | Studies on the Mechanisms, Stereochemistry and Inhibition of Folate-dependent Group Transfer Enzymes |