PT96120B - Processo para a preparacao de diastereomeros de compostos tetra-hidrofolato opticamente puros - Google Patents
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Description
1;ί das fórmulas (la e ib> para os quais os compostos tem a estereoquimica CR) s CS) respectivamente sm C—é.
im antídoto para os antaao--sxata, d qual bloqueia a ácido tetrahidrofó1ico. Os água parai in j seção com έ priricipalmente usado como n is tas do acido fólico tal cocuo mete conversão ds ácido dihidrofólico em sais leucovorin s-So formulados em os apropriados, coma descrito sob Leucovorin Caleium p resarvatxvos Inj ec tion na Phvsician’s Economics CoiTipany.·! Oradsll
Desk Reference, Edição ϋ S Cs MJ 1989 CPDR 43i rd Ed.) p. 112· Medicai 0 comportamento farmacocinético dos dois isómeros íb) ssr seiectivamente absorvi-ntestinaj relativa de plasma mais curta da que a (R)~isómero Cia) ínético dos dois facto de o íS)—isómero cThi -=.»ϊ-do a partir do aparelho gastrointestinal e ter uma semi vida plasma mais curta do que α íRl—isómera difere na 0 isémero íb de ocorrência natural, o qual ê o diaste-'oi assinalado (C- Teraple, Jr„, JP» Rose, W» R» Las ter 5 and J* A» Montgomery, Câncer Treatment Report, 65, ÍÍÍ7-ÍÍÍ9 (Í9SD) como sendo importante para a terapia de salvamento em virtude da sua eficiência no restauro do metabolismo de um carbono.
Um relatório CR. P. Lsary, N Kisliuk ? Biochem» and Biophysn Res» Commii dis que a síntese do thimidilato a partir da
Gaumont, Η» 1—« 5 5à 5 484“ •488 C Í974)) da. L» casei é inibida. pelo diastereoisémero não natural de b =ΙΘ-metileno tetrahidrofa- lato e um
Lstário CV«
Sc o 11 and K« D * Bon a 1 d son, si oc hef and Biophys» Res» Commun», Í4» 523-526 (1964)) dic que α ο,1Θ-meti leno tetrahidrofolato desidrogenase da E. Coli é também inibido 1 o 11'γηlj QiâstsreQiSoissfo a*~oplado com a ooservaçao h..
Smith? P, A. Benkovic, and S» J» Benkovic, Biochem», 20. 4034- -4036 <198i>> de que α mesmo diastereoisómero de iS-formiltetra— hidrofolato é um inibidor competitivo potente de Slicinamida ribonucleótido farmiltransferase iBAR) a partir de pontos do figado dai galinha, da inibição da. biosintese de ambas pirimidina e purina s assim da d.i.qsxntese de DMA pelos diastereoisòmeros não naturais de derivados um carbono de tetrahidrofolato. Portanto, as formas não naturaxs nâo podem ser consideradas como biológica-mente inertes. Se tal inibição estiver presente nos sitemas dos mamíferos5 então εκiste uma necessidade clinica potencial só para a forma natural (68) dos tetrahidrofolatos, em especial a leuco-vorin,
Ia. 0 Ib Pu P d i a s terecíisoméricos )s componentes
Toram separados í D, B« Cosulich, J. M» Smith, Jr. and H, P. Proglist, J. Am = Chem» Soe., 74, 4215 (1953)) por cristalização fraccionada e por cromatografia (J, Feeney, B« Birdsal1, J-, P. Albrand, 8» G« líu Roberts, A» '3= Bunqen , Pu A« Charlton and D» W« Young, Biochem,, 2©, 1837 (1981))= Uma redução estereoscópia de dihidro-folato catalisada por dihidrofolato reductase foi assinalada (L« Rees, E» Valente, C. J, Sucklinq and H = C = S» Wood, Tetrahedran, 42, li: mero, (1986)) para obtermos estereoespecificamente o 6<8)~isó-
Um artigo publicado por L, Rees, E. Valente, C. J· Suckling and H, C. B, Wood, Tetrahedron, 42, 117-136 (1986) descreve a sintese de derivados chiral de tetrahidrofolato, incluindo leucovorin. Este sistema precisa do uso de dihidrofola— to reductase de E, coli e uma reciclagem extensiva e cara do cofactorde redução NADPH. Outro artigo publicado por L =
Rees, C« u. Suckling and H» C» S. Wood, J. Chem. Soc. Cheai» Commun, 470, (1987) (European Patent Application © 266 042 A2) descreve a acllação de 6(R,S)—tetrahidrofolato com í—)—menti1 cloroformato para obtermos derivados N-5 na forma de uma mistura diastereoisomérica os quais foram separados por precipitação fraccionada, 0 tratamento subsequente de cada diastereoisómero com ácido fórmico s brometo de hidrogénio em ácido acético seguido por hidrólise oriqinou caída um dos disstereoisómeros de 5-formiltetrahidrofolato.
Foi agora descoberto que os disstereoisémeros dos compostos tetrahidrofolatos ópticamente puros podem ser obtidas <Bâis fácilmente de acorda com este invento» tste processo tem a vantagem principal sobre os processos patenteados previamente cr^ t.os pelo facto de ser surpreedentemente simples, porque a etapa chave precisa só do uso de uma só enzima, tetrahidrofolato formilase, por outro lado chamada enzima de actxvaçáo do formato ou formiltetrahidrofolato sintetase ÍFTHFB), a qual ajuda também selectivamente o grupo formilo necessário para sómente o óS diastereoisómero quando usamos uma mistura rscémica de ácido 5s6<R?S?57,8-tetrahidrafólico CIIa,b>* Além disso, a utilização, desta enzima tem uma vantagem distinta em relação ao uso da enzima dihidrofolsto reductase pelo facto de não termos de usar um sistema extensivo de regeneração para os cofactores. A formilase tetrahidrofolato pode ser elaborada por Micrococcus aerooenes, Clostridium cvlindrosporum» Clostridium acidi-urici» Clostridium thsrmoaceticum, e por outros microorga-nismos, plantas e animais» D, H» Butlaire, Methods In Enzymology, óó, 585-599 í1980)»
Usandu formato de amónio radioetiquetado ou qualquer outro, incluindo o fabricado in situ, sais da ácido fórmico radioetiquetado ou seus derivados, na formilação enzimàtica. podemos obter etiquetados ou <Ib) etiquetados» Com a ajuda e cuiiverter em ílVb) etiquetados da enzima 5,1Θ—metilenetetrahi— drofcaaio desidrogenase, qucalquer dos grupos formilo radioetique— tados transportando 5,óB,7s8-tetrahidrofolatos CIh,IIh, ou IVb), de preferencia \IVb), podem ser transformados em acido 5,1 ©"fnst i— s-ob pode leno-o,óS,7,8-tetrâhidrofólico etiquetado o qual por sua vez, a acção tía enzima 5,10—iisstzlsnststrahicirQfoIatQ reductase 7,S—tetrahidrofólico ílb) gerado pela para a produção de radioetiquetado» ser convertido em ácido 5,10-metil-55ès= radioetiquetado» Assim, o radioetiquetado aplicação deste invento é um composto útil derivados de ácido 5,ÓS,7,8~tetrahidrofólico 0 processo do invento também permite inesperadamente α isolamento de ácido 5,ó-R,7,B-tstrshidrofàlico <IIa) o qual é não formilado pela enzima. 0 isolado ClIa) pode ser a seguir vendido tal qual (comercializado como um composto raro) ou serve como material de partida para a produção de, por exemplo, ácido 5-f ormi i -5 , 6R, 7 , 8—tetrahidrofóI ico (Ia) numa analogia com um processa descrita por R« 0. Moran and P„ D# Colman, Anal,, Biochem# 122# 7® - 78 (1982) usando ácido fórmico com ou sem a carbodiimida solúvel em água, i-etil~3~<3"-dimeti1-aminopropil)-carbodiimida. Preferível, no entanto, é o isolamento de (lia) após a conversão de (IHb) em CIVh) e/ou (Ib) ter sido completa» Isto permite uma separação mais fácil dos componentes por croma-tagrafia de fase inversa, por exempla. Também, o (lia) pode ser modificado na presença de (IVb> e/ou (Ib), uma vez que a posição 5 de (lia) é ainda reactiva ao passo que de (IVb) ou (Ib) não é, para produzir o derivado (lia), por exemplo, ácido 5-carboxime-til-5,óR,7,8~te.rahidrofólico, o qual pode ser separado a partir de CIVh) ou ílb) numa etapa única, de adsorpção,
Além disso, o (Ha) separado pode reagir como assinala do por C= Tsmple, Jr„, L Elliott, J„A„ Hontgomery and - 166 (1982) para preparar “tetrahidrofólico 5- s 1®- . «L. Bennett, Jr.» 3» D. Rose, R. D. t J„H# Manguei, J« Med. Chem», 25, 161 vários derivados de ácido 5,óR,7,B— substituídos, 5,1Θ—disubstituidos, e 5,l®~substituidos em ponte» Em particular, o 5-meti1-5,óR,7,8-—tetrahidrofolata pode ser sintetizado a partir de (lia) com formaldeido e borohidreto de sódio sob condições básicas como descrito num método por J„A# Blsir and K„J# Saunders, Anal. Biochem., 34, 376 (197®)# A alquilaçSo de (lia) com sulfato de dimetilo em N,M-dimetilacetamitía a 55°C é conseguida pelo uso de um método descrito na patente Japonesa 73 32#12® (1973)p Chem. Abst., 8®, 2792K (1974). 5 & 8-
Par substituição de ácido térmico ou de agentes de alquilação nas reecçSes acima indicadas com ácido fórmico radio— etiquetado ou seus derivados ou agentes d© alquilação radioacii-vos? obteremos derivados de ácido 5,óR,7,8~tetrahidrofóXico rad iaetiquetadas.
J
J
De acordo com este invento, ambos os derivados de ácido 5,68,7,8-tetrahidrofólica radioetiquetado s as derivados de ácido 5,6R,7,8-tetrahidrofàlico radioetiquetado e os seus sais podem ser produzidos separadamente, os quais são compostos úteis para o teste, por enemplo o estudo dos mecanismos enξimáticos,
RESUMO DQ INVENTO
De acordo com o presente invento, fornece—se um processo para a preparação de um diastereoisómero íèR ou é8) desejada substancialmente puro de um derivado de ácido tetrahidrafólico ou. um seu sal ou seu éster, cujo processo compreende as etapas des
J ía) formilação enzimática da forma ê>S de uma. mistura, de diastereoisómeros 6R e 6S de ácido tetrahidrofólico ou de um seu sa.l ou seu éster de ácido tetrahidrofólico substituído de modo a formar uma mistura de compreendendo σ ácida í©-í a rm i1-5,6S,7,8--—tetra.hidrof ól ico ou um seu sa.l ou um seu ésterρ o ácido 5,63,7,8-tetrahidrafólico que não reagiu ou um -seu sal ou um seu éster se presente; ácido 5,óR,7,8-tetrah.i.drof ól ico que não reagiu ou um seu sal ou um seu éster ? e ou
J (b) <1) separação do ácido l€J-formil-5,óS57,8-tetrahi-drofólico ou de um seu sal ou de u.m seu éster a partir de ácido 10-í ormi 1-5, AR, 7,8-tetra.hidrof ól ico ou de um seu sal ou de um seu éster e a seguir ciclizaçlo e hidrolisaçlo do referido ácido 1 ©—f ormi 1 —5, ó5,7,8 tet rahidrof ól ico ou de um seu. ss.l ou de um seu éster de modo a formar ácido 5,10~metenil-5,óS,7,8-tetrahidrofó-lico, ou ácido 5~íormii~5,6S,7,8-tetrahidr0fóIicD ou ssus sais ou seus ésteres , ou. ambos dos anteriores? ou (2) ciclização s hidrolização do referido ácido Í0-for-mil“5,6S,7,8—tetrahidrofólico ou um seu sal ou um seu éster de modo a formar o ácido 5,i0“metenil-5,6S,7,8-·tetrahidrofólico, ou 5-formil“5,6S,7,8--tetrahidrafólíco ou seus sais ou seus ésteres, ou ambos dos anteriores, na presença de ácido 5,6R,7?8~tetrahi-drofólico ou um seu sal ou seu éster? e a seguir ou íi> derivatizaçãa do ácido 5,6R,7,8-tetrahidrofó-lico ou um seu sal ou seu éster de modo a formar ácido 5,68,7,8-“tetrahidrofólico 5-substitudo ou. um seu sal ou seu éster e a seguir separação dos componentess ou alternatiyamente (ii) separação de qualquer ácido 5,i0-metanil~ -5,6S,7,8-tetrahidrofólico ou qualquer ácido 5-formi 1 -5,é-S,7,B~ -tetrahidrofólico ou seus sais ou seus ésteres a partir de ácido 5,6R,7,S-tetrahidrafólico ou um seu sal ou seu éster? e após separação5 se o desejarmos (3) realização quimica da formilação, ciclisação, e hidrolização do referido ácido 5,6R,7,8-tetrahidrofólico que não reagiu ou um seu sal ou. seu. éster de modo a produzir ácido 5~formil“5,6R,7,8~tetrahidrofólicD ou um seu sal ou seu éster, ou, alternativamente, der.ivatização do referido ácido 5,6R,7,S“tetrahidrofólico ou um seu. sal ou seu éster com outros grupos funcionais de modo a formar ácido 5,6R,7,8-tetrahidrofólic.o 5-substitudo ou um seu sal ou seu éster? e, se o desejarmos (c) conversão do ácido 5-formíl-5,6S,7,8~tetrahidrofó-lico substancial mente puro ou um seu. sal ou um seu. éster ou de
Í0· ácido 5~forrail~b,óR,7,8-tetrahidrofálica ou um seu sal ou um seu éster no ácido, sal ou éster correspondente.,
Os produtos do processo são valiosos por eles próprios, por exemplo, na terapia, e como intermediários para produzir outros produtos valiosos, e, quando radioetiquetados, eles podem ser usados para estudar mecanismos enzimáticos, por exemplo» Os especialistas nesta arte conhecerão como usar tais compostos para tais fins.
De? preferencia, o processo ê usado para produzir um ácido S-formi1-5,63,7,S-teirahidrofólico substancilamente puro desejado ou um seu sal ou seu éster» Tais compostos tem propriedades valiosas como agentes de salvamento» Em especial prefere—se o processo em que a enzima usada para a íormilação selectiva compreenda o tetrahidrofalato formilase» Também, o processo é útil para produzir um diastersoisómero (6R ou 6S) desejado substancialmente puro de um derivado de ácido tetrahidrofólico íradioetiquetado) ou um seu sal ou seu éster» Tais materiais podem ser usados para estudar os mecanismos enzimaticos»
DESCRICgo DETALHADA DQ IMVENTO
Os compostos de partida usados neste inventa podem ser preparados por técnicas bem conhecidas dos especialistas da arte das transformações bioquímicas» A mistura de Ila(R) e Ilb(S) pode ser preparada por redução de borohidreto de sódio de ácido fólico usando α processa de C» Tempie, Jr», R» D» Elliott, J= D. Rose and J» A» Montgomery , J» Hed» Chem»,, 22% 731 <1979/.
Começando com estes materiais, o esquema reaccional do processo do invento ê como se mostra no Esquema is
Ul£?!Hâ X
R
lia +
(FTHFS)
V - Vv Ç.' Λ
Esquema í {continuação)
IVb
Ib
V V Ia) d qual pode ser formilado com ácido tente de (Ia), o sal
Cernia se mostra na Esquema 2, <1 separado do ílllb) por cromatografia é térmico para obtermos, sob formação intermi imidazolinium ÍIVa> o qual após cristalização é hidrolizado para obtermos o isómeo não natural pu.ro de leucovorin < Ia). Alternativamente, a mistura de ílllb) e ílla) pode' ser efectuada para converter ílllb) em (IVb) e/ou (Ih), produzindo assim uma mistura de íIVb) e/ou (Ib> e ílla). A cromatografia separa fácilmente os componentes da mistura, isto é, ílla) de (IVb) e/ou <Ih>»
Este processo de isolamento também constitui uma separação de facto dos diastereoisómeros 6R e óS de ácido tetra— hidrofólico» Uma vez que o ílla) pode ser transformado quimicamente em (Ia), este invento estabelece formalmente um método para a separação efectiva de (Ib) de íla) os quais sã'o mais comuaiente referidos coma as formas naturais e não naturais de leucovorin»
IVa . : ••w'4' .5
- ^ xS v t·
DESCRIC«Q DftS EXECUcúES PREFERIDAS
Os exemplos seguintes ilustram o invent-pretendem limitar de qualquer modo as Reivindicações, ma:
I ÈClQ
PROCESSO A
Efectuamos o isolamento s crescimento de C1ostridium c:y 1 indrosporum {também referida como Clostridium sp. — ftTCC No» 7905).
Uma vez que a Clostridium é um anaeróbio, todas as operações de produção, manutenção e manuseamento da cultura, são efectuadas sob condições que minimizam a exposição das estirpes ao oxigénio. Do mesmo modo, devido à extrema instabilidade do oxigénio do tetrahidrofolato e dos seus derivados, todos os processos envolvendo estes compostos são efectuados na ausência de oxigénio. Um aparelho caixa anaeróbica de plástico ligada a uma fonte de oxigénio sem azoto, é usado para. este fim, i» Preparação de um Meio de Crescimento de Acido úrico» 0 meio de ácido úrico é preparado como descrito no Handbook Media ATCC - Receita No» 519;
Composição do Meio de Ácido úrico
tsssesass&ssatstt «βββββββββββββ 3,0 q. Λ-, w Π*. τ'··! g ft ,*v ££. _ l£J 9 0,1 9 5,€s mi 1,0 Q 0,5 Π 1,0 L Ácido úrico.
Extracto de Fsrnseno»
Fosfato Dibásico de Potássio............
Sulfato de fiaqnesio i“!spiahzdracaoo..... =
Sulíato Ferroso......................... r/« ? !
Solução de Fenol Vermelho Tioglicolato de Sódio.... Agua Destilada........... 14.9 ml de hidróxido de sódio Φ,Θ1 M necessários para Φ,Ι g de indicador d es tilada pa r a so 1 u.ç ão meio5 o ácido úrico é * de liquido, aquecido a "« Diluídos a 250 ml com água. a 0,®4 %. Na preparação do suspenso no volume quase total ebulição e ajustado a uma cor rosa permanente de fenol vermelho (pH 7,6) com hidróxido de sódio. 0 pH é verificado com papel pH« Para o meio sólido juntamos ao meio 20,0 g de agar. 0 meio é deitado num frasco com tampa de rosca até o volume ficar práticamente completo e a seguir vaporizamos enquanto purgamos com oxigénio sem azoto. Imediatamente após a autoclave a tampa do frasco é aparafusada razoavelmente apertada. 0 meio é armazenado à temperatura ambiente para evitar a precipitação do ácido úrico a temperaturas mais baixas. Í3 *
2, Inoculação do Meio de Crescimento com Cultura de Clostridium cvlindrosoorum.
Todos os processos são efectuados sob condições anaeróbicas num "saco de luvas”. Juntamos uma porção de 1,0 ml de meio ácido úrico liquido ao granulo liofilizado de bactéria obtido a partir de ATCC. 0 granulo é dissolvido e usamos um anel de inoculação rejeitável estéril para listrar a cultura resuspensa no meio de blindagem do ácido úrico. As lamelas são colocadas num jarro anaeróbico contendo um envelope gerador de H^-CO^ e uma tira de indicador azul de metileno. 0 jarro contendo as lamelas inoculadas é incubado a 37°C. Dentro de 24 horas o crescimento é aparente nas lamelas na forma de projecçSes suaves5 transparentes, como os dedos, radiando das colónias. Uma amostra de uma colónia representativa vista à microscopia de contraste da fase revela a microscopia iipica da morfologia da célula Clostridium a a formação de esporos. · Preparação de uma Cultura permanente Stock de Clostridium cvlindrosoorum
Preparamos um meio de lamela de ácido úrico em tubos Hungate <Bellco Olass Ca.) — 10 ml de meio/tubo e serviu como fonte de uma cultura stock permanente de Clostridium cvlindrosoorum. Uma amostra de uma colónia simples de células a partir da colónia acima descrita é retirada com um laço de inoculação estéril e deitada no meio do tubo de Hungate. Este ' V . . * i·
processo é realizado numa mala anaeróbica contenda azoto gasoso. Os tubos são colocados num jarro anaeróbica e incubados a 35°C» Após cinco dias, os tubos são removidos do jarro s as tampas apsrtadamente seladas com parafina.. Os tubos são armazenados à temperatura ambiente até uso posterior„ 4,. Preparação do Meio Liquido Inoculum de Crescimento
Os tubos de meio acido úrico semi sólido (2,5 q/1
Batco-Agar) são inoculados com uma colónia de Clostridium cvlindrosparmn„ incubados a 35':'C e armazenados à temperatura ambiente como acima observado. Estas culturas servem como uma fonte de inoculum por meio liquido de crescimento como descrita na secção seguinte. cr w «
Meio Liquido ds
Crescimento Clostridium cvlindrosporum ι
Juntamos ml) a um operações a cultura uma cultura mole de tubo agar (todos os 10 litro de meio liquido ácido úrico. Todas as são eíectuadas numa mala anaeróbica e toda é incubada num jarro anaeróbico durante 4 di
PROCESSO B
Efectuamos a preparação de e;-: tracto de hidrofolato de Clostridium cylindrosporum em bruto. ra- *S ví £ C -V . , '
Como no Processo A, todas as operações de produção? manutenção e manuseamento da cultura são efectuadas sob condições que minimizam a exposição das estirpes ao oxigénio porque o Clostridium é um anaeróbio. Do mesmo modo, devido á extrema instabilidade do oxigénio do tetrahidrofolato e seus derivados? todos os processos envolvendo estes compostos são efectuadas na ausência de oxigénio. Usamos para este fim um aparelho mala de plástico anaeróbica ligado a uma. fonte de azoto gasoso sem oxigénio. A cultura de um litro fica túrbida e o material em partículas sedimenta a partir do meio. A cultura é dividida em partes aliquotas de 4 x 250 ml e adicionada a 4 x 25© ml garrafas centrífugas. As culturas são centrifugadas a 4’:’C5 8.00© RPM durante 15 minutos numa. centrífuga Beckman J2-21.
Embora o meio seja arrefecido a 4°C, o ácido úrico não precipita devido ao seu consumo pela bactéria. Os grânulos de células são resuspensos em 4 x 25 ml de água destilada arrefecida por gelo e centrifugados como acima. Os grânulos são congelados a --20^0 durante 5 dias antes de serem ensaiadas para o formíltetrahidrofolato sintetase.
Os grânulos geeldos são descongelados num total de ml de tampão (bifasfato de potássio ©s©5 M, 2-mercaptoetanol Θ,Θ5 M ípH 755 por adição de hidróxido de potássio ÍM>>« Os grânulos são agitados a deixados dissolver por agitação intermitente â temperatura ambiente durante ó© minutos. Apreciavelmente os grânulos celulares tornam-se viscosos devido á lise celular. A autólise ocorre à temperatura ambiente. 0 lisato celular é centrifugado a 17 ,Φ&Θ RPM/3© minutos e a parte sobrenadante é retida em gelo e ensaiada para o formiltetrahidrofolato sinte- D \ .·
PROCESSO C O Ensaio de Formiltetrahidrofolato Sintetase é produzido pelo método fornecida no Buttlaire "Purif icatiori and Proper-ties of Formyltetrahydrofolate Synthetase", Enzymology Vol. 66, p. 585? 19B®). EXEMPLO 1 fi redução de ácido fálico em ácido 5,6(RsS>,7,8-tetra-hidrofálico é efectuada usando um processo da literatura recente ÍC, Temple, Jr., R- D« Elliott, J. D. Rose -and J. A. Montgomery, J„ Med„ Chem» 22, 731 (1979>> empregando borohidreto de sódio. EXEMPLO 2 GERACãO DE ÁCIDO 1 3-FQRMIL-5.ÓS.7.8-TETRAHIDROFóL100
Preparamos a mistura reagente seguinte, própria para a formilação enzimática de ácido 5sóS,7,8-tetrahidrofólico para produzir ácido 10—formil—5,óS,7,8—tetrahidrofólicos 100 ml de hidrocloreto de trietanolamina 1,® M CpH 8,®), 10® ml de adenosi-na trifosfato 0,5 M (pH 8,0), 1®® ml de cloreto de potássio ®,5 Μ, 1ΘΘ ml de cloreto de magnésio hexahidratatío ®,1 M, e 2®@ ml de formato de amónio ®,Ξ M <pH 8,®). 0 conteúdo de* todo um frasco de 5 g de ácido 5,ó(R,S),7,8-tetrahidrofólico (Sigma? 69 por cento de pureza? Lote No. 117F~5®13) é suspenso em 20® ml de Tris-HQl ®,2 M/2—mercptoetanol ®,®5 M ípH 7,®) e dissolvido pela adição de aproximadamente 15 ml de hidróxido de potsâssio i Μ. A solução limpida é deitada na mistura anterior e juntamos água destilada íaproximadamente 2®® ml) para perfazer um total de 1,® L de mistura reaaente numa garrafa de vidro de 2 litros. -21-
Inicia-se a reacção por adição de 4 ml do extracto de enzima em bruto, contendo “Formiltetrshidrofolato sintetase" ÍFTHFS) e deixando prosseguir a reacção à temperatura ambiente (22°C). As amostras são periodicamente removidas para. vigiar o progresso da reacção por HPLC usando uma coluna de afse inversa CC-18) eluida com ácido térmico β51 íi e modificada, por metanol num gradiente linear de 12 a 25 por cento durante 3>3 minutos» 0 eluido da. coluna é vigiado a 282 . nm detectando ácido 556<R5S)5758-tetrahidroféIico aos 16 minutos» A reacção fica completa após 18 horas» Ao fim deste tempo, resta 48 por cento da quantidade original de ácido 5,ó<R?S)57?8—tetrahidrafólico coma determinado pelas áreas sob a curva. Calculamos um equivalente de 1585 mg de ácido l€s-formil-5?6S5758-tetrahidrofólico a partir da mistura reagente, do cromatograma HPLC representando 5,10-mete— niltetrahidrofolato» Isto corresponde a uma conversão de 92 por cento do valor teórico considerando que só 3450 mg de ácido 556ÍR?S5?7s8~tetrahidrofólica estarão disponíveis para a reacção de conversão enzimática» Cinquenta por cento do valor teórico é convertida aoós 5 horas» EXEMPLO 3
CONVERSaO DE ACIDO 10-FORMIL-5.ÓS.7.9-TETRAHIDROFóLICG EM ÁCIDO
5—FORMIL—5»68,7,8—TETRAHIDROFÓLICO A mistura reagente do Exemplo 2 ê vigiada durante mais um dia não revelando qsisquer mudanças na sua composição» Uma porção de Í0& ml da mistura ê transferida para uma garrafa de tres tubuladuras e o pH da solução ajustado a 6,5 com ácido sulfúrico» Enquanto desgasificamos com azoto, a garrafa é imersa num banho de água e aquecida a 9Φ-95°0 durante 2 horas» A reacção continua a seguir sob azoto a 40°C durante a noite» Esta mistura reagente tem um aspecto castanho após 16 horas» Uma amostra è ' ί ν λ Ν analizatía por HPLC usando uma coluna de fase inversa (C--18) eluida com ácido fórmico Θ, 1 M e modificada por metanol num gradiente linear de 12 a 25 por cento durante 30 minutos» 0 eluido da coluna é vigiado a 282 nm. A análise HPLC indica tuna velocidade de conversão de 9Ô,2 por cento, quando considerando áreas sob a curva, para os picos de ácido 5-formil—5,óS5 7,8·-·t^~ ΐΓahidΓOfólico» A área para o ácido 5,6R,7?8—tetrahidrofólico, que deveria ter permanecido invariável, é reduzida para 33,1 porcento em relação ao material de partida <48 por cento)» •Juntamos as amostras da mistura reagente através de uma bomba numa coluna preparativa HPLC de fase inversa (Dynamax A0A-C18, 8 micrometer, 2,1 x 3© cm) e a seguir desenvolvemos com 0,1 n de á eido fér mico 13 ml/ minuto durante 60 óS ,7,8- tetrahi tírofólico algi 82 pOf cento, o qual SOb cufn uma rotação òptica em ácido aquoso e metanol com um tinutos* Obtivemos ácido amarelo com um rendimento as condições de eluição acidicas <0,1 M de ácido fórmico aquoso e metanol) se deixa converter sm ácido 5f! 1 ft-meteni 1 -5,ó8,7,B-tetrahidrDfói ico o qual a seguir em repouso a uma concentração de 3 a 6 mg/ml forma um gel num frasco de recolha» A pureza enantiomérica desta amostra foi determinada por HPLC usando uma coluna chiral (Diacel Chira~ cel OD), eluindo isocráticamente com Θ,5 por cento de formato de amónio, pH = 3,8, e 25 por cento de metanol» Registamos um tempo de retenção de 15,2 minutos, fórmico como se seoues
D Α
Concentração C%) Rotação
Composto ísolução com 88% de ácido fórmico) <aifa D a 26gC) ácido 5,Í0-metenil~5, 63,7 ,8-te-trahidro- fólico ®,óíi -f-42 EXEMPLO 4
CONVERSÃO DE ACIDO 5.1Θ-ΜΕΤΕΝIL-5.ÒS.7.8-TETRftHiDRDFôLICD EM ÃCIDO 5-FP.RHIL-5.6S,7 * 8-TETRftNISROFáLICO E ACIDO 5.6R.7.8-TETRA-HIDROFÓLICO 0 pH do resto da mistura reagente conforme obtida no Exemplo 2 é ajustado de 8,0 a 5,0 com ácido sulfúrico, iniciando uma rápida cristalização de ácido í®-fòrmil-5-,6S,7,8—fcetrahidro-fólico em ácido 5,10-metenil-5,óS,7,8-tetrahidrofc>lico o qual a seguir por repouso à temperatura ambiente se hidroliza lentamente para formar ácido 5—formil—5,63,7,8—tetrahidrafólico. 0 último não é detectado. na mistura reagente antes do ajuste do pH. A reacção é vigiada por HPLC usando uma coluna de fase inversa <C~1B) eluida com ácidD fórmico ô,l M s modificada por metanol num gradiente linear de í'2 a 25 por cento durante 30 minutos* 0 controlo da reacção por HPLC revela que mais do que 7® por cento do ácido 5,10-metenil-5,6S,7,8-tetrahidrofólico foi convertido em ácido 5-formil-5s6S,7,8-tetrahxdrofólico após 5 dias à temperatura ambiente durante cujo tempo a concentração de ácido 5,6R,7,8-tetrahidrofólico na mistura reagente permanece invariável. Os produtos formilados obtidos na forma de ácido qjv $*·
ÓS„7.8-- 5-formil—5,6S,7,S—tetrahidrofélicQ e ácido 5,1@—metani1·
J -tetrahidrof óIícd5 e o áurido 59èR,7,8-tetrahidrofélico não formilado, são a seguir isolados por HPLC preparativa de coluna de fase inversa \Dynamax Ò0A-CÍ8. 8 micrometro, 2, i x 3Φ cm) , desenvolvidos com um gradiente de ácido térmico aquoso Θ,1 M e metanol com um caudal de 13 ml/minuto durante 6® minutos.
Os rendimentos determinados para as duas preparações (cada uma equivalente a 5Θ ml de misturas reagentes) são como se segue s
Composto Isolado tma)
Rendimento (%)
Rend. Relativo ácido 5,1®-meteni1-5,6S,' -tetrabidrofélicD C22.é) 1 tt 7 O ts u O/ ,Ο ácido 5-formi1—5,òtí,7,8--tetrahidrofólico (118.1 ácido 5,6R,/,8-tetrahi-fólico % (145*5) 83 41, SEÍCO para qual, S 0 ácido 5,6R,7,8-tetrahidrafélico isolado é imediatamente e formilado com ácido térmico (como descrito a seguir) obtermos ácido 5., l©-metenil-5,óR,7,8-tetrahidrofólico, o não como a forma 6S, cristaliza a partir do ácido térmico diluí do. -•S30\ EXEMPLO 5
FORMILftCgQ DE ACIDO 5.ÓR.7.8—TETRftHΣDROFÓLICO PARA OBTERMOS ÁCIDO 5.10-METANIL-5.ÓR.7,8-TETRAHIDROFÓLICO CRISTALINO
Uma amostra de 253 mg ds ácido 5,éR?7,8-tetrahidroféii~ co cromatograficamente purificado e liofilizado é dissolvida em 50 ml de ácido fórmico a 97 por cento, contendo 2 por cento de ácido trifluoroacético e deixada à temperatura ambiente na garrafa de reacção -sob atmosfera de azoto sem agitação». A reacção é analisada por HPLC usando uma coluna <C-Í8> de fase inversa, eluida com ácido fórmico aquoso 0,1 M, e modificada por metanol num gradiente linear de 12 a 25 por cento durante 3Θ minutos e vigiada a 282 nm» Após tres horas todo o ácido 5sóR?7,8~tetrahi~ drofólico tinha reagido como julgado pelo aparecimento de um novo pico representando o ácido 5,i0-metenil-556R?758-tetrãhidrDfólico no cromatograma HPLC» A totalidade do ácido fórmico é consequentemente removida por evaporação e juntamos lentamente 30 ml de ácido fórmico aquoso 0,1 M, com agitação ocasional da mistura» A solução é a seguir armazenada em sala arrefecida durante a noite» Formam-se agulhas finas amare Las, dando à solução o aspecto de um sólido» Recolhemos os cristais num funil de vidro cozido, lavamos com acetona, e secamos em vácuo originando 218 mg de material amarelo cristalino» A pureza enantiomérica do ácido o,10—metenil—5,6R,7,S--tetrahidrofólico é determinada usando uma coluna chiral <Diacel Chiracel 0D> eluida. isocráticamente com 0,5 por cento de formato de amónio, pH 3,8 e 25 por cento de metanol» 0 produto, ácido 5,IO—metenil—5sóR,7,8—tetrahidrofólico, foi eluido durante 18,2 minutos» de solução eíii A rotação ópiica determinada na forma ácido fórmico a 88 por cento, è como se segues
Concentração 17.) Rotação
Composto {solução com 88λ de ácido fórmico? Calfa D a 26°C? ácido 5,13-metenil-5, 6R57,8-te- trahidro— fólico 3,619 —47 EXEMPLO 6
DERIVATIZACSD DE ÁCIDO 5.6R,7.8-TETRAH1DROFáLICO MA PRESENÇA DE ACIDQ 5-FORMIL—5,6S. 7,8-TETRAHIDRQF6LICO E/PU ÁCIDO
5.13—METENIL—5.65.7,8-TETRAHIDROFáLICO
Modificando o processo apresentado por L, Rees, C. J. Suckling e H« C« S« Wood, J» Chem. Soc- Chem. Commun. 473 <1987), o í~)mentiIclorofarmato é adicionado a uma amostra da mistura reagente do EXemplo 4, ajustada a pH 7, o que ocasiona a carboxi-mentilação só do ácido 5,6R,7,8~tetrahidrafólica e deixa sem reagir o ácido 5,68,7,8-tetrahidrQfólico e/ou o ácido 5,13-mete-nil-5,«6S,7,8”tetrahidrofólico. A reacção foi vigiada por HPLC, Consegue-se uma separação efectiva do ácido 5-mentiIoxicarbonil--5,6R,7,8--tetrahidrofólico dos componentes que não reagiram, por passagem da mistura reagente sobre uma coluna carregada com XAD-2* 0 ácido 5-<nentiloxicarbonil-5,6R,7,S—tetrahidrofálico é absorvido pela resina e o ácido 5-formil-5,6S,7,8-tetrahidroféli-co ou o ácido 5,í3~métenil-5,6S,7,8“tetrahidrafólico passam
PURIFICAÇÃO DE ACIDO 5—FQRSilL—5.65.7.8-TETRftHIDROFáLICQ. ACIDO 5 ,6R«718-TETRAHIDROFÓLICQ E OUTROS DERIVADOS POR HPLC PREPARATIVA
Carregamos porções (50 ou ίθ© ml) da mistura reagente da Exempla 4 directemente numa coluna de fase inversa ÍDynamax 6©A—Cí8, 8 micrometer, 2,1 κ 3© cm) através de uma bomba de carga. e a seguir desenvolvemos com um gradiente -©,1 M de ácido fórmico aquoso e metanol com um caudal de 13 ml/minuto durante 6© minutos. Q gradiente usado começa com uma concentração de metanol de 5 por cento para atingir i© por cento após 12 minutos de operação. A concentração de 1© por cento de metanol é a seguir mantida constante durante os próximos 1© minutos em cujo tempo (22 minutos de operação) o nivel de metanol aumenta linearmente para atingir 18 por cento ao fim de 38 minutos e a partir dai aumenta roais para atingir 25 por cento ao fim de 52 minutos de operação. Esta concentração já não aumenta mais até ao fim da operação, O efluente da coluna é vigiado a 319 nm parque o 5«lô—metenil— -5,6S,7,8-tetrahi-áquele comprimento —5,é>S,7,8—tsítrahidrofolato e o ácido 5—formi drofòlico tem o mesmo coeficiente de absorpção de onda.
Sob estas condições preparativas o ácido 556R57s8-ts-trahidrofólico elui entre 11 e 17,5 minutos, ao passo que o ácido 5-formil-5?óS,7,8-tetrahidrofólico elui entre 39,5 e 44,5 minutos, A eluição da banda 5,l©-mstenil-5,óS,758-tetrahidrQfolato é fortemente dependente da concentração aparecendo entre 2© e 3© minutos como um pico arrastado» A banda de ácido 5,6R,7,8-tetra-hidrofólico e a banda de 5,i©-metenil-5,6S,7?8-tetrahidrofolato não podem ser corapletamente separadas quando carregamos 14© ml da mistura reagente, equivalente a 70© mg de material« -28-
fis bandas de eluição de ácido 5sôR5798-tetrshidrQfólico e ácido 5-formi1-5,6-3 =, 7 = 8-ietrahidrofólico são recolhidas em garrafas de vidro as quais são imersas em gelo seco de modo que o liquido pode gelar imediatamenfce. As fracçSes geladas são a seguir iiofilizadas para obtermos um pó branco acinzentada no caso de ácido 5 ?6R., 7,8-tetrahidrof ólico, e um pó branco amarelado no caso de ácido 5-forsiíil~5?óS57?8-tetrahidrofólico« ft análise HPLC é efsctuada sobre estes pós usando uma coluna de fase inversa (Dynamax 6€>Α~0'ί8Γ, 8 micrometro, 2,1 x 3€? cm) desenvolvida com um gradiente de ácido térmico aquoso 6,1 M e metanol. 0 ácido 5-farroil“5,óSs7s8-tetrahidrofólico prova~se ser 97 por cento puro e o ácido 5,6R ,7,8-tetrahidrofélico prova-se ser 93 por cento puro. pelas áreas abaixo da curva. Par causa da instabilidade do ácido 5,6R,7,8-tetrahidrofólico, converte-se por formilação quimica no ácido 5. l€>-metenil-556R?758-tetrahidrofólico mais estável. Para contrariar qualquer problema de instabilidade do ácido 5-formi1-5 5 63,7 5 8-tetrahidrofólico , este compostos é convertido no seu sal de cálcio como descrito no Exemplo 8. EXEMPLO 8
FREFARftçaP DE 5-F0RHIL-5»63.7.8-TETRAHIDRQFOLATQ DE CÁLCIO 00 DE 5-FQRMIL-5.6R.7.8-TETRAHIDR0F0LAT0 DE CÁLCIO
Na modificação do processo publicado por C. Temple, Jr„5 R= D. Elliott, J. D. Rase e J» A. Montgamery, J» Med. Chem„, 223 731 (1979) para produzir c 5-formil-5.,ó(R,S> ,7,8-tetrahidro foiato de cálcio racémico, o ácido 5-formiI“5sóS57s8-tetrahidra-félico é lavado com éter para remover o formato de amónio possível. Dissolvemos a seguir 62 mg do material lavado em 32 ml de metanol desgasificado (ácido folinico sem sal é bem solúvel em metanol) aos quais juntamos cerca de 1 ml de solução metanólica de cloreto de cálcio» A adiçlo do sal faz com que haja a formação imediata de um precip funil ds vidro reco secaqeai é de 6Θ,5 mq itado zido e (9© por
quase branco o qual seco em vácuo» 0 cento do rendimento ê recolhido rendimento teórico)»
num :i pQS jn,
Se repetirmos este processo com os materiais obteremos o 5—formil~5,6R,7,8—tetrahidrofolôto de cálcio» A pureza dos- compostos preparados é determinada por UV/HPLC independentemente da presença ds qualquer matéria não absorvente de UV» A pureza enantiomérica é determinada na etapa dos derivados 5, 10-metenil~5,ó<R,S> ,7?8-tetrahidrofaIato por HPLC usando uma coluna chiral (Diacel Chiracel OD) eluida isocrática-mente com ©,5 por cento de formato de amónio pH 3,8 e 25 por cento de metanol» 0 ácido 5» í€í--metenii-5,6S,7,8-tetrahidrof ólico elui primeiro com 15,2 minutos de tempo de retenção, ao passo que o ácido 5,10—metenil-o,6R,/,8—tetrahidrofóli elui com 18,2 minutos de tempo de retenção»
As soluções dos compostos preparados em acido fórmico em vez de em ácido hidroclórico í© M ou 12 li, como assinalado na literatura, foram usadas para registar as suas propriedades de rotação óptica, por causa da acidicidade reduzida do ácido fórmico e do seu crescente poder dissolvente para os folatos» As amostras das preparações anteriores mostram as rotações ópticas seguintess
Concentração (/* 5 Rotação
Composto (solução com 88% de ácido fórmico) (alfa D a 26°C) ác.ido 5 5 10 metenil-o, éS5 7,8-te-trahidro-fólico $ ácido 5,,10-metenil-S, 6R 5 7 5 8-te-trahidro-fólico f* ,611 4-42
€*?óÍR —47 t Cromatogrâficamente isolado na forma de ácido 5-formii·-5s6S37,8-1etrahia'ro f ά 1 i c o ? o qual por repouso na mistura de ácido fórmico Ô91 M eluida se converte em ácido 5,Í0-metenil-5?6S»7j8-tetrahidrofólico e a seguir solidifica para formar um gel o qual foi liofilibado*
Originalmente isolado na forma de ácido SjóRs^jS-tetrahidrofólica não convertido5 o qual após liofilização foi imedialamente formilado com ácido fórmico como antes descrito* Recolhemos o ácido 5,1 0-me ieni 1 -5,6R,,7,,S— t e trahidrofólico o qual cristalizou a partir da mistura de ácido fórmico diluido, lavou-se com acetona, e secou-se em vácuo* Dos 253 mg de ácido 55òR3/,8-tetrahidrofólico <em peso>5 recolhemos 218 mg de ácido 5,10—metenxl—556R5758—tetrahidrofólico (em peso).
EXEMPLO 9
PREPftRftuSO DE ÁCIDO FORrIILFóLICO E DERIVftDQS RftDIOET1OUETADOS 2 por substituição rad ioet iauetado ou.
Se repetirmos o processo do fcxamplo de formato de amónio com formato de amónio qualquer outro derivado de ácido mos um ácido 1β-formi1-5?68, 7.8-Se este for submetido aos proces obteremos os correspondentes áci fórmico radioetiquetado? obtere-tetrahidrofólico radioetiquetado» sos dos Exemplos 3-S? inclusivé? dos e sais radiostiquetados..
As patentes3 publicações e métodos de teste acima mencionados? são aqui incorporados para referencia. A descrição detalhada, anterior sugerirá muitas variações óbvias aos especialistas desta arte, Por exemplo? em vez de leucovorin de cálcio? podemos produzir a leucovorin de estroncio e a leucovorin de sódio» 0 tetrahidrofolato formilase pode ser elaborado por Clostridium acidi-urici« Todas estas modificaçSes óbvias estão dentro do âmbito global pretendido das reivindicações επί anexo -. ν\
REIVIMDICfiCSES 13 a — Processo pare. a preparação de um diastereoisómero <òR ou 6S) desejada substanciaimente puro de um derivado de ácido 5,6(R ou B),7,8-tetra-hidrofólico, ou de um seu sal ou éster, caractericado por compreender os passos de s (a) formilacao enzimatica da forma 6S de uma mistura ÚS é eido tetra—hid ro Irof ó 1 ico substitu ído !e modo a formar uma ! ido 10— formi1-5?è S ? — seu sal ou éster p o . ico ru nSo reagiu ou ou ae um um se ?u sa 1 ou éster se prSSSfs tS ρ o ác id u , ;._í · \ , / ?a~ — tetr a—hidrof ólico que nao reagiu e um s eu sal ou éster| e ou U) separaçS o do ácido 1® —formi 1- .*=- 63 h / sB-tet ra- -hidrofó lico ou de um seu sa 1 OU ssu éster a partir de ácido 10 -formi 1- 5:, èR, 7 ,8-tet ra- —hidrafálico ou de um seu sai ou éster e a seguir ciclização e hidrólise do referido ác ido i 0-formi I -5,6S7,8- te tra-hid rofó 1 ico ou de um seu sal ou éster de modo a formar ácido 5=1ô—meteni1—5 5 6S s 7 = 8—tetra—hidrofó1ico 5 ou ácido 5—form.il—5-,é>Sj7sS—tetra—nidrofólico ou seus sais ou ésteres5 ou - ambos dos anteriores i ou (2) ciclizaçSo e hidrólise do referido ácido 1 ®—f ormi 1 —5, óS, 7, S—tetra—hid raf 61 ico ou um
Claims (1)
- Β seu sai ou éster de modo a formar o ácido 5 5 i Θ-me teni1-5,68 ,7,8-tet ra-hi d rofó1ic o , ou J 5—f armi i -5,6S, 7, 8—fcetra-hidrafá I ica ou. seus sais ou ésteres? ou ambos dos anteriores, na presença, de ácido 5,68,7,8—tetra—hidrofólico ou um seu sai ou éster; e a seguir ou Ci> derivatização do ácido 5,6R,7,8-tetra-—hidrofélíco ou um seu sal ou éster de modo a formar ácido 5,6R,7,8~tetra-hi-drofélico 5-substitudo ou. um seu. sai ou éster e a seguir separação dos componentes, ou alternativamente <ii> separação de qualquer ácido 5,ίΦ-mets— ni i—5,68,7,8—tetra-hi drofólico ou qualquer ácido 5-formi1-5,68,7,8-tetra-—hidrof61ico ou seus sais ou ésteres a partir de ácido 5,68,7,8—tetra—hidrof6— lico ou um seu sai ou éster? e após separação, se for desejado da -formilação, ciclização, e hidrólise do referido ácido 5,.6R,7,8—tetra— -hidrofólico que não reagiu ou um seu sal ou seu éster de modo a produzir ácido 5-formi1--5,68,7,8-tetra-hidrofólico ou um seu sal ou éster, ou, alternativamente, a derivação do referido ácido 5,6R,7,8-tetra-hidrofólico ou de um seu. sal ou éster com outros grupos funcionais de modo a formar ácido 5,6R,7,8~ —tetra—hidrofólico 5—substitudo ou. um seu. sal ou éster? e, se for desejado \ Cc> conversão do ácido 5-farmil-5gô3,7,8~tetra~hidra··-fálico substancialmente puro ou um seu sal ou éster ou do ácido 5-fori-nil~556R57s8-tetra-hidro-fólico ou um seu sal ou éster no ácido, sal ou éster correspondente» 2ã» - Processo de acordo com a Reivindicação 1, carácter içado por a encima usada para a formilação selectiva compreender uma tetra-hidrofolato formilase» 3ê» - Processo de acordo com a Reivindicação 2, carac-terisa.do por a referida tetra-hidrofolato formilase ser elaborada por Clostridium sp« ATCC No» 79Ô5, ou um seu mutante. 4§» - Processo de acordo com a Reivindicação 1, caraf-tsriçado por a formilação química do ácido 5,èR,758~tetrâ-hidrQ... fólico que não reagiu ser efectuada com ácido fôrmico na presença de carbodi-imida. 5â. - Processo de acordo com a Reivindicação í, carar--. teriçado por o passo de conversão (c) compreender a conversão derivado de ácido fólico no sal correspondente» óâ = - Processo de acordo com a Reivindicação 5, carac„ terizado por o referido sal compreender um sal de cálcio, um sai de magnésio, um sal de estrôncio, um sal de ferro, ou misturas ^ quaisquer dos anteriores» 7§U - Processo de acordo com a Reivindicação 1, carar— terizado por a referida formilação encimàtica ser efectuada πυ.^ mistura reagente contendo um ácido fôrmico radiomarcado ou ^ equivalente químico» 8§, — Processo para. a preparação do desejado ácido 5~* formil-5s6SP 7 í 8-tetra-hidrofólico substancia1mente puro? ou de y*n seu sa 1 ou ésters caracterisado por compreender os pass: os des •in ds uma mistura PormilaçSD enzimática da fc de diastereoisómeros 6R e 68 de ácido tetra—hidro— •fálico ou de um seu sal ou éster de modo a formar uma mistura compreendendo o ácido lô-fonnil··· -5sá>S575S-tetr5-hidrofàlicD ou um seu sal ou ésterρ o ácido 53òS57s8-tetra-hitírafólico que não reagiu ou um seu sal ou éster se presentes o ácido 556R5 73 8-tetra-hid rofé 1 ico qu.e não reagiu ou um seu sal ou ésters e referido ácido 1€>—for— ico ou de um seu sal ou o ác ido 5 η 1 €í~íi?e ten i 1 -5 ou 5-formil-556S,7?8~ ciclização e hidrólise do mi1-5$68 5 7 5 8-tetra—hidrof61 éster de modo a formar -•568 9 7 5 8-tetra—hidrof ól ico ses is na pr ou um sais OU. ésteres 4 ou. sença de s. c x d o íd 5 íjR g seu. sal ou seu ésterp -tetra—hidrofól,ico ou ambos dos anteriores, 7 ? 8—tetra-hidrofólico e a seguir íc separação de qualquer ácido 5,l@-metenil—5?óS?7?8- -tetra- -hidrofólic :o ou ds seus sais ou ésteres a partir de ácido S AR *7 R- w J Uw ς t q Q -tetra -hidrofólico ou de um seu sa 1 ou éster p e iXpOtH- -separação ? se o desej armos conversão do ácido 5-formil-55áSf.798-fólico substancialmente puro ou de um £?S*C©r OU do t e t r a - h i d r o-seu sa1 ou ácido ,w'W 5-formi1 -5 r, 6N ? 7,8-tetra-hidru f ó l ico ou de um seu sal ou éster no árido, sal ou éster correspondente „ t 9ã= — Processo de a.cordo com a Reivindicação S, ca.rac— terizado por a enzima usada para a formilação selectiva compreender uma tetra—hitírofolato formilase» 1 ô§ „ - Processo de acordo com a R terizado por a referida tetra-hidrofolato por Clastridium sp = ATCC Na» 7905, ou u.m s eivindicaçso formi1ase ser eu mu tan te» 9? el carcsc— aborada ilá» — Processo de acordo com a Reivindicação S, carac-terizado por o passo de conversão Cd) compreender a conversão do derivado de ácido fálico no sal correspondente» 12ã» - Processo de acorda com a Reivindicação 11, caracterizado por o referido sal compreender um sal de cálcio, sal de magnésios sal de estrôncio» sal de ferro, ou misturas de quaisquer dos anteriores» Lisboa. 7 de Dezembro de 199€sJ. PEREIRA DA CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VtCTOR CORDON, 10-A 3.® 1200 USBOA
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