PL167781B1

PL167781B1 - A method of constructing a recombinant vector for the cloning and / or expression, in host cells, of a polypeptide that is a fragment of human protein C

Info

Publication number: PL167781B1
Application number: PL30495990A
Authority: PL
Inventors: Iwona Fijalkowska-Gorzka; Czeslaw Cierniewski; Andrzej Plucienniczak; Grazyna Plucienniczak; Wojciech J Stec; Genowefa Goss; Andrzej Wilk
Original assignee: Pan; Pancentrum Mikrobiologii I Wirusologii
Priority date: 1990-10-24
Filing date: 1990-10-24
Publication date: 1995-11-30

Abstract

1. Sposób konstruowania zrekombinowanego wektora do klonowania i/lub ekspresji, w komórkach gospodarza, polipeptydu stanowiącego fragment ludzkiego białka C przez łączenie fragmentów DNA, znamienny tym, że wektor łączy się z DNA kodującym polipeptydem o wzorze (X)c-A-(Z)b, w którym X oznacza peptyd łączący, korzystnie Phe, Asp, Pro; c oznacza 0 lub 1, A oznacza sekwencję odpowiadającą fragmentowi ludzkiego białka C, obejmującemu aminokwasy w pozycji 56 - 119 łańcucha ciężkiego ludzkiego białka C, zdolną do wytwarzania przeciwciał reagujących specyficznie z białkiem C oraz z tym polipeptydem, a mianowicie: - Met - Asp - Glu -S e r - Lys 61: -L ys - Leu - Leu- Val - Arg - Leu - Gly - Glu - Ty-- Asp 71: -Leu- Arg - Arg - Trp - Glu -Lys - Trp - Glu - Leu- Asp 81: -Leu- Asp - Ile - Lys - Glu-Val - Phe- Val - His- Pro 91: -Asn - Tyr - Ser - Lys - Ser -Thr - Thr- Asp -Asn- Asp 101: - Ile - Ala - Leu - Leu - His -Leu - Ala - Gln - Pro - Ala 111: -Thr- Leu - Ser - Gln - Thr - I 1 e - Val- Pro - Ile-, Z oznacza sekwencję uzupełniającą, korzystnie Met i/lub sekwencję kodowaną przez fragment polilinkera, b oznacza 0 lub 11. A method of constructing a recombinant vector for cloning and/or expressing, in host cells, a polypeptide constituting a fragment of human protein C by linking DNA fragments, characterized in that the vector is linked to DNA encoding a polypeptide of the formula (X)c-A-(Z)b, wherein X is a linking peptide, preferably Phe, Asp, Pro; c is 0 or 1, A is a sequence corresponding to a fragment of human protein C, comprising amino acids at position 56-119 of the heavy chain of human protein C, capable of producing antibodies specifically reactive with protein C and with this polypeptide, namely: - Met - Asp - Glu -S e r - Lys 61: -L ys - Leu - Leu- Val - Arg - Leu - Gly - Glu - Ty-- Asp 71: -Leu- Arg - Arg - Trp - Glu -Lys - Trp - Glu - Leu- Asp 81: -Leu- Asp - Ile - Lys - Glu-Val - Phe- Val - His- Pro 91: -Asn - Tyr - Ser - Lys - Ser -Thr - Thr- Asp -Asn- Asp 101: - Ile - Ala - Leu - Leu - His -Leu - Ala - Gln - Pro - Ala 111: -Thr- Leu - Ser - Gln - Thr - I 1 e - Val- Pro - Ile-, Z is a complementary sequence, preferably Met and/or a sequence encoded by a polylinker fragment, b is 0 or 1

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób konstruowania zrekombinowanego wektora do klonowania i/lub ekspresji w komórkach gospodarza polipeptydu stanowiącego fragment ludzkiego białka C, zdolnego do produkcji przeciwciał reagujących specyficznie z ludzkim białkiem C oraz z tym polipeptydem i/lub reagującego specyficznie z przeciwciałami dla ludzkiego białka C oraz z przeciwciałami dla tego polipeptydu.The present invention relates to a method of constructing a recombinant vector for the cloning and / or expression in host cells of a polypeptide constituting a fragment of human protein C, capable of producing antibodies reactive specifically with human protein C and with this polypeptide and / or reacting specifically with antibodies to human protein C and with antibodies to that polypeptide.

Jednym ze znanych sposobów konstruowania wektorów jest łączenie odpowiednich fragmentówOne known way to construct vectors is to join the appropriate fragments

DNA.GOUT.

Białko C należy do rodziny białek zależnych od witaminy K. Aktywne białko C jest silnym czynnikiem an1ykwagulacykeym działającym na poziomie czynników Va ο VIII podczas krzepnięcia. Ma także swój udział w procesie f^^no^zy skrzepu poprzez wpływ na poziom aktywatora plazmknogenu we krwi (P.C.Comp, R.R.Nixon, C.T.Esmon, Blood, 63, 1984, 15-21). Niedobór białka C zaobserwowano w przypadkach głębokiej zakrzepicy żylnej i tętniczej, zatoru płucnego, zawału mięśnia sercowego, zespołu rozsianego krzepnięcia śróZnaczyekowego i innych (R.A.Malar, Seminars ón Thromb. Hemost., 11, nr 4, 1985, 389-392).Protein C belongs to the vitamin K-dependent protein family. Active C protein is a potent antiquagulant factor acting at the level of factors Va and VIII during clotting. It also participates in the clot process by influencing the level of plasmogene activator in the blood (P.C.Comp, R.R.Nixon, C.T.Esmon, Blood, 63, 1984, 15-21). Protein C deficiency has been observed in cases of deep venous and arterial thrombosis, pulmonary embolism, myocardial infarction, disseminated vascular coagulation syndrome and others (R.A.Malar, Seminars ón Thromb. Hemost., 11, No. 4, 1985, 389-392).

Poziom białka C oznacza się kilkoma metodami, które podzielić można na trzy grupy. Do pierwszej grupy należą metody wykorzystujące antykwagulacykne właściwości białka, jedna z nich polega na oznaczaniu białka C przy użyciu trwmrwmwdulkey z płuc królika do hamowaniaThe level of protein C is determined by several methods, which can be divided into three groups. The first group includes methods that make use of the anticoagulant properties of the protein, one of which is the determination of protein C using the persist mrwmwdulkey from rabbit lung to inhibit

167 781 aktywności prokoagulacyjnej trombiny i jednoczesnego stymulowania aktywności białka C. Tak zaktywowane białko C wpływa na czas tworzenia skrzepu przy udziale tromboplastyny aktywowanej kaoliną i kefaliną (Kaolin-cephalin activated Partial Thromboplastin Time-PTT, R.B.Francis, Thromb. Res., 37, 1986, 337-340). Różne odmiany tej metody wykorzystują wpływ aktywnego białka C na tworzenie się skrzepu po aktywacji trombinowej (H.Vinazzer, U.Pengraz, Thromb-. Res, 46, 1987, 1-8), gdzie do aktywacji trombiny używa się różnych czynników takich jak kaolina, cefalcplastyna, aktyna czy pathrombin. Bada się także udział białka C w tworzeniu skrzepu pod wpływem protrombiny i prokonwertyny (Prothrombin-prokonvertin tome, P-P, R.B.Francis, Thromb. Res., 37, 1986, 337-340). Zauważono również, że białko C powoduje zmniejszanie liczby miejsc receptorowych dla czynnika Xa i wpływa na zdolność płytek do przekształcania protrombiny (Platelet Prothrombin-Converting Activity, P.C.Comp, C.T.Esmon, Blood, 54, nr 6, 1979, 12721281). W wymienionych metodach ilość aktywnego białka C w próbie badanej odczytuje się z krzywych kalibracyjnych.The pro-coagulatory activity of thrombin and the simultaneous stimulation of the activity of protein C. This activated protein C influences the clotting time with the participation of kaolin and kephalin-activated thromboplastin (Kaolin-cephalin activated Partial Thromboplastin Time-PTT, RBFrancis, Thromb. Res., 37, 1986). , 337-340). Variations of this method take advantage of the effect of active protein C on clot formation after thrombin activation (H. Vinazzer, U. Pengraz, Thromb-. Res, 46, 1987, 1-8), where various factors such as kaolin are used to activate thrombin. , cephalcplastin, actin or pathrombin. The involvement of protein C in clot formation under the influence of prothrombin and proconvertin is also investigated (Prothrombin-prokonvertin tome, P-P, R.B. Francis, Thromb. Res., 37, 1986, 337-340). Protein C has also been noted to reduce the number of factor Xa receptor sites and affect the ability of platelets to convert prothrombin (Platelet Prothrombin-Converting Activity, P.C.Comp, C.T.Esmon, Blood, 54, No. 6, 1979, 12721281). In these methods, the amount of active protein C in the test sample is read from the calibration curves.

Druga grupa metod oznaczania białka C wykorzystuje jego właściwości amidolityczne. Aktywne białko C powoduje rozkład substratu barwnego, co można badać spektrofotometrycznie. Jako substraty służą tu: pGlu-Pro-Arg-MNA, S-2222, S-2238, S-2251, S-2266, S-2302, S-2314, S-2366, S-2444 (H.Vinazzer, U.Pengraz, Thromb.Res., 46, 1987, 1-8). W tej grupie metod do aktywacji białka C używa się kompleksu trombina-trombomodulina (P.C.Comp, Blood, 23, 1987, 86-92), albo pewnych frakcji otrzymywanych z jadów węży (H.Vinazzer, U.Pengraz, Thromb.Res., 46, 1987, 1-8) oraz (W.Kisiel, Clin.Invest., 4, 1979, 761 - 769).The second group of methods for the determination of protein C uses its amidolytic properties. Active C protein decomposes the colored substrate, which can be examined spectrophotometrically. The following substrates are: pGlu-Pro-Arg-MNA, S-2222, S-2238, S-2251, S-2266, S-2302, S-2314, S-2366, S-2444 (H. Vinazzer, U Pengraz, Thromb. Res., 46, 1987, 1-8). In this group of methods, the thrombin-thrombomodulin complex (PCComp, Blood, 23, 1987, 86-92) or certain fractions obtained from snake venoms (H. Vinazzer, U Pengraz, Thromb.Res., 46, 1987, 1-8) and (W. Kisiel, Clin. Invest., 4, 1979, 761-769).

Wśród ssosowanych metod immunologicznych oznaazania poziomu białka C jako antygenu wyróżnia się kilka rodzajów. Należą do nich metoda radioimmunologiczna polegająca na wiązaniu białka C z przeciwciałami znakowanymi radioaktywnym jodem (R.M. Bertina, A.W. Broeckmans, et al., Thromb.Haemost., 1982), metoda immunoradiometryczna (R.M. Bertina, A.W. Broeckmans, et al., Thromb.Haemost., 57, nr 1, 19B7, 112-117), oraz testy enzymoimmunologiczne (H.Vinazzer, U.Pengraz, Thromb.Res., 46, 1987, 1-8), czy metody immunoblotingu (M.Heeb, P.Schwartz, Tromb. Res., 52, 1988, 33-43).There are several types of immunological methods for determining the level of protein C as an antigen. These include the radioimmunological method involving the binding of protein C to radioactive iodine-labeled antibodies (RM Bertina, AW Broeckmans, et al., Thromb. Haemost., 1982), the immunoradiometric method (RM Bertina, AW Broeckmans, et al., Thromb. Haemost. ., 57, no. 1, 19B7, 112-117), and enzyme-immunological tests (H. Vinazzer, U Pengraz, Thromb. Res., 46, 1987, 1-8), and immunoblotting methods (M. Heeb, P. Schwartz, Tromb. Res. 52, 1988, 33-43).

Białko C stosowane w wymienionych metodach służące do iemunizacJi, a dalej do uzyskania przeciwciał na ogół izoluje się z plazmy ludzkiej za pomocą absorpcji na cytrynianie baru, elucji, frakcjonowaniu w siarczanie amonu, chromatografii, a następnie elektroforezy preparatywnej w żelu poliakΓyloamedowym. Wydajność metody wynosi 5 mg białka z 15 litrów plazmy, a stężenie bia^k na posscczeginych eft^ac ooczyszcana oznaacz się metodą aktywacji ttombii nowej (PTT) (W.Kisiel, J.Clin.Invest., 64, 1979, 761-769).Protein C used in the aforementioned methods for immunization and then for obtaining antibodies is generally isolated from human plasma by barium citrate absorption, elution, ammonium sulfate fractionation, chromatography followed by preparative polyacrylate gel electrophoresis. The yield of the method is 5 mg of protein from 15 liters of plasma, and the concentration of protein on the puri? Ed effects is determined by the method of nova ttombia activation (PTT) (W. Kisiel, J. Clin. Invest., 64, 1979, 761-769 ).

Opisana wyżej metoda otrzymywania białka C jest czasochłonna, skomplikowana i kosztowna, co w znazanye stopniu zawyża koszt całego testu. Otrzymywanie całej cząsteczki białka metodą biotechnologiczną jest także trudne do przeprowadzenia i kosztowne.The method of obtaining protein C described above is time-consuming, complicated and expensive, which significantly increases the cost of the entire test. Obtaining the entire protein molecule by biotechnology is also difficult and expensive.

Nieoczekiwanie okazało się, że można przeprowadzić ozyazcanle ilościowe ludzkiego białka C z dużą dokładnością w oparciu o metodę, w której stosuje się fragment pznapepOydowc zawierający arekoelanowαny wektor wytworzony sposobem według wynalazku. Stwierdzono, że można wykorzystać pełną reakcję krzyżową w teście imeunzlogizzncm przeciwciał otrzymanych dla fragmentu białka oraz dla całej cząsteczki białka C.Surprisingly, it has been found that quantitative human protein C can be performed with high accuracy on the basis of a method which uses a pseudapepOydov fragment containing an arecoelan vector produced by the method of the invention. It was found that full cross-reactivity in the immunological test of the antibodies obtained for the protein fragment and for the whole protein C molecule can be used.

W odróżnieniu od znanych metod, fragment pzlipeptydzwy kodowany przez arekzebinowαyy wektor wytworzony sposobem według wynalazku, a nie całe białko, służy do produkcji przeciwciał rozpoznających w ten sam sposób zarówno ten fragment jak i rodzime białko C. Fragment ten również stosuje się do uzyskania krzywej wzorcowej oraz do zayazzayla przeciwciał dla ludzkiego białka C.Contrary to known methods, the pzlipeptide fragment encoded by the arequebine vector of the invention, and not the whole protein, serves to produce antibodies that recognize both this fragment and the native C protein in the same way. This fragment is also used to obtain the standard curve and to zayazzayla antibodies to human protein C.

Sposób konstruowania arekomlinzwanego wektora do klonowania i/lub ekspresji w komórkach gospodarza pzlipeotydu stanowiącego fragment ludzkiego białka C przez łączenie fragmentów DNA, według wynalazku polega na tym, że wektor łączy się z DNA kodującym ozlaoeotcd o wzorze (X)c-A-(Z)b, w którym X oanαcaα peptyd łączący, korzystnie Phe, Asp, Pro; c zanαzaα 0 lub 1,The method of constructing an arecomlin so-called vector for cloning and / or expression in host cells of a pzlipeotide fragment of human protein C by joining DNA fragments, according to the invention, consists in linking the vector to DNA encoding ozlaoeotcd of formula (X) cA- (Z) b, wherein X oanαcaα a linker peptide, preferably Phe, Asp, Pro; c zanαzaα 0 or 1,

A oayazaa sekwencję odpowiadającą fragmentowi ludzkiego białka C, obejmującemu aminokwasy w pozycji 16 - 119 łańcucha ciężkiego ludzkiego białka C, zdolną do wytwarzania przeciwciał reagujących specyficznie z białkiem C oraz z tym pzllpeptydem, a elanzwazae:A oayazaa is a sequence corresponding to a fragment of human protein C, comprising the amino acids at positions 16-119 of the heavy chain of human protein C, capable of producing antibodies reactive specifically with protein C and this pz11peptide, and elanzwazae:

167 781167 781

-Met-Asp-Glu-Ser-Lys 61: -Lys-Leu-Leu-Val-Arg-Leu-Gly-Glu-Tyr-Asp-Met-Asp-Glu-Ser-Lys 61: -Lys-Leu-Leu-Val-Arg-Leu-Gly-Glu-Tyr-Asp

71: -Leu-Arg-Arg-Trp-Glu-Lys-Trp-Glu-Leu-Asp71: -Leu-Arg-Arg-Trp-Glu-Lys-Trp-Glu-Leu-Asp

81: -Leu-Asp-Ile-Lys-Glu-Val-Phe-Val-His-Pro81: -Leu-Asp-Ile-Lys-Glu-Val-Phe-Val-His-Pro

91: -Asn-Tyr-Ser-Lys-Ser-Thr-Thr-Asp-Asn-Asp91: -Asn-Tyr-Ser-Lys-Ser-Thr-Thr-Asp-Asn-Asp

101: -Ile-Ala-Leu-Leu-His-Leu-Ala-Gln-Pro-Ala101: -Ile-Ala-Leu-Leu-His-Leu-Ala-Gln-Pro-Ala

111: -Thr-Leu-Ser-Gln-Thr-Ile-Val-Pro-Ile-,111: -Thr-Leu-Ser-Gln-Thr-Ile-Val-Pro-Ile-,

Z oznacza sekwencję uzupełniającą, korzystnie Met i/lub sekwencję kodowaną przez fragment polilinkera, b oznacza 0 lub 1.Z is a complementary sequence, preferably Met, and / or a sequence encoded by a polylinker fragment, b is 0 or 1.

Zgodnie z wynalazkiem wektor łączy się z syntetyzowanym chemicznie DNA kodującym polipeptyd o wzorze jak wyżej.According to the invention, the vector is combined with a chemically synthesized DNA encoding a polypeptide of formula as above.

Korzystnie stosuje się wektor zawierający zsyntetyzowany chemicznie DNA odpowiadający cDNA o sekwencji:Preferably a vector is used containing chemically synthesized DNA corresponding to a cDNA having the sequence:

AA TTC G/AT CCA ATG GGA GAG TCC AAG AAG CTC CTT GTC CGCAA TTC G / AT CCA ATG GGA GAG TCC AAG AAG CTC CTT GTC CGC

CTT GGA GAG TTJ GAC CCG CGG CCC TGG GAG AAG TGG GAG CTGCTT GGA GAG TTJ GAC CCG CGG CCC TGG GAG AAG TGG GAG CTG

GAC CTG GAC ATC AAG GGA GTC TTT GTC CAC CCC AAC TAC AGCGAC CTG GAC ATC AAG GGA GTC TTT GTC CAC CCC AAC TAC AGC

ACC ACC GAC AAT GAC AAT GAC ATC GCA CCG CTG CAC CTG GCCACC ACC GAC AAT GAC AAT GAC ATC GCA CCG CTG CAC CTG GCC

CAG CCC GCC AAC CTC TC CAG AAC ATA GTG CCC ATC ATG TACAG CCC GCC AAC CTC TC CAG AAC ATA GTG CCC ATC ATG TA

Otrzymanym sposobem według wynalazku, zrekombinowanym wektorem, transformuje się komórki gospodarza, które hoduje się i wyodrębnia z nich białko o wzorze jak wyżej, po czym ewentualnie rozbija się na fragmenty o wzorach (Y)a-(X)C- oraz A-(Z)b- Białko to zawiera DNA kodujące polipeptyd o wzorze (Y)a-(X)c-A-(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, Y oznacza białko nośnikowe kodowane przez fragment wektora, korzystnie Met 1-Val 444 β-galaktozydazy i/lub sekwencję kodowaną przez fragment polilinkera, korzystnie Gln, Gly, Glu, Leu, Glu; a=0 lub 1.The recombinant vector obtained by the method according to the invention is transformed into the host cells, which are cultured, and the protein of formula as above is isolated from them, and then optionally broken into fragments of the formulas (Y) a- (X) C- and A- (Z ) b- This protein comprises DNA encoding a polypeptide of formula (Y) a- (X) cA- (Z) b, in which the symbols have the above meanings, Y represents a carrier protein encoded by a vector fragment, preferably Met 1-Val 444 β -galactosidases and / or a sequence encoded by a polylinker fragment, preferably Gln, Gly, Glu, Leu, Glu; a = 0 or 1.

Opisanym wyżej sposobem wytwarza się fragment polipeptydowy o dużej hydrofilowości łańcucha ciężkiego ludzkiego białka C, o sekwencji okreśoonej symbolem A.The method described above produces a polypeptide fragment with high hydrophilicity of the heavy chain of human protein C with the sequence described by the symbol A.

Ze względu na powierzchniowe ułożenie, region ten może zawierać determinanty antygenowe. Jest to także obszar o specyficznej sekwencji aminokwasowej, w odróżnieniu od pozostałych obszarów, które wykazują znaczne podobieństwo do innych białek z grupy zależnych od witaminy K. Charakterystyczne dla centrum aktywnego preteaz serynowych są aminokwasy: His 54, Asp 100 i Ser 203 łańcucha ciężkiego (G.Plutzki et al., Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 83, 1984, 546556). Otrzymany fragment stanowi część centrum katalitycznego.Due to the surface arrangement, this region may contain antigenic determinants. It is also an area with a specific amino acid sequence, unlike other areas that show significant similarity to other proteins from the vitamin K-dependent group. The amino acids His 54, Asp 100 and Ser 203 of the heavy chain (G . Plutzki et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 83, 1984, 546556). The fragment obtained is part of the catalytic center.

Sekwencja nukleotydowa cDNA dla białka C jest znana, (R.J.Beckman et al., Nucleic Acid Res., 13, nr 14, 1985, 5233-5247).The nucleotide sequence of the cDNA for protein C is known (R.J. Beckman et al., Nucleic Acid Res., 13, No. 14, 1985, 5233-5247).

W procesie według wynalazku, gen kodujący polipeptyd o wyżej określonym wzorze (X)c-A-(Z)b można skonstruować z fragmentów oligonukleotydowych zsyntetyzowanych chemicznie. Fragmenty oligonukleotydowe można zsyntetyzować chemicznie na nośniku poprzez kolejne przyłączanie nukleozydów z zablokowanymi grupami czynnymi. Korzystnie do ochrony funkcji aminowej stosuje się grupę izopropoksyacetylową, co przedstawiono w opisie patentowym polskim nr 157 777. Frrgmenty oligonukleotydowe zsyntetyzowane chemicznie poddaje się enzymatycznej reakcji kinazowania, w trakcie której wprowadza się fosforan na końcach 5' za pomocą kinazy polinukleotydowej i ATP. Kinazowane oligonukleotydy liguje się in vitro w dwuniciowe odcinki ograniczone sekwencjami rozpoznawanymi przez enzymy restrykcyjne, korzystnie Eco RI i Hind III. Zligowane odcinki namnaża się w wektorze do klonowania, stosując właściwe miejsce restrykcyjne polilinkera. Stosować można różne wektory np. plazmidowe, fagowe, przy czym korzystne są plazmity, np. plazmid pUC-19. Sklonowane wektory z odcinkami DNA namnaża się w komórkach gospodarza, którymi mogą być bakterie, drożdże ltp. Wektory z wklonowanymi odcinkami izoluje się, a następnie odcinki odzyskuje się przez trawienie restrykazami i rozdzielenie otrzymanych odcinków e-ektroforetyczme. Odzyskane odcinki włącza się do wektora ekspresyjnego po uprzednim strawieniu go odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi. Na tym etapie stosuje się różne wektory ekspresyjne, np. plazmidowe, fagowe i inne. Przykładowo plazmid pWR 450.1 zawiera gen koduiący β-galaktozydazę i gen oporności na ampicylinę.In the process according to the invention, a gene encoding a polypeptide of formula (X) c-A- (Z) b above can be constructed from chemically synthesized oligonucleotide fragments. Oligonucleotide fragments can be chemically synthesized on the support by sequentially adding blocked active group nucleosides. Preferably, the isopropoxyacetyl group is used to protect the amino function, as described in Polish Patent No. 157,777. Chemically synthesized oligonucleotide fractions are subjected to an enzymatic kinase reaction, during which phosphate is introduced at the 5 'ends by means of a polynucleotide kinase and ATP. The kinase oligonucleotides are ligated in vitro into double stranded stretches delimited by restriction enzyme recognition sequences, preferably Eco RI and Hind III. The ligated segments are amplified in a cloning vector using the appropriate polylinker restriction site. Various vectors can be used, e.g. plasmid, phage vectors, with plasmites being preferred, e.g. plasmid pUC-19. Cloned vectors with DNA segments are grown in host cells, which may be bacteria, yeast, etc. Vectors with cloned sections are isolated and then the sections are recovered by restriction digestion and e-ectrophoretic separation of the resulting sections. The recovered segments are incorporated into the expression vector after digesting it with the appropriate restriction enzymes. Various expression vectors are used in this step, e.g. plasmid, phage and others. For example, plasmid pWR 450.1 contains a gene encoding β-galactosidase and an ampicillin resistance gene.

167 781167 781

Komórki gospodarza, np. bakterii, transformowane zrekombinowanym wektorem, są po namnożeniu źródłem polipeptydu o wzorze (Y)a-(X)cóA-(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, albo fragmentu ludzkiego białka C. Fragment ewentualnie odcina się od polipeptydu.Host cells, e.g. bacteria, transformed with the recombinant vector, after amplification, are the source of the polypeptide of formula (Y) a- (X) cóA- (Z) b, in which the symbols have the above-mentioned meanings, or of a fragment of human protein C. The fragment is optionally cleaved off from the polypeptide.

Wytworzony w ten sposób fragment białka C, ewentualnie w połączeniu z fragmentem białka nośnikowego, np. ^'-galaktozydazy, można stosować do otrzymania przeciwciłł różnymi znanymi metodami, a także do wykreślania krzywej wzorcowej niezbędnej do ilościowego oznaczania białka C.The protein C fragment produced in this way, optionally in combination with a carrier protein fragment, e.g., β '-galactosidase, can be used to obtain the counterpart by various known methods, as well as to plot a standard curve necessary for the quantification of protein C.

Stosując tak otrzymany polipeptyd można wytworzyć przeciwciała poliklonalne reagujące specyficznie z białkiem C, w ten sposób, że immunizuje się zwierzęta polipeptydem o wzorze (Y)a-(X)c-A-(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, albo polipeptydem o wzorze A-(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, pobiera się krew i izoluje przeciwciała .By using the polypeptide thus obtained, polyclonal antibodies reactive specifically with protein C can be produced by immunizing animals with a polypeptide of formula (Y) a- (X) cA- (Z) b, in which the symbols have the above meanings, or with a polypeptide of formula A- (Z) b, wherein the symbols are as defined above, blood is drawn and antibodies isolated.

Wytworzone w ten sposób przeciwciała można zastosować do oznaczania ludzkiego białka C jako antygenu oraz przeciwciał dla tego białka oraz do wytworzenia testów do ich oznaczania.The antibodies produced in this manner can be used to designate human protein C as an antigen and antibodies to that protein and to produce assays for their determination.

Sposób oznaczania ludzkiego białka C jako antygenu polega na tym, że badaną próbkę, np. materiału biologicznego kontaktuje się z przeciwciałami dla polipeptydu o wzorze (Y)a-(X)c-A-(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, albo z przeciwciałami dla polipeptydu o wzorze A-(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, po czym, oznacza się wytworzony kompleks antygen-przeciwciało.The method of determining the human protein C as an antigen consists in contacting the test sample, e.g. biological material, with antibodies for the polypeptide of formula (Y) a- (X) cA- (Z) b, in which the symbols have the above-mentioned meanings, or with antibodies to a polypeptide of formula A- (Z) b, wherein the symbols are as defined above, followed by determination of the antigen-antibody complex produced.

W alternatywnej metodzie najpierw wytwarza się kompleks dwuskładnikowy antygenu z pierwszym przeciwciałem zdolnym do reagowania ze wspomnianym antygenem, po czym wytwarza się kompleks trójskładnikowy przez skontaktowanie kompleksu dwuskładnikowego z drugim przeciwciałem zdolnym do reagowania ze wspomnianym antygenem, przy czym jako jedne z tych przeciwciał stosuje się przeciwciała dla polipeptydu o wzorze (Y)a-(X)c-Ac(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, albo przeciwciała dla polipeptydu o wzorze A-(Z)b. Obecność kompleksu trójskładnikowego wykrywa się za pomocą sygnału tworzonego przez odczynnik dający się oznaczyć analitycznie lub znakowanego izotopowo przeciwciała immunoglobulinowego. Badaną próbkę, w której wykrywa się i oznacza antygen, tj. ludzkie białko C, kontaktuje się i inkubuje z przeciwciałami reagującymi specyficznie z tym antygenem. Wytworzenie kompleksu dwuskładnikowego antygen-przeciwciało wykrywa się i oznacza za pomocą środka wykrywającego i sygnalizującego reakcję immunologiczną, korzystnie przeciwciało reagujące specyficznie z białkiem C znakowane odczynnikiem dającym się oznaczyć analitycznie. Środek wykrywający i sygnalizujący reakcję immunologiczną może być obecny podczas inkubowania antygenu z przeciwciałem. Można na przykład bezpośrednio wyznakować przeciwciała kontaktowane z badaną próbką i po przemyciu produktu reakcji uzyskać sygnał. Środkiem jest wówczas sam znacznik. Środek wykrywający można też dodać dopiero po wytworzeniu kompleksu dwuskładnikowego i usunięciu nieprzereagowanego materiału. Wykrywanie i oznaczanie prowadzi się wówczas następująco: dwuskładnikowy kompleks antygen-przeciwciało po odmyciu kontaktuje się z drugim przeciwciałem reagującym specyficznie z białkiem C, przy czym jako jedno z tych przeciwciał stosuje się przeciwciała dla polipeptydu o wzorze (Y)a-(X)c-A-(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, albo przeciwciała dla polipeptydu o wzorze A-(Z)b o tym samym znaczeniu symboli. Pozostałym (pierwszym lub drugim) przeciwciałem może być na przykład przeciwciało dla całej cząsteczki białka C. Otrzymuje się wówczas kompleks trójskładnikowy przeciwciało-antygen-przeciwciało. Drugie przeciwciała mogą być znakowane odczynnikiem dającym się oznaczyć analitycznie. Alternatywnie, jako środek stosuje się układ dwuskładnikowy zawierający drugie przeciwciała tworzące kompleks trójskładnikowy, który wykrywa się za pomocą przeciwciała przeciwlymunologlobuliaowego.In an alternative method, the binary complex of an antigen is first prepared with a first antibody capable of reacting with said antigen, and then the ternary complex is produced by contacting the binary complex with a second antibody capable of reacting with said antigen, one of which antibodies are used for a polypeptide of formula (Y) a- (X) c-Ac (Z) b, wherein the symbols are as defined above, or antibodies for a polypeptide of formula A- (Z) b. The presence of the ternary complex is detected by a signal generated by an analytically measurable reagent or a radiolabeled immunoglobulin antibody. A test sample which detects and determines the antigen, ie human protein C, is contacted and incubated with antibodies reactive specifically with this antigen. The formation of the binary antigen-antibody complex is detected and determined by an immunological detection and signaling agent, preferably an antibody reactive specifically with Protein C labeled with an analytically determinable reagent. An agent for detecting and signaling an immune response may be present when the antigen is incubated with the antibody. For example, the antibodies contacted with the test sample can be directly labeled and the signal obtained after washing the reaction product. The center is then the marker itself. The detection agent can also be added only after the formation of the two-component complex and removal of unreacted material. Detection and determination are then carried out as follows: after washing, the two-component antigen-antibody complex is contacted with a second antibody that specifically reacts with protein C, one of these antibodies being antibodies to the polypeptide of formula (Y) a- (X) cA- (Z) b, in which the symbols have the meaning given above, or antibodies for the polypeptide of formula A- (Z) with the same meaning of the symbols. The residual (first or second) antibody can be, for example, an antibody to the entire protein C molecule. A ternary antibody-antigen-antibody complex is then obtained. Second antibodies may be labeled with an analytically measurable reagent. Alternatively, a two-component system is used as the agent that comprises second antibodies forming a ternary complex which is detected by an anti-lymuno-lobulia antibody.

Do znakowania można stosować enzym, biotynę, izotop promieniotwórczy, korzystnie 125j lub inne znane odczynniki. Wykrywanie i oznaczanie prowadzi się za pomocą sygnału wytwarzanego przez znacznik. Badaną próbkę, oznaczany antygen lub jedno z przeciwciał, korzystnie pierwsze, unieruchamia się na stałym nośniku takim jak bibuła nitrocelulozowa lub płytka plastikowa i inne.An enzyme, biotin, radioisotope, preferably 125 I or other known reagents can be used for labeling. Detection and determination are carried out by means of the signal produced by the label. The test sample, the antigen to be determined or one of the antibodies, preferably the first, is immobilized on a solid support such as nitrocellulose paper or plastic plate and others.

Wykrywanie i oznaczanie dogodnie prowadzi się za pomocą testu diagnostycznego, który zawiera przeciwciała dla polipeptydu o wzorze (Y)a-(X)c-A-(Z)b, w którym symbole mają wyżejDetection and determination are conveniently carried out by a diagnostic assay which contains antibodies to a polypeptide of formula (Y) a- (X) c-A- (Z) b, wherein the symbols are above

167 781 podane znaczenie, albo przeciwciała dla polipeptydu o wzorze A-(Z)b o tym samym znaczeniu symboli, ewentualnie unieruchomione na stałym nośniku lub rozpuszczone w fazie ciekłej. Przeciwciała są związane z odczynnikiem dającym się oznaczyć analitycznie.Or antibodies to a polypeptide of formula A- (Z) b with the same meaning of symbols, optionally immobilized on a solid support or dissolved in a liquid phase. The antibodies are bound to an analytically determinable reagent.

Alternatywnie test może zawierać pierwsze przeciwciała reagujące specyficznie z ludzkim białkiem C oraz układ do wykrywania kompleksu antygen-przeciwciało zawierający drugie przeciwciała zdolne do specyficznego reagowania z ludzkim białkiem C i ewentualnie przeciwciała przeciwimmunoglobulinowe, przy czym jedne z tych przeciwciał stanowią przeciwciała dla polipeptydu o wzorze (Y)a-(X)c-A-(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, albo przeciwciała dla polipeptydu o wzorze A-(Z)b o tym samym znaczeniu symboli. Korzystnie przeciwciała są związane z fazą stałą lub ciekłą. Test może dodatkowo zawierać nośnik stały i ciekły dla związania próbki zawierającej antygen.Alternatively, the assay may comprise first antibodies specifically reactive with human protein C and a system for detecting an antigen-antibody complex comprising second antibodies capable of specifically reacting with human protein C, and optionally anti-immunoglobulin antibodies, one of these antibodies being antibodies to a polypeptide of formula (Y ) a- (X) cA- (Z) b, in which the symbols have the meaning given above, or antibodies for a polypeptide of formula A- (Z) with the same meaning of the symbols. Preferably the antibodies are bound to a solid or a liquid phase. The test may additionally contain a solid and a liquid carrier to bind the sample containing the antigen.

Układ do wykrywania kompleksu antygen-przeciwciało zawiera drugie przeciwciała bezpośrednio związane z odczynnikiem dającym się wykryć analitycznie, albo też układ ten zawiera trzecie przeciwciała przeciwimmunoglobulinowe związane ze znacznikiem.The system for detecting an antigen-antibody complex comprises second antibodies directly linked to an analytically detectable reagent, or the system comprises third anti-immunoglobulin antibodies bound to a label.

W sposobie i testach do oznaczania ludzkiego białka C można stosować przeciwciała otrzymane dotychczas znanymi metodami. Sposób wykrywania przeciwciał dla białka C w badanej próbce, na przykład w materiale bilogicznym, polega na tym, że polipeptyd o wzorze (Y)a-(X)c-A-(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, kontaktuje się z badaną próbką aż do związania przeciwciał, po czym wykrywa się produkt reakcji immunologicznej. Korzystnie reakcję prowadzi się w roztworze. Dogodnie jest stosować test do wykrywania przeciwciał anty-białko C zawierający polipeptyd o określonym wyżej wzorze. Polipeptyd jest związany z odczynnikiem dającym się wykryć analitycznie. Do znakowania można stosować znane metody.Antibodies obtained by methods known in the art can be used in the method and assays for determining human protein C. The method of detecting antibodies to protein C in a test sample, for example in biological material, consists in contacting a polypeptide of formula (Y) a- (X) cA- (Z) b with the above-mentioned symbols. with the test sample until the antibodies are bound, after which the product of the immune reaction is detected. Preferably the reaction is carried out in solution. It is convenient to use an anti-protein C antibody assay comprising a polypeptide of formula as defined above. The polypeptide is bound to an analytically detectable reagent. Known methods can be used for marking.

Celem uproszczenia, w opisie i przykładach używane są następujące skróty:For simplicity, the following abbreviations are used in the description and examples:

A: adeninaA: adenine

C: cytozynaC: cytosine

G: guaninaG: guanine

T: tyminaT: thymine

Ala: alaninaAla: alanine

Arg: argininaArg: arginine

Asn: asparaginaAsn: asparagine

Asp: kwas asparaginowyAsp: aspartic acid

Gin: glutaminaGin: glutamine

Glu: kwas glutaminowyGlu: glutamic acid

His: histydynaHis: Histidine

Ile: izoleucynaHow much: isoleucine

Leu: leucynaLeu: leucine

Lys: lizynaLys: lysine

Met: metioninaMet: methionine

Phe: fenyloalaninaPhe: phenylalanine

Pro: prolinaPro: proline

Ser: serynaCheese: serine

Thr: treoninaThr: threonine

Trp: tryptofanTrp: tryptophan

Tyr: tyrozynaTyr: tyrosine

Val: walinaVal: valine

DNA: kwas deoksyrybonukleinowyDNA: deoxyribonucleic acid

ATP: trójfosforan adenozynyATP: adenosine triphosphate

EDTA: kwas etylenodwuaminoczterooctowyEDTA: ethylenediaminetetraacetic acid

SDS: siarczan dodecylu sodu bufor Eco RI: 100 mM Tris-HCl pH 7,5SDS: sodium dodecyl sulfate Eco RI buffer: 100 mM Tris-HCl pH 7.5

M NaCl mM β-merkaptoetanolM NaCl mM β-mercaptoethanol

167 781 bufor do kinazowania:167 781 kinase buffer:

bufor ligacyjny:ligation buffer:

bufor do ekstrakcji:extraction buffer:

0, 0, 0 M 0 M. Tris-HC0 pH 7.6 Tris-HCO pH 7.6 0, 0, 1 M 1 M MgCl₂ MgCl ₂ 50 50 mM mM ditiotreitol dithiothreitol 0, 0, 60 M Tr±s-HC0 pH 60M Tr ± s-HCO pH 50 50 mM mM MgCl2 MgCl2 50 50 mM mM ditiotreitol dithiothreitol 10 10 mM mM ATP ATP 50 50 mM mM Tris-Hl0 pH 8^ Tris-H10 pH 8 ° C

300 mM octanu sodu300 mM sodium acetate

0,2% SDS 4 mM EDTA pożywka LB: 10 g bacto tryptnn g ekstrakt drożdży 5 g NaCl rozpuszczone w 1 l ^O bufor TE: 10 mM Tris-HC0 pH 13,0 mM EDTA bufor z SDS: 10 g Tris-CC0 pH 8,0 g glicyny 1 g SDS rozpuszczone w 1 l -2O bufor do lizy komórek: 150 mg Tris 400 mg SOS ml jS -merkaptoetanol ml glicerolu, 7 ml wody bufor RI: 50 mM glukoza mM EDTA mM Tris-HCl p- 8,0 4 mg/ml lizozym0.2% SDS 4 mM EDTA LB medium: 10 g bacto tryptn g yeast extract 5 g NaCl dissolved in 1 L> O TE buffer: 10 mM Tris-HC0 pH 13.0 mM EDTA buffer with SDS: 10 g Tris-CC0 pH 8.0 g glycine 1 g SDS dissolved in 1 l -2O cell lysis buffer: 150 mg Tris 400 mg SOS ml jS-mercaptoethanol ml glycerol, 7 ml water RI buffer: 50 mM glucose mM EDTA mM Tris-HCl p- 8.0 4 mg / ml lysozyme

bufor buffer RII: RII: 0,2 M NaOH 1% SDS 0.2 M NaOH 1% SDS bufor buffer RIII: RIII: 60 ml 5 M kwasu octowego 60 ml of 5 M acetic acid PMSF: PMSF: fluorek fluoride kwasu fenylometylosulfonowego phenylmethylsulfonic acid PBS: PBS: 167,5 ml 167.5 ml 0,2 Na2-PO. 2 4 0.2 Na2 PO. 2 4

82,5 ml 0,2 M Na-2PO4 w 5 l 0,9% NaCl82.5 ml 0.2 M Na-2PO4 in 5 l 0.9% NaCl

DTT: ditiotreitolDTT: dithiothreitol

ELISA: test immunoenzymatycznyELISA: enzyme immunoassay

EDTA: wersenian sodowyEDTA: sodium edetate

Na załączonych rysunkach fig. 1 przedstawia wykres hydrofobowości łańcucha polipeptydowego białka C, fig. 2 przedstawia sekwencję fragmentu genu ludzkiego białka C rozłożoną na fragmenty syntetyzowane chemicznie, fig. 3 i fig. 4 podają schematy konstrukcji genu dla białka C sklonowanego w wektorze rekombinacyjnym pUC 19 i ekspresyjnym pWR 450.1, fig. 5 przedstawia rozdział elektroforetyczny w żelu poliakryloamidowym z SDS ekstraktów białkowych otrzymanych z komórek E.coli oraz oczyszczonego kompleksu —>-galaktozydaza-białko C:In the accompanying drawings, Fig. 1 shows a graph of the hydrophobicity of the protein C polypeptide chain, Fig. 2 shows the sequence of a human protein C gene fragment broken down into chemically synthesized fragments, Fig. 3 and Fig. 4 show gene construction schemes for protein C cloned in the recombinant vector pUC 19 and expression pWR 450.1, Fig. 5 shows the electrophoretic separation on a SDS polyacrylamide gel of protein extracts obtained from E.coli cells and the purified -> - galactosidase-protein C complex:

1) ciałka inkluzyjne rozpuszczone w zbuforowanym 6 M roztworze mocznika, 2) oczyszczone białko hybrydowe —5agalaktozydaz--białko C, fig. 6 przedstawia schemat rozbicia kompleksu białkowego o wzorze (Y)a-(X)c-A-(Z)b, i oczyszczenia fragmentu peptydowego o wzorze A-(Z)b. Produkty degradacji kompleksu beta-galaktozydaza-białko C stanowią mieszaninę peptydów o długości 3 do 125 aminokwasów. Fragment białka C składa się z 65 aminokwasów 1 izoluje się go przy pomocy -PLC.1) inclusion bodies dissolved in a buffered 6M urea solution, 2) purified 5agalactosidase-protein C hybrid protein, Fig. 6 shows a diagram of the breakdown of the protein complex of formula (Y) a- (X) cA- (Z) b, and purifying the peptide fragment of formula A- (Z) b. The degradation products of the beta-galactosidase-protein C complex are a mixture of peptides 3 to 125 amino acids long. Protein C fragment consists of 65 amino acids and is isolated with -PLC.

167 781167 781

Wynalazek jest bliżej wyjaśniony w przykadαzh wykonania.The invention is explained in more detail in the embodiment example.

Przykład I.Example I.

Etap 1. Synteza olagzyukleotydów.Step 1. Synthesis of oligosucleotides.

Syntezę chemiczną ollgonukleztcdów przeprowadza się stosując metodę amidzfzsforynzwą syntezy na stałym nośniku (Μ.ΕιϊΟ, OligoyucleoOidel ^n^esis - a practical approach., IRL Press, 1984). Jako nośnik użyto szkło o kontrolowanej porowatości typu LCA-CPG ze związaną pierwszą jednostką nuknezzydową. Jednostka ma przyłączoną na końcu 5’-OH dezksyrylzay blokującą grupę kwaso^H^ą - dlmeOoksyOritcl (DMT, którą usuwa się w środowisku kwaśnym). Odsłonięta w ten sposób grupa 5'-OH jednostki nukleozydzweJ przyłącza prekursor kolejnej jednostki: amidofzsforyn. Przy udziale jodu w obecności wody dokonuje się utlenienia grupy fzsfzrynzwej do fosforanu. Kolejnym etapem jest usunięcie DMT z przyłączonej jednostki, tym siuciu cykl rozpoczyna się na nowo. Ponieważ wydajność poszczególnych etapów fosforowania wynosi 99,7%, w celu usunięcia pozostałych 0,3% jednostek z wolnymi grupami 5'-OH stosuje się tzw. doping tj. zablokowanie pomyłkowych sekwencji przez ^etylow^ie bezwodnikiem octowym w obecności aktywatorów. Po utworzeniu żądanego zligonukleoOydu odcina się go od złoża 29% amoniakiem, oczyszcza elektroforetycznie, następnie odsala metodą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (Waters C-18 RP, 10 pm). Onigznukleo0ydc przechowuje się w porcjach po około 0,5 OD.The chemical synthesis of ollgonucleotides is carried out using the method of solid support synthesis (Μ.ΕιϊΟ, OligoyucleoOidel ^ n ^ esis - a practical approach., IRL Press, 1984). A controlled porosity glass of the LCA-CPG type with a bonded first nucnesoside unit was used as a support. The unit has a 5'-OH dexyril blocking group attached to the acid2H4A-dlmeOoxyOritcl (DMT which is removed in an acid medium). The 5'-OH group of the nucleoside unit thus exposed joins the precursor of the next unit: phosphoramidite. With the participation of iodine in the presence of water, the fsfzrinz group is oxidized to phosphate. The next step is to remove DMT from the attached unit, and the cycle starts all over again. Since the efficiency of the individual stages of phosphating is 99.7%, in order to remove the remaining 0.3% of units with free 5'-OH groups, the so-called doping, i.e. blocking of wrong sequences by ethyl acetic anhydride in the presence of activators. After formation of the desired ligonucleoide, it is cleaved from the bed with 29% ammonia, purified by electrophoresis, then desalted by high pressure liquid chromatography (Waters C-18 RP, 10 µm). Onigznucleoydc is stored in aliquots of approximately 0.5 OD.

Etap 2. Konstrukcja wektora rekomblyacyJnegz i wektora ekspresyjnego.Stage 2. Construction of the recomblyative vector and expression vector.

A. Klnazowayie i ligacja odcinków DNA.A. Klnazowayie and ligation of DNA sections.

Fragmenty- zligzyukleotcdowe C1-C10 rozpuszcza się w wodzie tak, aby w 5 pl roztworu znaj dowało się 2 pg kwasu. Miesza się po 4 pl fragmentów C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9 i C10 (fig. 2) i do mieszaniny dodaje po 5 pl 20 mM ATP, 2 pl buforu do kinazowanll, 2 pl wody i 1 pP llaaαz ppSlayklnoZoCdzee, ι^^ι^ porze 2 ggozż^y w tomePΓaαouze 33°C, π^^ρι^ε ppogrzewa do temperatury 65’C przez 10 minut, a potem ozhaadaa. Po fosforylacji dodaje się 3 pg PUC trawionego uprzednio enzyeaei Eco RI i Hind III, 0,5 pl llgaac faga T4 i zostawia na 12 godain w temperaturze 4*C.The C1-C10 nucleotide ligand fragments are dissolved in water such that 5 µl of the solution contains 2 µg of acid. 4 µl of C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, and C10 fragments are mixed (Fig. 2) and 5 µl of 20 mM ATP, 2 µl of kinase buffer, 2 µl of water are added to the mixture. and 1 pP llaaαz ppSlayklnoZoCdzee, ι ^^ ι ^ season 2 ggozż ^ y in tomePΓaαouze 33 ° C, π ^^ ρι ^ ε ppheated to a temperature of 65'C for 10 minutes, then ozhaadaa. After phosphorylation, 3 µg PUC of previously digested Eco RI and Hind III enzymes, 0.5 µl of T4 phage are added and left for 12 hours at 4 ° C.

W celu sprawdzenia czy fragmenty genów połączyły się z plazeidem, mieszaninę ligacyjną z barwnikiem nayzsi się na 6% żel ooliakrynzaeldzwy i rozdaiela elektroforetycznie. Po wybarwieniu lrzekiee etcZyny wycina się odpowieZnle pasmo w celu wyizolowania plaamidu rekzmllnacyjnego. Izolowany plazmid poddaje się hcZrzllaie enzymatycznej.In order to check whether the gene fragments were bound to the plzeid, the ligation mixture with the dye was put on a 6% ooliacrine gel and distributed by electrophoresis. After staining of the veins etc, the appropriate band is cut to isolate the reclamation plamid. The isolated plasmid is subjected to the enzyme hcZllaie.

B. Ι^-μΙ^ι enzymami.B. Ι ^ -μΙ ^ ι with enzymes.

Do rozpuszczonego DNA (80 pl) dodaje się 10 x 10 pl stężonego buforu EcoRI, 2U restryktazy EcoRI (firmy Pharmacia) oraz wody do objętości 100 pl. Mieszaninę inkubuje się w temperaturze 37“C przez 2 gz-ainy. Po tye czuie DNA strąca się etanolem, dodając 3 objętości alkoholu etylowego (99,8%), wymraża się w -20°C przez 5 minut, a następnie o-wirzwcwuJe się przy 15 tys. obr. przez 5 einut. Osad rozpuszcza się w 20 pl buforu TE. Postępuje się w identyczny sposób trawiąc reltrcktαzą Hind III.To the dissolved DNA (80 µl) is added 10 x 10 µl concentrated EcoRI buffer, 2U EcoRI restrictase (from Pharmacia) and water to a volume of 100 µl. The mixture is incubated at 37 ° C for 2 g of aine. After this sensation, the DNA is precipitated with ethanol, by adding 3 volumes of ethyl alcohol (99.8%), frozen at -20 ° C for 5 minutes, and then o-oily at 15 thousand. rev. for 5 einut. The pellet is dissolved in 20 µl of TE buffer. The same procedure is followed when digesting Hind III reltrcktaase.

C. Rza-alαł elektroOretyczny.C. Rza-alαł electroOretic.

W celu spraw-aenla czy zligowane fragmenty DNA eają o-pzwae-nlą długość, rza-alelα się je w 8% żelu ozllakrylzael-zwcm z SDS w TBE. Rzz-alaa orzwα-ai się przy napięciu 130 V w ciągu 3 godzin. Żel wOickIi się bromkiem e0y-cnc (0,5 pg/ml - firey Serva) przez 20 minut w temperaturze pokojowej, następnie płucze dwukrotnie w wo-ale destylowanej. Roa-alelzne produkty obserwuje się po krótkie naświetlaniu lampą UV. Dla oceny wielkości fragmentów DNA, po-zaal elektroforezy używa się następujących wzorców: PUC 19 trawiony Msp i PUC 19 trawiony Bsp RI. Jeśli zligowane fragmenty polia-aJą oczekiwaną długość, po elektroforezie sprawdzającej wykonuje się elektroforezę prepαrαtywaą i odzyskuje się odcinek DNA, który następnie liguje się z plazeidee pWR 450.1 trawionym Eco RI i Η^Ζ III.In order to determine whether the ligated DNA fragments are of equal length, they are cast on an 8% ozllacrylzael-zwcm gel with SDS in TBE. Rzz-alaa orzwα-ai is performed at 130V for 3 hours. The woickI gel is washed with e0y-cnc bromide (0.5 pg / ml - firey Serva) for 20 minutes at room temperature, then washed twice in distilled water. Roa-alel products are observed after a short exposure to a UV lamp. The following standards are used to estimate the size of the DNA fragments, following electrophoresis: PUC 19 digested with Msp and PUC 19 digested with Bsp RI. If the ligated polya-aJ fragments are of the expected length, after checking electrophoresis, prep-α-α-tayan electrophoresis is performed and a DNA segment is recovered, which is then ligated to pWR 450.1 digested with Eco RI and Ζ ^ Ζ III.

D. Sprawdzenie sekwencji klonowanych fragmentów.D. Check the sequence of cloned fragments.

W celu upewnienia się czy sekwencja sklonowanego fragmentu jest prawi-łowa, fragment lekwenzJznuJe się eeto-ą Maxama i Gilberta (MeWo-s ln Enzcmzlzgc 65, 499-560, 1989).In order to ascertain whether the sequence of the cloned fragment is correct, the drug fragment is known as the eethe of Maxam and Gilbert (MeWo-s ln Enzcmzlzgc 65, 499-560, 1989).

167 781167 781

E. Ligacja zrekombinowanego DNA z plazmidem ekspresyjnym pWR 450.1.E. Ligation of recombinant DNA to the pWR 450.1 expression plasmid.

Odcinek DNA odzyskany w etapie 2.C dodaje się do 3 pg pWR 450.1 uprzednio trawionego enzymami Eco RI i Hind III, 0,5 pl ligazy faga T4 i zostawia się na 12 godzin w temperaturze 4‘C. Po inkubacji część mieszaniny rozdziela się elektroforetycznie. Po sprawdzeniu, że odcinek DNA połączył się z plazmidem, resztę mieszaniny używa się do transformacji komórek. Uzyskuje się w ten sposób zrekombinowany plazmid pW-b.C.The DNA segment recovered in step 2.C is added to 3 µg of pWR 450.1 previously digested with Eco RI and Hind III enzymes, 0.5 µl of T4 phage ligase and left for 12 hours at 4 ° C. After incubation, part of the mixture is separated electrophoretically. After checking that the DNA segment is bound to the plasmid, the rest of the mixture is used to transform the cells. A recombinant pW-b.C plasmid is thus obtained.

Etap 3. Hodowla komórek transformowanych plazmidem PWR 450.1.Step 3. Cultivation of cells transformed with PWR 450.1 plasmid.

A. Przygotowanie kompetentnych komórek.A. Preparation of competent cells.

Z płytki z posianymi bakteriami DHS, pobiera się jedną kolonię, którą szczepi się na 5 ml pożywki LB. Bakterie hiduje się w temperaturze 37‘C przez 18 godzin. Do 100 ml pożywki LB dodaje się 2 ml otrzymanej zawiesiny i prowadzi się hodowlę do gęstości optycznej OD 600=0.3. Zawiesinę bakterii odwirowywuje się (5 tys. obr., 20 min), a osad bakteryjny ochładza, zawiesza w 50 ml buforu SB i umieszcza w temperaturze ok. 0*C. Zwirowuje się jak wyżej, a osad zawiesza w 1/12 objętości wyjściowej buforem SB. Przeprowadza się 20 minut inkubacje w temperaturze 0°C. Po tym czasie z zawieszonych komórek pobiera się do sterylnych probówek po 200 pl zawiesiny komórek i inkubuje przez 30 minut w 0°), a następnie dodaje się 7 pl DTT i plazmidy (20 pl). Inkubuje się w lodzie (0°C) przez 30 minut, a następnie 45 sekund w 45°. Ochładza się w lodzie i dodaje 800 pl pożywki LB. Po 1 godzinnej inkubacji w 37°, komórki bakteryjne posiewa się na płytki: wylewa się 200 pl mieszaniny ligacyjnej na płytkę i inkubuje w temperaturze 37° przez 18 godzin.From the DHS inoculated plate, one colony is taken and inoculated onto 5 ml of LB medium. The bacteria are hid at 37 ° C for 18 hours. 2 ml of the suspension obtained are added to 100 ml of LB medium and the cultivation is carried out to the optical density OD 600 = 0.3. The bacterial suspension is centrifuged (5,000 revolutions, 20 min), and the bacterial pellet is cooled, suspended in 50 ml of SB buffer and placed at a temperature of about 0 ° C. It is centrifuged as above and the pellet is suspended in 1/12 of the original volume in SB buffer. 20 minutes of incubation at 0 ° C are performed. After this time, 200 µl of the cell suspension are withdrawn from the suspended cells into sterile tubes and incubated for 30 minutes at 0 °), then 7 µl DTT and plasmids (20 µl) are added. Incubated on ice (0 ° C) for 30 minutes followed by 45 seconds at 45 °. It is cooled in ice and 800 µl of LB medium is added. After incubation for 1 hour at 37 °, bacterial cells are plated on the plates: 200 µl of the ligation mixture is poured onto the plate and incubated at 37 ° for 18 hours.

B. Analiza otrzymanych transformantów.B. Analysis of the obtained transformants.

Po 18 godzinach hodowli na płytce z wysianą mieszaniną transformacyjną obserwuje się pojedyńcze kolonie. Do dalszej analizy wybiera się 10 kolonii. 5 ml pożywki szczepi się pojedyńczymi koloniami i hoduje w 37° przez 18 godzin, a następnie izoluje plazmidowym DNA. Preparatyka plazmidowego DNA z 5 ml pożywki przebiega w następujący sposób: Bakterie odwirowuje się (5 tys. obr. 5 min). Osad bakteryjny zawiesza się w 200 pl buforu RI i przetrzymuje przez 5 minut w temperaturze 0°, a następnie dodaje 400 pl RII i 300 pl RIII (0°). Całość odwirowywuje się (15 tys. obr., 5 min.), supernatant przenosi się znad osadu do nowej probówki i dodaje 2,5 objętości izopropanolu. Wymraża się w -20°, odwirowywuje, osad płucze 70% etanolem i suszy w próżni. Osad rozpuszcza się w 200 pl TE i dodaje 20 pl roztworu RNazy o sttżeniu 1 mg/ml. Innkuuje się 30 minut w 37°. Dooaae się 200 pl fenolu. Zbiera się ffzę wodną i dodaje 200 pl mlnszauiuy chloroform/alkohol izoamylowy w proporcjach 24:1. Odwirowywuje się ponownie, zbiera supernataut. czynność powtarza się jeszcze raz. Do fazy wodnej dodaje się 0,1 objętości 3M octanu sodu (pH 5,2) oraz 2,5 objętości etanolu i wymraża 30 minut w temperaturze -20°, a następnie odwirowywuje (15 tys. obr., 15 gin.), osad przemywa 70% etanolem i suszy. Osad plazmidowy DNA rozpuszcza się w 40 pl buforu TE. W celu wybrania klonu zawierającego plazmid pUC 19 z wklonowanym fragmentem, przeprowadza się analizę otrzymanych DNA plazmidowych przy użyciu enzymów restrykcyjnych EcoRI i Hind III, a produkty trawienia rozdziela się w żelu pollakryloagldowyg. Trawienie przeprowadza się jak w punkcie B, a rozdział nlnktroeorntyczuy jak w punkcie C.Single colonies are observed on the plate with the inoculated transformation mixture after 18 hours of cultivation. 10 colonies are selected for further analysis. 5 ml of medium is inoculated with single colonies and cultured at 37 ° for 18 hours, followed by plasmid DNA isolation. Preparation of plasmid DNA from 5 ml of medium is as follows: The bacteria are centrifuged (5 thousand revolutions 5 min). The bacterial pellet is resuspended in 200 µl of RI buffer and kept for 5 minutes at 0 °, then 400 µl of RII and 300 µl of RIII (0 °) are added. The whole is centrifuged (15,000 rpm, 5 min.), The supernatant is transferred from the pellet to a new tube and 2.5 volumes of isopropanol are added. It is frozen at -20 °, centrifuged, washed with 70% ethanol and dried in vacuo. The precipitate is dissolved in 200 µl of TE and 20 µl of RNase solution at 1 mg / ml is added. The inn is 30 minutes at 37 °. Dooaae take 200 pl of phenol. The aqueous phase is collected and 200 µl of millium chloroform / isoamyl alcohol are added in a ratio of 24: 1. It spins again, collects the supernataut. the action is repeated once more. 0.1 volumes of 3M sodium acetate (pH 5.2) and 2.5 volumes of ethanol are added to the aqueous phase, frozen for 30 minutes at -20 ° C, and then centrifuged (15,000 rpm, 15 gin.) washed with 70% ethanol and dried. The DNA plasmid pellet is dissolved in 40 µl TE buffer. In order to select a clone containing the pUC 19 plasmid with the cloned fragment, analysis of the obtained plasmid DNA is performed with the restriction enzymes EcoRI and Hind III, and the digestion products are separated on a polacrylaglde gel. Digestion is performed as in point B, and the separation of elements as in point C.

C. Oczyszczanie ciałek inkluzyjnych.C. Purification of inclusion bodies.

Po 18 godzinach inkubacji w temperaturze 37° zawiesinę komórek bakteryjnych chłodzi się w lodzie, wiruje przez 10 mluut/4000 obr., osad przemywa 0,1 M roztworem CaC^. Odwirowany osad zawiesza się w 100 mM buforze fosforanowym pH 6,2, dodaje 1 M glicerol, 1% lizozym i ogrzewa się do temperatury pokojowej. Dodaje się 0.5 M EDTA pH 8,0 i schładza do 0°, następnie poddaje szokowi termicznemu w temperaturze 42° przez 1 minutę. Zawiesinę wiruje się przy 4500 obr. przez 15 minut, osad zawiesza w 100 mM Tris-Cl pH 8,0 z 10 mM EDTA i 1 mM PMSF. Po kolejnym wirowaniu (4500 obr., 15 min.), osad zawiesza się w 100 mM Tris-Cl pH 8,0 z 10 mM EDTA, 1 mM PMSF, 100 mM beta-ME, 1% Triton Χ-100 i poddaje działaniu ultradźwięków 10 razy po 30 sekund. Mieszaninę wiruje się w buforze Tris-Cl pH = 8,0 z 10 mM EDTA (20000 obr., 20 min.), osad zawiesza w buforze Tris-Cl pH 7,4 i znów wiruje. Pozostały osad zawiesza się w 9 M moczniku buforowanym Tris-Cl pH 7,4, dializuje wobec 6 M mocznika buforowanego Tris-ClAfter 18 hours of incubation at 37 °, the bacterial cell suspension is cooled on ice, centrifuged for 10 ml / 4000 rpm, the pellet washed with 0.1 M CaCl 2 solution. The centrifuged pellet is suspended in 100 mM phosphate buffer pH 6.2, 1 M glycerol, 1% lysozyme are added and warmed to room temperature. 0.5 M EDTA pH 8.0 is added and cooled to 0 °, then heat shock at 42 ° for 1 minute. The slurry is spun at 4500 rpm. for 15 minutes, the pellet is suspended in 100 mM Tris-Cl pH 8.0 with 10 mM EDTA and 1 mM PMSF. After another centrifugation (4500 rpm, 15 min), the pellet is resuspended in 100 mM Tris-Cl pH 8.0 with 10 mM EDTA, 1 mM PMSF, 100 mM beta-ME, 1% Triton Χ-100 and treated ultrasound 10 times for 30 seconds. The mixture is centrifuged in Tris-Cl buffer pH = 8.0 with 10 mM EDTA (20,000 rpm, 20 min), the pellet is suspended in Tris-Cl buffer pH 7.4 and centrifuged again. The residual pellet is suspended in 9 M Tris-Cl buffered urea, pH 7.4, dialyzed against 6 M Tris-Cl buffered urea.

167 781 pH 7,4, wZiiΓWiyiikw i supehnaUant nanosi się na kolumnę z DEAE 52 zrównoważona buforem startowym: 6 M mocznik, Tris-Cl pH 7,4, zawierającym 1 mM PMSF. Kompleks galak1ozyZaza-bkaako C eluuje się 0,2 M NaCl w powyższym buforze. Czystość frakcji chromatograficznych sprawdza się elektrolitycznie.167 781 pH 7.4, wZiiΓWiyiikw and supehnaUant are applied to a DEAE 52 column equilibrated with the starting buffer: 6M urea, Tris-Cl pH 7.4 containing 1 mM PMSF. The galactoseZase-bacaco C complex was eluted with 0.2M NaCl in the above buffer. The purity of the chromatographic fractions is checked electrolytically.

D. Rozbicie kompleksu na drodze reakcji chemicznej.D. Breakdown of the complex by chemical reaction.

Oczyszczone białko hybrydowe be1a-galaktozyZaza-rkaakw C dializuje się wobec buforu 10 mM Tris-HCl pH 7,4 w celu usunięcia mocznika, następnie liofilizuje. Rozbicie kompleksu przeprowadza się stosując 1 mg/ml CNBr w 80% kwasie mrówkowym, który l^di^lizuje wiązania Mw1-X (G.Bauw et.al. Methods in Protein Swquencw Analysis, Springer^erlag, str. 220-233, 1988). Reakcje przeprowadza się w temperaturze pokojowej przez 24 godziny, po czym kwas usuwa w wyparce próżniowej, a hydrolizat rozpuszcza się w 0,1% kwasie 1rójfliwrooctwwym. Produkty powstałe w wyniku tej reakcji analizuje się po przeprowadzeniu elektroforezy w żelu pwlkaOrylwamkdoiym, a następnie wyodrębnia się fragment białka C Met 56-Ile 119.The purified be1a-galactoseZaza-rkaakw C hybrid protein is dialyzed against 10 mM Tris-HCl pH 7.4 buffer to remove urea, then lyophilized. The disruption of the complex is carried out using 1 mg / ml CNBr in 80% formic acid which lyses Mw1-X bonds (G. Bauw et al. Methods in Protein Swquencw Analysis, Springer et al., Pp. 220-233, 1988). The reactions are carried out at room temperature for 24 hours, then the acid is removed in a vacuum evaporator and the hydrolyzate is dissolved in 0.1% trihydric acid. The products resulting from this reaction are analyzed after electrophoresis on the Orilvamkdoi gel, and then the fragment of the C Met 56-Ile 119 protein is isolated.

E. Sposób wyodrębnienia polipeptydu odpowiadającego fragmentowi Met 56-Ile 119 łańcucha ciężkiego ludzkiego białka C za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC).E. A method of isolating the polypeptide corresponding to the Met 56-Ile 119 fragment of the heavy chain of human protein C by high pressure liquid chromatography (HPLC).

Rozdział chromatograficzny przeprowadzono np. na kolumnie semiprepara1yinek TSK G3000 SW firmy LKB, Szwecja.The chromatographic separation was carried out e.g. on a semiprepara1yinek TSK G3000 SW column from LKB, Sweden.

Etap 4. Otrzymywanie przeciwciał poligonalnych.Stage 4. Obtaining polygonal antibodies.

A. Imminkzacja zwierząt.A. Animal Immunization.

W celu uzyskania przeciwciał poligonalnych dla fragmentu białka C po 50 pg antygenu rozpuszczonego w 0,5 ml PBS z dodatkiem 0,5 ml kompletnego adkiwanti Freunda podaje się królikom śróZe0órnie, co trzy tygodnie. Po 7 dniach od każdego szczepienia pobiera się krew z żyły usznej królika w celu sprawdzenia poziomu przeciwciał. Po wykrzepieniu w temperaturze 37°C przez 0,5-1,0 godziny, skrzep oddziela się od ścianek probówki i całość pozostawia w temperaturze 4'C przez 12-24 godzin. Następnie surowicę odciąga się do jałowych probówek wirówkowych i wiruje przy 3000 obr. przez 20 minut. Obecny dopełniacz w surowicach ^aktywuje się podczas inkubacji przez 30 minut w temperaturze 56“C. Miano poszczególnych próbek surowicy określa się metodą radioimmunologiczną, oznaczając ich zdolność do wiązania znakowanego antygenu. Próby o najwyższym mianie przeciwciał przechowuje się w temperaturze -20°C.In order to obtain polygonal antibodies to the protein C fragment, 50 µg of the antigen dissolved in 0.5 ml of PBS with the addition of 0.5 ml of complete Freund's adquant is administered to rabbits intradermally every three weeks. 7 days after each vaccination, blood is taken from the ear vein of the rabbit to check the level of antibodies. After clotting at 37 ° C for 0.5-1.0 hours, the clot is detached from the walls of the tube and left at 4 ° C for 12-24 hours. The serum is then withdrawn into sterile centrifuge tubes and centrifuged at 3000 rpm. for 20 minutes. The complement present in the sera is activated during incubation for 30 minutes at 56 ° C. The titre of individual serum samples is determined by radioimmunoassay, determining their ability to bind the labeled antigen. The samples with the highest antibody titer are stored at -20 ° C.

B. Oczyszczanie przeciwciał.B. Purification of antibodies.

Przeciwciała dla fragmentu białka C izoluje się z surowicy odpornościowej metodą chromatografii powinowactwa. Immunoadswrrent otrzymuje się poprzez związanie fragmentu białka C ze złożem CWBo-Seph-rese: 1 g złoża przemowa się 1 mM HCs i zawirsza w buforze irrinwwyw pH 8,0. Natychmiast dodaje się 20 mg antygenu w PBS i lekko miesza w temperaturze 4°C, następnie wiruje (4000 obr. przez 10 minut) i sprawdza stężenie białka w supernatancke. Złoże następnie zawiesza się w buforze boranwwMm pH 8,3 z 2 M glicyny, lubuje przez 1 godzinę i wiruje. Osad przemywa się trzykrotnie buforem boranowyw pH 8,3, 1 raz wodą destylowaną o 2 razy r ubufem roranowym .H 8.35. Na tak przygotowane złoże nanoso się 11 ml ssurwicy dda fragmentu białka C o wiesza w temperaturze 4° przez 12-14 godzon. Do mieszanony dodaje soę PMSF o chlorek renzawidynM do stężenia końcowego 1 wM. Po odwirowaniu (3000 obr., 10 minut) złoże przemywa soę 4 razy buforem PBS z 1% Tween, a następnie 4 razy buforem 1 M NaCl z 1% Tween w PBS. Po każdym wirowaniu sprawdza soę zawartość białka w supehnatancoe przez pomiar absorpcji przy 280 nw. Złoże umieszcza soę w kolumnie 0,7 x 10 cm. Przeciwciała specyficznie związane z unieruchomionym na złożu antygenem eluuje soę 0,5 M kwasem octowym do probówek zawierających 100 pl 2 M Tros. Frakcje o dużej zawartości białka łączy soę o dializuje wobec PBS przez 24 godzony w temperaturze 0°C.Antibodies to the protein C fragment are isolated from the immune serum by affinity chromatography. Immunoadswrrent is obtained by binding the protein C fragment to the CWBo-Seph-rese resin: 1 g of the resin is washed with 1 mM HCs and suspended in the irrinew buffer at pH 8.0. 20 mg of antigen in PBS is immediately added and mixed gently at 4 ° C, then centrifuged (4000 rpm for 10 minutes) and the protein concentration in the supernatant is checked. The bed is then suspended in borate buffer in mm pH 8.3 with 2 M glycine, or for 1 hour and vortexed. The precipitate is washed three times with borate buffer at pH 8.3, 1 time with distilled water 2 times with rorane buffer. H 8.35. On the thus prepared bed, 11 ml of the serum d for the fragment of protein C are placed and suspended at the temperature of 4 ° for 12-14 hours. To the mixture is added soybean PMSF and renzavidinM chloride to a final concentration of 1 wM. After centrifugation (3000 rpm, 10 minutes), the medium is washed with soybean 4 times with PBS with 1% Tween, then 4 times with 1 M NaCl with 1% Tween in PBS. After each centrifugation, the soybean content of protein in the supernatancoe is checked by measuring the absorption at 280 nw. The bed places the soybean in a 0.7 x 10 cm column. Antibodies specifically bound to the antigen immobilized on the resin elute the soybean with 0.5 M acetic acid into tubes containing 100 µl of 2 M Tros. The high protein fractions are pooled and dialyzed against PBS for 24 hours at 0 ° C.

C. Sprzęganie przeciwciał z peroksydazę.C. Conjugation of antibodies to peroxidase.

Uzyskane w ten sposób pΓhewlkilkła dda ifragwetu b^ałk C ss^^ sso z peeroksdazą.The phewlkła dda ifragvetu b ^ ałk C ss ^^ sso obtained in this way with pereroxdase.

W tyt wele r ohwzeisza s ls 5 mw HRPP o 1 ml 0.3 o Rwo śnekw węgla nw sodu o pu W,H , nas rępstę dodaje 0,1 wl 1% FDNB (1-fauoro-2,4-Ziiekthwfauwhwrwnzen) w etanolu absolutnym o delikatnie wytrząsa w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Następnie dodaje soę 40 - 80 wl NaJO4The title of the r ohwzeisz is ls 5 m in HRPP o 1 ml 0.3 o Carbon nw sodium o pu W, H, the blunt is added 0.1 wl 1% FDNB (1-fauoro-2,4-Ziiekthwfauwhwrwnzen) in absolute ethanol o gently shake at room temperature for 1 hour. Then he adds the soybeans 40 - 80 l NaJO4

167 781 rozpuszczonego w wodzie destylowanej i lekko miesza przez 30 minut. Po zmianie barwy na zielono-żółtą dodaje się 1 ml 0,16 M glikolu etylenowego i miesza przez godzinę, a następnie dializuje wobec 0,01 M węglanu sodu pH 9,5 w temperaturze 4°. Do 3 ml tak przygotowanego roztworu aldehydu peroksydazy (HRPO) dodaje się 5 mg IgG rozpuszczone w 1 ml buforu węglanowego lub w postaci zliofllizowanego proszku wolnego od soli, lekko miesza przez 2-3 godziny w temperaturze pokojowej, następnie dodaje 5 mg NaBH^ i pozostawia w 4°C przez 3 do 12 godzin. Po inkubacji mieszaninę dializuje się w 4°C wobec PBS, ewentualny osad usuwa się przez wirowanie. Próbkę nanosi się na kolumnę 85 x 1,5 cm Sephadex G-100, zrównoważoną PBS. Zbiera się frakcje po 1,5 ml, poziom białka mierzy się spektrofotometrycznie. Frakcja IgG sprzężonych z peroksydazą schodzi w pierwszym szczycie. Roztwory koniugatu przechowuje się w 10 mg/ml albuminy w temperaturze 20°.167,781 dissolved in distilled water and mixed gently for 30 minutes. After the color turned green-yellow, 1 ml of 0.16 M ethylene glycol was added and stirred for one hour, followed by dialysis against 0.01 M sodium carbonate, pH 9.5 at 4 °. To 3 ml of the peroxidase aldehyde (HRPO) solution prepared in this way, 5 mg of IgG dissolved in 1 ml of carbonate buffer or in the form of a salt-free lyophilized powder are added, stirred for 2-3 hours at room temperature, then 5 mg of NaBH 3 is added and the mixture is left to stand. at 4 ° C for 3 to 12 hours. After incubation, the mixture is dialyzed at 4 ° C against PBS, any precipitate is removed by centrifugation. The sample is applied to an 85 x 1.5 cm Sephadex G-100 column, equilibrated with PBS. Fractions of 1.5 ml are collected and the protein level is measured spectrophotometrically. The peroxidase-conjugated IgG fraction comes down at the first peak. Conjugate solutions are stored in 10 mg / ml albumin at 20 °.

Etap 5. Oznaczenie białka C jako antygenu w badanej próbce za pomocą przeciwciał dla fragmentu w wzorze -A-. tj. fragmentu 56-119 łańcucha ciężkiego ludzkiego białka C.Step 5. Determination of protein C as antigen in the test sample using antibodies to the fragment in formula -A-. i.e., fragment 56-119 of the heavy chain of human protein C.

Do roztworu antygenu w badanej próbce dodaje się wyznakowane np. peroksydazą przeciwciała dla fragmentu 56-119 łańcucha ciężkiego ludzkiego białka C i inkubuje się przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Do wywołania reakcji enzymatycznej stosuje się roztwór substratu: ortofenylodwuaminę w 0.05 M buforze cytrynianowym, pH 5,0, zawierającym 0.02% nadtlenku wodoru. Po 6 minutach inkubacji pojawia się zabarwienie i reakcję hamuje się przez dodanie 3 M kwasu sjalowego. Absorbancję mierzy się przy 490 nm. Wynik odczytuje się z krzywej wzorcowej wykreślonej dla standardowego roztworu białka C.Antibodies to the human protein C heavy chain fragment 56-119 labeled with e.g. peroxidase are added to the antigen solution in the test sample and incubated for 2 hours at room temperature. The substrate solution is used to induce the enzymatic reaction: orthophenyldiamine in 0.05 M citrate buffer, pH 5.0, containing 0.02% hydrogen peroxide. After 6 minutes of incubation, color appears and the reaction is stopped by adding 3 M sialic acid. Absorbance is measured at 490 nm. The result is read from a calibration curve plotted for the protein C standard solution.

Etap 6. Wykonanie testu ELISA.Stage 6. Performing the ELISA test.

Studzienki w płytce do testu ELISA (firmy Plastomed) opłaszcza się przeciwciałami dla polipeptydu o wzorze -A-, w którym symbol A ma wyżej wymienione znaczenie, zawieszonymi w 50 mM buforze fosforanowym pH 7,5. Testowane próbki osocza rozcieńcza się przed oznaczeniem 50 mM buforem fosforanowym, pH 7,5, zawierającym 0,15 M NaCl, 10 mM EDTA, 0,1% Tween 20 i 1% BSA, dodaje się po 200 pl na studzienkę i inkubuje przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu inkubacji płytki 5-krotnie przemywa się 0,15 M NaCl zawierającym 0,1% Tween 20. Następnie dodaje się 200 pl koniugatu IgG-HRP (przeciwciała dla całej cząsteczki białka C sprzęgnięte z peroksydazą) o stężeniu 5 pl/ml. Po 2 godzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej ponownie 5-krotnie przemywa się, po czym, w celu wywołania reakcji enzymatycznej dodaje się 200 pl roztworu substratu (0,4 mg/ml ortofenylodiaminy w 0.05 M buforze cytrynianowym, pH 5,0, zawierającym 0.02% HO2). Po 6 min. inkubacji pojawia się zabarwienie i reakcję hamuje się przez dodanie 50 pl 3M kwasu sjalowego. Absorbancję mierzy się przy 490 nm. Równocześnie wykonuje się oznaczenia z szeregiem rozcieńczeń fragmentu C aby uzyskać krzywą wzorcową. Etap 7. Zastosowanie fragmentu Met 56-Ile 119 łańcucha ciężkiego ludzkiego białka C do oznaczania poziomu przeciwciał dla białka C w badanej próbce.The wells of an ELISA plate (from Plastomed) are coated with antibodies to the polypeptide of formula -A-, wherein the symbol A is as defined above, suspended in 50 mM phosphate buffer pH 7.5. The test plasma samples are diluted prior to assay with 50 mM phosphate buffer, pH 7.5, containing 0.15 M NaCl, 10 mM EDTA, 0.1% Tween 20 and 1% BSA, added 200 µl per well and incubated for 2 hours at room temperature. After incubation, the plates are washed 5 times with 0.15 M NaCl containing 0.1% Tween 20. Then 200 µl of an IgG-HRP conjugate (peroxidase-conjugated antibodies to the whole protein C molecule) at a concentration of 5 µl / ml is added. After incubation for 2 hours at room temperature, it is washed again 5 times, then 200 µl of substrate solution (0.4 mg / ml orthophenyldiamine in 0.05 M citrate buffer, pH 5.0 containing 0.02%) is added to induce the enzymatic reaction. HO2). After 6 min. color appears in incubation and the reaction is stopped by adding 50 µl of 3M sialic acid. Absorbance is measured at 490 nm. Simultaneously, determinations are made with serial dilutions of fragment C to obtain a standard curve. Step 7. Use of the Met 56-Ile 119 fragment of the heavy chain of human protein C to determine the level of antibodies to protein C in the test sample.

Fragment polipeptydowy odpowiadający odcinkowi Met 56 - Ile 119 łańcucha ciężkiego ludzkiego białka C znakuje się izotopem jodu 125j. Do 100 pl radioznaaowanego liggndu (ok 60000 opm) dodaje się 100 pl badanej próbki (np. rozcieńczonej surowicy) i onOubuje się 12 - 16 godzin w temperaturze 4°. Następnie dodaje się przeciwciała przeciwimmunoglobulinowe (np. IgG królicze przeciw IgG ludzkim). Po 2-godzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej zwirowywuje się immunoprecypitat i przemywa go zbuforowanym roztworem soli fizjologicznej. Radioaktywność osadów mierzy się licznikiem gamma. Poziom przeciwciał dla białka C odczytuje się z krzywej wzorcowej.The polypeptide fragment corresponding to the Met stretch 56 - Ile 119 of the heavy chain of human protein C is labeled with the iodine isotope 125 I. 100 µl of the test sample (e.g. diluted serum) is added to 100 µl of the radiolabelled liggnd (approx. 60,000 µm) and the test sample (e.g. diluted serum) is fermented for 12 - 16 hours at 4 °. Subsequently, anti-immunoglobulin antibodies (e.g., rabbit IgG against human IgG) are added. After a 2-hour incubation at room temperature, the immunoprecipitate is spun down and washed with a buffered saline solution. The radioactivity of the sludge is measured with a gamma counter. The antibody level for protein C is read from the standard curve.

Test do oznaczania poziomu ludzkiego białka C składa się z: pojemnika zawierającego zbuforowany roztwór soli fizjologicznej (PBS) z EDTA i Tween 20, pojemnika z albuminą surowiczą, pojemnika z przeciwciałami dla fragmentu białka C, pojemnika z wyznakowanymi peroksydazą przeciwciałami dla białka C, pojemnika z substratem (ortodwufenyloaminą), pojemnika z buforem cytrynianowym o pH 5.0 i pojemnika z 3 M kwasem sjalowym.The human protein C test consists of: a container containing a buffered saline solution (PBS) with EDTA and Tween 20, a serum albumin container, an antibody container for the protein C fragment, a container with peroxidase-labeled antibodies for protein C, a container with substrate (orthodiphenylamine), a container with citrate buffer at pH 5.0, and a container with 3 M sialic acid.

167 701167 701

Przykład II. Postępując sposobem analogicznym jak w przykładzie I, z wyjątkiem etapu 3D i 3E, otrzymano przeciwciała dla kompleksu (Y)a-(X)c-A-(Z)b, w którym Y oznacza fragment 1 Met - 444 Val beta-galaktozydazy, X oznacza peptyd łączący: Phe, Asp, Pro, A ma wyżej podane znaczenie, Z oznacza Met. Przeciwciała te stosowano analogicznie jak w przykładzie I etap 5 i 6.Example II. By following the same procedure as in Example I, except for steps 3D and 3E, antibodies for the complex (Y) a- (X) cA- (Z) b were obtained, in which Y is the fragment 1 Met - 444 Val of beta-galactosidase, X is linking peptide: Phe, Asp, Pro, A is as defined above, Z is Met. These antibodies were used analogously to steps 5 and 6 in Example 1.

167 701167 701

Cl: ΛΑ TTC GAT CCA ATG GAC GAG TTC AAG AAG CTC CTT GTG CGC CTCl: ΛΑ TTC GAT CCA ATG GAC GAG TTC AAG AAG CTC CTT GTG CGC CT

C2: T GGA GAG ΤΛΤ GAC CTG CGG CGC TGG GAG AAG TGG GAG CTG GAC CTGC2: T GGA GAG ΤΛΤ GAC CTG CGG CGC TGG GAG AAG TGG GAG CTG GAC CTG

C3: GAC ATC AAG GAG GTC TTC GTC CAC CCC AAC TAC AGC AAG AGC3: GAC ATC AAG GAG GTC TTC GTC CAC CCC AAC TAC AGC AAG AG

C4: C ACC ACC GAC AAT GAC ATC GCA CTG CTG CAC CTGC4: C ACC ACC GAC AAT GAC ATC GCA CTG CTG CAC CTG

C5: GCC CAG CCC GCC ACC CTC TCG CAG ACC ATA GTG CCC ATC* ATG TAC5: GCC CAG CCC GCC ACC CTC TCG CAG ACC ATA GTG CCC ATC * ATG TA

C6: GTC GGG CGG TGG GAG AGC GTC TGG TAT CAC GGG TAG TAC ATT CGAC6: GTC GGG CGG TGG GAG AGC GTC TGG TAT CAC GGG TAG TAC ATT CGA

C7: TCG TGG TGG CTG TTA CTG TAG CGT GAC GAC GTG GAC CGGC7: TCG TGG TGG CTG TTA CTG TAG CGT GAC GAC GTG GAC CGG

CO: GAC CTG TAG TTC CTC CAG AAG CAG GTG GGG TTG ATG TCG TTCCO: GAC CTG TAG TTC CTC CAG AAG CAG GTG GGG TTG ATG TCG TTC

C9: CTC ATA CTG GAC GCC GCG ACC CTC TTC ACC CTC GAC CTGC9: CTC ATA CTG GAC GCC GCG ACC CTC TTC ACC CTC GAC CTG

CIO: G CTA GGT TAC CTG CTC AGG TTC TTC GAG GAA CAG GCG GAA CCTCIO: G CTA GGT TAC CTG CTC AGG TTC TTC GAG GAA CAG GCG GAA CCT

FIG.2FIG. 2

167 781167 781

1. The Asp Pro Het Asp Glu Ser Lys Lys Leu Leu'Val Arg Leu Gly1. The Asp Pro Het Asp Glu Ser Lys Lys Leu Leu'Val Arg Leu Gly

2. AA TTC GAT CCA ATG GAC GAG TCC AAG AAG CTC CTT GTC CGC CTT GGA2.AA TTC GAT CCA ATG GAC GAG TCC AAG AAG CTC CTT GTC CGC CTT GGA

3. G CTA GGT TAC CTG CTC AGG TTC TTC GAG GAA CAG GCG GAA CCT3.G CTA GGT TAC CTG CTC AGG TTC TTC GAG GAA CAG GCG GAA CCT

1. Glu Tyr Asp Leu Arg Arg Trp Glu Lys Trp Glu Leu Asp Leu Asp1. Glu Tyr Asp Leu Arg Arg Trp Glu Lys Trp Glu Leu Asp Leu Asp

2. GAG TAT GAC CTG CGG CGC TGG GAG AAG TGG .GAG CTG GAC CTG GAC2. GAG TAT GAC CTG CGG CGC TGG GAG AAG TGG .GAG CTG GAC CTG GAC

3. CTC AT A CTG GAC GCC GCG ACC CTC TTC ACC CTC GAC CTG GAC CTG3. CTC AT A CTG GAC GCC GCG ACC CTC TTC ACC CTC GAC CTG GAC CTG

1. Ile Lys Glu Vnl Phe Val His Pro Asa Tyr Ser Lys Ser Thr Thr1. Ile Lys Glu Vnl Phe Val His Pro Asa Tyr Ser Lys Ser Thr Thr

2. ATC AAG GAG GTC TTC GTC CAC CCC AAC TAC AGC AAG AGC ACC ACC2.ATC AAG GAG GTC TTC GTC CAC CCC AAC TAC AGC AAG AGC ACC ACC

3. TAG TTC CTC CAG AAG CAG GTG GGG TTG ATG TCO TTC TCG TGG TGG3.TAG TTC CTC CAG AAG CAG GTG GGG TTG ATG TCO TTC TCG TGG TGG

1. Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu His Leu Ala Gin Pro Ala Thr Leu1. Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu His Leu Ala Gin Pro Ala Thr Leu

2. GAC AAT GAC ATC GCA CTG CTG CAC CTG GCC CAG CCC GCC ACC CTC2. GAC AAT GAC ATC GCA CTG CTG CAC CTG GCC CAG CCC GCC ACC CTC

3. CTG TTA CTG TAG CGT GAC GAC GTG GAC CGG GTC GGQ CGG TGG GAG3.CTG TTA CTG TAG CGT GAC GAC GTG GAC CGG GTC GGQ CGG TGG GAG

1. Ser Gin Thr Ile Val Pro Ile Ket LŁl Ala1. Gin Thr Ile Val Pro Ile Ket LŁl Ala cheese

2. TCG CAG ACC ATA GTG CCC ATC ATG TA2. TCG CAG ACC ATA GTG CCC ATC ATG TA

3. AGC GTC TGG TAT CAC GGG TAG TAC ATT CGA3. AGC GTC TGG TAT CAC GGG TAG TAC ATT CGA

FIG.3FIG. 3

167 781167 781

EcoRIEcoRI

Hind IIIHind III

FIG.4FIG. 4

167 781167 781

FIG.5FIG.5

167 781167 781

BETA-GALAKTOZYDAZA: BIAŁKO CBETA-GALACTOSIDASE: PROTEIN C

oczyszczanie produktów hydrolizypurification of the hydrolysis products

FIG.6FIG. 6

167 781167 781

Współczynnik HydrofobowościHydrophobicity factor

FIG.1FIG.1

Departament Wydawnictw UP RP Nakład 90 egz Cena l ,50 złThe Publishing Department of the Polish Patent Office of the Republic of Poland Circulation 90 copies Price PLN 1.50

Claims

Patent claims

A method for constructing a decambinated vector for expressing and expressing a polypeptide constituting a fragment of human fiber C in host cells by a link of DNA fragments, characterized in that the vector combines with DNA encoding a polypeptide of formula (X) cA- (Z) t, in wherein X is a linker peptide, preferably Phe, Asp, Pro; c is 0 Feb 1, A is the sequence corresponding to a fragment of human protein C, including amino acids at positions 56-119 of the heavy chain of human protein C, capable of producing antibodies reactive specifically with protein C and this polypeptide, namely:

-Met-Asp-Glu-Ser-Lys 61: -Lys-Lwu-Lwu-Val-Arg-Lwu-Gly-Glu-TyΓ-Asp

71: -Leu-Arg-Arg-Tro-Glu-Lys-T ^ -Glu-Leu-Asp

81: -Lwu-Asp-Ilw-Lys-Glu-Val-Phw-Val-Hks-Pro

91: -Asn-Tyr-Ser-Lys-Ser-Thr-Thr-Asp-Asn-Asp

101: -Ilw-Ala-Lwu-Lwu-His-Lwu-Ala-Gln-Pro-Ala

111: -Thr-Lwu-Swr-Gln-Thr-Ilw-Val-Pro-Ilw-,

Z is a complementary sequence, preferably Met, and / or a sequence encoded by a polylinker fragment, b is 0 or 1.

2. Way weóbog zaugrz. 1, z-amiennn is ^m > ż, stoerse sij rsknreSyeowtnz chemically DNA with the sequence:

AA TTC GAT CCA ATG GAC GAG TCC AAG AAG CTC CTT GTC CGC CTT

GGA GAG TAT GAC CTG CGG CGC TGG GAG AAG TGG GAG CTG GAC CTG

GAC ATC AAG GAG GTC TTC GTC CAC CCC AAC TAC AGC AAG AGC ACC

ACC GAC AAT GAC ATC GCA CTG CTG CAC CTG GCC CAG CCC GCC ACC

CTC TCG CAG ACC ATA GTG CCC ATC ATG TA * * *