DK171940B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af polypeptider meden C-terminal carboxamidgruppe, polypeptider til anvendelse ved fremgangsmåden, fusionsproteiner deraf og dertil egnede DNA-sekvenser, plasmider og værtsorganismer - Google Patents
Fremgangsmåde til fremstilling af polypeptider meden C-terminal carboxamidgruppe, polypeptider til anvendelse ved fremgangsmåden, fusionsproteiner deraf og dertil egnede DNA-sekvenser, plasmider og værtsorganismer Download PDFInfo
- Publication number
- DK171940B1 DK171940B1 DK365484A DK365484A DK171940B1 DK 171940 B1 DK171940 B1 DK 171940B1 DK 365484 A DK365484 A DK 365484A DK 365484 A DK365484 A DK 365484A DK 171940 B1 DK171940 B1 DK 171940B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- grf
- formula
- dna sequence
- polypeptide
- polypeptides
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 36
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 27
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 21
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 11
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims description 38
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title claims description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 title description 7
- 125000005392 carboxamide group Chemical group NC(=O)* 0.000 title description 5
- 101710142969 Somatoliberin Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 claims abstract description 11
- 102000038461 Growth Hormone-Releasing Hormone Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 239000000095 Growth Hormone-Releasing Hormone Substances 0.000 claims abstract description 8
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims abstract description 6
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims abstract description 4
- 102100022831 Somatoliberin Human genes 0.000 claims description 33
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 31
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 15
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 14
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 14
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 9
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 claims description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 7
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 claims description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 claims description 5
- 101800000736 Growth hormone-releasing factor Proteins 0.000 claims description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 35
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 30
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 6
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 abstract description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 abstract description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 abstract description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 abstract 1
- 150000003857 carboxamides Chemical group 0.000 abstract 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 abstract 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 13
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 10
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 10
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 8
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 8
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 7
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 7
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- OISVCGZHLKNMSJ-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethylpyridine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=N1 OISVCGZHLKNMSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 4
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- -1 nucleotide amino acid Chemical class 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical group CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 3
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010626 work up procedure Methods 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000005572 Cathepsin A Human genes 0.000 description 2
- 108010059081 Cathepsin A Proteins 0.000 description 2
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 2
- LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000002367 endolytic effect Effects 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 150000002333 glycines Chemical class 0.000 description 2
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- LYGJENNIWJXYER-UHFFFAOYSA-N nitromethane Chemical compound C[N+]([O-])=O LYGJENNIWJXYER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 2
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 2
- OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N phosphorous acid Chemical compound OP(O)O OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000006308 propyl amino group Chemical group 0.000 description 2
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 2
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N (3-aminopropyl)triethoxysilane Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)CCCN WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BWZVCCNYKMEVEX-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-Trimethylpyridine Chemical compound CC1=CC(C)=NC(C)=C1 BWZVCCNYKMEVEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTWJRLJHJPIABL-UHFFFAOYSA-N 2-methylphenol;3-methylphenol;4-methylphenol Chemical compound CC1=CC=C(O)C=C1.CC1=CC=CC(O)=C1.CC1=CC=CC=C1O QTWJRLJHJPIABL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940082584 3-(triethoxysilyl)propylamine Drugs 0.000 description 1
- WLHCBQAPPJAULW-UHFFFAOYSA-N 4-methylbenzenethiol Chemical compound CC1=CC=C(S)C=C1 WLHCBQAPPJAULW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- QCTFKEJEIMPOLW-JURCDPSOSA-N Ala-Ile-Phe Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 QCTFKEJEIMPOLW-JURCDPSOSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- SGYSTDWPNPKJPP-GUBZILKMSA-N Arg-Ala-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O SGYSTDWPNPKJPP-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- CLICCYPMVFGUOF-IHRRRGAJSA-N Arg-Lys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O CLICCYPMVFGUOF-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- BSWHERGFUNMWGS-UHFFFAOYSA-N Asp-Ile Chemical compound CCC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC(O)=O BSWHERGFUNMWGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102100024881 C3 and PZP-like alpha-2-macroglobulin domain-containing protein 8 Human genes 0.000 description 1
- 102000055006 Calcitonin Human genes 0.000 description 1
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800001982 Cholecystokinin Proteins 0.000 description 1
- 102100025841 Cholecystokinin Human genes 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102100021752 Corticoliberin Human genes 0.000 description 1
- 101710113174 Corticoliberin Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N D-alanine Chemical compound C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- 150000008574 D-amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- NWEGIYMHTZXVBP-OCCSQVGLSA-N Dtyr-Val-Gly Chemical compound [O-]C(=O)CNC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]([NH3+])CC1=CC=C(O)C=C1 NWEGIYMHTZXVBP-OCCSQVGLSA-N 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 102400000921 Gastrin Human genes 0.000 description 1
- 108010052343 Gastrins Proteins 0.000 description 1
- NLKVNZUFDPWPNL-YUMQZZPRSA-N Glu-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O NLKVNZUFDPWPNL-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- VGOFRWOTSXVPAU-SDDRHHMPSA-N Glu-His-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)O VGOFRWOTSXVPAU-SDDRHHMPSA-N 0.000 description 1
- 102100031132 Glucose-6-phosphate isomerase Human genes 0.000 description 1
- 108010070600 Glucose-6-phosphate isomerase Proteins 0.000 description 1
- IEFJWDNGDZAYNZ-BYPYZUCNSA-N Gly-Glu Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O IEFJWDNGDZAYNZ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 101000741445 Homo sapiens Calcitonin Proteins 0.000 description 1
- 101150017040 I gene Proteins 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- IRMLZWSRWSGTOP-CIUDSAMLSA-N Leu-Ser-Ala Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O IRMLZWSRWSGTOP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 108010007013 Melanocyte-Stimulating Hormones Proteins 0.000 description 1
- 108010036176 Melitten Proteins 0.000 description 1
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010002311 N-glycylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 102400000050 Oxytocin Human genes 0.000 description 1
- 101800000989 Oxytocin Proteins 0.000 description 1
- XNOPRXBHLZRZKH-UHFFFAOYSA-N Oxytocin Natural products N1C(=O)C(N)CSSCC(C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C1CC1=CC=C(O)C=C1 XNOPRXBHLZRZKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 108091036333 Rapid DNA Proteins 0.000 description 1
- RZEQTVHJZCIUBT-WDSKDSINSA-N Ser-Arg Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N RZEQTVHJZCIUBT-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 229910002808 Si–O–Si Inorganic materials 0.000 description 1
- OJRNZRROAIAHDL-LKXGYXEUSA-N Thr-Asn-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O OJRNZRROAIAHDL-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- BURPTJBFWIOHEY-UWJYBYFXSA-N Tyr-Ala-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 BURPTJBFWIOHEY-UWJYBYFXSA-N 0.000 description 1
- 108010003205 Vasoactive Intestinal Peptide Proteins 0.000 description 1
- GXBMIBRIOWHPDT-UHFFFAOYSA-N Vasopressin Natural products N1C(=O)C(CC=2C=C(O)C=CC=2)NC(=O)C(N)CSSCC(C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C1CC1=CC=CC=C1 GXBMIBRIOWHPDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010004977 Vasopressins Proteins 0.000 description 1
- 102000002852 Vasopressins Human genes 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000010640 amide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011260 aqueous acid Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- KBZOIRJILGZLEJ-LGYYRGKSSA-N argipressin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N1)=O)N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(N)=O)C1=CC=CC=C1 KBZOIRJILGZLEJ-LGYYRGKSSA-N 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 description 1
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 125000005521 carbonamide group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- AOXOCDRNSPFDPE-UKEONUMOSA-N chembl413654 Chemical compound C([C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@H](CCSC)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 AOXOCDRNSPFDPE-UKEONUMOSA-N 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940107137 cholecystokinin Drugs 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 229930003836 cresol Natural products 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- OKKJLVBELUTLKV-MICDWDOJSA-N deuteriomethanol Chemical compound [2H]CO OKKJLVBELUTLKV-MICDWDOJSA-N 0.000 description 1
- HPYNZHMRTTWQTB-UHFFFAOYSA-N dimethylpyridine Natural products CC1=CC=CN=C1C HPYNZHMRTTWQTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 229940045644 human calcitonin Drugs 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- VDXZNPDIRNWWCW-UHFFFAOYSA-N melitten Chemical compound NCC(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NCC(=O)NC(C)C(=O)NC(C(C)C)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)C)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)NCC(=O)NC(CC(C)C)C(=O)N1CCCC1C(=O)NC(C)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(N)=O)CC1=CNC2=CC=CC=C12 VDXZNPDIRNWWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- CAAULPUQFIIOTL-UHFFFAOYSA-N methyl dihydrogen phosphate Chemical group COP(O)(O)=O CAAULPUQFIIOTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 125000004573 morpholin-4-yl group Chemical group N1(CCOCC1)* 0.000 description 1
- PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylpyridin-2-amine Chemical compound CN(C)C1=CC=CC=N1 PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 1
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 1
- 230000000720 neurosecretory effect Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- XNOPRXBHLZRZKH-DSZYJQQASA-N oxytocin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](N)C(=O)N1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(N)=O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 XNOPRXBHLZRZKH-DSZYJQQASA-N 0.000 description 1
- 229960001723 oxytocin Drugs 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 125000001302 tertiary amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 150000003536 tetrazoles Chemical class 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229960003726 vasopressin Drugs 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- VNDYJBBGRKZCSX-UHFFFAOYSA-L zinc bromide Chemical class Br[Zn]Br VNDYJBBGRKZCSX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- SFVVQRJOGUKCEG-OPQSFPLASA-N β-MSH Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H]2C(COC(=O)[C@@](O)([C@@H](C)O)C(C)C)=CCN21 SFVVQRJOGUKCEG-OPQSFPLASA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/60—Growth hormone-releasing factor [GH-RF], i.e. somatoliberin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
i DK 171940 B1
Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af polypeptider med en C-terminal carboxamidgruppe, poly-peptider til anvendelse ved fremgangsmåden, fusionsproteiner deraf og dertil egnede DNA-sekvenser, plasmider og værts-5 organismer.
Den direkte genteknologiske syntese af polypeptider med en C-terminal carboxamidgruppe er ikke mulig. Der er dog isoleret en hel række naturlige peptider med en C-ter-minal carboxamidgruppe, såsom PHI, VIP, CRF, nervevækstfak-10 tor, oxytocin, cholecystokinin, gastrin, calcitonin, vasopressin, mellitin, melanotropin og især den væksthormonfrigørende faktor, der herefter vil blive kaldt GRF.
GRF dannes i hypothalamus og stimulerer i hypofysen sekretionen af væksthormonet. Tidligere kunne GRF dog ikke 15 isoleres fra ekstrakter af humanhypothalamus. Fra en pan-kreastumor hos mennesker kunne man dog isolere et peptid bestående af 44 aminosyrer, som in vitro og in vivo udviser GRF-aktivitet (R. Guillemin m.fl.. Science 218 (1982) 585--587). Dette peptid har følgende aminosyresekvens: 20 H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Art-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2.
I EP-A-0.070.675 diskuteres, at man kunne fremstille 25 humant calcitonin ved, at man først fremstiller et forprodukt, ved hvilket der ved den C-terminale ende translateres et yderligere glycin. Dette glycin skal derefter omdannes enzymatisk til en carboxamidgruppe af den foregående aminosyre. Denne omdannelse skal foretages med gær-carboxypep-30 tidase Y.
Det fremgår imidlertid af en artikel af Breddam et al., Carlsberg Res. Commun., bind 45, side 237-247 (1980), at gær-carboxypeptidase Y ikke er egnet til gennemførelse af denne omdannelse (jf. skema 1 på side 244).
35 I en artikel af A.F. Bradbury et al., "Mechanism of C-terminal amide formation by pituitary enzymes", Nature, bind 298, nr. 5874, side 686-688 (12. august 1982), anføres, 2 DK 171940 B1 at på grund af den almindeligt kendte substratspecificitet af enzymer hydrolyserer det dér beskrevne homogenisat af svinehypofyser tripeptiderne D-Tyr-Val-Gly eller tripeptider, hvori valinet i position 2 er erstattet med Phe eller Gly, 5 men ikke hvori valin er erstattet med D-Ala, Lys eller Asp (side 688, 3. afsnit).
I en artikel af I. Husain et al., FEBS Letters, bind 152, side 277-281 (1983), anføres yderligere, at det dér beskrevne enzym fra neurosekretoriske granula i hypofysen 10 hos okser hydrolyserer peptidet <Glu-His-Pro-Gly.
Ingen af de ovenfor anførte artikler beskriver følgelig, at et peptid med -Leu-Gly som C-terminus kan hydrolyseres. Det fremgår heller ikke af artiklerne, om de beskrevne enzymer ikke også har en endolytisk aktivitet, hvilket er 15 af betydning, fordi GRF har glyciner som potentielle angrebspunkter i positionerne 15, 32 og 39 (jf. den ovenfor anførte polypeptidsekvens). Herudover skal det bemærkes, at de i artiklen af Bradbury et al. anvendte forsøgssubstrater er tripeptider med en N-terminal D-aminosyre. Anvendelsen af 20 sådanne substrater er et kunstgreb, som ganske vist forøger peptidernes stabilitet, men samtidig fører til en struktur som ikke kan sammenlignes med strukturen af naturlige substrater, som naturligvis kun indeholder L-aminosyrer.
På denne baggrund må det derfor betragtes som over-25 raskende, at det ifølge opfindelsen nu har vist sig, at et homogenisat af svinehypofyser har -Leu-Gly-specificitet. løvrigt er det nævnte homogenisat af svinehypofyser også fordelagtigt frit for enhver endolytisk aktivitet.
Herved åbnes mulighed for en genteknisk/enzymatisk 30 fremstilling af polypeptider med en C-terminal gruppe -Leu-CONH2 og især peptider med GRF's aminosyresekvens og delsekvenser af sådanne peptider.
Opfindelsen angår således: 1) En fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid 35 med formlen
Y - R - NH2 I
3 DK 171940 B1 hvor Y er en methioningruppe eller en via methionin bundet gruppe af et bakterieprotein, og R er en peptidsekvens af aminosyrer, der kan kodes genetisk, og hvor den sidste aminosyre 5 er leucin, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at et polypeptid med formlen
Y - R - NH - CH2 - COOH II
10 hvori Y og R har de ovenfor angivne betydninger, fremstilles genteknisk, og produktet omdannes enzymatisk til polypeptidet med formlen I ved hjælp af et homogenisat af svinehypofyser.
R betyder fortrinsvis aminosyresekvensen (GRF 1-n), 15 hvor GRF er væksthormonfrigørende faktor, og n er 16 til 44.
2) Et polypeptid med formlen
Met - R - NH - CH2 - COOH Ila hvor R har den ovennævnte foretrukne betydning, og n er 44.
20 3) Et polypeptid med formlen
H - R - Gly IV
hvor R er GRF's aminosyresekvens, idet der dog i stilling 25 27 er Leu i stedet for Met.
4) Fusionsproteiner, som er ejendommelige ved, at de har den ovenfor angivne formel II, hvor R har den ovenfor anførte foretrukne betydning, og n er 44, idet et bakterielt protein er bundet til methioningruppens aminogruppe.
30 5) En DNA-sekvens, som er ejendommelig ved formlen
5' - AA TTC ATG - -CTG CA
(GRF 1-22) V
3' - G TAC - -G
hvor (GRF 1-22) er codonerne for aminosyrerne 1-22 i GRF.
35 4 DK 171940 B1 6) En DNA-sekvens, som er ejendommelig ved formlen
G - - GGT TAA TAG
(GRF 25-44)
5 3' - AC GTC - - CCA ATT ATC AGC T
VI
hvor (GRF 25-44) er codonerne for aminosyrerne 25-44 i GRF.
10 7) En DNA-sekvens, som er ejendommelig ved formlen
5' - AA TTC ATG - -GGT TAA TAG
(GRF 1-44)
3’ - G TAC - -CCA ATT ATC AGC T
15
VII
hvor (GRF 1-44) er codonerne for aminosyrerne 1-44 i GRF.
8) Hybridplasmider, som er ejendommelige ved, at de 20 mellem et EcoRI- og et Pstl-spaltningssted indeholder en DNA-sekvens med formlen V.
9) Hybridplasmider, som er ejendommelige ved, at de mellem et PstI- og et Sall-spaltningssted indeholder en DNA-sekvens med formlen VI.
25 10) Hybridplasmider, som er ejendommelige ved, at de mellem et EcoRI- og Sall-spaltningssted indeholder en DNA--sekvens med formlen VII.
11) E. coli-værtsorganismer, som er ejendommelige ved, at de indeholder hybridplasmiderne som defineret oven-30 for.
Den genetiske kode er som bekendt "degenereret", dvs. at kun to aminosyrer indkodes af en nucleotidtriplet, medens der til de øvrige 18 aminosyrer, der kan kodes, hører 2-6 tripletter. Til syntese af genet for GRF med den ovenfor 35 anførte aminosyresekvens findes derfor en uoverskuelig mængde codonmuligheder. Det har imidlertid vist sig, at DNA-sekvens I er særlig fordelagtig.
5 DK 171940 B1 I 5'-enden af den indkodende streng findes en vedhængende DNA-sekvens svarende til restriktionsendo-nuclease EcoRI, i 3'-enden af den indkodende streng derimod den enkeltstrengede vedhængende sekvens, der 5 svarer til restriktionsenzymet Sall. Disse to indbyrdes forskellige genkendelsessekvenser sørger for indsætning af DNA i plasmider i den ønskede orientering.
Mellem disse genkendelsessekvenser og codo-nerne for aminosvrerækkefølgen findes i 5'-enden på 10 den indkodende streng codonet for aminosyren methio-nin (som i DNA-sekvensen I har tallet 0). I enden på denne streng følger efter den triplet, der koder for leucin, codonet 45 for glycin og 2-terminationstriplet-ter.
15 Et internt enkelt skæringsted for restrik tionsenzymet PstI (i codon 24 på den indkodende streng eller codon 23 på den ikke-indkodende strena) muliggør subKLoning af to genfragmenter, som kan indbygges i vel undersøgte kloningvektorer, såsom ca. pBR322 el-20 ler pUC8. Desuden indbygges inden for strukturgenet en række yderligere singulære genkendelsessekvenser for restriktionsendonucleaser, som skaffer adgang for GRF's delsekvenser: 25 Peptidfragment
Restriktions- Snit eft. nukleotid aminosyre enzym_nr. (indkod, streng)_fra til_
Pvu II 56 1-16
PstI 79 1-24 30 Xba I 90 1-29
Hinf I 105 1-34
Bst N I 114 1-36
Xho I 127 1-41 35 DK 171940 B1 0 6 DNA-Sekvensen I kan opbygges af 13 oligonu-cleotider med en længde på 18-20 nucleotider, idet denne først syntetiseres kemisk og derefter bindes enzymatisk via "klæbrige ender" af 4-6 nucleotider.
5 Ved DNA-sekvens I er der endvidere taget hen syn til, at de aminosyrer, hvortil der skal knyttes flere codoner, ikke er ækvivalente, men frembyder flere forskellige præferencer i den pågældende værtscelle såsom Escherichia coli. Desuden reduceres palindrome sekven-10 ser til det mindst mulige.
DNA-Sekvens I's genstruktur er således let tilgængelig ud fra relativt små byggesten, muliggør sub-kloning af to genfragmenter til velkendte vektorer og tillader disses ekspression i stort udbytte. Afhængigt 15 af indsætningen af det syntetiske gen i kloningsvektoren eksprimeres det ønskede peptid med GRFs aminosyre-sekvens umiddelbart eller i form af et fusionsprotein med et bakterielt protein såsom β-galactosidase. Sådanne fusionsproteiner bliver derpå på i og for sig kendt 20 måde spaltet kemisk eller enzymatisk.
Som eksempel på en delsekvens, der fører til et peptid med GRFs første 16 aminosyrer med endestillet carbonamidgruppe (og en methioningruppe i aminoenden), kan nævnes en modificeret DNA-sekvens I, hvor tripletter-25 ne nr. 45-57 bindes umiddelbart ved triplet nr. 16. Noget tilsvarende gælder for de peptidfragmenter, der er anført i den foregående tabel og som har aminosyrerne indtil nr. 24, 29, 34, 36 og 41. Analogt kan f.eks. også en delsekvens med de første 26 aminosyrer frem-30 stilles.
Som eksempel på et modificeret GRF kan nævnes et polypeptid, hvor methioninet i stilling 27 er erstattet med leucin. Hertil erstattes i DNA-sekvens I
tripletten nr. 27 med følgende: 35 7 DK 171940 B1 27
Leu
CTG
GAC
5 Yderligere variationer fremgår af DNA-sekvens II, hvorudfra - af hensyn til forenkling - kun den in-kodende streng er vist.
Når R er GRF's aminosyresekvens, idet der i stilling 27 er Leu, kan methioninet i aminoenden skil-10 les fra ved hjælp af bromcyanfraspaltning. Hvis der ved den gentekniske syntese fås et fusionsprotein, fjernes den uønskede del i bakterieproteinet ved bromcyanf raspaltningen.
Indsætningen af det syntetiske gen eller gen-15 fragment i kloningsvektorerne, f.eks. plåsmiderne pUC 8, pBT 322, pKK 177.3, ptac 11 og andre i handelen værende eller alment tilgængelige plasmider sker på i og for sig kendt måde. I denne forbindelse henvises til Maniatis' lærebog (Molecular Cloning, Maniatis m.fl., 20 Cold Spring Harbor, 1982).
Transformationen af de således opnåede hy-bridplasmider i egnede værtsorganismer, bedst E. coli, er ligeledes i og for sig kendt og nøje beskrevet i den lige nævnte lærebog. Udvindingen af det eksprimérede 25 protein, bromcyanspaltningen og oparbejdningen er beskrevet af Guillemin ovenfor.
Opfindelsen vil i det følgende blive forklaret ved hjælp af eksempler, i hvilke der forklares y-derligere udførelsesformer for opfindelsen, og af dis-30 se vil der for fagmanden fremgå mange mulige modifikationer og kombinationer. Procentangivelserne er her beregnet på vægt, når andet ikke er anført.
35 DK 171940 B1 0 8
Eksempel 1
Kemisk syntese af enkeltstrenget oligonucleotid
Med genbyggesten la som eksempel, der omfatter nucleotiderne 1-27 i den indkodende streng, forkla-5 res syntesen af genbyggesten. Ved hjælp af kendte metoder (M.J. Gait m.fl., Nucleic Acids Res. 8 (1980) 1081-1096) bindes det i 3'-enden værende nucleosid, i det foreliggende tilfælde også adenosin (nucleotid nr. 27) 'rS) covalent til kieselgel("Fractosil"^ fra firma Merck) 10 via 3'-hydroxyfunktionen. Herved omsættes først kie- selgelen under fraspaltning af ethanol med 3-(triethoxy-silyl)-propylamin, hvorved der opstår en Si-O-Si-binding.
g
Adenosinet omsættes som N -benzoyl-3’-0-succinoyl-5'-di-methoxytritylether i nærvær af paranitrophenol og N,N'-15 -dicyclohexylcarbodiimid med den modificerede bærer, idet succinoylgruppens frie carboxygruppe acylerer pro-pylamingruppens aminogruppe.
I de følgende syntesetrin anvendes som basekomponent 5'-O-dimethoxytrityl-nucleosid-3'-phosphorsvre-20 -monomethylester-dialkylamid eller -chlorid, hvor adeni- net forekommer som N^-benzoylforbindelse, cvtosinet som 4 2 N -benzoylforbindelse, guaninet som N -isobutyrylforbin- delse^ og tymin, der ikke indeholder nogen aminogruppe, er uden beskyttelsesgruppe.
25 100 mg af den polymere bærer, der indeholder 4^umol bundet adenin, behandles i rækkefølge med følgende stoffer: (a) Nitromethan (b) Mættet zinkbromidopløsning i nitromethan 30 med 1% vand (c) Methanol (d) Tetrahydrofuran (e) Acetonitril (f) 80^umol af det tilsvarende nucleosidphos- 35 phit og 400^umol tetrazol i 1 ml vandfri acetonitril (5 minutter) 0 DK 171940 B1 9 (g) 20% acetanhvdrid i tetrahvdrofuran med 40% lutidin og 10% dimethylaminopyridin (2 minutter) (h) Tetrahvdrofuran 5 (i) Tetrahydrofuran med 20% vand og 40% luti din (j) 3% jod i kollidin/vand/tetrahydrofuran i volumenforholdet 5:4:1 (k) Tetrahydrofuran 10 (1) Methanol
Ved "phosphit" skal her forstås desoxyribo-se-3’-monophosphorsvre-monomethylester, idet den 3. valens er mættet med chlor eller en tertiær aminogruppe, f.eks. en morpholinogruppe. Udbytterne af de enkelte 15 syntesetrin kan måles spektrofotometrisk efter detrity- leringsreaktionen (b) ved måling af dimethoxytritylkat-ionens absorption ved en bølgelængde på 496 nm
Efter afsluttet syntese af oligonucleotidet fraspaltes oligomerens methylphosphatbeskyttelsesgrupper 20 ved hjælp af p-thiokresol og triethylamin. Derpå fraskilles oligonucleotidet fra den faste bærer ved en 3 timer lang behandling med ammoniak. Ved en behandling i 2-3 dage af oligomeren med koncentreret ammoniak fraspaltes basernes aminobeskyttelsesgrupper kvantitativt.
25 Det således opnåede råprodukt renses ved højtryksvæske-chromatografi (HPLC) eller ved polyacrylamid-gelelektro-phorese.
Ganske på tilsvarende måde syntetiseres også de øvrige genbyggesten iB-IIG, hvis nucleotidrækkefølge 30 fremgår af DNA-sekvensen III.
Eksempel 2
De enkeltstrengede oligonucleotiders enzymatiske binding til genfragmenterne I og II
35 Med henblik på phosphorvlering af oligonucleo- dierne i 5’-endestillingen behandles hver 1 nmol af oli-gonucleotiderne la og Ib med 5 nmol adisonintriphosphat 10 DK 171940 B1 o med 4 enheder T4-polynucleotid-kinase i 20^,ul 50 mmolær tirs-HCl-puffer (pH 7,6), 10 mmolaer magnesiumchlorid og 10 mmolaer dithiothreitol (DDT) i 30 minutter ved 37°C (C.C. Richardson, Progress in Nucl. Acids Res. 2 (1972), 5 825). Enzymet deaktiveres ved 5 minutters opvarmning til 95°C. Derpå hybridiseres oligonucloetiderne la og Ib mod hinanden, idet man opvarmer dem i vandig opløsning i 2 minutter til 95°C og derpå afkøler langsomt til 5°C.
10 Analogt phosphoryleres oligonucleotiderne Ic og Id samt le og If og hybridiseres parvis.
Til genfragmentet II hybridiseres oligonu— cleotiderne Ila med Ilb samt Ilf med lig parvis, og de tilbageblevne oligonucleotider Ile, Ild og Ile hybri-15 diseres fælles.
De således opnåede tre oligo-nucleotidpar til genfragmentet I eller de to oliac-nucleotidpar og oli-go-nucleotidtripel til genfragment II ligeres på følgende måde: 20 De dobbeltstrengede nucleotider kombineres og ligeres i hhv. 40^ul 50 mmolaer tris-HCl-puffer, 20 mmolaer magnesiumchlorid og 10 mmolaer DTT ved hjælp af 100 enheder T4-DNA-ligase ved 15°C i løbet af 16 timer.
Rensningen af genfragmenterne I og II sker 25 ved hjælp af gelelektrophorese på en 15%'s polyacryla-midgel (uden urinstoftilsætning, 20 x 40 cm, 1 mm tyk), idet der som mærkningstof anvendes "ØX 174 DNA" (firma BRL), skåret med Hinf I.
30 Eksempel 3
Fremstilling af hybridplasmider, som Indeholder genfragmenterne I og II
(a) Indsætning af genfragment I 1 pBR 322.
Plasmid pBR 322, der findes på markedet, åb-35 nes på kendt måde med restriktionsendonucleaserne EcoRI og PstI som anvist af producenten. Nedbrydningsmateria- DK 171940 B1 11 o 1st fraskilles på kendte måde på en 5%'s polyacrylamid-gel ved hjælp af elektrophorese, og brudstykkerne gøres synlige ved hjælp af farvning med ethidiumbromid eller ved hjælp af radioaktiv mærkning ("nick-translation" 5 ifølge Maniatis, ovenfor). Plasmidbåndene udskæres derpå fra acrylamidgelen og fraskilles elektrophoretisk fra polyacrvlamidet.
l^ug plasmid ligeres så med 10 ng genfragment I natten over ved 16°C. Herved fås det i fig. 1 viste 10 hybridplasmid.
(b) Indsætning af genfragmentet II i pTJC 8.
Analogt med (a) udskæres det i handelen værende plasmid pUC 8 med PstI og Sall og ligeres med genfragmentet II. Der fås det på fig. 2 viste hybridplasmid.
15 (c) Indsætning af et modificeret genfragment.
Analogt med (b) kan også et modificeret genfragment II indsættes, hvor - som for DNA-sekvensen II i nucleotid-tripletten nr. 27-codonet for leucin indsættes.
Dette modificerede genfragment II fås ved en tilsvarende 20 modificeret syntese af genbyggestenene Ila og Ilb, idet sekvensen ATG i byggesten Ila erstattes med CTG og tilsvarende i genbyggesten Ilb sekvensen TAC erstattes med GAC.
25 Eksempel 4
Syntese af det komplette gen (a) Transformation og amplifikation.
De således opnåede hybridplasmider transformeres i E. coli. Hertil gøres stammen E. coli K 12 egnet 30 ved behandling med en 70 mmolær calciumchloridopløsning og tilsættes suspensionen af hybridplasmidet i 10 mmolær tris HCl-puffer (pH 7,5) eller 70 mmolær calciumchlorid-opløsning. De transformerede stammer selektioneres som vanligt ved udnyttelse af de ved hjælp af plasmidet op-35 nåede antibiotikaresistenser eller -sensibiliteter, og hybridvektorerne amplificeres. Efter at cellerne er dræbt>isoleres hybridplasmiderne, opskæres med de oprin- 0 12 DK 171940 B1 deligt anvendte restriktionsenzymer, og genfragmenterne I og II isoleres ved gelelektrophorese.
(b) Binding af genfragmenterne.
De ved amplifikation opnåede genfragmenter la 5 og Ib bindes enzymatisk som beskrevet i eksempel 2, og det således opnåede syntetiske gen indsættes sammen med DNA-sekvensen I i kloningsvektorer.
Eksempel 5 10 Syntese af hybridplasmider, der indeholder det komplette gen (a) Indsætning i pKK 177.3
Ekspressionsplasmidet pKK 177.3 (plasmid ptac 11, Amman ro.f1., Gene 1983, 167-178, hvor der i EcoRI-15 genkendelsesstedet syntetisk indsættes en sekvens, som indeholder et Sall-skæringssted) åbnes med restriktionsenzymerne EcoRI og Sall og ligeres med det syntetiske gen svarende til DNA-sekvensen I. Herved anbringes det indsatte gen bag ved plasmid pKK 177.3's regulationsre-20 gion. Efter tilsætning af en egnet igangsætter såsom isopropyl-fi-thiogalacto-pyrancsid (IPTG) dannes et mRNA, som fører til ekspression af polypeptidet Met-GRF-Gly.
(b) Indsætning i pWHl
Ekspressionsplasmidet pWHl består af en pBR 25 322-andel og af genet for 8-galactosidase med dettes re-gulationsregion (fig. 3 på tegningen). Til fremstilling heraf skæres lO^ug pBR 322 med restriktionsendonucleaser-ne EcoRI og PvuII og adskilles elektrophoretisk i 5%'s polyacrylamidgel. Efter at DNS-båndet er gjort synligt 30 med ethidiumbromid (eller ved radioaktiv mærkning), udskæres det største bånd (2292 basepar) fra gelen og befries ved elektroeluering fra polyacrylamid. Fra en Lac-trans-ducerende phag såsom Λ. eller 0 80 dlac udspaltes genet for 8-galactosidase ved omsætning med EcoRI og delvis 35 omsætning med Pvu II. Analogt med den ovenfor beskrevne oparbejdning isoleres et fragment på ca. 3185 nucleotid-par. Dette fragment bærer Lac-operonets intakte regula- 13 DK 171940 B1 0 tionsregion og β-galactosidasens genetiske information med aminosyrerne 1-1005. Ved ligering af dette Lac--DNA-fragment i DNA-fragmentet fra plasmidet pBR 322 fås plasmidet pWH 1 med regulationsregionen fra Lac-operon, 5 β-galactosidases kodningssekvens (aminosyrerne 1 til 1005), ampicillin-resistensgenet fra pBR 322 og replika-tionsregionen fra pBR 322. Derved kan Lac-operonets naturlige regulationsregion erstattes med vilkårlige svnte-tiske regulationsregioner såsom eksempelvis tac. Dette 10 plasmid indeholder ved β-galactosidases aminosyre 1005 et enestående EcoRI-skæringssted, som kan benyttes som kloningssted for eukaryotiske gener.
Til DNA-sekvensen I kan der ligeres en kemisksyntetisk kobler, som indeholder genkendelsessekvenserne 15 for restriktionsenzymerne Sall og EcoRI:
5'-TCGACGCCCG
GCGGGCTTA-5' 20 Efter restriktionsenzymkløvning med EcoRI fås et DNA-fragment flankeret af EcoRI-genkendelsessekvenser.
Et sådant fragment kan derefter integreres i det med EcoRI åbnede plasmid pWHl.
Hertil åbnes pWHl med EcoRI og dephosphoryli-25 seres med bakteriel alkalisk phosphatase i EcoRI-brud- stedets 5'-ender. Herved forhindres en ligering af plasmidet med sig selv, og "baggrunden" af transformerede bakteriekulturer med ikke rekombinant plasmid reduceres betydeligt. Kun sådanne plasmider kan sluttes ringfor-30 migt, som har et genfragment integreret med flankerende EcoRI-genkendelsessekvenser.
Eksempel 6
Transformation af hybrldplasmider 35 Kompetente E. coli-celler transformeres med 0,1-l^ug plasmid pWHl, som sammenligeres med lO^ug GRF-gen og udstryges på ampicillin-agarplader. Derpå kan 0 14 DK 171940 B1 integrationen af GRF-genet og dets integrationsretning i plasmidet bestemmes ved hurtig DNA-oparbejdning (Ma-niatis, ovenfor).
5 Eksempel 7
Ekspression
Efter transformation af disse hvbridplasmider i E. coli eksprimeres et fusionsprotein, som i Met-GRF-sekvensens aminoende bærer β-galactosidases 1005 amino- 10 syrer. Efter bromcyanspaltning fås et GRF-Gly-derivat.
Analogt hermed fås modificerede GRF-proteiner, f.eks. det produkt, hvor der som aminosyre nr. 27 er leu-cin i stedet for methionin.
15 Eksempel 8
Oparbejdning og rensning
Bakteriestammerne, der er dyrket til den ønskede optiske tæthed, induceres med en egnet induktor, f. eks. IPTG, i tilstrækkelig lang tid, f.eks. 2 timer.
20 Herefter dræbes cellerne med 0,1% kresol og 0,1 mmolær phenylmethyl-sulfonylfluorid (benzylsulfonylfluorid).
Efter centrifugering eller filtrering opbrydes cellemassen i en vandig-sur opløsning ved pH 3,0 i et egnet apparat (French Presse eller "Dyno-mølle'^j, hvorpå de 25 uopløselige bestanddele centrifugeres fra. Fra det o-venpå flydende lag isoleres proteinerne ved hjælp af Guillemin's (se ovenfor) metode. Ved hjælp af HPLC-analyseteknik kontrolleres produktets berigelse og renhed.
30 Methioninet (eller ved fusionsproteiner også den del af det til methioninet bundne bakterieprotein såsom β-galactosidase) fraskilles ved bromcyanspaltning, og GRF-derivatet ekstraheres surt og renses (Guillemin ovenfor).
35 Fusionproteiner med en Ø-galactosidaseandel kan allerede i råekstrakten af de lyserede bakterier 0 15 DK 171940 B1 på grund af deres strømningsegenskaber, der afviger fra autentisk fi-galactosidase, påvises ved gelelektro-phorese. Efter bromcyanspaltningen bestemmes - som nævnt ovenfor - GRF-derivatets renhedsgrad og berigel-5 se tillige med varianterne deraf ved hjælp af HPLC.
Karakteriseringen af produkter med hensyn til GRF-aktivitet kan ske immunologisk og biologisk.
Ved en radioimmunanalyse reagerer det bakteriologisk fremstillede GRF og varianter deraf med et 10 antistof mod syntetisk GRF med aminosyresekvensen 1-44. Radioimmunanalysen udformes bedst som indirekte immunfældningsanalyse med anti-GRF-antistof og anti-IgG-an-ti-GRF-antistof. Radioimmunanalysens følsomhed er 10 ng GRF.
15 Ved den biologiske prøve afprøves det bak teriologisk fremstillede produkt og varianter heraf på rotter med hensyn til væksthormonfrigørelse. Hertil anvendes anæstetiserede rotter, der får indgivet produktet eller varianter heraf intravenøst, og fri-20 gøreisen af væksthormonet i rotterne blod påvises radioimmunologisk .
25 30 35 DK 171940 B1 16
DNA-Sequens I
Triplet-nr. 0 12 3
Aminosyre Met Tyr Ala Asp
Nucleotid-nr. 15 10 15
Indkoaende streng 5‘ AA TTC ATG TAC GCT GAC
5 Ikke-inakodende streng 3» G TAC ATG CGA CTG
4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 .Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val 20 25 . 30 35 40 45
10 GCT ATC TTC ACT AAC TCT TAC CGT AAA GTT
CGA TAG AAG TGA TTG AGA ATG GCA TTT CAA
14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
Leu Gly Gin Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu 15 50 55 60 65 70 75
CTG GGT CAG CTG TCT GCT CGT AAA CTG CTG
GAC CCA GTC GAC AGA CGA C-CA TTT GAC GAC
24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 20 Gin Asp Ile Met Ser Arg Gin Gin Gly Glu 80 85 90 95 100 105
CAG GAC ATC ATG TCT AGA CAG CAG GGT GAA
GTC CTG TAG TAC AGA TCT GTC GTC CCA CTT
25 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43
Ser Asn Gir. Glu Arg Gly Ala Arg Ala Arg 110 115 120 125 130 135
TCT AAC CAG GAA CGT . GGT GCT CGA GCT CGT
AGA TTG GTC CTT GCA CCA CGA GCT OGA GCA
30 44 45 46 47
Leu Gly Stp Stp 140 145 149 CK3 GGT TAA TAG 3' 35 GAC CCA ATT ATC AGC T 5' DK 171940 B1 17
M
O
Vi oo Η m ft) r~- O *> 3 r-cbO 9
- fc g S ™ å S ~ 8'k M
O ^
cm c w bo vo o tt> OH«fl rfj n & r> S
«- cu >> t- cm η μ 3Τ υ m c u t-< y c -i c cm o c , , ,
Vi Vi u Vr «£
Q) tt) ft) ft) O
«— H bo in oo O. 3 O' h >) M μ Ζί M Z^ *· *- O t. W C B H OO O Μ V.
O c O C O OS O C 4> <D 0) ft) < ij ϋ u < < out. st =r cm oo ε bo c η h o c c
T~ < t>> CM < Η ·Η OO M i- r—I
M M O O X O C O II II II II II
o o o w m e
O' h I- 0003 f- < 3 CO Ό U .C M
O ft) CM H tt) OO C i—i
t-* CO O J O O
U C < Έ- O
CO O C C-, CM O 3 vO O C Vi Vi Vi Vi Vi « .¾ ™ ft C) ^ < rJ ft) ft) tt) tt) tt)
<<C0 OJ U O Μ Μ Μ Μ M
r—( rH i—i i—i M
,{D ft) 0) 0) 0) t— §-< J- *- c ra inuc
O JC CM C >> OO <C to H C O O' O
C c—* C _3 C C
II II II II II
Λ Γ· (M OO 3· ΙΛ
rn vO O tt) O Η M 3 h V M
Si [-< sz nul oo φ ο t- ~ m o- O c *σ to c
Vi 4-) tn in o o σ\ h to oo -¾ 3 c— o o.
H M ·— QiH OO C M 3 < *)
Φ CM O C O O H CO
O
c ft) fl· S- B CO’-t.L. CM f-> >> vo C O.
rn O M *- OO <D >. 01 OM 3T C .U
o o <3 H CO H O O h W
.* Ό C OO O O. r- p 3 . H.UC in H >>
M C to »“ M tt) OO C M 3T O M
—· OC U 00 00 w M N h It vO O C OOC 3T03 8M »“CM 00 C M 3J-Kft) c u o o o o c ft)
5 J- n uo H >» Ov C bo 00 *- M C
•m <>»r< »- P μ cm O U 3 Ή L B 1 ft| «“ h x 00 cc x: c c w 2 ° P “ΐ ·=τ p 3 CO O £_ C CM T- «Β 4)
λ 2 »“ M O CM O ft) W 33- bO M JO
Q CS O -J «JCOC V < ft DK 171940 B1 18
DNA-fiekvens IIT
Triplet-nr. 0123 -la-
Indkodende streng 5' AA TTC ATG TAC GCT GAC
5 Ikke-indkodende streng 3' G TAC ATG CGA CTG
--Ib- 45 6 7 8 9 10 11 12 13 -Ia-► -*-Ic-
10 GCT ATC TTC A3T AAC TCT TAC CGT AAA GTT
CGA TAG AAG TGA TTG Æa ATG GCA TTT CAA
-:—Ib- Id- 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 15 -le-c»- -=a-le-
CTG GGT CAG CTG TCT GCT CGT AAA CTG CTG
I -1-1-1-
GAC CCA GTC GAC AGA CGA GCA TTT GAC GAC
-Id--=-li-^— II b —- 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 20 le**- -°-II a-*»--»-Ile-
CAG GAC ATC ATG TCT AGA CAG CAG GGT GAA
-1-I-1-
GTC CTG TAG TAC AGA TCT GTC GTC OCA CTT
-.-Ilb--Ild- 25 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 ---Hc---II ί-
TCT AAC CAG GAA CGT GGT GCT CGA GCT CGT
AGA TTG GTC CTT GCA CCA CGA GCT CGA GCA
2q —1—Ild----Ile-—ig — 44 45 46 47 --II f-- CTG GGT TAA TAG_3* 35 GAC CCA ATT ATC AGC T 5' -II g --
Claims (14)
1. Fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid med formlen Y - R - NH2 I 5 hvor Y er en methioningruppe eller en via methionin bundet gruppe af et bakterieprotein, og R er en peptidsekvens af aminosyrer, der kan kodes genetisk, og hvor den sidste aminosyre er leucin, 10 kendetegnet ved, at et polypeptid med formlen Y - R - NH - CH2 - COOH II hvori Y og R har de ovenfor angivne betydninger, 15 fremstilles genteknisk, og produktet omdannes enzymatisk til polypeptidet med formlen I ved hjælp af et homogenisat af svinehypofyser.
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at et peptid med formlen II, hvor R ikke inde- 20 holder nogen methioningruppe, fremstilles genteknisk, hvorefter gruppen Y fraskilles ved bromcyanfraspaltning.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kende -tegnet ved, at R er aminosyresekvensen (GRF 1-n), hvor GRF er væksthormonfrigørende faktor, og n er 16 til 44.
4. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af kravene 1-3, kendetegnet ved, at der ved den gentekniske fremstilling af polypeptidet med formlen II bag ved den for glycin kodende triplet findes 2 stopcodoner.
5. Polypeptid med formlen 30 Met - R - NH - CH2 - COOH Ila hvor R har den i krav 3 nævnte betydning, og n er 44.
6. Polypeptid, kendetegnet ved formlen 35 H - R - Gly IV DK 171940 B1 hvor R er GRF’s aminosyresekvens, idet der dog i stilling 27 er Leu i stedet for Met.
7. Fusionsproteiner, kendetegnet ved, at de har den i krav 1 angivne formel II, hvor R har den i 5 krav 3 anførte betydning, og n er 44, idet et bakterielt protein er bundet til methioningruppens aminogruppe.
8. DNA-sekvens kendetegnet ved formlen 5' - AA TTC ATG - -CTG CA 10 (GRF 1-22) V 3’ - G TAC - -G hvor (GRF 1-22) er codonerne for aminosyrerne 1-22 i GRF.
9. DNA-sekvens kendetegnet ved formlen 15 G - - GGT TAA TAG (GRF 25-44) 3' - AC GTC - - CCA ATT ATC AGC T
20 VI hvor (GRF 25-44) er codonerne for aminosyrerne 25-44 i GRF.
10. DNA-sekvens kendetegnet ved formlen 25 5' - AA TTC ATG - -GGT TAA TAG (GRF 1-44) 3' - G TAC - -CCA ATT ATC AGC T VII 30 hvor (GRF 1-44) er codonerne for aminosyrerne 1-44 i GRF.
11. Hybridpiasmider, kendetegnet ved, at de mellem et EcoRI- og et Pstl-spaltningssted indeholder en DNA-sekvens ifølge krav 8.
12. Hybridplasmider, kendetegnet ved, at de mellem et PstI- og et Sall-spaltningssted indeholder en DNA-sekvens ifølge krav 9.
13. Hybridplasmider, kendetegnet ved, at de mellem et EcoRI- og Sall-spaltningssted indeholder en DNA-40 -sekvens ifølge krav 10. DK 171940 B1
14. E. coli-værtsorganismer, kendetegnet ved, at de indeholder hybridplasmiderne ifølge krav 11-13. 5
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3327007 | 1983-07-27 | ||
| DE19833327007 DE3327007A1 (de) | 1983-07-27 | 1983-07-27 | Herstellung von polypeptiden mit einem saeureamid-carboxyterminus |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK365484D0 DK365484D0 (da) | 1984-07-26 |
| DK365484A DK365484A (da) | 1985-01-28 |
| DK171940B1 true DK171940B1 (da) | 1997-08-18 |
Family
ID=6205008
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK365484A DK171940B1 (da) | 1983-07-27 | 1984-07-26 | Fremgangsmåde til fremstilling af polypeptider meden C-terminal carboxamidgruppe, polypeptider til anvendelse ved fremgangsmåden, fusionsproteiner deraf og dertil egnede DNA-sekvenser, plasmider og værtsorganismer |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5457033A (da) |
| EP (1) | EP0133282B1 (da) |
| JP (1) | JPH07121229B2 (da) |
| KR (1) | KR850001287A (da) |
| AT (1) | ATE68827T1 (da) |
| AU (1) | AU572171B2 (da) |
| CA (1) | CA1224166A (da) |
| DE (2) | DE3327007A1 (da) |
| DK (1) | DK171940B1 (da) |
| ES (1) | ES8601303A1 (da) |
| GR (1) | GR82436B (da) |
| IE (1) | IE57664B1 (da) |
| IL (1) | IL72489A0 (da) |
| PT (1) | PT78979A (da) |
| ZA (1) | ZA845779B (da) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61291598A (ja) * | 1985-06-18 | 1986-12-22 | Sagami Chem Res Center | 魚類カルシトニン誘導体及びその製造方法 |
| JPS61257187A (ja) * | 1985-05-11 | 1986-11-14 | Sagami Chem Res Center | サケカルシトニン誘導体遺伝子 |
| DE3436819A1 (de) * | 1984-10-06 | 1986-04-17 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Arzneimittel mit grf-wirkung |
| IT1234977B (it) * | 1985-03-22 | 1992-06-09 | Serono Ist Farm | Espressione in e. coli polipeptidi ibridi contenenti la sequenza del fattore di rilascio dell'ormone della crescita |
| FR2587359B1 (fr) * | 1985-05-28 | 1987-12-24 | Sanofi Sa | Derives non amides de la somatocrinine et procede de preparation par genie genetique |
| DK382886A (da) * | 1985-08-12 | 1987-02-13 | Syntex Inc | Fremgangsmaade til fremstilling af hormonfaktorderivater |
| GB8523156D0 (en) * | 1985-09-19 | 1985-10-23 | Celltech Ltd | Polypeptide production |
| US4865974A (en) * | 1985-09-20 | 1989-09-12 | Cetus Corporation | Bacterial methionine N-terminal peptidase |
| DE3632037A1 (de) * | 1986-09-20 | 1988-04-07 | Hoechst Ag | Gentechnisches verfahren zur herstellung von salm-calcitonin sowie mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens |
| US5789234A (en) * | 1987-08-14 | 1998-08-04 | Unigene Laboratories, Inc. | Expression systems for amidating enzyme |
| JPH01144981A (ja) * | 1987-12-02 | 1989-06-07 | Wakunaga Pharmaceut Co Ltd | 蛋白質の製造 |
| EP0490249B1 (en) * | 1990-12-10 | 1995-03-15 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Process for the enzymatic preparation of GRF(1-44)NH2 |
| GB0512610D0 (en) | 2005-06-18 | 2005-07-27 | Hexcel Composites Ltd | Composite material |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0108387B1 (en) * | 1982-11-04 | 1990-05-16 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Preparation of recombinant growth releasing factors |
| US4581168A (en) * | 1983-02-21 | 1986-04-08 | Sanofi | Synthesis of hpGRF (Somatocrinin) in liquid phase and intermediate peptides |
| AU574064B2 (en) * | 1983-03-07 | 1988-06-30 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Growth hormone releasing factor analogues |
| ZA844380B (en) * | 1983-07-05 | 1985-01-30 | Salk Inst For Biological Studi | Dna encoding a grf precursor |
| EP0191869A4 (en) * | 1984-08-17 | 1988-06-27 | Sagami Chem Res | FISH-CALCITONINE COMBAT AND ITS PRODUCTION AND GENE SYSTEM FOR THIS. |
-
1983
- 1983-07-27 DE DE19833327007 patent/DE3327007A1/de not_active Withdrawn
-
1984
- 1984-07-24 ES ES534589A patent/ES8601303A1/es not_active Expired
- 1984-07-25 IL IL72489A patent/IL72489A0/xx unknown
- 1984-07-25 DE DE84108766T patent/DE3485199D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-07-25 GR GR75419A patent/GR82436B/el unknown
- 1984-07-25 AT AT84108766T patent/ATE68827T1/de not_active IP Right Cessation
- 1984-07-25 EP EP84108766A patent/EP0133282B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-07-26 PT PT78979A patent/PT78979A/pt active IP Right Revival
- 1984-07-26 JP JP59154188A patent/JPH07121229B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1984-07-26 AU AU31217/84A patent/AU572171B2/en not_active Expired
- 1984-07-26 CA CA000459771A patent/CA1224166A/en not_active Expired
- 1984-07-26 KR KR1019840004448A patent/KR850001287A/ko not_active Ceased
- 1984-07-26 IE IE1930/84A patent/IE57664B1/en not_active IP Right Cessation
- 1984-07-26 ZA ZA845779A patent/ZA845779B/xx unknown
- 1984-07-26 DK DK365484A patent/DK171940B1/da not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-03-04 US US08/205,816 patent/US5457033A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0133282B1 (de) | 1991-10-23 |
| US5457033A (en) | 1995-10-10 |
| AU3121784A (en) | 1985-01-31 |
| JPH07121229B2 (ja) | 1995-12-25 |
| CA1224166A (en) | 1987-07-14 |
| ES534589A0 (es) | 1985-10-16 |
| IE841930L (en) | 1985-01-27 |
| AU572171B2 (en) | 1988-05-05 |
| JPS6049798A (ja) | 1985-03-19 |
| IL72489A0 (en) | 1984-11-30 |
| GR82436B (da) | 1984-12-13 |
| EP0133282A1 (de) | 1985-02-20 |
| PT78979A (de) | 1984-08-01 |
| ATE68827T1 (de) | 1991-11-15 |
| DE3327007A1 (de) | 1985-02-07 |
| DK365484D0 (da) | 1984-07-26 |
| DE3485199D1 (da) | 1991-11-28 |
| IE57664B1 (en) | 1993-02-24 |
| ZA845779B (en) | 1985-02-27 |
| KR850001287A (ko) | 1985-03-18 |
| DK365484A (da) | 1985-01-28 |
| ES8601303A1 (es) | 1985-10-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR930009337B1 (ko) | 히루딘을 유전공학적으로 제조하는 방법 | |
| KR950000299B1 (ko) | 융합 단백질의 제조방법 | |
| SU1644720A3 (ru) | Способ получени антигенной детерминанты вируса СПИД | |
| DK171940B1 (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af polypeptider meden C-terminal carboxamidgruppe, polypeptider til anvendelse ved fremgangsmåden, fusionsproteiner deraf og dertil egnede DNA-sekvenser, plasmider og værtsorganismer | |
| KR920009505B1 (ko) | 인체 γ－인터페론 활성을 갖는 폴리펩타이드의 제조방법 | |
| IL74626A (en) | Insulin-like growth factor i | |
| DK166681B1 (da) | Dna-sekvenser, dna-sekvenser og dna-oligonucleotider til brug ved fremstilling af de foerstnaevnte dna-sekvenser, hybridplasmider indeholdende dna-sekvens, vaertsceller indeholdende hybridplasmiderne samt genteknologisk fremgangsmaade til fremstilling af il-2 | |
| JP3531947B2 (ja) | ペプチドの製造方法 | |
| AU617999B2 (en) | A genetic engineering process for the preparation of angiogenins | |
| US4711847A (en) | Preparation of secretin | |
| DK175511B1 (da) | DNA-sekvens, fremgangsmåde til transportekspression af proteiner ved anvendelse af DNA-sekvensen, hybridvektor og hybridplasmid indeholdende DNA-sekvensen samt værtsorganisme indeholdende hybridvektoren eller hybridplasmidet | |
| WO1988005082A1 (en) | Microbial production of peptide oligomers | |
| JPS61149089A (ja) | Ｄｎａ塩基配列、ポリペプチド分泌発現ベクター及び形質転換微生物 | |
| KR920003663B1 (ko) | 합성유전자에 의한 효모세포로부터 돼지 성장 호르몬의 제조방법 | |
| KR940004543B1 (ko) | 이.콜라이의 trp 발현 시스템을 갖는 벡터를 제조하는 방법 | |
| KR100274185B1 (ko) | 유비퀴틴에 융합된 인간 칼시토닌 | |
| AU656791B2 (en) | Process for producing peptide | |
| KR910000457B1 (ko) | 인간성장호르몬 발현 벡터 ptrp322H-HGH | |
| KR100284036B1 (ko) | 재조합 인간 형질전환 성장인자-베타 유전자, 그의 발현벡터 및 인간 형질전환 성장인자-베타의 제조방법 | |
| JPS63226288A (ja) | 新規遺伝子、その発現プラスミドｄｎａ、及び形質転換微生物 | |
| PT85753B (pt) | Processo para a preparacao por engenharia genetica de calcitonina de salmao bem como de agentes para a realizacao do referido processo |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B1 | Patent granted (law 1993) | ||
| PUP | Patent expired |