PL168868B1 - Sposób wytwarzania genów nowych mutein ludzkiego białka TTF-a - Google Patents

Abstract

Sposób wytwarzania genów nowych mutein ludzkiego białka TNF-α wykorzystujący kasetowąmutagenezę genu białkaTNF-αpolegającąna zastąpieniupoczątkowegofragmentu genu parą syntetycznych oligonukleotydów i klonowaniu takiego genu w komórkach gospodarza, znamienny tym, że gen muteiny TNF-α o wzorze X-Y, kodujący białko muteiny TNF-α o wzorzeX' - Y’ , twórzy sio prezz oołąceenie, drógo enzymatyzzeej ligccji, cęęściowo komplementarnej pary syntetycznych oliooeukleotydów stanowiącej część X genu ze stałą częścią Y genu, o sekwencji nukleotydowej: CCGAGTGACAA6CCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAACCCTCAAGCTGAGGGGCACACTGTTCGGACATCGGGTACAACATCGTTTGGGAGTTCGACTCCCCGTffi © © © © © -GCTGCAGTGGCAGAACCGCCGGGCCAATGCCCTCCTGGCCAATGGCGTGGAGCTG- —CGACGTCACCGACTTGGCGGCCCGGTTACGGGAGGACCGGTTACCGCACCTCGAC— -AGAGATAACCAGCTGGTGGTACCATCAGAGGGCCTGTACCTCATCTACTCCCAGG- —TCTCTATTGGTCGACCACCATGGTAGTCTCCCGGACATGGAGTAGATGAGGGTCC — -TCCTCTTCAAGGGCCAAGGCTGCCCGTCGACCCATGTGCTCCTCACCCACACCAT- -AGGAGAAGTTCCCGGTTCCGACGGGCAGCTGGGTACACGAGGAGTGGGTGTGGTA-

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nukleotydowych sekwencji genów kodujących nowe muteiny III, IV, V i VI białka TNF-α (ludzkiego czynnika martwicy nowotworów typu a, kachetyny), o nowych sekwencjach aminokwasowych polipeptydów.

Ludzki czynnik martwicy nowotworów (TNF-α, kachektyna) jest cytokiną syntetyzowaną przez aktywowane makrofagi i monocyty. Białko to jest zbudowane z 157 aminokwasów, zaś

168 868 jego masa cząsteczkowa wynosi ok. 17000 daltonów [Pennica, D., Nedwin, G.E., Hayflick, J.S., Seeburg, P.H., Derynck, R., Palladino, M.A. Kohr, W.J., Aggarwal, B.B and Goedeel, D.V. (1984) Nature 312,724], Biologiczne właściwości TNF-α sąpleiotropowe. Do najważniejszych zaliczyć należy aktywność cytostatyczną i cytotoksyczną obserwowaną wobec wielu typów linii nowotworowych oraz aktywność nekrotyczną wykazywaną in vivo wobec wielu rodzajów guzów litych. Obserwowano również właściwości przeciwbakteryjne, przeciwwirusowe i przeciwpasożytnicze. TNF-α jako immunomodulator stymuluje makrofagi do produkcji interleukiny-1, GM-CSF oraz prostaglandyn. Także produkcja interfeiOnu-gammaprzez limfocyty zależnajest od TNF [Bender, B. and Cerami,A. (1986) Nature 320, 584; Aggarwal, B.B. (1987) Drugs of the Future 12, 891]. Jako czynnik odpowiedzialny za proces kacheksji. TNF-α powoduje supresję lipazy lipoproteinowej [Beutler,B. and Cerami,A. (1986) Nature 320, 584]. Właściwości TNF-α pozwalały mieć nadzieję na zastosowanie go w terapii onkologicznej [Aggarwal, B.B. (1987) Drugs of the Future 12, 891] i dlatego opracowano, stosując metody inżynierii genetycznej, szczepy bakteryjne i drożdżowe produkujące na dużą skalę rekombinowany ludzki TNF-α (identyczny z naturalnym ludzkim TNF-α) [ Pennica, D., Nedwin,G.E., Hayflick,J.S., Seeburg,P.H., Derynck,R., Palladino,M.A. Kohr,W.J., Aggarwal, B.B and Goeddel,D.V. (1984) Nature 312, 724], Jednakże TNF-α jako potencjalny lek ma wiele wad. Wiele linii nowotworowych jest opornych na działanie tego białka, a ponadto jego silne właściwości pyrogenne mogą powodować działanie uboczne wywołując gorączkę lub wstrząs [Silva, A.T., Bayston, K.F. and Cohen, J. (1990)

J.Infect. Dis. 162, 421]. Niekorzystnajest także aktywność kacheksyjna TNF-α. Z tego powodu przeprowadzono zakrojone na szeroką skalę badania nad mutagenizacją TNF-α mające na celu otrzymanie mutein, które zachowując aktywność cytotoksyczną TNF-α wykazywałyby zmniejszone skutki uboczne [Aggarwal, B.B. (1987) Drugs of the Future 12, 891; Goh, C.Rand Porter, A.G (1991) Protein Eng. 4, 385]. W ramach tych badań stwierdzono m.in., że zmiany w N-tenminalnej części TNF-α, polegające na usunięciu 8 aminokwasów nie powodują znamiennego zmniejszenia jego aktywności cytotoksycznej, zaś usunięcie 4 końcowych aminokwasów powoduje nawet wzrost swoistej aktywności cytotoksycznej [Cre<o;ey,A.A., Doyle, L.V., Reynolds, M.T., Jung, T., Lin, L.S. and Vitt, C.R. (1987) Cancer Res. 47, 145], W innym eksperymencie stwierdzono, że monoklonalne przeciwciała przeciwko pentadekapeptydom o sekwencji aminokwasowej identycznej jak sekwencja N-końca TNF-α hamują cytotoksyczną aktywność tego białka. Zespół badaczy japońskich wykazał, że zmiana hydrofobowości N-tenminalnej domeny białka prowadzi do poszerzenia spektrum działania TNF przy zmniejszeniu działania ubocznego [Mizuno, D. (1988) in Bonavida, Gifford, Kirchner, Old (Eds.) Tumor Necrosis Factor/Cachectin and Related Cytokines. Int.Conf.TNF and Related Cytotoxins, Heidelberg 1987. Karger. Basel, pp. 210]. Pokazano ponadto, że zastąpienie 17 aminokwasów N-końca TNF czterema aminokwasami o sekwencji Arg-lle-Arg-Met-..., lub dołączenie takiej sekwencji aminokwasów na N-końcu białka TNF powoduje, że otrzymane w ten sposób białka muteinowe mają szersze spektrum aktywności cytotoksycznej i znacząco mniejszą toksyczność (LD50 jest ok. 20 razy mniejsza a aktywność kacheksyjnaok. 4 razy mniejsza). Mutacjatego rodzaju zwiększa znacząco zasadowość N-terminalej domeny białka TNF-α [Soma,G.-I., Kitahara, N., Tsuji,Y., Kato, M., Oshima, H., Gatanaga,T., Inagawa, H., Noguchi, K., Tanabe, Y. and Mizuno,D. (1987) Bioch. Bioph. Res. Comm. 148, 629]. Z badań rentgenograficznych TNF-α wynika, że dominującą formą strukturalną jest w tym białku struktura β, ale pierwszych 10 aminokwasów na N-końcu białka niejest włączonych z żadną strukturę i tworzy łańcuch o względnie dużej swobodzie konformacyjnej [Jones, E.Y., Stuart, D.L and Walker, N.P.C. (1989) Nature 338, 225], Sekwencja aminokwasowa tej części białka TNF-α jest następująca:

ValArgSerSerSerArgThrProSer Asp...

Podane powyżej informacje zostały wykorzystane przy opracowaniu konstrukcji genów nowych mutei TNF-α sposobem według wynalazku. Przy konstrukcji tych genów wykorzystano także opisany wcześniej gen TNF-α sklonowany w plazmidzie pUCTNF ([Kłysik, J., Konarzewska-Zglińska, A., Gałązka, G., Uznański, B., Okruszek, A., Guga, P., Wilk, A., Koziołkiewicz, M., Tchorzewski, H., Zembala, M. and Stec, W.J. (1991) Arch. Immunol, et Therap. Experim. 39 - w druku] oraz polskie opisy patentowe nr, nr 160 149 i 162 869).

168 868

Sposób konstrukcji genów nowych mutein białka TNF-α polega według wynalazku na tym, że gen muteiny TNF-α o wzorze X-Y, kodujący białko muteiny TNF-α o wzorze (odpowiednio) X’ -Y’, tworzy się przez połączenie, drugą enzymatycznej ligacji, częściowo komplementarnej pary syntetycznych oligonukleotydów stanowiącej część X genu ze stałą częścią Y genu, o sekwencji nukleotydowej:

5' CCGAGTGAeAftSCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAACCCTCAAGCTGASGGGCA3' CACTGTTCGGACAACSCGTAAftAAAACGTTTGGSAATTCGAATCCCCCST--GCTGC^AGT^GGCAGAACCGCCGGi^^i^^i^^AATGCCCTCCTGGCCAATGGCGTGGAi^^lATG-TTATATTATT:TATTTGATAATT.CA.GTTACGGGAAAAiTi^^T{^iTTATTTTATTTCAAiT-ATAAATAATTAATTAATAGTACTATTAAASAGCCTATACCTTATTTATTTTTAAA-TCTTTATTGTTCAACCACCftTATTAATCTCCC6GACATTTATTATATAAAAGTCT-·TCCTCTTCAAGTTCTAAAATTACTCATTAATTCATTTTCTTCTCATTTACATTAT-AAAAAAAATTCCCTTTTCCAACAAACAACTTAATACACTATTAGTTGGTGTAGTA~·

-TAATC:TTATTTCTTTTTTCTACTATATTAAATTCAACCTCCTCTCTTCTATTAAT-ATCGTCATATCATCAAAAGATGGTCTAATTCTAATTTTAAAAGAGACGCTAGTTC-ATCCCCTACCAAAASAATACCC:CAAAAAAAATTAATTCTAAACCCTTAΓATTAGC-TCTTTAATTTTTTCCCTTTATTATCTCCTCTAATTCCTATTTTTAACCATwCTCA-CCATCTATCTGGGATTTATCTTCCAGCTGGAAAAAAATTACCAACTTATCACTTA—AATAAATAAACCCTTTCTAAAATGTCAACCTCTTCTTATTAACTAATTCACTACT—

-AATCAATCTTTCCTATTATTTAAACTTTACCTAATTTTTTCAGSTCTACTTTAAA-TTAATTATCCTTTCTTATAAATCTAAAACAACTTAAACCCTTTTAAATAAAACCC-ATCATTTCCCTATTATAA 3'

-TAATAACATAATATTATCCTAT 5' która to stała część Y koduje następującą sekwencję aminokwasową:

ProSerAspLy sPr oVał ftIaHisVa l Va lAla AsnProT l nA l aT l uT l yT l nLeu T l nTrpLeuAsnArgArgA l aAsnA l aLeuLeuA l aAsnT l y'Va l T luLeuArg Asp AsnGInLeuValValProSerTluTlyLeuTyrLeu11eTy rSerTlnValLeuPhe LysT 1 yT 1 nTI yGysProSerThrHisya 1 LeuLeuThjrHisThrJ 1 eSsrArg Ile AlaUalSerTyrTlnThrLysVał AsnLeuLsuSerAlal IeLysSerProAysTln ArgT 1 uThrProT 1 uTIyAl aT 1 uA I aLysProTrpTy rTI uPro11 eTyrL.euT 1 y TlyVa1PheTlnLeuTluLysTlyAspAręLeuSsrAlaTlulIeAaiArgProAsp TyrLeu.AspPheA 1 aT 1 uSerT 1 yT 1 nVa 1 TyrPheT 1 y 11 e11eA 1 al.eu stanowiącą część stałą Y’ białka muteiny TNF-α. Jako wymienne części X genów muteinowych stosuje się następujące pary oligonukleotydów:

168 868 dla muteiny III

C-TAif tt-t<

'AASASACATASACAT -TTi—rr-TT-TATCTGTAGGCT kodująca sekwencję aminokwasowi’:

MetLysHisLysArgHisArgHi s dla muteiny IV

T -r r~1 iCM

TGTTTATSTCTTTTTTTATGATG 'AACT kodująca sekwencję aminokwasową X’:

MetPheMetAlaPhePheMetMet dla muteiny V

5' AATTCATSSTACATTCTTCAAAASTAATA kodująca sekwencję aminokwasową X’:

MetVaLArgSerSerIleVanie dla muteiny VI

5' AATTCAABASAATAASAATG

3' STACTCTTATTCTAACGGCT kodująca sekwencję aminokwasową X’:

MetArglleArgMet

Połączone części genów muteinowych wprowadza się do odpowiednich wektorów, korzystnie plazmidowych i klonuje w komórkach gospodarza korzystnie bakterii E.coli. Po wyselekcjonowaniu klonów i wyizolowaniu z nich wektorów niosących geny muteinowe oznacza się sekwencję tych genów i po potwierdzeniu zgodności tych sekwencji z sekwencjami planowanymi przenosi się otrzymane w ten sposób geny muteinowe do odpowiednich wektorów ekspresyjnych.

Sekwencje nukleotydowe genów mutein ludzkiego białka TNF-α otrzymane sposobem według wynalazku mają strukturę opisaną wzorem X-Y gdzie X i Y mają wyżej podane znaczenie.

Sekwencje aminokwasowe polipeptydów kodowanych przez geny otrzymane. sposobem według wynalazku mają sekwencje aminokwasowe o wzorze X’-Y\ gdzie X’ i Y’ mają wyżej podane znaczenie.

Sekwencje aminokwasowe N-końców nowych mutein dobierano kierując się następującymi kryteriami:

a) muteina III - została zaprojektowana tak aby N-koniec był bardzo silnie zasadowy;

b) muteina IV - została zaprojektowana tak aby N-koniec był zupełnie hydrofobowy;

c) muteina V - została zaprojektowana tak aby N-koniec był nieznacznie bardziej hydrofobowy od tego jaki występuje w naturalnym ludzkim TNF-α, co uzyskano zamieniając trzy aminokwasy hydrofilowe o sekwencji SerArgThr (pozycja od 5 do 7) na trzy aminokwasy hydrofobowe o sekwencji IleVallle;

d) muteina VI - została zaprojektowana jako ulepszenie sekwencji mutein typu TNF-S [Soma, G.-I., Kitahara, N., Tsuji,Y., Kato, M., Oshima, H., Gatanaga,T., Inagawa, H., Noguchi,

K., Tanabe,Y. and Mizuno, D. (1987) Biochem. Biophys. Res. Comm. 148, 6291.

Konstrukcja pierwszej muteiny TNF-S polegała na usunięciu pierwszych 17 aminokwasów z N-końca białka TNF-α i zastąpieniu ich czterema aminokwasami o sekwencji: ArglleArgMet. Mutacja taka powoduje zaburzenie struktury β zaczynającej się w białku TNF-α od jedenastego aminokwasu. Druga muteina TNF-S powstała przez dołączenie wyżej opisanej

168 868

Ί sekwencji aminokwasowej do N-końca naturalnego ludzkiego TNF-α, co spowodowało wydłużenie nieustnikturalizowanej domeny białka o cztery dodatkowe aminokwasy. Nie znany jest jak dotąd wpływ wydłużenia N-końca łańcucha polipeptydowego TNF-α na właściwości tego białka. Natomiast wiadomo, że skrócenie tego fragmentu białka o cztery aminokwasy zwiększa aktywność cytotoksyczną TNF-α, [Creasey, A.A., Doyle, L.V., Reynolds, M.T., Jung,T., Lin,

L.S. and Vitt,C.R. (198Ί) Cancer Res. 4Ί, 145]. -Mutacja zaprojektowana według wynalazku polega na zastąpieniu siedmiu aminokwasów na N-końcu naturalnego TNF-α przez cztery aminokwasy o sekwencji takiej jak opisana wyżej. Zaletą tego rozwiązania w porównaniu z muteinami TNF-S jest to, że nie narusza ono zasadniczej struktury (β białka TNF-α, oraz nie zmienia w istotny sposób rozmiaru jego domeny N-terminalnej.

Aminokwas metionina (Met) kodowany przez nukleotydową sekwencję. ATG występującą na początku genu każdej muteiny jest sygnałem startu translacji podczas ekspresji białka w komórkach. Powinien on zostać usunięty przez odpowiednie enzymy komórkowe po zakończeniu biosyntezy białka.

Wszystkie elementy metodyczne nie przedstawione szczegółowo w niniejszym opisie są zawarte w publikacji: Maniatis i wsp. Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, New York (1982).

Celem uproszczenia w opisie i przykładach używane są następujące skróty:

A: adenina

C: cytozyna

G: guanina

T: tymina

Ala: alanina

Arg: arginina

Asn: asparagina

Asp: kwas asparaginowy

Cys: cysteina

Gin: glutamina

Glu: kwas glutaminowy

His: histydyna

Ile: izoleucyna

Leu: leucyna

Lys: lizyna

Met: metionina

Phe: fenyloalanina

Pro: prolina

Ser: .seryna

Thr: treonina

Trp: tryptofan

Tyr: tyrozyna

Val: walina

DNA: kwas deoksyrybonukleinowy

ATP: trójfosforan adenozyny

Tris-HCl: chlorowodorek trójhydroksymetyloaminometanu

EDTA: kwas etylenodwuaminoczterooctowy

SDS: sól sodowa siarczanu dodecylu

TNF-α czynnik martwicy nowotworów typu α (kachektyna) pz: para zasad

168 868

Bufor Η	100 mM Tris-HCl pH 7,5 1M NaCl 100 mM MgCh 10 mM β-imerkaptoce anol
Ό,,Γ.--Λ Λ U Ul VI ινι	lOOmM Tris KCl pK 7,5 500 mmM NaCl 100 mM MgCl2 10 mM β-merkaptoetanol
Bufor ligacyjny	660 mM Tris-HCl pH 7,6 50 mM MgCl2 50 mM ditiotreitol 10 mM ATP
Bufor do ekstrakcji DNA	50 mM Tris-HCl pH 8,0 300 mM octan sodu 4 mM EDTA 0,2% SDS
Bufor TAE	40 nmi Trii-HCl pH 8,3 22 mM octan s odu 2 mM EDTA
Pożywka LB	10 g bacto trypton 5 g ekstrakt drożdży 5 g NaCl rozpuszczone w 1 1 H2O i sterylizowane 20 min. w 121°C
Pożywka LB z ampicyliną	pożywka LB uzupełniona ampicyliną do stężenia 100 mg/l
X-Gal	2% roztwór 5-bromo-4-chloc0-3-inddliio-galaktozyUu w Uwumetyloformamidzie
IPTG	100 mM roztwór izopropylo-β-D--togalaktopiranozyUu w H2O
Bufor RI	50 mM glukoza 10 mM EDTA 25 mM Tris-HCl pH 8,0 4 mg/ml lizozym (produkcji Pharmacia LKB)
Bufor RII	0,2 M NaOH 1%SDS
Bufor RIII	60 ml 5 M octan potasu 11,5 ml kwas octowy lodowaty 28,5 ml H8H
Bufor TE	100 mM Tris-HCl pH 8,0 1 mM EDTA
Fenol	fenol saturowany 50 mM buforem Tris-HCl pH 8,0
Eter	eter dwuetylowy salutowany H2O
PEG	40% roztwór glikolu polietylenowego 6000 (śr. m.cz. 6000) w 2 M NaCl

Wynalazek jest bliżej wyjaśniony w przykładach, które jednak nie ograniczają jego zakresu.

Przykład I. Konstrukcja genu muteiny III TNF-α

Etap I. Chemiczna synteza oligonukleotydów.

Przeprowadza się chemiczną syntezę dwóch oligodeoksynukleotydów o sekwencjach:

5’ AATTCATGAAACATAAGAGACATAGACAT 3’

5’ TCGGATGTCTATGTCTCTTATGTTTCATG 5’

Oligonukleotydy syntetyzuje się na nośniku stałym przez kolejne przyłączanie amidofosforynowych pochodnych nukleozydów z grupami aminowymi zasad nukleinowych zablokowanymi resztami izopropoksyacetylowymi. Amidofosforyny nukleozydów przyłącza się kolejno w kierunku od 3’ do 5’, przy czym po każdym etapie kondensacji utlenia się fosforyn do fosforanu. Syntezę prowadzi się sposobem przedstawionym w polskich opisach patentowych nr nr 160 149 i 162 869.

Etap II. Przygotowanie niezmienianego fragmentu genu mutein TNF-α (części Y).

Plazmid pUCTNF niosący gen TNF-α (patrz polskie opisy patentowe nr nr 160 149 i 162 869 oraz [Kłysik, J., Konarzewska Zglińska, A., Gałązka,G., Uznański, B., Okruszek, A., Guga, P., Wilk, A., Koziołkiewicz, M., Tchorzewski, H., Zembala, M. and Stec,W.J. (1991) Arch. Immunol. et Therap. Experim. 39 - w druku]) jest poddawany trawieniu restryktazanm BamHI i Ava. Następnie produkty trawienia rozdziela się na żelu poliakryiaimidowym i izoluje się z żelu

168 868 dłuższy fragment (486 pz) ograniczony restryktazarm Ava i BamHI stanowiący część Y genu muteiny III.

Etap II. 1. Trawienie restryktazami.

Do 50 pg DNA plazmidu pUCTNF (100 pl) dodaje się 15 pl bufom M, 31 jjtl H2O i 20 jedn. (4 pl) restryktazy Aval (prod. Pharmacia LKB). Po 3-godzinnej inkubacji w temp. 37°C do roztworu dodaje się 4 pl 0,5 M roztworu EDTA, miesza, po czym DNA strąca się dodając 470 pl 98% etanolu. Po 15-rmnutowym wymrożeniu próbki w 70°C całość wiruje się przy 12000 g przez 10 minut i dokładnie usuwa supernatant. Osad przemywa się 50 pl 70% etanolu, ponownie wiruje (12000 g, 10 minut) dokładnie usuwa supernatant i pozostały osad suszy pod próżnią. Wysuszony osad rozpuszcza się w 133 pl H2O, dodaje 15 pl buforu H i 20 jedn. (2pl) restryktazy BamHI (prod. Pharmacia LKB). Po 3-godzinnej inkubacji w temp. 37°C do roztworu dodaje się 4 pl 0,5 M roztworu EDTA, miesza, po czym DNA itrrca lię oraz oczyszcza lak lamo jak opisano wcześniej. Wysuszony osad rozpuszcza się w 25 pl H2O.

Etap II. 2. Elektroforeza preparatywna DNA.

Produkty trawienia otrzymane w etapie II. 1 nanosi się na 6% żel poliakrylamidowy i rozdziela przez 3 godziny przy 0,5 V/cm w buforze TAE. Po zakończeniu elektroforezy żel wybarwia się przez 20 min. w wodnym roztworze bromku etydyny o stężeniu 0,5 pg/ml. Barwnik odmywa się dwukrotnie płucząc żel przez 20 min. w 1 1 H2O. Wybarwniony DNA obserwuje się w świetle UV (305 nm).

Etap II. 3. Izolacja fragmentu Ava I-BamHI.

Spośród obserwowanych w postaci prążków w żelu (etap II.2) produktów trawienia (etap

II. 1) wybiera się ten, który odpowiada długości ok. 490 pz. Wycina się skrawek żelu zawierający ten prążek, miażdży się go dokładnie po czym zawiesza się w 1 ml buforu do elucji. dNa wymywa się z żelu przez 12 godz. w tem. 37°C z mieszaniem. Po zakończeniu elucji próbkę wiruje się przez 15 min. przy 13000 g. Supernatant po wirowaniu zbiera się i wytrąca się z niego DNA dodając 3 objętości 98% etanolu. Po 15-minutowym wymrożeniu próbki w temp. -70°C całość wiruje się przez 10 min. przy 13000 g. Supernatant jest usuwany, zaś osad zawiesza się w 100 (tl 0,3 M octanu sodowego pH 5,2 i ponownie strąca się DNA za pomocą 300 pl 98% etanolu. Po ponownym wymrożeniu i wirowaniu do otrzymanego osadu dodaje się 70% etanol, przemywa, ponownie wiruje i po usunięciu supernatantu suszy po próżnią. Wysuszony osad zawiesza się w 10 pl H2O.

Etap III. Przygotowanie wektora do klonowania.

DNA plazmidu pUC19 w ilości 5 pl (10 pl) miesza się z 5 pl buforu H, dodaje 33 pl H2O oraz 10 jedn. (1 pl) restryktazy EcoRI i 10 jedn, (1 pl·) restryktazy BamHI.

Próbkę inkubuje się w temp. 37°C przez 1 godz. po czym inaktywuje się enzymy przez 30 min. w temp. 85°C.

Etap IV. Klonowanie genu muteiny III.

Klonowanie przeprowadza się w ten sposób, że DNA otrzymane w etapach I--H łączy się ze sobą za pomocą ligazy po czym produktem tej reakcji transformuje się komórki E.coli szczepu JM 105. Transformanty selekcjonuje się na podłożu z X-gal i IPTG, po czym z wybranych klonów izoluje się plazmidy. Plazmidy te podlegają następnej selekcji metodą analizy restrykcyjnej. Poprawność skłonowania genu muteiny III potwierdza się ostatecznie za pomocą sekwencj onowania DNA.

Etap IV. 1. Ligacja DNA.

OligonukleOtydy otrzymane w etapie I rozpuszcza się w H2O do stężenia 0,5 pg/pl. Następnie miesza się: po 1 pl roztworu każdego oligonukleotydu, 2 pl roztworu fragmentu Ava I-BamHI (etap II), 2 pl wektora trawionego restryktazami EcoRI i BamHI, 5 pl buforu ligacyjnego. 38 pl H2O oraz 1 jedn. (1 pl) DNA ligazy (prod. Pharmacia LKB). Próbkę inkubuje się w temp. 16°C przez 4 godziny.

Etap IV.2. Transformacja.

Etap IV.2.1. Przygotowanie kompetentnych komórek E.coli. szczepu JM105:

Z płytki agarowej z pożywką LB, na której rosną bakterie E.coli JM 105 pobiera się jedną kolonię, którą szczepi się 5 ml pożywki LB. Bakterie hoduje się w temperaturze 37°C przez 18 godz. Z hodowli tej pobiera się 2 ml i dodaje do 100 ml pożywki LB. Bakterie hoduje się do

168 868 momentu gdy gęstość optyczna ODóoo osiągnie 0,3, po czym bakterie zbiera się przez wirowanie (5.000 g, 20 minut, 4°C). Otrzymany osad bakteryjny zawiesza w 15 ml 0,1 M CaCl₂ i inkubuje przez 20 min w temp. 0°C. Bakterie ponownie zwirowuje się (jak wyżej), a osad zawiesza w 3 ml 0,1 M CaCl2 i inkubuje przez 20 minut w 0 C.

Etap IV.2.2. Przygotowanie płytki LB z X-Gal i IPTG:

Do 20 ml sterylnej i ochłodzonej do temperatury 55°C pożywki LB z 1,5% agarem (firmy Difco) dodaje się 40 μΐ X-Gal (firmy Serva), 10 μΐ IPTG (firmy Pharmacia LKB) i 2 mg ampicyliny (Polfa). Po wymieszaniu całość wylewa się na sterylną szalkę Petriego. Płytkę umieszcza się na 18 godzin w cieplarce (37°C).

Etap IV.2.3. Transformowanie komórek kompetentnych przez produkt ligacji:

Do sterylnej probówki dodaje się 200 μ] komórek kompetentnych E.coli JM105 (przygotowanych w etapie IV.2.1), 100 μl 0,1 M CaCl₂ i 20 μl mieszaniny ligacyjnej (otrzymanej w etapie IV. 1). Całość wytrząsa się przez 60 sekund w temp. 37°C, a następnie umieszcza się

1,5 godz. w łaźni lodowej (0°C). Po tym czasie dodaje się 4 ml pożywki LB i inkubuje się bakterie w 37°C przez 1,5 godz.

Na płytkę agarową z X-Gal, IPTG i ampicyliną (przygotowaną w etapie IV .2.2) wylewa się 200 μl mieszaniny transformacyjnej i umieszcza się ją w cieplarce, w 37°C na 18 godzin.

Etap IV.3. Selekcja klonów.

Transformanty bakteryjne rosnące na płytce z X-Gal i IPTG przyjmują kolor niebieski (jeżeli zawierają niezmodyfikowany wektor pUC19) lub biały (jeżeli niosą wektor ze wstawką). Pierwsza selekcja polega na przesianiu białych kolonii bakteryjnych na płytki LB z ampicyliną. Po całonocnej hodowli w 37°C pojedynczymi koloniami z tej płytki szczepi się 5 ml pożywki LB z ampicyliną. Bakterie hoduje się w temperaturze 37°C przez 18 godz.

Etap IV.3.1. Izolacja plazmidów:

Z otrzymanych klonów izoluje się plazmidowy DNA. Preparatyka plazmidowego DNA z 5 ml hodowli jest następująca:

Bakterie zbiera się przez wirowanie przy 5.000 g w temp. 4°C, przez 5 minut. Osad bakteryjny zawiesza się w 200 μl buforu RI i inkubuje w temp. 0°C przez 5 minut. Dodaje się 400 μ] buforu RII (0°C, 5 minut), a następnie 300 μΐ buforu RIII (0°C, 5 minut). Całość wiruje się (13.000 g, 5 minut) i Ί00 μ] supernatantu przenosi się znad osadu do nowej probówki. Do supernatantu dodaje się Ί00 μl wychłodzonego izopropanolu, wymraża 10 minut w temp. -20°C i wiruje (jak wyżej). Osad przemywa się Ί0% etanolem i suszy pod próżnią, a następnie rozpuszcza się w 80 μl buforu TE i dodaje 20 μl roztworu RN-azy (firmy Pharmacia LKB) o stężeniu 1 mg/ml. Całość inkubuje się przez 30 minut w temperaturze 37°C po czym dodaje się 100 μ] fenolu zwirowuje (3 minuty, 5.000 g), zbiera fazę wodną do nowej probówki, dodaje 10 μl 3M octanu sodowego (pH = 5,2) oraz 250 μ] etanolu, po czym wymraża 30 minut w temp. -20°C. Po wirowaniu (15 minut, 15.000 g), przemyciu osadu Ί0% etanolem i wysuszeniu osad plazmidowego DNA rozpuszcza się w 50 μl buforu TE.

Etap IV.3.2. Analiza restrykcyjna plazmidów:

Celem wybrania klonu zawierającego wektor pUC19 z wbudowanym genem muteiny III TNF-α przeprowadza się analizę otrzymanych plazmidowych DNA przy użyciu enzymów restrykcyjnych BamHI i EcoRI, a produkty trawienia rozdziela się w żelu poliakrylamidowym.

Do 20 μl plazmidowego DNA dodaje się 5 μl buforu H, 23 μΐ H₂O, oraz 10 jedn. (1 μΤ) restryktazy EcoRI i 10 jedn. (1 μθ restryktazy BamHI. Mieszaninę inkubuje się przez 30 minut w temp. 37°C. DNA strąca się sposobem opisanym w etapie II.1, a osad rozpuszcza w 10 μ! H₂O.

Produkty trawienia rozdziela się elektroforetycznie w żelu poliakrylamidowym sposobem opisanym w etapie II.2.

Na podstawie analizy obrazu elektroforetycznego fragmentów powstających w wyniku działania restryktaz na DNA otrzymanych plazmidów wybiera się klon zawierający wbudowany fragment o długości odpowiadającej przewidywanym rozmiarom genu muteiny III TNF-α. Klon ten oznacza się pUCTNFMutIII.

168 868

Etap IV.3.3. Preparowanie dużej ilości DNA plazmidów pUCTNFMutIII.

Bakterie zawierające plazmid pUCTNFMutIII hoduje się w 0,51 pożywki LB z ampicyliną przez 18 godzin w temp. 37°C. Następnie izoluje się plazmidowe DNA przy użyciu metody alkalicznej [Birnboim, H.C., Doly I. Nucleic Acids Res. 7, 1513-1521, (1979)].

Bakterie zbiera się przez wirowanie. Uzyskany osad bakteryjny zawiesza się w 50 ml buforu RI i inkubuje przez 5 minut w temp. 0°C, a następnie dodaje się 1)0 ml buforu RII. Po ponownej 5-rrnnutowej inkubacji w 0°C dodaje się 75 ml buforu RIII i pozostawia całość w 0°C na następne 5 minut. Po zakończeniu inkubacji całość wiruje się przy 5000 g przez 30 minut (4°C), zbiera się supernatem, sączy go przez bibułę i dodaje 135 ml izopropanolu. Całość inkubuje się przez 30 minut w temp. pokojowej, po czym wiruje (w tej samej temp.) przy 5000 g przez 30 minut. Osad rozpuszcza się w 6 ml buforu TE i dodaje 0,6 ml roztworu RN-azy o stężeniu 1 mg/ml. Po godzinnym trawieniu w 37°C do próbki dodaje się 2,2 ml PEG i pozostawia się całość w temp. 4°C na 16 godzin. Po zakończeniu inkubacji próbkę wiruje się przy 13000 g przez 10 minut w temp. 4°C. Supernatant usuwa się dokładnie, a osad rozpuszcza się w 2 ml buforu TE. Roztwór ten ekstrahuje się dwukrotnie fenolem i trzykrotnie eterem, po czym DNA strąca się dodając 6 ml 98% etanolu. Po 15-minutowym wymrożeniu próbki w -70°C całość wiruje się przy 12000 g przez 10 minut i dokładnie usuwa supernatant. Osad przemywa się 500.pl 70% etanolu, ponownie wiruje (12000 g, 10 minut) dokładnie usuwa supernatant i pozostały osad suszy pod próżnią. Osad rozpuszcza się w 1ml H2O.

Etap IV.3.4. Oznaczanie sekwencji nuk^^dowej sklonowanego genu muteiny

III TNF-α.

Aby upewnić się, że sekwencja genu sklonowanego w pUCTNFMutIII jest zgodna z planowaną, sekwencjonuje się go metodą Maxama-Gilberta.

Etap V. Przeniesienie genu muteiny III TNF-α do wektora ekspresyjnego.

Gen muteiny III TNF-α, sklonowany w plazmidzie pUCTNFMuIIII, izoluje się z tego plazmidu za pomocą trawienia restryktazami, elektroforezy w żelu poliakrylamidowym oraz elucji z żelu. Tak otrzymany gen łączy się za pomocą ligazy z DNA wektora ekspresyjnego pKK223-3 i klonuje w komórkach E.coli JM 105.

Etap V.1. Izolowanie genu muteiny III TNF-αz plazmidu pUCTNFMutIII.

Do około 100 pg DNA (100 pl) plazmidu pUCTNFMutHl (etap V.3.) dodaje się 25 pl bufom H, 115 pl H2O, oraz 50 jedn. (5 pl) restryktazy EcoRI i 50 jedn. (5 pl) restryktazy HindIII. Całość inkubuje się przez 16 godzin w temperaturze 37°C. Następnie do roztworu dodaje się 6 pl 0,5 M roztworu EDTA, miesza, po czym DNA strąca się dodając 770 pl 98% etanolu. Po 15-rmnutowym wymrożeniu próbki w -70°C całość wiruje się przy 12000 g przez 10 minut i dokładnie usuwa supernatant. Osad przemywa się 50 pl 70% etanolu, ponownie wiruje (12000 g, 10 minut) dokładnie usuwa supernatant i pozostały osad suszy pod próżnią. Wysuszony osad rozpuszcza się w 100 pl H2O. Produkty trawienia rozdziela się w żelu poliakrylamidowym tak jak to opisano w etapie II.2 i izoluje z tego żelu metodą opisaną w etapie II.3.

Etap V.2. Przygotowanie wektora do klonowania.

DNA plazmidu pKK223-3- w ilości 5 pg (10 pl) miesza się z 5 pl buforu H, dodaje 33 pl H2O oraz 10 jedn. (1 pl) restryktazy EcoRI i 10 jedn. (1 pl) restryktazy HindIII. Próbkę inkubuje się w temp. 37°C przez 1 godz., po czym inaktywuje się enzymy przez 30-minutową inkubację próbki w temp. 85°C.

Etap V.3. Klonowanie genu muteiny III TNF-α w plazmidzie ekspresyjnym pKK223-3.

Miesza się ze sobą: 2 pl roztworu fragmentu EcoRI-HindIII (etap V.1), 2 pl wektora trawionego restryktazami EcoRI i HindIII (etap V.2.), 5 pl bufom ligacyjnego, 38 pl H2O oraz 1 jedn. (1 pl) DNA ligazy (prod. Pharmacia LKB). Próbkę inkubuje się w temp. 16°C przez 4 godziny. Mieszaninąligacyjną transformuje się komórki E.coli JM105 takjak to opisano w etapie IV.2 z tym, że do selekcji klonów zamiast płytek LB z ampicyliną, X-gal i IPTG używa się płytek LB z ampicyliną. Selekcję klonów prowadzi się podobnie jak w etapie IV z tym, że nie stosuje się różnicowania barwnego kolonii bakteryjnych ale poprostu -zbiera się kilka kolonii, przesiewa na 5 ml podłoża płynnego LB z ampicyliną, hoduje przez 16 godzin w 37°C i izoluje plazmidy jak opisano w etapie IV.1. Analizę restrykcyjną plazmidów prowadzi się tak samo jak w etapie

168 868

IV.3.2 z tym, że zamiast rest.ryk.tazy BamHI stosuje się restryktazę HindIII. Na podstawie wyników tej analizy wybiera się klon niosący plazmid pKK223-3 ze wstawką o długości ok. 550 pz ograniczoną miejscami restrykcyjnymi EcoRI i HindIII. Plazmid ten oznacza się pKKTNFMutIII.

Przykład Π. Konstrukcja genu muteiny IV TNF-α.

Przeprowadza się chemiczną syntezę dwóch oiigodedksynukieotydów o sekwencjach:

5’ AATTCATGjTTTATGGCTTTTTTTATGATG 3’

5’ TCGGCATCATAAAAAAAGCCATAAACATG 3’

Syntezę prowadzi się tak samo jak to dpi-and w przykładzie I, etap I. Ciąg dalszy procedury tzn. kondensacja i klonowanie genu muteiny IV (zakończone otrzymaniem plazmidu pUCTNFMutIV) oraz przeniesienie tego genu o do wektora ek-preoyjnegd (oznaczonego pKKTNFMutIV) jest prowadzone dokładnie tak samo jak to opisano w przykładzie I.

Przykład III. Konstrukcja genu muteiny V TNF-α.

Przeprowadza się chemiczną syntezę dwóch dhgoUedksynukleotydów o sekwencjach:

5’ AATTCATGGTACGTTCTTCTATAGTAATA 3’

5’ TCGGTATTAGTATAGAAGAACGTACCATG 3’

Syntezę prowadzi się tak samo jak to dpi-and w przykładzie I, etap I. Ciąg dalszy procedury tzn. konstrukcja i klonowanie genu muteiny V (zakończone otrzymaniem plazmidu pUCTNFMutV) oraz przeniesienie tego genu o do wektora ekspresyjnego (oznaczonego pKKTNFMutV) jest prowadzone dokładnie tak samo jak to opisano w przykładzie I.

Przykład IV. Konstrukcja genu muteiny VI TNF-α.

Przeprowadza się chemiczną syntezę dwóch diigoUeoksynukleotydów o sekwencjach:

5’ AATTCATGAGAATAAGAATG 3’

5’ TCGGCATTCTTATTCTCATG 3’

Syntezę prowadzi się tak samo jak to opi-and w przykładzie I, etap I. Ciąg dalszy procedury tzn. konstrukcja i klonowanie genu muteiny VI (zakończone otrzymaniem plazmidu pUCTNFMutVI) oraz przeniesienie tego genu o do wektora ekspresyjnego (oznaczonego pKKTNFMu-VI) prowadzono jak w przykładzie I.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 150 zł

Claims (3)

1. Zastrzeżenie patentowe

   Sposób wytwarzania genów nowych mutein ludzkiego białka TNF-α wykorzystujący kasetową mutagenezę genu białka TNF-α polegającą na zastąpieniu początkowego fragmentu genu parą syntetycznych oligonukleotydów i klonowaniu takiego genu w komórkach gospodarza, znamienny tym, że gen muteiny TNF-α o wzorze X-Y, kodujący białko muteiny TNF-α o wzorze X’ -Y’, tworzy się przez połączenie, drogą enzymatycznej ligacji, częściowo komplementarnej pary syntetycznych oligonukleotydów stanowiącej część X genu ze stałą częścią Y genu, o sekwencji nukleotydowej:

   CCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAACCCTCAAGCTGAGGGGCACACTGTTCGGACATCGGGTACAACATCGTTTGGGAGTTCGACTCCCCGT-GCTGCAGTGGCAGAACCGCCGG6CCAATGCCCTCCTGGCCAATGGCGTGGAGCTG-CGACGTCACCGACTTGGCGGCCCGGTTACGGGAGGACCGGTTACCGCACCTCGAC-AGAGATAACCAGCTGGTGGTACCATCAGAGGGCCTGTACCTCATCTACTCCCAGG-TCTCTATTGGTCGACCACCATGGTAGTCTCCCGGACATGGAGTAGATGAGGGTCC-TCCTCTTCAAGGGCCAAGGCTGCCCGTCGACCCATGTGCTCCTCACCCACACCAT-AGGAGAAGTTCCCGGTTCCGACGGGCAGCTGGGTACACGAGGAGTGGGTGTGGTA-CAGCCGCATCGCCGTCTCCTACCAGACCAAGGTCAACCTCCTCTCTGCGATCAAG-GTCGGCGTAGCGGCAGAGGATGGTCTGGTTCCAGTTGGAGGAGAGACGCTAGTTC-AGCCCCTGCCAGAGGGAGACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGC--TCGGGGACGGTCTCCCTCTGGGGTCTCCCCCGACTCCGGTTCGGGACCATACTCG-CCATCTATCTGG6AGGGGTCTTCCA6CT6GAGAAGGGTGACCGACTCAGCGCTGA-GGTAGATAGACCCTCCCCAGAAGGTCGACCTCTTCCCACTGGCTGAGTCGCGAGT-AATCAATCGGCCCGACTATCTAGACTTTGCCGAGTCTGGGCAGGTCTACTTTGGG-TTAGTTAGCCGGGCTGATAGATCTGAAACGGCTCAGACCCGTCCAGATGAAACCC-ATCATTGCCCTGTGATAG 3'

   -TAGTAACGGGACACTATCCTAG 5' która to stała część Y koduje następującą sekwencję aminokwasową:

   168 868

   ProSerAspLysProVa 1 Al aHisVaI Va 1A1 aAsnProG 1 ri Al aS .1 uG 1 yG 1 nLeu GInT rpLsuAsnnrrArgA l aAsnAl aLeuLLuA laA=nUl yVa lU l uLLuArgAsp AsnGlnLeuVal V alProSLrGluGl y LLuTyrLLuIlLTyrSLryl n V a l Ll u P h l LysUlyGlnGl lCysPcoSsrThrHisValLLuLLuThrHisThc·I leSerArg I Il

   AlaValSlcTirUlnThrLysValAsnLeuLLuSerAlallLLysSLrProCysGln

   ArgG l uThrProU l uU l yA laUluA laLysProTrpTyrG l u.Pro 11 LTyrLLuG l y G l y V alPheUln!_ l uG l u L y s U l y AspArgLeuSe r A l a U l u 11 LAsnArgPrc A sp

   TyrLluAspPheAlaUluSlrUlyUlnValTyrPheUly11lIIlAlaLeu stanowiącą część Y’ białka muteiny TNF-α, a jako wymienne części wych stosuje się następujące pary oligonukleotydów:

   dla muteiny III

   X genów muteinoAATTCATGAAACATAAGAGACATAGACAT

   GTACTTTGTATTCTC^TG^TA^TC^IGsTAtGGCT kodująca sekwencję amiokwasową X’:

   MetLysHisLysArgHisArgHis dla muteiny IV

   TTTTTTTTAGATTS

   SAGAGAGATACrAG

   CATGTTTATGGC

   GTAAAAATACGC
2. 3CT kodująca sekwencję aminokwasową X’:

   MetPheM.etAlaPhePheMetMIet dla muteiny V
3. 5' AATTCAT6GTAC6TTCTTCAATGSATATA 3' ΘΤACCATGCAAGAAGATATCATTATGGCT kodująca sekwencję aminokwasową X’:

   MetV alArgSerSerIleVallle dla muteiny VI

   5' AATTCATGAGAATAAGAATG 3' GTACTCTTATTCTTACSGCT kodującą sekwencję aminokwasową X’:

   MetArglleArgMet po czym połączone części genów muteinowych wprowadza się do odpowiednich wektorów, korzystnie plazmidowych i klonuje w komórkach gospodarza, korzystnie bakterii E.coli.