PL167781B1 - Sposób konstruowania zrekombinowanego wektora do klonowania i/lub ekspresji, w komórkach gospodarza, polipeptydu stanowiącego fragment ludzkiego białka C - Google Patents

Abstract

1. Sposób konstruowania zrekombinowanego wektora do klonowania i/lub ekspresji, w komórkach gospodarza, polipeptydu stanowiącego fragment ludzkiego białka C przez łączenie fragmentów DNA, znamienny tym, że wektor łączy się z DNA kodującym polipeptydem o wzorze (X)c-A-(Z)b, w którym X oznacza peptyd łączący, korzystnie Phe, Asp, Pro; c oznacza 0 lub 1, A oznacza sekwencję odpowiadającą fragmentowi ludzkiego białka C, obejmującemu aminokwasy w pozycji 56 - 119 łańcucha ciężkiego ludzkiego białka C, zdolną do wytwarzania przeciwciał reagujących specyficznie z białkiem C oraz z tym polipeptydem, a mianowicie: - Met - Asp - Glu -S e r - Lys 61: -L ys - Leu - Leu- Val - Arg - Leu - Gly - Glu - Ty-- Asp 71: -Leu- Arg - Arg - Trp - Glu -Lys - Trp - Glu - Leu- Asp 81: -Leu- Asp - Ile - Lys - Glu-Val - Phe- Val - His- Pro 91: -Asn - Tyr - Ser - Lys - Ser -Thr - Thr- Asp -Asn- Asp 101: - Ile - Ala - Leu - Leu - His -Leu - Ala - Gln - Pro - Ala 111: -Thr- Leu - Ser - Gln - Thr - I 1 e - Val- Pro - Ile-, Z oznacza sekwencję uzupełniającą, korzystnie Met i/lub sekwencję kodowaną przez fragment polilinkera, b oznacza 0 lub 1

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób konstruowania zrekombinowanego wektora do klonowania i/lub ekspresji w komórkach gospodarza polipeptydu stanowiącego fragment ludzkiego białka C, zdolnego do produkcji przeciwciał reagujących specyficznie z ludzkim białkiem C oraz z tym polipeptydem i/lub reagującego specyficznie z przeciwciałami dla ludzkiego białka C oraz z przeciwciałami dla tego polipeptydu.

Jednym ze znanych sposobów konstruowania wektorów jest łączenie odpowiednich fragmentów

DNA.

Białko C należy do rodziny białek zależnych od witaminy K. Aktywne białko C jest silnym czynnikiem an1ykwagulacykeym działającym na poziomie czynników Va ο VIII podczas krzepnięcia. Ma także swój udział w procesie f^^no^zy skrzepu poprzez wpływ na poziom aktywatora plazmknogenu we krwi (P.C.Comp, R.R.Nixon, C.T.Esmon, Blood, 63, 1984, 15-21). Niedobór białka C zaobserwowano w przypadkach głębokiej zakrzepicy żylnej i tętniczej, zatoru płucnego, zawału mięśnia sercowego, zespołu rozsianego krzepnięcia śróZnaczyekowego i innych (R.A.Malar, Seminars ón Thromb. Hemost., 11, nr 4, 1985, 389-392).

Poziom białka C oznacza się kilkoma metodami, które podzielić można na trzy grupy. Do pierwszej grupy należą metody wykorzystujące antykwagulacykne właściwości białka, jedna z nich polega na oznaczaniu białka C przy użyciu trwmrwmwdulkey z płuc królika do hamowania

167 781 aktywności prokoagulacyjnej trombiny i jednoczesnego stymulowania aktywności białka C. Tak zaktywowane białko C wpływa na czas tworzenia skrzepu przy udziale tromboplastyny aktywowanej kaoliną i kefaliną (Kaolin-cephalin activated Partial Thromboplastin Time-PTT, R.B.Francis, Thromb. Res., 37, 1986, 337-340). Różne odmiany tej metody wykorzystują wpływ aktywnego białka C na tworzenie się skrzepu po aktywacji trombinowej (H.Vinazzer, U.Pengraz, Thromb-. Res, 46, 1987, 1-8), gdzie do aktywacji trombiny używa się różnych czynników takich jak kaolina, cefalcplastyna, aktyna czy pathrombin. Bada się także udział białka C w tworzeniu skrzepu pod wpływem protrombiny i prokonwertyny (Prothrombin-prokonvertin tome, P-P, R.B.Francis, Thromb. Res., 37, 1986, 337-340). Zauważono również, że białko C powoduje zmniejszanie liczby miejsc receptorowych dla czynnika Xa i wpływa na zdolność płytek do przekształcania protrombiny (Platelet Prothrombin-Converting Activity, P.C.Comp, C.T.Esmon, Blood, 54, nr 6, 1979, 12721281). W wymienionych metodach ilość aktywnego białka C w próbie badanej odczytuje się z krzywych kalibracyjnych.

Druga grupa metod oznaczania białka C wykorzystuje jego właściwości amidolityczne. Aktywne białko C powoduje rozkład substratu barwnego, co można badać spektrofotometrycznie. Jako substraty służą tu: pGlu-Pro-Arg-MNA, S-2222, S-2238, S-2251, S-2266, S-2302, S-2314, S-2366, S-2444 (H.Vinazzer, U.Pengraz, Thromb.Res., 46, 1987, 1-8). W tej grupie metod do aktywacji białka C używa się kompleksu trombina-trombomodulina (P.C.Comp, Blood, 23, 1987, 86-92), albo pewnych frakcji otrzymywanych z jadów węży (H.Vinazzer, U.Pengraz, Thromb.Res., 46, 1987, 1-8) oraz (W.Kisiel, Clin.Invest., 4, 1979, 761 - 769).

Wśród ssosowanych metod immunologicznych oznaazania poziomu białka C jako antygenu wyróżnia się kilka rodzajów. Należą do nich metoda radioimmunologiczna polegająca na wiązaniu białka C z przeciwciałami znakowanymi radioaktywnym jodem (R.M. Bertina, A.W. Broeckmans, et al., Thromb.Haemost., 1982), metoda immunoradiometryczna (R.M. Bertina, A.W. Broeckmans, et al., Thromb.Haemost., 57, nr 1, 19B7, 112-117), oraz testy enzymoimmunologiczne (H.Vinazzer, U.Pengraz, Thromb.Res., 46, 1987, 1-8), czy metody immunoblotingu (M.Heeb, P.Schwartz, Tromb. Res., 52, 1988, 33-43).

Białko C stosowane w wymienionych metodach służące do iemunizacJi, a dalej do uzyskania przeciwciał na ogół izoluje się z plazmy ludzkiej za pomocą absorpcji na cytrynianie baru, elucji, frakcjonowaniu w siarczanie amonu, chromatografii, a następnie elektroforezy preparatywnej w żelu poliakΓyloamedowym. Wydajność metody wynosi 5 mg białka z 15 litrów plazmy, a stężenie bia^k na posscczeginych eft^ac ooczyszcana oznaacz się metodą aktywacji ttombii nowej (PTT) (W.Kisiel, J.Clin.Invest., 64, 1979, 761-769).

Opisana wyżej metoda otrzymywania białka C jest czasochłonna, skomplikowana i kosztowna, co w znazanye stopniu zawyża koszt całego testu. Otrzymywanie całej cząsteczki białka metodą biotechnologiczną jest także trudne do przeprowadzenia i kosztowne.

Nieoczekiwanie okazało się, że można przeprowadzić ozyazcanle ilościowe ludzkiego białka C z dużą dokładnością w oparciu o metodę, w której stosuje się fragment pznapepOydowc zawierający arekoelanowαny wektor wytworzony sposobem według wynalazku. Stwierdzono, że można wykorzystać pełną reakcję krzyżową w teście imeunzlogizzncm przeciwciał otrzymanych dla fragmentu białka oraz dla całej cząsteczki białka C.

W odróżnieniu od znanych metod, fragment pzlipeptydzwy kodowany przez arekzebinowαyy wektor wytworzony sposobem według wynalazku, a nie całe białko, służy do produkcji przeciwciał rozpoznających w ten sam sposób zarówno ten fragment jak i rodzime białko C. Fragment ten również stosuje się do uzyskania krzywej wzorcowej oraz do zayazzayla przeciwciał dla ludzkiego białka C.

Sposób konstruowania arekomlinzwanego wektora do klonowania i/lub ekspresji w komórkach gospodarza pzlipeotydu stanowiącego fragment ludzkiego białka C przez łączenie fragmentów DNA, według wynalazku polega na tym, że wektor łączy się z DNA kodującym ozlaoeotcd o wzorze (X)c-A-(Z)b, w którym X oanαcaα peptyd łączący, korzystnie Phe, Asp, Pro; c zanαzaα 0 lub 1,

A oayazaa sekwencję odpowiadającą fragmentowi ludzkiego białka C, obejmującemu aminokwasy w pozycji 16 - 119 łańcucha ciężkiego ludzkiego białka C, zdolną do wytwarzania przeciwciał reagujących specyficznie z białkiem C oraz z tym pzllpeptydem, a elanzwazae:

167 781

-Met-Asp-Glu-Ser-Lys 61: -Lys-Leu-Leu-Val-Arg-Leu-Gly-Glu-Tyr-Asp

71: -Leu-Arg-Arg-Trp-Glu-Lys-Trp-Glu-Leu-Asp

81: -Leu-Asp-Ile-Lys-Glu-Val-Phe-Val-His-Pro

91: -Asn-Tyr-Ser-Lys-Ser-Thr-Thr-Asp-Asn-Asp

101: -Ile-Ala-Leu-Leu-His-Leu-Ala-Gln-Pro-Ala

111: -Thr-Leu-Ser-Gln-Thr-Ile-Val-Pro-Ile-,

Z oznacza sekwencję uzupełniającą, korzystnie Met i/lub sekwencję kodowaną przez fragment polilinkera, b oznacza 0 lub 1.

Zgodnie z wynalazkiem wektor łączy się z syntetyzowanym chemicznie DNA kodującym polipeptyd o wzorze jak wyżej.

Korzystnie stosuje się wektor zawierający zsyntetyzowany chemicznie DNA odpowiadający cDNA o sekwencji:

AA TTC G/AT CCA ATG GGA GAG TCC AAG AAG CTC CTT GTC CGC

CTT GGA GAG TTJ GAC CCG CGG CCC TGG GAG AAG TGG GAG CTG

GAC CTG GAC ATC AAG GGA GTC TTT GTC CAC CCC AAC TAC AGC

ACC ACC GAC AAT GAC AAT GAC ATC GCA CCG CTG CAC CTG GCC

CAG CCC GCC AAC CTC TC CAG AAC ATA GTG CCC ATC ATG TA

Otrzymanym sposobem według wynalazku, zrekombinowanym wektorem, transformuje się komórki gospodarza, które hoduje się i wyodrębnia z nich białko o wzorze jak wyżej, po czym ewentualnie rozbija się na fragmenty o wzorach (Y)a-(X)C- oraz A-(Z)b- Białko to zawiera DNA kodujące polipeptyd o wzorze (Y)a-(X)c-A-(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, Y oznacza białko nośnikowe kodowane przez fragment wektora, korzystnie Met 1-Val 444 β-galaktozydazy i/lub sekwencję kodowaną przez fragment polilinkera, korzystnie Gln, Gly, Glu, Leu, Glu; a=0 lub 1.

Opisanym wyżej sposobem wytwarza się fragment polipeptydowy o dużej hydrofilowości łańcucha ciężkiego ludzkiego białka C, o sekwencji okreśoonej symbolem A.

Ze względu na powierzchniowe ułożenie, region ten może zawierać determinanty antygenowe. Jest to także obszar o specyficznej sekwencji aminokwasowej, w odróżnieniu od pozostałych obszarów, które wykazują znaczne podobieństwo do innych białek z grupy zależnych od witaminy K. Charakterystyczne dla centrum aktywnego preteaz serynowych są aminokwasy: His 54, Asp 100 i Ser 203 łańcucha ciężkiego (G.Plutzki et al., Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 83, 1984, 546556). Otrzymany fragment stanowi część centrum katalitycznego.

Sekwencja nukleotydowa cDNA dla białka C jest znana, (R.J.Beckman et al., Nucleic Acid Res., 13, nr 14, 1985, 5233-5247).

W procesie według wynalazku, gen kodujący polipeptyd o wyżej określonym wzorze (X)c-A-(Z)b można skonstruować z fragmentów oligonukleotydowych zsyntetyzowanych chemicznie. Fragmenty oligonukleotydowe można zsyntetyzować chemicznie na nośniku poprzez kolejne przyłączanie nukleozydów z zablokowanymi grupami czynnymi. Korzystnie do ochrony funkcji aminowej stosuje się grupę izopropoksyacetylową, co przedstawiono w opisie patentowym polskim nr 157 777. Frrgmenty oligonukleotydowe zsyntetyzowane chemicznie poddaje się enzymatycznej reakcji kinazowania, w trakcie której wprowadza się fosforan na końcach 5' za pomocą kinazy polinukleotydowej i ATP. Kinazowane oligonukleotydy liguje się in vitro w dwuniciowe odcinki ograniczone sekwencjami rozpoznawanymi przez enzymy restrykcyjne, korzystnie Eco RI i Hind III. Zligowane odcinki namnaża się w wektorze do klonowania, stosując właściwe miejsce restrykcyjne polilinkera. Stosować można różne wektory np. plazmidowe, fagowe, przy czym korzystne są plazmity, np. plazmid pUC-19. Sklonowane wektory z odcinkami DNA namnaża się w komórkach gospodarza, którymi mogą być bakterie, drożdże ltp. Wektory z wklonowanymi odcinkami izoluje się, a następnie odcinki odzyskuje się przez trawienie restrykazami i rozdzielenie otrzymanych odcinków e-ektroforetyczme. Odzyskane odcinki włącza się do wektora ekspresyjnego po uprzednim strawieniu go odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi. Na tym etapie stosuje się różne wektory ekspresyjne, np. plazmidowe, fagowe i inne. Przykładowo plazmid pWR 450.1 zawiera gen koduiący β-galaktozydazę i gen oporności na ampicylinę.

167 781

Komórki gospodarza, np. bakterii, transformowane zrekombinowanym wektorem, są po namnożeniu źródłem polipeptydu o wzorze (Y)a-(X)cóA-(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, albo fragmentu ludzkiego białka C. Fragment ewentualnie odcina się od polipeptydu.

Wytworzony w ten sposób fragment białka C, ewentualnie w połączeniu z fragmentem białka nośnikowego, np. ^'-galaktozydazy, można stosować do otrzymania przeciwciłł różnymi znanymi metodami, a także do wykreślania krzywej wzorcowej niezbędnej do ilościowego oznaczania białka C.

Stosując tak otrzymany polipeptyd można wytworzyć przeciwciała poliklonalne reagujące specyficznie z białkiem C, w ten sposób, że immunizuje się zwierzęta polipeptydem o wzorze (Y)a-(X)c-A-(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, albo polipeptydem o wzorze A-(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, pobiera się krew i izoluje przeciwciała .

Wytworzone w ten sposób przeciwciała można zastosować do oznaczania ludzkiego białka C jako antygenu oraz przeciwciał dla tego białka oraz do wytworzenia testów do ich oznaczania.

Sposób oznaczania ludzkiego białka C jako antygenu polega na tym, że badaną próbkę, np. materiału biologicznego kontaktuje się z przeciwciałami dla polipeptydu o wzorze (Y)a-(X)c-A-(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, albo z przeciwciałami dla polipeptydu o wzorze A-(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, po czym, oznacza się wytworzony kompleks antygen-przeciwciało.

W alternatywnej metodzie najpierw wytwarza się kompleks dwuskładnikowy antygenu z pierwszym przeciwciałem zdolnym do reagowania ze wspomnianym antygenem, po czym wytwarza się kompleks trójskładnikowy przez skontaktowanie kompleksu dwuskładnikowego z drugim przeciwciałem zdolnym do reagowania ze wspomnianym antygenem, przy czym jako jedne z tych przeciwciał stosuje się przeciwciała dla polipeptydu o wzorze (Y)a-(X)c-Ac(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, albo przeciwciała dla polipeptydu o wzorze A-(Z)b. Obecność kompleksu trójskładnikowego wykrywa się za pomocą sygnału tworzonego przez odczynnik dający się oznaczyć analitycznie lub znakowanego izotopowo przeciwciała immunoglobulinowego. Badaną próbkę, w której wykrywa się i oznacza antygen, tj. ludzkie białko C, kontaktuje się i inkubuje z przeciwciałami reagującymi specyficznie z tym antygenem. Wytworzenie kompleksu dwuskładnikowego antygen-przeciwciało wykrywa się i oznacza za pomocą środka wykrywającego i sygnalizującego reakcję immunologiczną, korzystnie przeciwciało reagujące specyficznie z białkiem C znakowane odczynnikiem dającym się oznaczyć analitycznie. Środek wykrywający i sygnalizujący reakcję immunologiczną może być obecny podczas inkubowania antygenu z przeciwciałem. Można na przykład bezpośrednio wyznakować przeciwciała kontaktowane z badaną próbką i po przemyciu produktu reakcji uzyskać sygnał. Środkiem jest wówczas sam znacznik. Środek wykrywający można też dodać dopiero po wytworzeniu kompleksu dwuskładnikowego i usunięciu nieprzereagowanego materiału. Wykrywanie i oznaczanie prowadzi się wówczas następująco: dwuskładnikowy kompleks antygen-przeciwciało po odmyciu kontaktuje się z drugim przeciwciałem reagującym specyficznie z białkiem C, przy czym jako jedno z tych przeciwciał stosuje się przeciwciała dla polipeptydu o wzorze (Y)a-(X)c-A-(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, albo przeciwciała dla polipeptydu o wzorze A-(Z)b o tym samym znaczeniu symboli. Pozostałym (pierwszym lub drugim) przeciwciałem może być na przykład przeciwciało dla całej cząsteczki białka C. Otrzymuje się wówczas kompleks trójskładnikowy przeciwciało-antygen-przeciwciało. Drugie przeciwciała mogą być znakowane odczynnikiem dającym się oznaczyć analitycznie. Alternatywnie, jako środek stosuje się układ dwuskładnikowy zawierający drugie przeciwciała tworzące kompleks trójskładnikowy, który wykrywa się za pomocą przeciwciała przeciwlymunologlobuliaowego.

Do znakowania można stosować enzym, biotynę, izotop promieniotwórczy, korzystnie 125j lub inne znane odczynniki. Wykrywanie i oznaczanie prowadzi się za pomocą sygnału wytwarzanego przez znacznik. Badaną próbkę, oznaczany antygen lub jedno z przeciwciał, korzystnie pierwsze, unieruchamia się na stałym nośniku takim jak bibuła nitrocelulozowa lub płytka plastikowa i inne.

Wykrywanie i oznaczanie dogodnie prowadzi się za pomocą testu diagnostycznego, który zawiera przeciwciała dla polipeptydu o wzorze (Y)a-(X)c-A-(Z)b, w którym symbole mają wyżej

167 781 podane znaczenie, albo przeciwciała dla polipeptydu o wzorze A-(Z)b o tym samym znaczeniu symboli, ewentualnie unieruchomione na stałym nośniku lub rozpuszczone w fazie ciekłej. Przeciwciała są związane z odczynnikiem dającym się oznaczyć analitycznie.

Alternatywnie test może zawierać pierwsze przeciwciała reagujące specyficznie z ludzkim białkiem C oraz układ do wykrywania kompleksu antygen-przeciwciało zawierający drugie przeciwciała zdolne do specyficznego reagowania z ludzkim białkiem C i ewentualnie przeciwciała przeciwimmunoglobulinowe, przy czym jedne z tych przeciwciał stanowią przeciwciała dla polipeptydu o wzorze (Y)a-(X)c-A-(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, albo przeciwciała dla polipeptydu o wzorze A-(Z)b o tym samym znaczeniu symboli. Korzystnie przeciwciała są związane z fazą stałą lub ciekłą. Test może dodatkowo zawierać nośnik stały i ciekły dla związania próbki zawierającej antygen.

Układ do wykrywania kompleksu antygen-przeciwciało zawiera drugie przeciwciała bezpośrednio związane z odczynnikiem dającym się wykryć analitycznie, albo też układ ten zawiera trzecie przeciwciała przeciwimmunoglobulinowe związane ze znacznikiem.

W sposobie i testach do oznaczania ludzkiego białka C można stosować przeciwciała otrzymane dotychczas znanymi metodami. Sposób wykrywania przeciwciał dla białka C w badanej próbce, na przykład w materiale bilogicznym, polega na tym, że polipeptyd o wzorze (Y)a-(X)c-A-(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, kontaktuje się z badaną próbką aż do związania przeciwciał, po czym wykrywa się produkt reakcji immunologicznej. Korzystnie reakcję prowadzi się w roztworze. Dogodnie jest stosować test do wykrywania przeciwciał anty-białko C zawierający polipeptyd o określonym wyżej wzorze. Polipeptyd jest związany z odczynnikiem dającym się wykryć analitycznie. Do znakowania można stosować znane metody.

Celem uproszczenia, w opisie i przykładach używane są następujące skróty:

A: adenina

C: cytozyna

G: guanina

T: tymina

Ala: alanina

Arg: arginina

Asn: asparagina

Asp: kwas asparaginowy

Gin: glutamina

Glu: kwas glutaminowy

His: histydyna

Ile: izoleucyna

Leu: leucyna

Lys: lizyna

Met: metionina

Phe: fenyloalanina

Pro: prolina

Ser: seryna

Thr: treonina

Trp: tryptofan

Tyr: tyrozyna

Val: walina

DNA: kwas deoksyrybonukleinowy

ATP: trójfosforan adenozyny

EDTA: kwas etylenodwuaminoczterooctowy

SDS: siarczan dodecylu sodu bufor Eco RI: 100 mM Tris-HCl pH 7,5

M NaCl mM β-merkaptoetanol

167 781 bufor do kinazowania:

bufor ligacyjny:

bufor do ekstrakcji:

0,	0 M	Tris-HC0 pH 7.6
0,	1 M	MgCl2
50	mM	ditiotreitol
0,	60 M Tr±s-HC0 pH
50	mM	MgCl2
50	mM	ditiotreitol
10	mM	ATP
50	mM	Tris-Hl0 pH 8^

300 mM octanu sodu

0,2% SDS 4 mM EDTA pożywka LB: 10 g bacto tryptnn g ekstrakt drożdży 5 g NaCl rozpuszczone w 1 l ^O bufor TE: 10 mM Tris-HC0 pH 13,0 mM EDTA bufor z SDS: 10 g Tris-CC0 pH 8,0 g glicyny 1 g SDS rozpuszczone w 1 l -2O bufor do lizy komórek: 150 mg Tris 400 mg SOS ml jS -merkaptoetanol ml glicerolu, 7 ml wody bufor RI: 50 mM glukoza mM EDTA mM Tris-HCl p- 8,0 4 mg/ml lizozym

bufor	RII:	0,2 M NaOH 1% SDS
bufor	RIII:	60 ml 5 M kwasu octowego
PMSF:	fluorek	kwasu fenylometylosulfonowego
PBS:	167,5 ml	0,2 Na2-PO. 2 4

82,5 ml 0,2 M Na-2PO4 w 5 l 0,9% NaCl

DTT: ditiotreitol

ELISA: test immunoenzymatyczny

EDTA: wersenian sodowy

Na załączonych rysunkach fig. 1 przedstawia wykres hydrofobowości łańcucha polipeptydowego białka C, fig. 2 przedstawia sekwencję fragmentu genu ludzkiego białka C rozłożoną na fragmenty syntetyzowane chemicznie, fig. 3 i fig. 4 podają schematy konstrukcji genu dla białka C sklonowanego w wektorze rekombinacyjnym pUC 19 i ekspresyjnym pWR 450.1, fig. 5 przedstawia rozdział elektroforetyczny w żelu poliakryloamidowym z SDS ekstraktów białkowych otrzymanych z komórek E.coli oraz oczyszczonego kompleksu —>-galaktozydaza-białko C:

1) ciałka inkluzyjne rozpuszczone w zbuforowanym 6 M roztworze mocznika, 2) oczyszczone białko hybrydowe —5agalaktozydaz--białko C, fig. 6 przedstawia schemat rozbicia kompleksu białkowego o wzorze (Y)a-(X)c-A-(Z)b, i oczyszczenia fragmentu peptydowego o wzorze A-(Z)b. Produkty degradacji kompleksu beta-galaktozydaza-białko C stanowią mieszaninę peptydów o długości 3 do 125 aminokwasów. Fragment białka C składa się z 65 aminokwasów 1 izoluje się go przy pomocy -PLC.

167 781

Wynalazek jest bliżej wyjaśniony w przykadαzh wykonania.

Przykład I.

Etap 1. Synteza olagzyukleotydów.

Syntezę chemiczną ollgonukleztcdów przeprowadza się stosując metodę amidzfzsforynzwą syntezy na stałym nośniku (Μ.ΕιϊΟ, OligoyucleoOidel ^n^esis - a practical approach., IRL Press, 1984). Jako nośnik użyto szkło o kontrolowanej porowatości typu LCA-CPG ze związaną pierwszą jednostką nuknezzydową. Jednostka ma przyłączoną na końcu 5’-OH dezksyrylzay blokującą grupę kwaso^H^ą - dlmeOoksyOritcl (DMT, którą usuwa się w środowisku kwaśnym). Odsłonięta w ten sposób grupa 5'-OH jednostki nukleozydzweJ przyłącza prekursor kolejnej jednostki: amidofzsforyn. Przy udziale jodu w obecności wody dokonuje się utlenienia grupy fzsfzrynzwej do fosforanu. Kolejnym etapem jest usunięcie DMT z przyłączonej jednostki, tym siuciu cykl rozpoczyna się na nowo. Ponieważ wydajność poszczególnych etapów fosforowania wynosi 99,7%, w celu usunięcia pozostałych 0,3% jednostek z wolnymi grupami 5'-OH stosuje się tzw. doping tj. zablokowanie pomyłkowych sekwencji przez ^etylow^ie bezwodnikiem octowym w obecności aktywatorów. Po utworzeniu żądanego zligonukleoOydu odcina się go od złoża 29% amoniakiem, oczyszcza elektroforetycznie, następnie odsala metodą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (Waters C-18 RP, 10 pm). Onigznukleo0ydc przechowuje się w porcjach po około 0,5 OD.

Etap 2. Konstrukcja wektora rekomblyacyJnegz i wektora ekspresyjnego.

A. Klnazowayie i ligacja odcinków DNA.

Fragmenty- zligzyukleotcdowe C1-C10 rozpuszcza się w wodzie tak, aby w 5 pl roztworu znaj dowało się 2 pg kwasu. Miesza się po 4 pl fragmentów C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9 i C10 (fig. 2) i do mieszaniny dodaje po 5 pl 20 mM ATP, 2 pl buforu do kinazowanll, 2 pl wody i 1 pP llaaαz ppSlayklnoZoCdzee, ι^^ι^ porze 2 ggozż^y w tomePΓaαouze 33°C, π^^ρι^ε ppogrzewa do temperatury 65’C przez 10 minut, a potem ozhaadaa. Po fosforylacji dodaje się 3 pg PUC trawionego uprzednio enzyeaei Eco RI i Hind III, 0,5 pl llgaac faga T4 i zostawia na 12 godain w temperaturze 4*C.

W celu sprawdzenia czy fragmenty genów połączyły się z plazeidem, mieszaninę ligacyjną z barwnikiem nayzsi się na 6% żel ooliakrynzaeldzwy i rozdaiela elektroforetycznie. Po wybarwieniu lrzekiee etcZyny wycina się odpowieZnle pasmo w celu wyizolowania plaamidu rekzmllnacyjnego. Izolowany plazmid poddaje się hcZrzllaie enzymatycznej.

B. Ι^-μΙ^ι enzymami.

Do rozpuszczonego DNA (80 pl) dodaje się 10 x 10 pl stężonego buforu EcoRI, 2U restryktazy EcoRI (firmy Pharmacia) oraz wody do objętości 100 pl. Mieszaninę inkubuje się w temperaturze 37“C przez 2 gz-ainy. Po tye czuie DNA strąca się etanolem, dodając 3 objętości alkoholu etylowego (99,8%), wymraża się w -20°C przez 5 minut, a następnie o-wirzwcwuJe się przy 15 tys. obr. przez 5 einut. Osad rozpuszcza się w 20 pl buforu TE. Postępuje się w identyczny sposób trawiąc reltrcktαzą Hind III.

C. Rza-alαł elektroOretyczny.

W celu spraw-aenla czy zligowane fragmenty DNA eają o-pzwae-nlą długość, rza-alelα się je w 8% żelu ozllakrylzael-zwcm z SDS w TBE. Rzz-alaa orzwα-ai się przy napięciu 130 V w ciągu 3 godzin. Żel wOickIi się bromkiem e0y-cnc (0,5 pg/ml - firey Serva) przez 20 minut w temperaturze pokojowej, następnie płucze dwukrotnie w wo-ale destylowanej. Roa-alelzne produkty obserwuje się po krótkie naświetlaniu lampą UV. Dla oceny wielkości fragmentów DNA, po-zaal elektroforezy używa się następujących wzorców: PUC 19 trawiony Msp i PUC 19 trawiony Bsp RI. Jeśli zligowane fragmenty polia-aJą oczekiwaną długość, po elektroforezie sprawdzającej wykonuje się elektroforezę prepαrαtywaą i odzyskuje się odcinek DNA, który następnie liguje się z plazeidee pWR 450.1 trawionym Eco RI i Η^Ζ III.

D. Sprawdzenie sekwencji klonowanych fragmentów.

W celu upewnienia się czy sekwencja sklonowanego fragmentu jest prawi-łowa, fragment lekwenzJznuJe się eeto-ą Maxama i Gilberta (MeWo-s ln Enzcmzlzgc 65, 499-560, 1989).

167 781

E. Ligacja zrekombinowanego DNA z plazmidem ekspresyjnym pWR 450.1.

Odcinek DNA odzyskany w etapie 2.C dodaje się do 3 pg pWR 450.1 uprzednio trawionego enzymami Eco RI i Hind III, 0,5 pl ligazy faga T4 i zostawia się na 12 godzin w temperaturze 4‘C. Po inkubacji część mieszaniny rozdziela się elektroforetycznie. Po sprawdzeniu, że odcinek DNA połączył się z plazmidem, resztę mieszaniny używa się do transformacji komórek. Uzyskuje się w ten sposób zrekombinowany plazmid pW-b.C.

Etap 3. Hodowla komórek transformowanych plazmidem PWR 450.1.

A. Przygotowanie kompetentnych komórek.

Z płytki z posianymi bakteriami DHS, pobiera się jedną kolonię, którą szczepi się na 5 ml pożywki LB. Bakterie hiduje się w temperaturze 37‘C przez 18 godzin. Do 100 ml pożywki LB dodaje się 2 ml otrzymanej zawiesiny i prowadzi się hodowlę do gęstości optycznej OD 600=0.3. Zawiesinę bakterii odwirowywuje się (5 tys. obr., 20 min), a osad bakteryjny ochładza, zawiesza w 50 ml buforu SB i umieszcza w temperaturze ok. 0*C. Zwirowuje się jak wyżej, a osad zawiesza w 1/12 objętości wyjściowej buforem SB. Przeprowadza się 20 minut inkubacje w temperaturze 0°C. Po tym czasie z zawieszonych komórek pobiera się do sterylnych probówek po 200 pl zawiesiny komórek i inkubuje przez 30 minut w 0°), a następnie dodaje się 7 pl DTT i plazmidy (20 pl). Inkubuje się w lodzie (0°C) przez 30 minut, a następnie 45 sekund w 45°. Ochładza się w lodzie i dodaje 800 pl pożywki LB. Po 1 godzinnej inkubacji w 37°, komórki bakteryjne posiewa się na płytki: wylewa się 200 pl mieszaniny ligacyjnej na płytkę i inkubuje w temperaturze 37° przez 18 godzin.

B. Analiza otrzymanych transformantów.

Po 18 godzinach hodowli na płytce z wysianą mieszaniną transformacyjną obserwuje się pojedyńcze kolonie. Do dalszej analizy wybiera się 10 kolonii. 5 ml pożywki szczepi się pojedyńczymi koloniami i hoduje w 37° przez 18 godzin, a następnie izoluje plazmidowym DNA. Preparatyka plazmidowego DNA z 5 ml pożywki przebiega w następujący sposób: Bakterie odwirowuje się (5 tys. obr. 5 min). Osad bakteryjny zawiesza się w 200 pl buforu RI i przetrzymuje przez 5 minut w temperaturze 0°, a następnie dodaje 400 pl RII i 300 pl RIII (0°). Całość odwirowywuje się (15 tys. obr., 5 min.), supernatant przenosi się znad osadu do nowej probówki i dodaje 2,5 objętości izopropanolu. Wymraża się w -20°, odwirowywuje, osad płucze 70% etanolem i suszy w próżni. Osad rozpuszcza się w 200 pl TE i dodaje 20 pl roztworu RNazy o sttżeniu 1 mg/ml. Innkuuje się 30 minut w 37°. Dooaae się 200 pl fenolu. Zbiera się ffzę wodną i dodaje 200 pl mlnszauiuy chloroform/alkohol izoamylowy w proporcjach 24:1. Odwirowywuje się ponownie, zbiera supernataut. czynność powtarza się jeszcze raz. Do fazy wodnej dodaje się 0,1 objętości 3M octanu sodu (pH 5,2) oraz 2,5 objętości etanolu i wymraża 30 minut w temperaturze -20°, a następnie odwirowywuje (15 tys. obr., 15 gin.), osad przemywa 70% etanolem i suszy. Osad plazmidowy DNA rozpuszcza się w 40 pl buforu TE. W celu wybrania klonu zawierającego plazmid pUC 19 z wklonowanym fragmentem, przeprowadza się analizę otrzymanych DNA plazmidowych przy użyciu enzymów restrykcyjnych EcoRI i Hind III, a produkty trawienia rozdziela się w żelu pollakryloagldowyg. Trawienie przeprowadza się jak w punkcie B, a rozdział nlnktroeorntyczuy jak w punkcie C.

C. Oczyszczanie ciałek inkluzyjnych.

Po 18 godzinach inkubacji w temperaturze 37° zawiesinę komórek bakteryjnych chłodzi się w lodzie, wiruje przez 10 mluut/4000 obr., osad przemywa 0,1 M roztworem CaC^. Odwirowany osad zawiesza się w 100 mM buforze fosforanowym pH 6,2, dodaje 1 M glicerol, 1% lizozym i ogrzewa się do temperatury pokojowej. Dodaje się 0.5 M EDTA pH 8,0 i schładza do 0°, następnie poddaje szokowi termicznemu w temperaturze 42° przez 1 minutę. Zawiesinę wiruje się przy 4500 obr. przez 15 minut, osad zawiesza w 100 mM Tris-Cl pH 8,0 z 10 mM EDTA i 1 mM PMSF. Po kolejnym wirowaniu (4500 obr., 15 min.), osad zawiesza się w 100 mM Tris-Cl pH 8,0 z 10 mM EDTA, 1 mM PMSF, 100 mM beta-ME, 1% Triton Χ-100 i poddaje działaniu ultradźwięków 10 razy po 30 sekund. Mieszaninę wiruje się w buforze Tris-Cl pH = 8,0 z 10 mM EDTA (20000 obr., 20 min.), osad zawiesza w buforze Tris-Cl pH 7,4 i znów wiruje. Pozostały osad zawiesza się w 9 M moczniku buforowanym Tris-Cl pH 7,4, dializuje wobec 6 M mocznika buforowanego Tris-Cl

167 781 pH 7,4, wZiiΓWiyiikw i supehnaUant nanosi się na kolumnę z DEAE 52 zrównoważona buforem startowym: 6 M mocznik, Tris-Cl pH 7,4, zawierającym 1 mM PMSF. Kompleks galak1ozyZaza-bkaako C eluuje się 0,2 M NaCl w powyższym buforze. Czystość frakcji chromatograficznych sprawdza się elektrolitycznie.

D. Rozbicie kompleksu na drodze reakcji chemicznej.

Oczyszczone białko hybrydowe be1a-galaktozyZaza-rkaakw C dializuje się wobec buforu 10 mM Tris-HCl pH 7,4 w celu usunięcia mocznika, następnie liofilizuje. Rozbicie kompleksu przeprowadza się stosując 1 mg/ml CNBr w 80% kwasie mrówkowym, który l^di^lizuje wiązania Mw1-X (G.Bauw et.al. Methods in Protein Swquencw Analysis, Springer^erlag, str. 220-233, 1988). Reakcje przeprowadza się w temperaturze pokojowej przez 24 godziny, po czym kwas usuwa w wyparce próżniowej, a hydrolizat rozpuszcza się w 0,1% kwasie 1rójfliwrooctwwym. Produkty powstałe w wyniku tej reakcji analizuje się po przeprowadzeniu elektroforezy w żelu pwlkaOrylwamkdoiym, a następnie wyodrębnia się fragment białka C Met 56-Ile 119.

E. Sposób wyodrębnienia polipeptydu odpowiadającego fragmentowi Met 56-Ile 119 łańcucha ciężkiego ludzkiego białka C za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC).

Rozdział chromatograficzny przeprowadzono np. na kolumnie semiprepara1yinek TSK G3000 SW firmy LKB, Szwecja.

Etap 4. Otrzymywanie przeciwciał poligonalnych.

A. Imminkzacja zwierząt.

W celu uzyskania przeciwciał poligonalnych dla fragmentu białka C po 50 pg antygenu rozpuszczonego w 0,5 ml PBS z dodatkiem 0,5 ml kompletnego adkiwanti Freunda podaje się królikom śróZe0órnie, co trzy tygodnie. Po 7 dniach od każdego szczepienia pobiera się krew z żyły usznej królika w celu sprawdzenia poziomu przeciwciał. Po wykrzepieniu w temperaturze 37°C przez 0,5-1,0 godziny, skrzep oddziela się od ścianek probówki i całość pozostawia w temperaturze 4'C przez 12-24 godzin. Następnie surowicę odciąga się do jałowych probówek wirówkowych i wiruje przy 3000 obr. przez 20 minut. Obecny dopełniacz w surowicach ^aktywuje się podczas inkubacji przez 30 minut w temperaturze 56“C. Miano poszczególnych próbek surowicy określa się metodą radioimmunologiczną, oznaczając ich zdolność do wiązania znakowanego antygenu. Próby o najwyższym mianie przeciwciał przechowuje się w temperaturze -20°C.

B. Oczyszczanie przeciwciał.

Przeciwciała dla fragmentu białka C izoluje się z surowicy odpornościowej metodą chromatografii powinowactwa. Immunoadswrrent otrzymuje się poprzez związanie fragmentu białka C ze złożem CWBo-Seph-rese: 1 g złoża przemowa się 1 mM HCs i zawirsza w buforze irrinwwyw pH 8,0. Natychmiast dodaje się 20 mg antygenu w PBS i lekko miesza w temperaturze 4°C, następnie wiruje (4000 obr. przez 10 minut) i sprawdza stężenie białka w supernatancke. Złoże następnie zawiesza się w buforze boranwwMm pH 8,3 z 2 M glicyny, lubuje przez 1 godzinę i wiruje. Osad przemywa się trzykrotnie buforem boranowyw pH 8,3, 1 raz wodą destylowaną o 2 razy r ubufem roranowym .H 8.35. Na tak przygotowane złoże nanoso się 11 ml ssurwicy dda fragmentu białka C o wiesza w temperaturze 4° przez 12-14 godzon. Do mieszanony dodaje soę PMSF o chlorek renzawidynM do stężenia końcowego 1 wM. Po odwirowaniu (3000 obr., 10 minut) złoże przemywa soę 4 razy buforem PBS z 1% Tween, a następnie 4 razy buforem 1 M NaCl z 1% Tween w PBS. Po każdym wirowaniu sprawdza soę zawartość białka w supehnatancoe przez pomiar absorpcji przy 280 nw. Złoże umieszcza soę w kolumnie 0,7 x 10 cm. Przeciwciała specyficznie związane z unieruchomionym na złożu antygenem eluuje soę 0,5 M kwasem octowym do probówek zawierających 100 pl 2 M Tros. Frakcje o dużej zawartości białka łączy soę o dializuje wobec PBS przez 24 godzony w temperaturze 0°C.

C. Sprzęganie przeciwciał z peroksydazę.

Uzyskane w ten sposób pΓhewlkilkła dda ifragwetu b^ałk C ss^^ sso z peeroksdazą.

W tyt wele r ohwzeisza s ls 5 mw HRPP o 1 ml 0.3 o Rwo śnekw węgla nw sodu o pu W,H , nas rępstę dodaje 0,1 wl 1% FDNB (1-fauoro-2,4-Ziiekthwfauwhwrwnzen) w etanolu absolutnym o delikatnie wytrząsa w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Następnie dodaje soę 40 - 80 wl NaJO4

167 781 rozpuszczonego w wodzie destylowanej i lekko miesza przez 30 minut. Po zmianie barwy na zielono-żółtą dodaje się 1 ml 0,16 M glikolu etylenowego i miesza przez godzinę, a następnie dializuje wobec 0,01 M węglanu sodu pH 9,5 w temperaturze 4°. Do 3 ml tak przygotowanego roztworu aldehydu peroksydazy (HRPO) dodaje się 5 mg IgG rozpuszczone w 1 ml buforu węglanowego lub w postaci zliofllizowanego proszku wolnego od soli, lekko miesza przez 2-3 godziny w temperaturze pokojowej, następnie dodaje 5 mg NaBH^ i pozostawia w 4°C przez 3 do 12 godzin. Po inkubacji mieszaninę dializuje się w 4°C wobec PBS, ewentualny osad usuwa się przez wirowanie. Próbkę nanosi się na kolumnę 85 x 1,5 cm Sephadex G-100, zrównoważoną PBS. Zbiera się frakcje po 1,5 ml, poziom białka mierzy się spektrofotometrycznie. Frakcja IgG sprzężonych z peroksydazą schodzi w pierwszym szczycie. Roztwory koniugatu przechowuje się w 10 mg/ml albuminy w temperaturze 20°.

Etap 5. Oznaczenie białka C jako antygenu w badanej próbce za pomocą przeciwciał dla fragmentu w wzorze -A-. tj. fragmentu 56-119 łańcucha ciężkiego ludzkiego białka C.

Do roztworu antygenu w badanej próbce dodaje się wyznakowane np. peroksydazą przeciwciała dla fragmentu 56-119 łańcucha ciężkiego ludzkiego białka C i inkubuje się przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Do wywołania reakcji enzymatycznej stosuje się roztwór substratu: ortofenylodwuaminę w 0.05 M buforze cytrynianowym, pH 5,0, zawierającym 0.02% nadtlenku wodoru. Po 6 minutach inkubacji pojawia się zabarwienie i reakcję hamuje się przez dodanie 3 M kwasu sjalowego. Absorbancję mierzy się przy 490 nm. Wynik odczytuje się z krzywej wzorcowej wykreślonej dla standardowego roztworu białka C.

Etap 6. Wykonanie testu ELISA.

Studzienki w płytce do testu ELISA (firmy Plastomed) opłaszcza się przeciwciałami dla polipeptydu o wzorze -A-, w którym symbol A ma wyżej wymienione znaczenie, zawieszonymi w 50 mM buforze fosforanowym pH 7,5. Testowane próbki osocza rozcieńcza się przed oznaczeniem 50 mM buforem fosforanowym, pH 7,5, zawierającym 0,15 M NaCl, 10 mM EDTA, 0,1% Tween 20 i 1% BSA, dodaje się po 200 pl na studzienkę i inkubuje przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu inkubacji płytki 5-krotnie przemywa się 0,15 M NaCl zawierającym 0,1% Tween 20. Następnie dodaje się 200 pl koniugatu IgG-HRP (przeciwciała dla całej cząsteczki białka C sprzęgnięte z peroksydazą) o stężeniu 5 pl/ml. Po 2 godzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej ponownie 5-krotnie przemywa się, po czym, w celu wywołania reakcji enzymatycznej dodaje się 200 pl roztworu substratu (0,4 mg/ml ortofenylodiaminy w 0.05 M buforze cytrynianowym, pH 5,0, zawierającym 0.02% HO2). Po 6 min. inkubacji pojawia się zabarwienie i reakcję hamuje się przez dodanie 50 pl 3M kwasu sjalowego. Absorbancję mierzy się przy 490 nm. Równocześnie wykonuje się oznaczenia z szeregiem rozcieńczeń fragmentu C aby uzyskać krzywą wzorcową. Etap 7. Zastosowanie fragmentu Met 56-Ile 119 łańcucha ciężkiego ludzkiego białka C do oznaczania poziomu przeciwciał dla białka C w badanej próbce.

Fragment polipeptydowy odpowiadający odcinkowi Met 56 - Ile 119 łańcucha ciężkiego ludzkiego białka C znakuje się izotopem jodu 125j. Do 100 pl radioznaaowanego liggndu (ok 60000 opm) dodaje się 100 pl badanej próbki (np. rozcieńczonej surowicy) i onOubuje się 12 - 16 godzin w temperaturze 4°. Następnie dodaje się przeciwciała przeciwimmunoglobulinowe (np. IgG królicze przeciw IgG ludzkim). Po 2-godzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej zwirowywuje się immunoprecypitat i przemywa go zbuforowanym roztworem soli fizjologicznej. Radioaktywność osadów mierzy się licznikiem gamma. Poziom przeciwciał dla białka C odczytuje się z krzywej wzorcowej.

Test do oznaczania poziomu ludzkiego białka C składa się z: pojemnika zawierającego zbuforowany roztwór soli fizjologicznej (PBS) z EDTA i Tween 20, pojemnika z albuminą surowiczą, pojemnika z przeciwciałami dla fragmentu białka C, pojemnika z wyznakowanymi peroksydazą przeciwciałami dla białka C, pojemnika z substratem (ortodwufenyloaminą), pojemnika z buforem cytrynianowym o pH 5.0 i pojemnika z 3 M kwasem sjalowym.

167 701

Przykład II. Postępując sposobem analogicznym jak w przykładzie I, z wyjątkiem etapu 3D i 3E, otrzymano przeciwciała dla kompleksu (Y)a-(X)c-A-(Z)b, w którym Y oznacza fragment 1 Met - 444 Val beta-galaktozydazy, X oznacza peptyd łączący: Phe, Asp, Pro, A ma wyżej podane znaczenie, Z oznacza Met. Przeciwciała te stosowano analogicznie jak w przykładzie I etap 5 i 6.

167 701

Cl: ΛΑ TTC GAT CCA ATG GAC GAG TTC AAG AAG CTC CTT GTG CGC CT

C2: T GGA GAG ΤΛΤ GAC CTG CGG CGC TGG GAG AAG TGG GAG CTG GAC CTG

C3: GAC ATC AAG GAG GTC TTC GTC CAC CCC AAC TAC AGC AAG AG

C4: C ACC ACC GAC AAT GAC ATC GCA CTG CTG CAC CTG

C5: GCC CAG CCC GCC ACC CTC TCG CAG ACC ATA GTG CCC ATC* ATG TA

C6: GTC GGG CGG TGG GAG AGC GTC TGG TAT CAC GGG TAG TAC ATT CGA

C7: TCG TGG TGG CTG TTA CTG TAG CGT GAC GAC GTG GAC CGG

CO: GAC CTG TAG TTC CTC CAG AAG CAG GTG GGG TTG ATG TCG TTC

C9: CTC ATA CTG GAC GCC GCG ACC CTC TTC ACC CTC GAC CTG

CIO: G CTA GGT TAC CTG CTC AGG TTC TTC GAG GAA CAG GCG GAA CCT

FIG.2

167 781

1. The Asp Pro Het Asp Glu Ser Lys Lys Leu Leu'Val Arg Leu Gly

2. AA TTC GAT CCA ATG GAC GAG TCC AAG AAG CTC CTT GTC CGC CTT GGA

3. G CTA GGT TAC CTG CTC AGG TTC TTC GAG GAA CAG GCG GAA CCT

1. Glu Tyr Asp Leu Arg Arg Trp Glu Lys Trp Glu Leu Asp Leu Asp

2. GAG TAT GAC CTG CGG CGC TGG GAG AAG TGG .GAG CTG GAC CTG GAC

3. CTC AT A CTG GAC GCC GCG ACC CTC TTC ACC CTC GAC CTG GAC CTG

1. Ile Lys Glu Vnl Phe Val His Pro Asa Tyr Ser Lys Ser Thr Thr

2. ATC AAG GAG GTC TTC GTC CAC CCC AAC TAC AGC AAG AGC ACC ACC

3. TAG TTC CTC CAG AAG CAG GTG GGG TTG ATG TCO TTC TCG TGG TGG

1. Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu His Leu Ala Gin Pro Ala Thr Leu

2. GAC AAT GAC ATC GCA CTG CTG CAC CTG GCC CAG CCC GCC ACC CTC

3. CTG TTA CTG TAG CGT GAC GAC GTG GAC CGG GTC GGQ CGG TGG GAG

1. Ser Gin Thr Ile Val Pro Ile Ket LŁl Ala

2. TCG CAG ACC ATA GTG CCC ATC ATG TA

3. AGC GTC TGG TAT CAC GGG TAG TAC ATT CGA

FIG.3

167 781

EcoRI

Hind III

FIG.4

167 781

FIG.5

167 781

BETA-GALAKTOZYDAZA: BIAŁKO C

oczyszczanie produktów hydrolizy

FIG.6

167 781

Współczynnik Hydrofobowości

FIG.1

Departament Wydawnictw UP RP Nakład 90 egz Cena l ,50 zł

Claims (2)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób konstruowanta zaekambinowanego wektora do raonowania iaiua ekspresji, w komórkach gospodarza polipeptydu stanowiącego fragment ludzkiego tkałka C, przez łączwekw fragmentów DNA, znamienny tym, że wektor łączy się z DNA kodującym polkpeptyd o wzorze (X)c-A-(Z)t, w którym X oznacza peptyd łączący, korzystnie Phe, Asp, Pro; c oznacza 0 lut 1, A oznacza sekwencję odpowiadającą fragmentowi ludzkiego białka C, obejmującemu aminokwasy w pozycji 56 - 119 łańcucha ciężkiego ludzkiego białka C, zdolną do wytwarzania przeciwciał reagujących specyficznie z białkiem C oraz z tym polipeptydem, a mianowicie:

   -Met-Asp-Glu-Ser-Lys 61: -Lys-Lwu-Lwu-Val-Arg-Lwu-Gly-Glu-TyΓ-Asp

   71: -Leu-Arg-Arg-Tro-Glu-Lys-T^-Glu-Leu-Asp

   81: -Lwu-Asp-Ilw-Lys-Glu-Val-Phw-Val-Hks-Pro

   91: -Asn-Tyr-Ser-Lys-Ser-Thr-Thr-Asp-Asn-Asp

   101: -Ilw-Ala-Lwu-Lwu-His-Lwu-Ala-Gln-Pro-Ala

   111: -Thr-Lwu-Swr-Gln-Thr-Ilw-Val-Pro-Ilw-,

   Z oznacza sekwencję uzupełniającą, korzystnie Met i/lub sekwencję kodowaną przez fragment polilinkera, b oznacza 0 lub 1.
2. 2. Sposób weóbog zaugrz. 1, z-amiennn t o ^m> ż, stoerse sij rsknreSyeowtnz chemicznie DNA o sekwencji:

   AA TTC GAT CCA ATG GAC GAG TCC AAG AAG CTC CTT GTC CGC CTT

   GGA GAG TAT GAC CTG CGG CGC TGG GAG AAG TGG GAG CTG GAC CTG

   GAC ATC AAG GAG GTC TTC GTC CAC CCC AAC TAC AGC AAG AGC ACC

   ACC GAC AAT GAC ATC GCA CTG CTG CAC CTG GCC CAG CCC GCC ACC

   CTC TCG CAG ACC ATA GTG CCC ATC ATG TA * * *