PL169576B1 - Sposób wytwarzania czasteczki RNA o aktywnosci katalitycznej PL PL - Google Patents
Sposób wytwarzania czasteczki RNA o aktywnosci katalitycznej PL PLInfo
- Publication number
- PL169576B1 PL169576B1 PL91298867A PL29886791A PL169576B1 PL 169576 B1 PL169576 B1 PL 169576B1 PL 91298867 A PL91298867 A PL 91298867A PL 29886791 A PL29886791 A PL 29886791A PL 169576 B1 PL169576 B1 PL 169576B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- rna
- modified
- group
- nucleotide
- synthesis
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 71
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 title claims abstract description 27
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims abstract description 27
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 16
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims abstract description 15
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 claims abstract description 12
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims abstract description 7
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 claims abstract description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 29
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 26
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 22
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 20
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 20
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 20
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 20
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 20
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 18
- 150000003290 ribose derivatives Chemical group 0.000 claims description 11
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 claims description 10
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 10
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 claims description 9
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical group OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical class O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 6
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 6
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 claims description 5
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical class NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical compound S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 4
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 claims description 3
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 claims description 3
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 claims description 3
- MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 9H-purine-2,6-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical group C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 claims description 2
- 150000008039 phosphoramides Chemical class 0.000 claims description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 2
- 125000004044 trifluoroacetyl group Chemical group FC(C(=O)*)(F)F 0.000 claims description 2
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 claims description 2
- RJOXFJDOUQJOMQ-UHFFFAOYSA-N 6-sulfanylidene-3,7-dihydropurin-2-one Chemical compound S=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 RJOXFJDOUQJOMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 26
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 26
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 abstract description 16
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 abstract description 7
- -1 azido, amino, monosubstituted amino Chemical group 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 5
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 abstract description 5
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 abstract description 3
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 abstract 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 abstract 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 abstract 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 68
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 67
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 66
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 66
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 33
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 29
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 28
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 24
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 17
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 13
- QPHRQMAYYMYWFW-FJGDRVTGSA-N 1-[(2r,3s,4r,5r)-3-fluoro-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pyrimidine-2,4-dione Chemical compound O[C@]1(F)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 QPHRQMAYYMYWFW-FJGDRVTGSA-N 0.000 description 12
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 12
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 11
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 10
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 10
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 9
- OWNKJJAVEHMKCW-XVFCMESISA-N [(2r,3s,4r,5r)-4-amino-5-(2,4-dioxopyrimidin-1-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methyl dihydrogen phosphate Chemical compound N[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 OWNKJJAVEHMKCW-XVFCMESISA-N 0.000 description 9
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 8
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 8
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 8
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 7
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 7
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 7
- UIYWFOZZIZEEKJ-XVFCMESISA-N 1-[(2r,3r,4r,5r)-3-fluoro-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pyrimidine-2,4-dione Chemical compound F[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 UIYWFOZZIZEEKJ-XVFCMESISA-N 0.000 description 6
- LLIPTMWIZVIUSX-XVFCMESISA-N 1-[(2r,3r,4s,5r)-3-amino-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pyrimidine-2,4-dione Chemical compound N[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 LLIPTMWIZVIUSX-XVFCMESISA-N 0.000 description 6
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 6
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 6
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 6
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 description 6
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 6
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 5
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 5
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 5
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 5
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 5
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 5
- 108091027075 5S-rRNA precursor Proteins 0.000 description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 4
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 4
- 125000001309 chloro group Chemical group Cl* 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 4
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 3
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 230000007022 RNA scission Effects 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 125000001246 bromo group Chemical group Br* 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 3
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002718 pyrimidine nucleoside Substances 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 2'‐deoxycytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 2
- NVZFZMCNALTPBY-XVFCMESISA-N 4-amino-1-[(2r,3r,4r,5r)-3-fluoro-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pyrimidin-2-one Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](F)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 NVZFZMCNALTPBY-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- FECRKKQKJNKYNF-XVFCMESISA-N 4-amino-1-[(2r,3r,4s,5r)-3-amino-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pyrimidin-2-one Chemical compound N[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)N=C(N)C=C1 FECRKKQKJNKYNF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- PJWBTAIPBFWVHX-FJGDRVTGSA-N 4-amino-1-[(2r,3s,4r,5r)-3-fluoro-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pyrimidin-2-one Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@](F)(O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 PJWBTAIPBFWVHX-FJGDRVTGSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 2
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002494 Endoribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010093099 Endoribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 2
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 108090000621 Ribonuclease P Proteins 0.000 description 2
- 102000004167 Ribonuclease P Human genes 0.000 description 2
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 2
- 241000251131 Sphyrna Species 0.000 description 2
- 241000223892 Tetrahymena Species 0.000 description 2
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 2
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 2
- 241000726445 Viroids Species 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 2
- 238000011138 biotechnological process Methods 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 125000002346 iodo group Chemical group I* 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 description 2
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 125000002796 nucleotidyl group Chemical group 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 150000004713 phosphodiesters Chemical group 0.000 description 2
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical group [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- ZGYYPTJWJBEXBC-QYYRPYCUSA-N (2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-4-fluoro-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-ol Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1F ZGYYPTJWJBEXBC-QYYRPYCUSA-N 0.000 description 1
- CQKMBZHLOYVGHW-QYYRPYCUSA-N (2r,3s,4r,5r)-4-amino-5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-ol Chemical compound N[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 CQKMBZHLOYVGHW-QYYRPYCUSA-N 0.000 description 1
- 125000006273 (C1-C3) alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006527 (C1-C5) alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 108010052418 (N-(2-((4-((2-((4-(9-acridinylamino)phenyl)amino)-2-oxoethyl)amino)-4-oxobutyl)amino)-1-(1H-imidazol-4-ylmethyl)-1-oxoethyl)-6-(((-2-aminoethyl)amino)methyl)-2-pyridinecarboxamidato) iron(1+) Proteins 0.000 description 1
- KUNAXQVBPHKGOC-FJGDRVTGSA-N 1-[(2r,3r,4r,5r)-3-amino-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pyrimidine-2,4-dione Chemical class N[C@@]1(O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 KUNAXQVBPHKGOC-FJGDRVTGSA-N 0.000 description 1
- MRUKYOQQKHNMFI-XVFCMESISA-N 1-[(2r,3r,4s,5r)-3-azido-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pyrimidine-2,4-dione Chemical compound [N-]=[N+]=N[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 MRUKYOQQKHNMFI-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 2'-deoxyguanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- FEOYKPQEERVCAV-XVFCMESISA-N 4-amino-1-[(2r,3r,4s,5r)-3-azido-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pyrimidin-2-one Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](N=[N+]=[N-])[C@H](O)[C@@H](CO)O1 FEOYKPQEERVCAV-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- OLXZPDWKRNYJJZ-UHFFFAOYSA-N 5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-ol Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(CO)O1 OLXZPDWKRNYJJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108091028733 RNTP Proteins 0.000 description 1
- 102100037968 Ribonuclease inhibitor Human genes 0.000 description 1
- 108020005543 Satellite RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- VBDLXSNRDCWUPP-FJGDRVTGSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-4-amino-5-(2,4-dioxopyrimidin-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound N[C@@]1(O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 VBDLXSNRDCWUPP-FJGDRVTGSA-N 0.000 description 1
- HKSMIFAAUAWTKL-FJGDRVTGSA-N [[(2r,3r,4s,5r)-5-(2,4-dioxopyrimidin-1-yl)-4-fluoro-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound O[C@]1(F)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 HKSMIFAAUAWTKL-FJGDRVTGSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000002730 additional effect Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N azide group Chemical group [N-]=[N+]=[N-] IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical class [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-N diphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(O)=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150098622 gag gene Proteins 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920000140 heteropolymer Polymers 0.000 description 1
- 229910000037 hydrogen sulfide Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002768 hydroxyalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N iodine Chemical compound II PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000005580 one pot reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000005731 phosphitylation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000005496 phosphonium group Chemical group 0.000 description 1
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L phosphoramidate Chemical compound NP([O-])([O-])=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000008298 phosphoramidates Chemical class 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 108010024226 placental ribonuclease inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002245 ribonucleolytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 108010062513 snake venom phosphodiesterase I Proteins 0.000 description 1
- VVLFAAMTGMGYBS-UHFFFAOYSA-M sodium;4-[[4-(ethylamino)-3-methylphenyl]-(4-ethylimino-3-methylcyclohexa-2,5-dien-1-ylidene)methyl]-3-sulfobenzenesulfonate Chemical compound [Na+].C1=C(C)C(NCC)=CC=C1C(C=1C(=CC(=CC=1)S([O-])(=O)=O)S(O)(=O)=O)=C1C=C(C)C(=NCC)C=C1 VVLFAAMTGMGYBS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000005583 trifluoroacetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
- C12N15/1132—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses against retroviridae, e.g. HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
- C12N2310/121—Hammerhead
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
- C12N2310/122—Hairpin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/315—Phosphorothioates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
- C12N2310/322—2'-R Modification
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Emulsifying, Dispersing, Foam-Producing Or Wetting Agents (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Materials Applied To Surfaces To Minimize Adherence Of Mist Or Water (AREA)
- Prostheses (AREA)
- Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
1. Sposób wytwarzania czasteczki RNA o aktywnosci katalitycznej, znamienny tym, ze przeprowadza sie synteze lancucha RNA i wlacza sie co najmniej jeden zmodyfi- kowany nukleotyd, w którym grupe wodorotlenowa w pozycji 2' cukru rybozy zastapiono grupa modyfikujaca, wybrana sposród chlorowców, grupy siarkowodorowej, azydkowej, aminowej i grup aminowych, podstawionych w jednej lub dwóch pozycjach. PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania cząsteczki RNA o aktywności katalitycznej.
Pewne naturalnie występujące kwasy rybonukleinowe (RNA) ulegają samodzielnemu cięciu. Pierwszym opisanym przykładem było cięcie prekursora rybosomalnego RNA pierwotniaka Tetrahymena (patrz praca przeglądowa Cech, Ann-Rev.Biochem. 59 (1990), 543-568), które wymaga guanozyny jako kofaktora.
Następnie odkryto szereg przykładów cięcia RNA w wiroidach, wirusoidach i satelitarnych RNA (patrz prace przeglądowe Sheldon i wsp. Nucleic Acids and Molecular Biology (1990) tom 4, str. 227-242, wyd.F.Eckstein i D.M.J. Lilley, Springer Verlag Berlin Heidelberg; Symons, TEBS 14 (1989), 445-450). Cięcia te obejmują specyficzne miejscowo pęknięcie wiązania fosfodwuestrowego w obecności dwuwartościowego kationu takiego jak Mg +, w wyniku którego powstają końce fosfodwuestrowe 5'-wodorotlenowy i 2',3'-cykliczny. Analiza sekwencji wokół miejsca samodzielnego cięcia kilku takich RNA stworzyła podstawy do identyfikacji wspólnej cechy strukturalnej istotnej dla procesu cięcia, którą nazwano strukturą obucha młotka (Hutchins i wsp., Nucleic Acids Res. 14 (1986) 3627-3640). Ta struktura składa się z trzech helis i 13 konserwowanych nukleotydów (ujętych na poniższym schemacie), które tworzą trójwymiarową strukturę odpowiedzialną za zajście cięcia w jednej określonej pozycji. To samokatalizujące się cięcie jest normalnie procesem wewnątrzcząsteczkowym, to znaczy pojedyncza cząsteczka RNA pełni wszystkie funkcje niezbędne do zajścia cięcia. Jednakże Uhlenbeck (Nature 328 (1987), 596-600) wykazał, że ta struktura obucha nie musi być zbudowana z jednej nici, lecz może być utworzona z dwóch nici. Te dwie nici tworzą strukturę obucha, która doprowadza do przecięcia wiązania fosfodwuestrowego (zaznaczonego strzałką) w jednej z nici (nić S), podczas gdy druga (nić E) pozostaje nie zmieniona i może uczestniczyć w wielu reakcjach cięcia. Ta nić odpowiada definicji enzymu i nazwano ją rybozymem. Podczas gdy sekwencje w ramkach (poniższy schemat) są konserwowane, inne mogą różnić się zapewniając tym samym nienaruszalność struktury parujących ze sobą zasad i rejonów jednoniciowych.
Gppp
| CG CG „ U A S | |
| 'J | @ / C AGGA U |
| A (G/ | /£7UC CUGGGppp |
| U GGCCl/ | /U/ |
| Ugccgg | G |
169 576
Zbadano dokładnie reakcję przecinania po trójce nukleotydów GUC (Ruffner i wsp., Gene 82 (1989), 31-41; Fedor i Uhlenbeck, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 1668-1672). Skonstruowano również rybozymy o nowych charakterystycznych cechach (Haseloff i Gerlach, Nature 334 (1988), 585-591), wskazujące, że cięcie może mieć na przykład również miejsce po sekwencjach GUA, GUU, CUC, AUC i UUC. Dalszymi przykładami enzymów RNA są RNA o strukturze spinki do włosów (Hampel i wsp., Nucleic Acids RES. 18 (1990), 299-304), a także RNA zawierający białka jak telomeraza (Greider i Blackburn, Nature 337 (1989), 331-337) i RNaza P (Baer i wsp., w Nucleic Acids and Molecular Biology (1988), tom 3, str. 231-250, wyd. F. Eckstein i D.M.J. Lilley, Springer Verlag, Berlin/Haidelberg. Potencjalnie interesujące jest użycie rybozymów jako środków leczniczych (patrz praca przeglądowa Rossi i Sarver, TIBTECH8(1990), 179-183). Możliwą strategią byłoby zniszczenie RNA niezbędnego dla ekspresji zarówno obcych genów takich jak geny wirusowe jak i odpowiednich genów gospodarza. Wymaga to skonstruowania cząsteczki RNA, która jest zdolna do utworzenia struktury obucha lub spinki do włosów z RNA substratowym i przecięcia go w uprzednio określonym miejscu. Opublikowano pierwsze zastosowanie takiej inhibicji w stosunku do wirusa HIV-I (Sarver i wsp., Science 247 (1990), 1222-1224). Następne przykłady działania rybozymów o strukturze obucha ukierunkowanych na określony substrat in vivo podali Cammeron i Jennings (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1986), 9139-9143) i in vitro Cotten i wsp. (Mol. Cell. Biol. 9 (1989), 4479-4487). Ponadto znane są inne użyteczne właściwości katalityczne rybozomów, na przykład aktywności defosforylazy i transferazy nukleotydylowej (patrz Zgłoszenie Patentowe W088/04300). W zgłoszeniu tym wykazano, że enzymy RNA mają zdolność defosforylacji substratów oligonukleotydowych z wysoką specyficznością w stosunku do sekwencji, co odróżnia je od znanych enzymów białkowych. Cząsteczki RNA mogą również działać jak polimerazy RNA, różniąc się od enzymów białkowych tym, że używają raczej wewnętrznej niż zewnętrznej matrycy. Dzięki temu można konstruować różne heteropolimery używając różnych form enzymu RNA. Umożliwia to tworzenie na przykład cząsteczek matrycowego RNA dla odpowiednich białek lub peptydów. Ponadto Herschlag i Cech (Nature 344, (1990), 405-409) opisali enzym RNA o aktywności DNazy.
Enzym RNA musi być wprowadzony do komórek docelowych, aby mógł służyć jako czynnik leczniczy. A priori istnieją dwie metody wprowadzenia rybozymu do komórek docelowych:
(a) egzogenne dostarczenie uprzednio zsyntetyzowanego RNA;
(b) endogenna transkrypcja genu kodującego rybozym, umieszczonego w plazmidzie.
Duża niedogodność metody (a) polega na bardzo niskiej stabilności cząsteczek RNA w warunkach fizjologicznych z powodu ich szybkiej degradacji przez różne enzymy o aktywności rybonukleolitycznej obecne w żywej komórce. Niedogodności metody (b) wynikają z dużych trudności w specyficznym i stabilnym umieszczeniu genu kodującego rybozym w komórkach wyższych organizmów. Ponadto problem degradacji występuje również w przypadku cząsteczek RNA zsyntetyzowanych in vivo.
Zatem problemem podkreślanym w prezentowanym wynalazku było dostarczenie cząsteczek RNA, posiadających zarówno aktywności katalityczne, jak i podwyższoną odporność na degradację chemiczną i enzymatyczną, których można używać jako czynników leczniczych lub jako biokatalizatorów w procesach biochemicznych lub biotechnologicznych. Z ostatniej publikacji Perreault i wsp. (Nature 344 (1990), 565-567) wiadomo że pewne modyfikacje enzymu RNA, na przykład włączenie 2'-dezoksyrybonukleotydu w kilku miejscach rybozymu powoduje znaczne obniżenie jego aktywności katalitycznej. Obecnie ze zdziwieniem stwierdzono, że pewne chemiczne zmiany w pozycji 2' cukru rybozy, które podnoszą stabilność cząsteczki RNA, nie wpływają w znaczący sposób ani nie niszczą właściwości katalitycznych rybozymów. Zatem przedmiotem prezentowanego wynalazku jest dostarczenie cząsteczki RNA o aktywności katalitycznej zawierającej przynajmniej jeden zmieniony nukleozyd, w którym grupa wodorotlenowa w pozycji 2' cukru rybozy jest zastąpiona przez grupę modyfikującą, wybraną spośród grup halogenowych, grupy siarkowodorowej, azydkowej, aminowej albo pojedynczo lub podwójnie podstawionych grup aminowych. Katalityczna aktywność cząsteczki RNA według prezentowanego wynalazku obejmuje, co jest korzystne, przynajmniej jedną z grup o aktywności transferazy
169 576 nukleotydylowej, defosforylazy, deoksyrybonukleazy i endorybonukleazy specyficznej w stosunku do sekwencji. W korzystnym wariancie aktywność katalityczna obejmuje aktywność endorybonukleazy specyficzną w stosunku do sekwencji. W bardziej korzystnym wariancie RNA jest rybozymem o strukturze obuchajak opisano wyżej. W najlepszym przypadku rybozym może być połączony z mną nicią RNA w celu utworzenia struktury obucha złożonej z dwóch nici, gdzie zmodyfikowaną nicią RNA jest nić E jak opisano wyżej. Chociaż rybozym o strukturze obucha jest szczególnie preferowany, prezentowany wynalazek obejmuje również inne enzymy RNA, na przykład rybozym Tetrahymena (Cech, Ann. Rev. Biochem. 59 (1990), 543-568) w formie naturalnie występującej lub skróconej (Zang i wsp., Biochemistry 27 (1988), 8924-8931), a zwłaszcza RNA o strukturze spinki do włosów (Hampel i wsp. Nucleic Acids Res. 18 (1990) 299-304) lub RNA zawierający białka jak RNaza P (Baer i wsp., w Nucleic Acids & Molecular Biology (1988), tom 3, str. 231-250, wyd. F. Eckstein i D.M.J. Lilley, Springer Verlag Heidelberg) i telemerazę (Greider i Blackburn, Nature 337 (1989), 331-337).
Włączenie zmodyfikowanej grupy w pozycji 2' cukru rybozy wydaje się być również szczególnie użyteczne w przypadku RNA z nowymi funkcjami, otrzymywanymi zarówno za pomocą procedury, która polega na kolejnym zmienianiu cykli selekcji (Tuerg i Gold, Science 249 (1990), 505-510; Ellington i Szostak, Nature 346 (1990), 818-822) jak i za pomocą jakiejkolwiek innej metody.
Zmodyfikowaną grupę zastępującą grupę wodorotlenową w pozycji 2' cukru rybozy wybiera się spośród grup halogenowych, grupy siarkowodorowej, azydkowej, aminowej albo pojedynczo lub podwójnie podstawionych grup aminowych. Grupą halogenową może być grupa fluorowa, chlorowa, bromowa lub jodowa, z tym że grupa fluorowa jest preferowana. Najkorzystniejszymi podstawnikami podstawionych grup aminowych są grupy C1-C3 alkilowe i/lub hydroksyalkilowe. Najlepszymi grupami modyfikującymi są grupy halogenowa lub niepodstawiona grupa aminowa.
Włączenie grupy modyfikującej w pozycji 2' cukru rybozy w sposób znaczący zwiększa odporność nacięcie enzymatyczne. Potwierdzono, że 2'-dezoksy-2'-fluorourydyna i 2'-dezoksy-2'-aminourydyna, włączone w odpowiednie miejsce rybozymu zapobiegają przecięciu tego miejsca przez RNazę A (patrz Fig. 3 + 4). Enzym ten przecina w pozycji 3' nukleozydy pirymidynowe i wymaga obecności w pozycji 2' grupy wodorotlenowej (Uchida i Egami (1971), w The Enzymes tom IV, wyd. 3 (wyd. P. D. Boyer), Academic Pres str. 205-250). Ponadto wyniki uzyskane z użyciem polinukleotydów pokazują, że obecność funkcyjnej grupy aminowej w pozycji 2' zmniejsza również degradację przez niespecyficzne nukleazy jak fosfodwuesteraza z jadu węża (Hobbs i wsp., Biochemistry 12 (1973), 5138-5145). Obecność w pozycji 2' grupy halogenowej hamuje również nukleazy takie jak DNaza I (Hobbs i wsp., Biochemistry 11 (1972), 4336-4344). Wyniki uzyskane z użyciem polinukleotydów pokazują również, że obecność halogenu w pozycji 2' nukleotydu chroni przed działaniem nukleaz z surowicy ludzkiej (Black i wsp., Virology 48 (1972) 537-545). Zatem ochrona przez włączenie zmodyfikowanego cukru rybozy zgodnie z prezentowanym wynalazkiem będzie miała raczej charakter ogólny i nie będzie ograniczona do RNaz, których aktywność zależy od obecności grupy wodorotlenowej w pozycji 2'.
W kwasie rybonukleinowym cukier ryboza łączy się z nukleotydem wiązaniem N-glikozydowym. Zasadę nukleotydową, która jest połączona ze zmodyfikowanym cukrem rybozą w cząsteczce RNA prezentowanego wynalazku, wyselekcjonowano z grupy zawierającej zasady naturalnie występujące w RNA i z podstawionych zasad. Korzystne jest przyłączenie zmodyfikowanej rybozy do adeniny, guaniny, cytozyny i/lub uracylu, które są naturalnymi zasadami występującymi w RNA. Jednakże zmodyfikowaną rybozę można przyłączać również do podstawionych zasad, najlepiej wybranych z grupy zawierającej zasady ksantynę, hypoksantynę, 2,6-dwuaminopurynę, 2-hydroksy-6-merkamptopurynę i purynę, podstawione w pozycji 6 siarką lub zasadami pirymidynowymi, podstawionymi w pozycji 5 grupami halogenowymi lub C 1-C5 alkilowymi, zwłaszcza grupą bromową lub metylową. Najkorzystniejszą zasadą nukleotydową przyłączoną do zmodyfikowanego cukru rybozy jest uracyl.
Zmodyfikowanymi nukleozydami, które włączano do cząsteczki RNA, były zarówno poprzednio opisane związki jak i związki, które można przygotować analogicznie do znanych
169 576 związków. Najkorzystniejsze fluorowe i aminowe analogi rybonukleozydów opisano wyżej, 2'-dezoksy-2'-fluorocytydynę (Doerr & Fox, J. Org. Chem. 32 (1967), 1462; Mengel & Guschlbauer, Ang. Chem. 90 (1978), 557-558); 2'-dezoksy-2'-fluoroadenozynę (Ikehara&Miki, Chem. Pharm. Bull. 26 (1978) 2449-2453), 2'-dezoksy-2'-fluorourydynę (Codington i wsp., J. Org. Chem. 29 (1964), 558-564), 2'-dezoksy-2'-aminourydynę (Verheyden i wsp., J. Org. Chem. 36 (1971), 250) i 2'-dezoksy-2-aminocytydynę (Verheyden i wsp. (1971) jak wyżej). Do syntezy niektórych z tych związków zastosowano najnowsze metody syntezy. 2'-dezoksy-2'-fluorocytydynę można otrzymać z 2'-dezoksy-2'-fluorourydyny metodą Sunga (J. Org. Chem. 47 (1982), 3623-3628). Tej samej metody można używać do przekształcenia 2'-dezoksy-2'-azydourydyny w 2'-dezoksy-2'-azydocytydynę (Verheyden i wsp. (1971), jak wyżej). Tę ostatnią można zredukować do 2'-dezoksy-2'-aminocytydyny metodą Mungalla i wsp. (J. Org. Chem. 40 (1975), 1659).
Syntezę 5'-trójfosforanów 2'-dezoksy-2'-fluoronukleozydów można przeprowadzić zarówno według Ludwig (Acta Biochim. et Biophys. Acad. Sci. Hung. 16 (1981), 131-133) lub Ludwig i Eckstein (J. Org. Chem. 54 (1989), 631-635). 5'-trójfosforany 2'-dezoksy-2'-aminourydyny i -cytydyny można otrzymać jak opisał to dla dwufosforanów Hobbs i wsp. (Biochemistry 12 (1973), 5138-5145), z tym, że zamiast fosforanu stosuje się pirofosforan, 3'-fosforoamidy 2'-dezoksy-2'-fluoronukleozydów do automatycznej syntezy oligonukleotydu można otrzymać metodą Sinha i wsp. (Nucleic Acids Res. 12 (1984), 4539-4557). Do syntezy odpowiednich pochodnych 2'-aminowych grupa aminowa może być chroniona przez trójfluoroacetylowanie według Imazara i Eckstein (J.Org.Chem. 44 (1979), 2039-2041). Cząsteczka RNA wytworzona sposobem według wynalazku obejmuje przynajmniej jeden zmodyfikowany nukleozyd, gdzie grupa wodorotlenowa rybozy w pozycji 2' jest zastąpiona przez grupę modyfikującą. Korzystna jest cząsteczka RNA, w której wszystkie nukleozydy jednego rodzaju (to znaczy adenozyna lub guanozyna lub cytydyna lub urydyna) zawierają zmodyfikowane cukry, podczas gdy pozostałe trzy nukleozydy zawierają niezmodyfikowane cukry. Bardziej korzystnym zmodyfikowanym nukleozydem jest nukleozyd pirymidynowy, to znaczy cytydyna lub urydyna albo ich podstawione pochodne. Najkorzystniejszym cukrem jest 2'-fluororyboza lub 2'-aminoryboza. Przykładami tych cząsteczek są rybozymy E2 i E3 o strukturze obucha, które pochodzą od rybozymu E1 o strukturze obucha opisanego przez Fedor i Uhlenbeck (Proc.Natl. Acad.Sci. USA 87 (1990), 1668-1672). W E2 wszystkie reszty urydynowe zastąpiono resztami 2'-dezoksy-2'-fluorourydynowymi i w E3 wszystkie reszty urydynowe zastąpiono resztami 2'-dezoksy-2'-aminourydynowymi. Rybozymy E2 i E3 wykazują aktywność rybonukleazy, porównywalną z aktywnością niezmodyfikowanej cząsteczki RNA E1.
W innej korzystnej cząsteczce RNA wytwarzanej sposobem według wynalazku wszystkie nukleozydy dwóch różnych rodzajów zawierają zmodyfikowane cukry, podczas gdy pozostałe dwa nukleozydy zawierają niezmodyfikowane cukry. Korzystniej wszystkie nukleozydy pirymidynowe, to znaczy cytydyna i urydyna (łącznie z podstawionymi zasadami pirymidynowymi) zawierają zmodyfikowane cukry, najlepiej pochodne rybozy 2'-fluorowe lub 2'-aminowe.
Sposobem według wynalazku wytwarza się cząsteczkę RNA obejmującą zmodyfikowany wzór (to znaczy taki, w którym pewne nukleozydy są zmodyfikowane i pewne są niezmodyfikowane), który nazwano selektywnym wzorem modyfikacji. RNA obejmujący selektywny wzór modyfikacji jest cząsteczka, gdzie nukleozydy w wybranych specyficznych pozycjach mogą być zmodyfikowane, podczas gdy nukleozydy w innych wybranych specyficznych pozycjach mogą być niezmodyfikowane. Na przykład nukleozydy, o których wiadomo, że są miejscami nadwrażliwymi na działanie rybonukleaz (na przykład w związku z drugorzędową strukturą RNA) powinny być zmodyfikowane w celu przedłużenia życia cząsteczki RNA. Przykładem miejsca nadwrażliwego na działanie rybonukleazy jest pozycja 21 rybozymu E1. Jak pokazano na fig. 3 RNaza A przecina cząsteczkę RNA w tej pozycji z dużą częstością.
W jeszcze innym wykonaniu wynalazku wytwarzana cząsteczka RNA dodatkowo zawiera przynajmniej jedno zmodyfikowane międzynukleotydowe wiązanie fosfodwuestrowe. Przykładami odpowiednio zmodyfikowanych wiązań dwuestrowych są zmetylowane grupy fosfoniowe lub grupy tiofosforanowe, z których ostatnie są szczególnie korzystne. Korzystne jest, gdy przynajmniej 5'-końcowe wiązanie fosfodwuestrowe i/lub 3'-końcowe wiązanie fosfodwuestro169 576
Ί we w cząsteczce RNA jest zmodyfikowane. Najkorzystniej jest, gdy 5'-końcowe wiązanie fosfodwuestrowe i ostatnie trzy 3'-końcowe wiązania fosfodwuestrowe są zmodyfikowane.
Stwierdzono, że sama obecność zmodyfikowanych wiązań międzynukleotydowych nie wystarcza do spowodowania zwiększonej odporności na degradację. Jednakże połączona obecność reszt rybozowych zmodyfikowanych w pozycji 2' i zmodyfikowanych wiązań międzynukleotydowych wykazuje dodatkowy efekt zwiększonej stabilności. Więcej niż pięćdziesięciokrotny wzrost stabilności nadany przez obie modyfikacje przeważa zmniejszoną efektywność przecinania w porównaniu z niezmodyfikowanym rybozymem.
Syntezę cząsteczek RNA posiadających zmodyfikowane wiązania międzynukleotydowe najlepiej jest przeprowadzać na drodze chemicznej jak opisano dalej.
Sposób wytwarzania cząsteczki RNA o aktywności katalitycznej, według wynalazku polega na tym, ze przeprowadza się syntezę łańcucha RNA i włącza się co najmniej jeden zmodyfikowany nukleozyd, w którym grupę wodorotlenową w pozycji 2' cukru rybozy zastąpiono grupą modyfikującą, wybraną spośród chlorowców, grupy siarkowodorowej, azydkowej, aminowej i grup aminowych w jednej lub dwóch pozycjach.
Korzystną grupą modyfikującą jest chlorowiec (to znaczy grupa fluorowa, chlorowa, bromowa lub jodowa) lub grupa aminowa, przy czym bardziej korzystna jest grupa fluorowa lub niepodstawiona grupa aminowa. Zaznacza się, że sposób prezentowanego wynalazku obejmuje również syntezę cząsteczki RNA, do której włączono nukleotydy z przynajmniej dwoma zmodyfikowanymi grupami (to znaczy grupami fluorową lub aminową).
Najkorzystniejsze są dwa podejścia do włączania tych zmodyfikowanych nukleotydów do RNA. Jednym z nich jest zautomatyzowana chemiczna synteza, którą można przeprowadzać na stałym podłożu lub w roztworze, najlepiej z odpowiednimi fosforoamidami lub H-fosfonianami jako prekursorami nukleotydów, drugie podejście obejmuje enzymatyczne włączenie przez transkrypcję odpowiedniego kwasu nukleinowego, najlepiej matryc DNA, przeprowadzaną przy użyciu polimerazy kwasu nukleinowego i 5'-trójfosforanów nukleozydów zmodyfikowanych w pozycji 2'. Zautomatyzowaną chemiczną syntezę cząsteczek RNA, obejmujących zmodyfikowane wiązania międzynukleotydowe, można przeprowadzić przez włączenie do łańcucha RNA odpowiednich chemicznie zmodyfikowanych prekursorów nukleotydów takich jak metylowe pochodne związków fosfoniowych. W celu wprowadzenia wiązań tiofosforanowych jako prekursorów nukleotydów używa się standartowych pochodnych fosforoamidowych. Po przyłączeniu prekursora do łańcucha RNA następuje etap odpowiedniego utlenienia, jednakże nie przeprowadza się go za pomocą jodu, jak to jest w przypadku nie zmodyfikowanych wiązań lecz za pomocą siarki lub czynników siarkujących, dzięki czemu otrzymuje się grupę tiofosforanową.
Chemiczną syntezę zmodyfikowanych cząsteczek RNA przeprowadza się analogicznie do powszechnie znanej syntezy niezmodyfikowanych cząsteczek RNA lub DNA. Bardziej specyficznie syntezę RNA przeprowadza się przez chemiczną syntezę na stałym podłożu, obejmująca stopniowe dodawanie prekursorów nukleotydowych. Po otrzymaniu zsyntetyzowanego produktu RNA żądanej długości RNA usuwa się ze stałego podłoża stosując konwencjonalne metody i oczyszcza, najlepiej przez elektroforezę w żelu. Alternatywnie można również przeprowadzić chemiczną syntezę RNA stosując jakąkolwiek inną znaną technikę bez zastosowania stałego podłoża. Na przykład RNA można syntetyzować w formie rozpuszczonej i następnie oczyścić przy pomocy znanych metod.
Kiedy modyfikującą grupę aminową w pozycji 2' włącza się do łańcucha RNA, to musi on być chroniony przed reakcją fosfitylacji (to znaczy preparatyka prekursora nukleotydu) i w celu użycia do następujących po tym reakcji parowania.
W tym celu najlepiej jest używać jako grupy chroniącej grupy trójfluoroacetylowej, ponieważ jest ona stabilna podczas cykli syntezy w syntetyzerze kwasu nukleinowego i można ją usunąć przez konwencjonalne działanie amoniakiem.
Alternatywnie można przeprowadzić syntezę łańcucha RNA przez transkrypcję matrycy kwasu nukleinowego za pomocą odpowiedniej polimerazy kwasu nukleinowego. Korzystne jest użycie DNAjako matrycy ipolimerazy kwasu nukleinowego, którajest polimerazą RNA zależną od DNA. Jeszcze lepsza jest polimeraza RNA zależna od DNA, wybrana spośród polimeraz T7,
169 576
T3 i SP6, które są wysokowydajnymi polimerazami RNA bakteriofaga. Spośród tych polimeraz najlepsza jest polimeraza rNa T7. Matrycę DNA używaną do syntezy zmodyfikowanej cząsteczki RNA zgodnie z prezentowanym wynalazkiem najlepiej jest otrzymać przez wstawienie syntetycznego fragmentu DNA, kodującego żądaną sekwencję RNA do odpowiedniego miejsca w plazmidzie, który zawiera promotor dla odpowiedniej polimerazy RNA i wspomniane miejsce znajdujące się w takiej pozycji plazmidu, która umożliwia transkrypcję syntetycznego fragmentu DNA z wspomnianego promotora. Korzystną cechą tej reakcji transkrypcji jest to, że przebiega ona do końca matrycy DNA (tak zwana transkrypcja run off). Alternatywnie syntetyczne fragmenty DNA mogą służyć jako matryce do transkrypcji bez udziału plazmidu. Jednakże fragmenty te powinny zawierać sygnał rozpoczęcia transkrypcji, który pozwala na wydajną transkrypcję DNA.
Polimeryzację 2'-dezoksy-2'-halonukleotydów, to znaczy 2'-dezoksy-2'-fluorourydyny, -cytydyny, -adenozyny, -guanozyny i odpowiednich związków zawierających chlor najlepiej jest przeprowadzać przy udziale polimerazy T7 w obecności jonów Mn2+ jako kofaktora. Alternatywnie polimeryzację 2'-aminonukleotydów, to znaczy 2'-dezoksy-2'-aminourydyny, 2'-dezoksy-2'-aminocytydyny, 2'-dezoksy-2'-aminoadenozyny i 2'-dezoksy-2'-ammoguanozyny najlepiej jest przeprowadzać w obecności jonów Mg2+.
Z danych eksperymentalnych w następujących przykładach wynika, że obecność 2'-dezoksy-2'-fluorourydyny i 2'-dezoksy-2'-aminourydyny w rybozymie o strukturze obucha nie znosi aktywności katalitycznej. Jakościowo pokazano to na fig. 3 dla obecności 2'-fluorourydyny w części substratowej i ilościowo w tablicy 1 dla różnych innych par enzym/substrat. Prawdą jest, ze wszystkie te modyfikacje powodują wzrost wartości Km, który jest najbardziej zdecydowany w przypadku podstawienia aminowego. Jednakże to zaburzenie aktywnej struktury mieści się w zakresie zmian Km obserwowanych dla systemów o strukturze obucha z innym składem zasad (Fedor & Uhlenbeck, jak wyżej). Dodatkowo niespodziewanie okazało się, że włączenie pojedynczej 2'-aminourydyny zaraz za miejscem 5' cięcia w substracie znacznie zwiększa kkat (tabela I), stąd staje się wyobrażalne wytwarzanie rybozymów o zwiększonej aktywności przez selektywne wprowadzenie nukleozydów zmodyfikowanych w pozycji 2' w specyficzne miejsca. Wyniki te w sposób ostateczny pokazują, że nie jest wymagana dla aktywności katalitycznej obecność grup 2-wodorotlenowych w części enzymatycznej, ale że modyfikacje zgodnie z prezentowanym wynalazkiem są tolerowane przynajmniej w pewnych pozycjach. Przeciwnie, stwierdzono, że włączenie tylko 15% 2'-dezoksynukleotydów do rybozymu o strukturze obucha zmniejsza wydajność katalityczną o dwa rzędy wielkości, lecz nie wpływa na Km (Perreault i wsp. (1990), jak wyżej). Dopóki tempo przecinania jest określone przez kąt ataku grupy 2'-wodorotlenowej na fosfor w miejscu przecięcia, pozostaje ono pod dużym wpływem całościowej struktury obucha. Zatem obserwowany wpływ modyfikacji w pozycji 2' na to tempo potwierdza obserwację, że analogi z podstawionym fluorem w pozycji 2' przystosowują strukturę w sposób bardziej podobny do struktury rybonukleotydów niż do struktury dezoksyrybonukleotydów. Widoczne jest to również dla analogów aminowych. Inne nukleozydy zmodyfikowane w pozycji 2' zgodnie z prezentowanym wynalazkiem wykazują podobną aktywność katalityczną.
Cząsteczki RNA z aktywnością katalityczną zawierające przynajmniej jeden zmodyfikowany nukleozyd mogą być stosowane jako czynniki lecznicze, zwłaszcza służące do przecinania materiału genetycznego pochodzącego od wirusów albo z innych obcych źródeł lub do przecinania wirusowych albo innych obcych transkryptów lub jako biokatalizatory w procesach biochemicznych lub biotechnologicznych. Do tych celów cząsteczki RNA wytwarzane sposobem według wynalazku są bardziej odpowiednie niż ich nie zmodyfikowane analogi, ponieważ wykazują większą odporność na chemiczne i/lub enzymatyczne cięcia.
Wynalazek będzie następnie zilustrowany następującymi przykładami w połączeniu z fig. 1-7. Jednakże przykłady te nie ograniczają zakresu ochrony wynalazku.
Figura 1 pokazuje autoradiogramy transkryptów plazmidu pUCRS otrzymanych za pomocą polimerazy RNA T7 w procesie transkrypcji run off po elektroforezie w żelu poliakrylamidowym.
169 576
Figura 2 pokazuje autoradiogram transkryptów plazmidu pUCRE zawierającego 2'-aminourydynę otrzymanych za pomocą polimerazy RNA T7 w procesie transkrypcji run off po elektroforezie w żelu poliakrylamidowym.
Figura 3 pokazuje autoradiogram transktryptów E1 i E2 otrzymanych w procesie transkrypcji run off częściowo strawionych rybonukleazą A znakowanych na 5'-końcu rozdzielonych w żelu poliakrylamidowym.
Figura 4 pokazuje autoradiogram całkowitej degradacji S1 i S2 przez RNazę A.
Figura 5 pokazuje autoradiogram cięcia przez rybozym El 2'-fluorourydyny i substratu S3 zawierającego r-AMP.
Figura 6 pokazuje wykres Eadiego-Hofstee dla reakcji rybozymu E2 z S1.
Figura 7 pokazuje wykres Lineweavera-Burka dla reakcji rybozymu E3 z S1.
Figura 8 pokazuje organizację sekwencji HIV-1 sklonowanej w pOTH33.
Figura 9 pokazuje sekwencję nukleotydową rybozymu RE 115.
PRZYKŁADY
Przykład I. Przygotowanie oligorybonukleotydów
Automatyczna synteza oligorybonukleotydów: Automatyczną syntezę oligorybonukleotydów przeprowadzano za pomocą syntetyzera DNA Applied Biosystems 380B na skalę 1 pmol przy użyciu monomerów fosforoamidów rybonukleotydowych dostarczonych przez Milligen/Biosearch. Kontrolne kolumny ze szkła porowatego ze sprzężonym z nimi rybonukleozydem pochodziły zarówno z Milligen/Biosearch jak i Peninsula. Oligomery mieszano zgodnie z opisami załączonymi przez dostawcę fosforoamidów rybonukleotydowych (.Milligen/Biosearch). Po usunięciu grup ochronnych oligorybonukleotydy zatężano przez wirową dializę na membranowych filtrach typu centricon 10 firmy Amicon i strącano etanolem. Wysuszone osady zawieszano w 50 pl wody i poddawano elektroforezie w żelu poliakrylamidowym. Prążki oglądano przez podświetlenie UV, wycinano i izolowano RNA przez elucję w 37°C przez noc w buforze (0,25 M octan amonu 10 mM TRIS/HCl pH 8,0,1 mM EDTA) (Fedor & Uhlenbeck, PNAS USA 87 (1990), 1668-1672). Stężenie określano używając współczynnika ekstynkcji o wartości 6600 M’1 cmu podawane w literaturze (Fedor & Uhlenbeck 1990). Wodne roztwory oligorybonukleotydów przechowywano w -20°C.
Konstrukcja plazmidów zawierających matryce do transkrypcji run off':
Do konstrukcji plazmidu metodą fosforoamidową zsyntetyzowano następujące oligodezoksynukleotydy przy pomocy syntetyzera DNA Applied Biosystems 380B:
RS2-T,5'-d(GATATCCTGACTCCCTATAGTGAGTCGTATTA)-3;
RS2-C,5'-d(TAATACGACTCACTATAGGGAGTCAGGATATCTGCA)-3';
RE1-T,5'-d(GGAGTTTCGGCCTAACGGCCTCATCAGAGGACCCTATAGTGAGTCG
TATTA)-3'i
RE2-C,5'-d(TAATACGACTCACTATAGGGTCCTCTGATGAGGCCGTTAGGCCGA
AACTCCTGCA)-3'.
Przygotowanie klonów pUCRS i pUCRE16 niosących rybozymy:
Handlowy plazmid pUC19 przecięto w jednoetapowej reakcji używając enzymów restrykcyjnych Iso-SacI i Pstl. Następnie DNA oczyszczano za pomocą elektroforezy w 2% żelu agarozowym, a potem elektroelucji przy użyciu Centricon 30 i aparatu do centroelucji dostarczonych przez Amicon. Pary primerów oligonukleotydowych RE1-T i RE2-C (enzym rybozymu) lub RS2-T i RS2-C (substrat rybozymu) fosforylowano jak opisano przedtem (Taylor i wsp., Nucleic Acids Res. 13 (1985), 8749-8764). Tych par oligonukleotydów użyto do klonowania promotora T7 połączonego zarówno z sekwencją DNA dla rybozymu, w wyniku czego otrzymano.pUCRE16, jak i sekwencją DNA dla substratu rybozymu, w wyniku czego otrzymano pUCRS zgodnie z metodą King & Blakesley (Focus 8 -(1986), 1-3). Po transformacji komórek kompetentnych (Olsen & Eckstein, PNAS USA 87 (1990), 1451-1456) białe kolonie przeszukiwano pod kątem obecności drugiego miejsca Avall w przypadku pUCRE 16 lub pojedynczego miejsca EcoRV dla pUCRS. Sekwencję oczyszczonego dwuniciowego DNA określano metodą Olsen i Eckstein (Nucleic Acids Res. 17 (1989), 9613-9620).
169 576
Transkrypty typu run off' polimerazy RNA T7:
Transkrypty typu run off' polimerazy RNA T7 syntetyzowano na skalę 150 pl do 500 pl przystosowując do tego metodą podaną przez Milligan i Uhlenbeck (Meth. in Enzymology 180A (1989), 51-62). Reakcje transkrypcji przeprowadzano w 40 mM TRIS pH 8,0,1 mM spermidyna, 5 mM DTT, 0,01% Tritom x-100, 20 mM MgCh, 2,5 mM nukleotydy, 200 nM matrycy DNA, 0,2 U/pl inhibitora RNazy z łożyska ludzkiego i 100 U/pl polimerazy RNA T7. Jeżeli stosowano trójfosforany 2'-dezoksy-2'-fluoronukleozydów to MgCh zastępowano 20 mM MnCh. Reakcje przeprowadzano w 37°C przez 3 godziny. Transkrypty oczyszczano przez elektroforezę w żelu poliakrylamidowym jak opisano wyżej. Wodne roztwory oligorybonukleotydów przechowywano w -20°C.
Rysunek 1 pokazuje autoradiogramy otrzymanych za pomocą polimerazy RNA T7 transkryptów typu run off pUCRS po elektroforezie w żelu poliakrylamidowym. A: Transkrypcję przeprowadzano na skalę 150 pl w obecności 20 mM MgCh i 2,5 mM każdego z czterech trójfosforanów nukleozydów w 37°C przez 3 godz. Mieszaninę reakcyjną defosforylowano za pomocą alkalicznej fosfatazy i znakowano na 5'-końcach32P przy użyciu kinazy polinukleotydowej [τ-PJ-ATP. Wyznakowaną mieszaninę transkrypcyjną poddawano elektroforezie w żelu poliakrylamidowym. B: Transkrypcję przeprowadzano na skalę 150 pl w 37°C przez 3 godz. w obecności 20 mM MnCl 12, 0,5 mM ATP, 25 pCi [a^PJ-ATP, 2,5 mM CTP i GTP i 2,5 mM trójfosforanu 2'-fluorourydyny. Mieszaninę transkrypcyjną natychmiast poddawano elektroforezie w żelu poliakrylamidowym. Gwiazdki oznaczają fosforany wyznakowane 32p. 'N' oznacza każdy nukleotyd dodany przez polimerazę RNA T7 poza całkowitą długością matrycy DNA (zob. Milligan i Uhlenbeck, Meth. in Enzymology 180a (1989), 51-62).
Rysunek 2 pokazuje autoradiogramy otrzymanych za pomocą polimerazy RNA T7 transkryptów typu run off pUCRE 16 zawierających 2'-aminourydynę po elektroforezie w żelu poliakrylamidowym. Ścieżka 1: Znacznik E3, 34-mer zawierający 2'-aminourydynę, zsyntetyzowany chemicznie. Ścieżka 2: Transkrypcję przeprowadzano na skalę 150 pl w 37°C przez 3 godz. w obecności 20 mM MgCh, 60 pCi [α r]ATP, 1 mM CTP i GTP i 1 mM trójfosforanu 2'-aminourydyny. Mieszaninę transkrypcyjną poddawano natychmiast elektroforezie w żelu poliakrylamidowym.
Przygotowanie oligorybonukleotydów:
Przygotowano następujące oligorybonukleotydy
a. ) metodą transkrypcji run off (sekwencje podano bez 5'-trójfosforanu):
EL 5'-GGGUCCUCUGAUGAGGCCGUUAGGCCGAAACUCC-3';
E2 5'-GGG(2'-FU)CC(2'-FU)C(2'-FU)GA(2'-FU)GAGGCCG(2'-FU)(2'-FU)AGGCCGAAAC(2'-FU)CC-3' i
E3. 5'-GGG(2'-NH2U)CC(2'-NH2U)C(2'-NH2U)GA(2'-NH2U)GAGGCCG(2'-NH2U) (2'-NH2U)AGGCCGAAAC(2'-NH2U)CC-3';
S1. 5'-GGGGGACUGAAU-3';
S3. 5'-AAGAA(2'-FU)CAACA(2'-FU)-3' i
34. 5'AAGAAU(2'-FC)AGGAU-3'
b. ) metodą chemicznej syntezy: Oligorybonukleotydy E1, E2, E3, S1 i S2, 5'-GCGAC(2'· NH2U)GAGAAU-3'.
Oligorybonukleotydy znakowane w pozycji 5' 32P:
Oligorybonukleotydy otrzymane metodą transkrypcji run off' defosforylowano działając wolną od RNazy alkaliczną fosfatazą z wołu, oczyszczano na'kolumnach Quiagen tip-20 zgodnie z przepisem dostarczonym przez producenta (Diagen Inc.) i działano na nie kinazą polinukleotydową T4 i τ-P-ATP. Wyznakowane oligorybonukleotydy oczyszczano elektroforetycznie w żelu poliakrylamidowym.
Przykład II. Trawienie oligorybonukleotydów RNazą A
Częściowe trawienie oligorybonukleotydów RNazą A:
Oligorybonukleotydy E1 i E2 trawiono RNazą A po uprzednim wyznakowaniu w pozycji 5' 32p zgodnie z metodą według Donis-Keller i wsp. (Nucleic Acids Res. 4 (1977)^ 2527-2538) z następującymi zmianami. Około 25 pmoli RNA wyznakowanego w pozycji 5'22P dodawano do 50 pl buforu zawierającego 7 M mocznik, 50 mM EDTA, 0,04% błękitu bromofenolowego,
169 576
0,04% ksylen cyjanol FF i 0,25 mg/ml tRNA w lodzie. Następnie RNA rozdzielano równymi porcjami do 5 oznaczonych probówek, ogrzewano do 50°C przez 5 min. i natychmiast umieszczano w lodzie. Do pierwszej probówki dodawano 2 pl (2 X 104 jednostek) rybonukleazy A i mieszano pipetą. Następnie wykonywano kolejno 5-krotne rozcieńczenia enzymu w trzech dodatkowych probówkach używając nowej końcówki pipety po każdym przeniesieniu z jednej probówki do następnej.-Piąta probówka była próbą kontrolną, do której nie dodano enzymu. Następnie wszystkie probówki inkubowano w 50°C przez 5 min., umieszczano w lodzie i analizowano elektroforetycznie w żelu poliakrylamidowym.
Całkowita degradacja oligorybonukleotydów RNazą A:
Oligorybonukleotydy S1 i S2 trawiono RNazą A po uprzednim wyznakowaniu 32p na 5'-końcu według następującego przepisu: Przeprowadzano reakcję oligomeru (8,5 pM w końcowej objętości 20 pl) z 1,25 x 10'3 jednostek RNazy A w buforze zawierającym 50 mM TRIS/HCl pH 7,5 i 10 mM MgCk przez 10 min. w 37°C. Produkty analizowano elektroforetycznie w żelu poliakrylamidowym.
Rysunek 3 pokazuje autoradiogram częściowo strawionych rybonukleazą A transkryptów typu run off E1 i E2 wyznakowanych na 5'-końcu po rozdziale elektroforetycznym w żelu poliakrylamidowym. Stosowano warunki opisane poprzednio. Ponumerowane ścieżki odpowiadają 1) nie dodano enzymu, 2) 2Χ104 jednostek RNazy A, 3) 3x10‘5 jednostek RNazy A, 4) 8x10'° jednostek RNazy A, 5) 16x10'7jednostek RNazy A. Liczenie zasad było ułatwione przez policzenie prążków, powstałych po cięciu niezmodyfikowanego transkryptu w obecności Mn2+ (10 pmoli RNA ogrzewanego do 90°C przez 3 min. w 10 mM MnCh). Numery zaznaczone kółkami wskazują prążki, które powstały, jak się oczekuje, przez cięcie RNazy-A we wrażliwych pozycjach. Strzałki wskazują prążki, które powstały przez cięcie urydyny w pozycji 3', a które są niewidoczne na ścieżkach gdzie poddawany był cięciu rybozym zawierający 2'-fluorourydynę.
Rysunek 4 pokazuje autoradiogram całkowitej degradacji S1 i S2 RNazą A po elektroforezie w żelu poliakrylamidowym. Szczegóły reakcji podano wyżej. Ścieżka 1: całkowite trawienie 12-meru S2; ścieżka 2: całkowite trawienie 12-meru S1; ścieżka 3: drabina prążków, powstała po reakcji 34-meru E1 z 20 mM MnCh w 90°C przez 3 min. jako standart wielkości. Produkt cięcia S2 jest o 1 nukleotyd dłuższy niż produkt S1 co wskazuje na obecność 2'-aminourydyny w pozycji 6.
Przykład III. Cięcie substratów oligorybonukleotydowych przez rybozymy
Określenie kinetyki cięcia:
Reakcje cięcia przeprowadzano stosując przystosowaną do tego metodę według Fedor i Uhlenbeck (1990), jak wyżej). Roztwory podstawowe enzymu rybozymowego (zwykle 20 pl końcowej objętości, końcowe stężenie 100 nN, 50 mM TRIS/HCl, pH 7,5) i substratu oligonukleotydowego (zwykle 40 pl, końcowe stężenie 2 pM) podgrzewano oddzielnie w 90°C przez 1 min. i schładzano do temperatury pokojowej przez 15 min. przed dodaniem dwuwartościowego jonu metalu (MnCh lub MgCk, końcowe stężenie 10 mM). Te roztwory podstawowe inkubowano oddzielnie w 25°C przez 15 min. przed rozpoczęciem reakcji cięcia. Reakcje rozpoczynano przez dodanie enzymu do substratu (50 mM TRIS/HCl, pH 7,5,20 pl końcowej objętości, MgCk, końcowe stężenie 10 mM), z typowymi stężeniami 10 nN enzymu i między 50 i 5000 nN substratu. W przedziałach czasowych przenoszono 10 pl mieszaniny do 10 pl mieszaniny hamującej zawierającej mocznik i poddawano elektroforezie w żelu poliakrylamidowym. Autoradiogramy analizowano za pomocą densytometru laserowego LKB ULTROSCAN XL.
W badanym systemie rybozymu o strukturze obucha substrat oligonukleotydowy składający się z 12 reszt (oznaczony jako S) przecinano przy użyciu enzymu oligonukleotydowego składającego się z 34 reszt) w pozycji 3' cytydyny-7 jak to zaznaczono strzałką w strukturze zamieszczonej we wstępie. To cięcie wytwarzało hektamer z 2'-3'-cyklicznym końcem fosforanowym (produkt 1) i pentamer z końcem 5'-wodorotlenowym (produkt 2) (Ruffner i wsp., Gene 82 (1989), 31-41). Obserwowaliśmy ten typ produktów cięcia nie tylko w reakcji z oligorybonukleotydami E1 i S1, lecz równie z substratem S3 zawierającym 2'-fluorourydynę (fig. 5). Jak oczekiwano, substrat oligonukleotydowy S4, zawierający 2'-fluorocytydynę w pozycji cięcia nie
965:576 ulega przecięciu w identycznych warunkach. Te dwie reakcje zawierają 2'-fluorourydynę w substracie oligonukleotydowym.
Jednakże, potencjalnie bardziej interesującym dla przyszłych zastosowań pytaniem jest kwestia, czy obecność tych modyfikacji w części enzymatycznej rybozymu będzie kolidowała z jego aktywnością enzymatyczną. Zatem zbadano reakcję rybozymu E2 zawierającego 2'-fluorourydynę z niezmodyfikowanym substratem S1. Rzeczywiście, analiza w żelu pokazywała, że substrat podlegał cięciu z podobną wydajnością jak w przypadku pary E1 i S1. Określono stałe katalityczne rybozymu E2 zawierającego 2'-fluorourydynę (fig. 6) i porównano z odpowiednimi wartościami dla nie zmodyfikowanego rybozymu E1. Porównanie wykazało, że stała szybkość reakcji dla pierwszego (kkattKm = 0,0026 nM'1) jest o jeden rząd mniejsza niż dla drugiego (kkat/Km = 0,023 nM°) (Fedor & Uhlenbeck (1990) jak wyżej) (tabela 1). Ten spadek katalitycznej wydajności jest przede wszystkim spowodowany spadkiem szybkości przecinania, podczas gdy wartości Km dla obu rybozymów są prawie identyczne. Jednakże ta zmniejszona szybkość przecinania mieści się dobrze w zakresie wydajności cięcia obserwowanej w rozmaitych systemach ze strukturą obucha o różnych składach zasad (Fedor & Uhlenbeck (1990), jak wyżej). Reakcje rybozymu o strukturze obucha można przeprowadzać zarówno z MgCb jak i MnCl2 jak i jonami metali jako kofaktorami, gdzie połowiczny czas trwania cięcia zmniej-sza się w obecności ostatniego kofaktora około 10 razy (Uhlenbeck, Nature 328 (1987), 596-609). Ten spadek połowicznego czasu trwania substratu w warunkach cięcia po zmianie Mg2+ na Mto+ zaobserwowano również na reakcji enzymu E2 zawierającego 2'-fluorourydynę z substratem S1. To wymaganie obecności jonów metalu przez reakcję cięcia nie zmieniło się przez włączenie analogów 2'-fluoronukleotydów.
Zbadano również efekt obecności 2'-aminourydyny w rybozymie. Kiedy rybozym E3 zawierający 2'-aminourydynę reagował z niezmodyfikowanym substratem S1, wydajność katalityczna spadała do rzędu wielkości (kkat/Km = 0,0015 nM4). Ten spadek wydajności był w sposób oczywisty spowodowany wyższą Km, podczas gdy kkat pozostawała prawie nie zmieniona. Zatem całkowita wydajność rybozymu zawierającego 2'-aminourydynę jest porównywalna z wydajnością rybozymu zawierającego 2'-fluorourydynę. W komplementarnej reakcji niezmodyfikowanego rybozymu E1 z selektywnie zmodyfikowanym 2'-aminourydyną substratem S2 wydajność katalityczna wzrasta w porównaniu z powyższą reakcj ą do (kkat/Km = 0,0063 nM4). Ten efekt jest spowodowany wyłącznie przez wzrost kkat- Ta tendencja jest nawet wyraźnie widoczna w reakcji rybozymu E3, zawierającego 2'-aminourydynę, z S2, gdzie wydajność katalityczna wzrasta do (kkat/Km = 0,0011 nM’ ), znów głównie z powodu wzrostu kkat- Kinetyczne parametry dla wszystkich powyższych reakcji podsumowano w tabeli 1.
Tabela 1
Stałe kinetyczne rybozymów, zawierających zmodyfikowany w pozycji 2' nukleotyd. a
| Enzym | Substrat | kkat (min-i) | Km (nM) | kkat/Km (nM-1 min-1) |
| E1 (niezmod.) | S1 (niezmod.) | 3,0 | 140 | 0,023 |
| E2 (2'-FU) | S1 (niezmod.) | 0,8 | 300 | 0,0026 |
| E3 (2'-NH2U) | S1 (niezmod.) | 2,3 | 1500 | 0,0015 |
| E3 (2'-NH2U) | S2 (2'-NH2U) | 19,0 | 1800 | 0,011 |
| E1 (niezmod.) | S2 (2'-NH2U) | 10,0 | 1600 | 0,0063 |
a Stałe kinetyczne wyznaczono z wykresu Eadiego-Hofstee dla reakcji cięcia przeprowadzanych z 10 nM rybozymu i w zakresie stężeń substratu od 50 nM do 1200 nM.
Zatem, zestawione tutaj dane kinetyczne pokazują, że chociaż wydajności cięcią rybozymu zmodyfikowanego 2'-fluoro- i 2'-aminourydyną jest w pewien sposób zredukowana, to wciąż mieści się ona w zakresie zmian obserwowanych w systemach o strukturze obucha z różnym składem zasad. Stało się również jasne, że jest możliwe zwiększenie wydajności katalitycznej przez selektywne wprowadzenie modyfikacji w pozycji 2' w specyficznych miejscach. Chociaż
169 576 ostatni efekt zaobserwowano dla substratu oligorybonukleotydowego, to przewiduje się, ze podobny wpływ na katalizę można znaleźć dla selektywnych modyfikacji w enzymie.
Rysunek 5 pokazuje autoradiogram cięcia przez rybozym E1 substratu S3, zawierającego 2'-fluorourydynę i 32P-AMP. Reakcję cięcia przeprowadzano w obecności 10 mM MgCb w 50 mM TRIS/HCl, pH 7,5 na skalę 40 μl w 25°C. Stężenie Eli S3 wynosiło odpowiednio 2,5 μΜ i 7,5 μM, wszystkie inne szczegóły opisano wyżej (zob. Określenie kinetyki cięcia). W określonych przedziałach czasowych 10 μl próbki przenoszono do 10 μl wody i dodawano 10 μl mieszaniny hamującej z mocznikiem przed nałożeniem na Żel poliakrylamidowy. Ścieżka 1: reakcja po 0,5 min.; ścieżka 2: reakcja po 15 min.; ścieżka 3: reakcja po 30 min. Gwiazdki oznaczają fosforany wyznakowane MP.
Rysunek 6 pokazuje wykres Eadiego-Hofstee dla reakcji rybozymu E2 z S1. Reakcję cięcia przeprowadzano na skalę 20 μl w obecności 10 mM MgCb z 10 nM stężeniem E2 i stężeniami S1 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 500 nM i 700 nM. Po 7 min. 10 μl próbki przenoszono do 10 μl wody i dodawano 10 μl mieszaniny hamującej z mocznikiem przed nałożeniem na żel poliakrylamidowy. Najpierw określono, że te punkty czasowe mieszczą się w liniowym zakresie początkowej szybkości. Autoradiogramy analizowano przez integrację ich optycznej gęstości na densytometrze laserowym.
Rysunek 7 pokazuje wykres Lineweavera-Burka dla reakcji rybozymu E3 z S1. Reakcję cięcia przeprowadzano na skalę 20 μl w obecności 10 mM MgCb z 10 nM stężeniem E3 i stężeniami S1 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 500 nM i 700 nM. Wszystkie pozostałe szczegóły jak na fig. 6.
Przykład IV. Cięcie RNA LTR HIV-1 przy użyciu rybozymów
Konstrukcja plazmidu: Plazmid pOTH33 skonstruowano przez sklonowanie sekwencji HIV-1 od miejsca -525 do 386 (zgodnie z numeracją sekwencji według Ratner i wsp., Nature 313 (1985), 277-284) w handlowym plazmidzie pSPT19 (Pharmacia). Sekwencję HlV umieszczono pod kontrolą transkrypcyjną promotora T7 (T7). Diagram wstawki HIV w pOTH33 podano na fig. 8. Rejon RTL HIV-1 składa się z rejonu U3, rejonu R i rejonu U5. Rejon ten posiada na 5'-końcu obszar polipurynowy i na 3'-końcu miejsce wiążące primer (PBS), sekwencję sygnałową i część genu gag. Strzałki w pozycjach -525 i 386 wskazują miejsca restrykcyjne użyte do konstrukcji pOTH33. Strzałka w pozycji 115 wskazuje miejsce cięcia przeprowadzanego przez rybozym.
RNA HIV1 od pozycji -525 do 386, obejmujące długą powtórzoną sekwencję końcową od nukleotydu -453 do 182 otrzymano przez transkrypcję run off plazmidu pOTH33, przeciętego EcoRI (100 ng/il matrycy DNA, 10 mM DTT, 500 μM każdego rNTP, 50 mM Tris-Cl pH 7,5,2 mM spermidyna, 6 mM MgCb, 2 iCi/ll [a-P]-ATP, 50 U/il inhibitora RNazy i 15 U/il polimerazy RNA T7,2 godz. w 4°C) i następnie inkubację mieszaniny reakcyjnej z DNaząI (1 U/il 10 min. w 37°C) (wolna od RNazy) i ekstrakcję mieszaniną fenolu i chloroformu. Otrzymane RNA nazwano RNA LTR.
Miejsce 115 RNA LTR HIV1 zawierające potencjalne miejsce cięcia GUC wybrano jako substrat dla cięcia katalizowanego przez rybozym. Rybozymy o strukturze obucha, skierowane przeciwko temu miejscu, zsyntetyzowano chemicznie. Sekwencję nukleotydową niezmodyfikowanego enzymu o strukturze obucha RE115 podano na fig. 9.
Kinetyka cięcia za pomocą RNA RTL: wartości kka/Km określano w warunkach pojedynczej zmiany. Rybozymy preinkubowano w 75°C przez 1 min. w obecności 50 mM Tris-Cl pH 7,5, a następnie inkubowano przez 5 min. w 37°C. Dodawano MgCb do końcowego stężenia 10 mM i roztwory ponownie inkubowano przez 5 min w 37°C. RNA LTR używano bezpośrednio jako roztworu wodnego. Mieszanina reakcyjna (19 il) zawierała między 20 nM i 1 iM rybozymu, 50 mM Tris-Cl pH 7,5 i 10 mM MgCb. Reakcję rozpoczynano przez dodanie RNA RTL do końcowego stężenia 10 nM. Po 1 godz. w 37°C reakcję hamowano przez dodanie 10 il mieszaniny hamującej i analizowano elektroforetycznie w 4% żelu poliakrylamidowym (długość 40 cm, 8 M mocznik). Po 1 godz. elektroforezy przy 50 W wykonywano autoradiografię, a następnie frakcję nieprzeciętnego RNA RTL określano za pomocą laserowej densytometrii skaningowej.
169 576
Wartości kkat/Km otrzymano przez podzielenie pozostałej frakcji RNA RTL (Frac S) przez stężenie rybozymu ([RE]) według następującego równania:
k = ln(FracS) = [RE]—21 t Km gdzie k jest obserwowaną szybkością reakcji i t jest czasem reakcji równym 1 godz.
W celu zbadania wpływu chemicznych modyfikacji na katalityczną aktywność rybozymu zsyntetyzowano kilka analogów REI 15 zawierających podstawienia 2'-fluoro lub 2'-dezoksy i/lub końcowe wiązania tiofosforanowe. Podczas gdy podstawienia 2'-fluorocytydynowe nie wpływały na wydajność katalityczną [tabela 2 REI 15 (FC)], to podstawienia 2'-fluorourydynowe powodowały pięciokrotny spadek kkat/Km [tabela 2 REI 15 (FU)]. Jednak 5'-końcowa grupa tiofosforanowa w połączeniu z trzema 3'-końcowymi grupami tiofosforanowymi obniżała wydajność katalityczną w stopniu zaniedbywalnym [tabela 2, REI 15 (S)]. To samo dotyczyło połączenia końcowych wiązań tiofosforanowych z podstawieniami 2'-fluorourydynowymi, gdzie nie obserwowano dalszego spadku wartości kkat/Km [tabela 2, REI 15 (FU, S)]. Podstawienie wszystkich rybonukleotydów pirymidynowych przez ich analogi 2'-fluorowe i wprowadzenie czterech wiązań tiofosforanowych zmniejszało wydajność katalityczną tylko siedem razy w porównaniu z niezmodyfikowanym rybozymem [tabela 2, REI 15 (FC, FU, S)]. Przeciwnie, podstawienia wszystkich rybonukleotydów pirymidynowych ich analogami 2'-dezoksynukleozydowymi w połączeniu z tiofosforanami powodowany pięćdziesięciokrotny spadek kkat/Km [tabela 2, REI 15 (dC, dU, S)]. Zatem REI 15 (dC, dU, S) jest około siedem razy mniej wydajne niż REI 15 (FC, FU, S).
Tabela 2
Wpływ chemicznych modyfikacji na cięcie RNA LTR przez REI 15
| Rybozym | kkat/Km, M'1 s'1 | kkat/Km, względne |
| RE115 | 500 | 1 |
| RElll(S) | 360 | 0,72 |
| RE115(FC)‘ | 490 | 0,98 |
| RE115(FU)‘ | 89 | 0,18 |
| REllStFU.S)1 | 59 | 0,12 |
| REI 15(FC,FU,S)‘ | 69 | 0,14 |
| REI 15(dC,dU,S)2 | 10 | 0,020 |
Przykłady prezentowanego wynalazku 2 Przykład porównawczy
Przykład V. Stabilność oligorybonukleotydów
Rybozymy z przykładu IV badano pod względem ich odporności na trawienie nukleazą.
Warunki testu:
Klon komórkowy Molt 4 (otrzymany dzięki uprzejmości E. Jurkiewicz, Deutsches Primatenzentrum, Góttingen) hodowano wychodząc od 8 pojedynczych komórek, w pożywce RMPI 1640 do gęstości komórek około 106 komórek/ml, a następnie żwirowano przy 1000 g przez 5 min. w mikrowirówce Heraeus. Rybozymy wyznakowane w pozycji 5'32 ogrzewano przez 1 min. w 90°C, chłodzono w lodzie, dodawano do nadsączu komórkowego do końcowego stężenia 300 nM i inkubowano w 37°C. Próbki pobierano po upływie wskazanych przedziałów czasowych i analizowano przez elektroforezę w 20% żelu poliakrylamidowym zawierającym 8 M mocznik, a następnie poddawano autoradiografii.
Wyniki:
Więcej niż 80% REI 15 było zdegradowanych po 2 min. inkubacji w nadsączu komórkowym jak wykazano to w denaturującym żelu poliakrylamidowy. Dla RE115(S) otrzymano podobne wyniki. Jednakże nie obserwowano degradacji REI 15(FC, FU, S) po 1 godz Porów169 576 nanie z szybkością degradacji niezmodyfikowanego rybozymu wskazuje na to, że połączenie nukleozydów pirymidynowych zmodyfikowanych w pozycji 2' z końcowymi wiązaniami tiofosforanowymi powoduje więcej niz pięćdziesięciokrotne (szacunkowo) wzrost odporności rybozymu na trawienie nukleazami znajdującymi się w nadsączu komórek T. Rybozymy zmodyfikowane w pozycji 2' bez grupy tiofosforanowej wykazują stabilność, którajest około dwóch razy mzsza niż stabilność REI 15 (FC, FU, S).
Fig.2
2
169 576
169 576
7-mer-.5'-*pGGGAG(2'-NH2UlC-3' 6-mer 5’-*pGGGAGU-3'
A
Fig.5
substrafe5'-pppGGG*AGI2'-FU)[łAGGłAi2'-FU)-3' product t5'(HOl*AGG*A(2,-FUl[OHl-3' product 2 5'-pppGGGłAG(2'-FU|C(>l-3'
169 576
Fig.6
-0 010
-0 006 -0 002
002
010
169 576
Hindlll
T7
Kpnl EcoRI
-525 115 386
| « V, *ί~* |
U 3 R U 5 PBS LEADER gag
Lider
POTH33
Fig. 8
5'CACAACACUGAUGAGGCCGUUAGGCCGAAACGGGCA3'
Fig. 9
169 576
Fig .1
13-mer- 5'-*pGCGAGUCA GGA UN-3' 12-mer 5'-*pGGGAGUCAGGAU-3'
13-mer 5’-pppGGG*AGl2’-FU)C*AGG*A(2‘-FU)N-3· 12-mer S'-pppGGG*AG(2'-FU]CłAGG*A(2'-FUl-3·
Ł ii u
«*
Departament Wydawnictw UP RP Nakład 90 egz Cena 4,00 zł
Claims (25)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób wytwarzania cząsteczki RNA o aktywności katalitycznej, znamienny tym, ze przeprowadza się syntezę łańcucha RNA i włącza się co najmniej jeden zmodyfikowany nukleotyd, w którym grupę wodorotlenową w pozycji 2' cukru rybozy zastąpiono grupą modyfikującą, wybraną spośród chlorowców, grupy siarkowodorowej, azydkowej, aminowej i grup aminowych, podstawionych w jednej lub dwóch pozycjach.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że grupa modyfikująca jest chlorowcem lub grupą aminową.
- 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że grupa modyfikująca jest fluorem.
- 4. Sposób według zastrz. 1, zamienny tym, że syntezę łańcucha RNA przeprowadza się przez chemiczną syntezę prekursorów nukleotydowych na stałym podłożu, usunięcie produktu RNA z tego stałego podłoża i oczyszczenie usuniętego produktu RNa.
- 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że syntezę łańcucha RNA przeprowadza się przez chemiczną syntezę prekursorów nukleotydowych w roztworze i oczyszczenie produktu RNA.
- 6. Sposób według zastrz. 4 albo 5, znamienny tym, że jako prekursory nukleotydów stosuje się fosforoamidy lub H-fosfotiony.
- 7. Sposób według zastrz. 4 albo 5, znamienny tym, że modyfikującą grupę aminową włącza się do łańcucha RNA w formie trójfluoroacetylowanej grupy amidowej, a następnie chroniącą grupę trójfluoroacetylową usuwa się działając amoniakiem.
- 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że dodatkowo włącza się do łańcucha RNA przynajmniej jedno zmodyfikowane wiązanie fosfodwuestrowe między nukleotydami.
- 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że zmodyfikowane wiązanie fosfodwuestrowe jest grupą tiofosforanową.
- 10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że syntezę łańcucha RNA przeprowadza się przez transkrypcję z matrycy kwasu nukleinowego przy użyciu polimerazy kwasu nukleinowego.
- 11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że matryca kwasu nukleinowego jest matrycą RNA, a polimeraza kwasu nukleinowego jest polimerazą RNA zależną od DNA.
- 12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że polimeraza RNA zależna od DNA wybrana jest z grupy, obejmującej polimerazę T7, T3 i SP6.
- 13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że polimerazą RNA zależną od DNA jest polimeraza T7.
- 14. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że zmodyfikowana grupa jest chlorowcem i syntezę łańcucha RNA przeprowadza się w obecności jonów Mn2+.
- 15. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że grupa modyfikującajest grupą aminową lub grupą aminową podstawioną w jednej lub dwóch pozycjach i syntezę łańcucha RNA przeprowadza się w obecności jonów Mg2+.
- 16. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że zasadę nukleotydową przyłączoną do zmodyfikowanego cukru rybozy wybrano spośród grup naturalnie występujących w RNA i podstawionych zasad.
- 17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że podstawioną zasadę nukleotydową wybrano spośród grup zawierających ksantynę, hypoksantynę, 2,6-dwuaminopurynę, 2-hydroksy-6-merkaptopurynę i zasady purynowe, podstawione w pozycji 6 siarką lub zasadami pirymidowymi, podstawionymi w pozycji 5 chlorowcami lub grupami C1-C5alkilowymi.
- 18. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że zasada nukleotydową przyłączona do zmodyfikowanego cukru rybozy jest zasadą naturalnie występującą w RNA.169 576
- 19. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że zasada nukleotydowa przyłączona do zmodyfikowanego cukru rybozy jest zasadą pirymidynową.
- 20. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wszystkie zasady nukleotydowe jednego specyficznego rodzaju są przyłączone do zmodyfikowanego cukru rybozy.
- 21. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że wszystkie uracylowe zasady nukleotydowe są przyłączone do zmodyfikowanego cukru rybozy.
- 22. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że wszystkie cytozynowe zasady nukleotydowe są przyłączone do zmodyfikowanego cukru rybozy.
- 23. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wszystkie zasady nukleotydowe dwóch specyficznych rodzajów są przyłączone do zmodyfikowanego cukru rybozy.
- 24. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że wszystkie cytozynowe i uracylowe zasady nukleotydowe są przyłączone do zmodyfikowanego cukru.
- 25. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że zmodyfikowany cukier ryboza obejmuje grupy 2'-fluorowe i 2'-aminowe.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP9001731 | 1990-10-12 | ||
| PCT/EP1991/001811 WO1992007065A1 (en) | 1990-10-12 | 1991-09-23 | Modified ribozymes |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL169576B1 true PL169576B1 (pl) | 1996-08-30 |
Family
ID=8165527
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL91298867A PL169576B1 (pl) | 1990-10-12 | 1991-09-23 | Sposób wytwarzania czasteczki RNA o aktywnosci katalitycznej PL PL |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5672695A (pl) |
| EP (1) | EP0552178B1 (pl) |
| JP (2) | JP3257675B2 (pl) |
| AT (1) | ATE147098T1 (pl) |
| AU (1) | AU649074B2 (pl) |
| CA (1) | CA2093664C (pl) |
| DE (2) | DE552178T1 (pl) |
| ES (1) | ES2061416T3 (pl) |
| GR (1) | GR930300130T1 (pl) |
| PL (1) | PL169576B1 (pl) |
| WO (1) | WO1992007065A1 (pl) |
Families Citing this family (505)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5948634A (en) * | 1988-12-21 | 1999-09-07 | The General Hospital Coporation | Neural thread protein gene expression and detection of alzheimer's disease |
| US6005087A (en) * | 1995-06-06 | 1999-12-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 2'-modified oligonucleotides |
| US5670633A (en) * | 1990-01-11 | 1997-09-23 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression |
| US6399754B1 (en) | 1991-12-24 | 2002-06-04 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Sugar modified oligonucleotides |
| US5623065A (en) * | 1990-08-13 | 1997-04-22 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Gapped 2' modified oligonucleotides |
| US5955589A (en) * | 1991-12-24 | 1999-09-21 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Gapped 2' modified oligonucleotides |
| US5859221A (en) * | 1990-01-11 | 1999-01-12 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 2'-modified oligonucleotides |
| US5872232A (en) * | 1990-01-11 | 1999-02-16 | Isis Pharmaceuticals Inc. | 2'-O-modified oligonucleotides |
| US6395888B1 (en) | 1996-02-01 | 2002-05-28 | Gilead Sciences, Inc. | High affinity nucleic acid ligands of complement system proteins |
| AU650032B2 (en) * | 1990-06-19 | 1994-06-09 | Gene Shears Pty. Limited | Endonucleases |
| EP0552178B1 (en) | 1990-10-12 | 1997-01-02 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Modified ribozymes |
| US7015315B1 (en) | 1991-12-24 | 2006-03-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Gapped oligonucleotides |
| US5965722A (en) | 1991-05-21 | 1999-10-12 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense inhibition of ras gene with chimeric and alternating oligonucleotides |
| US7119184B2 (en) | 1991-08-12 | 2006-10-10 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides having A-DNA form and B-DNA form conformational geometry |
| US6307040B1 (en) | 1992-03-05 | 2001-10-23 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression |
| US5856455A (en) * | 1991-12-24 | 1999-01-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Gapped 2'-modified oligonucleotides |
| DK1695979T3 (da) * | 1991-12-24 | 2011-10-10 | Isis Pharmaceuticals Inc | Gappede modificerede oligonukleotider |
| US6277603B1 (en) | 1991-12-24 | 2001-08-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules |
| US5652094A (en) * | 1992-01-31 | 1997-07-29 | University Of Montreal | Nucleozymes |
| US6204027B1 (en) * | 1992-02-26 | 2001-03-20 | University Of Massachusetts Worcester | Ribozymes having 2′-O substituted nucleotides in the flanking sequences |
| US6469158B1 (en) | 1992-05-14 | 2002-10-22 | Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated | Synthesis, deprotection, analysis and purification of RNA and ribozymes |
| US5686599A (en) * | 1992-05-14 | 1997-11-11 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Synthesis, deprotection, analysis and purification of RNA and ribozymes |
| US20030125270A1 (en) * | 2000-12-18 | 2003-07-03 | Lawrence Blatt | Enzymatic nucleic acid treatment of diseases or conditions related to hepatitis C virus infection |
| US20030206887A1 (en) * | 1992-05-14 | 2003-11-06 | David Morrissey | RNA interference mediated inhibition of hepatitis B virus (HBV) using short interfering nucleic acid (siNA) |
| WO2002081494A1 (en) * | 2001-03-26 | 2002-10-17 | Sirna Therapeutics, Inc. | Oligonucleotide mediated inhibition of hepatitis b virus and hepatitis c virus replication |
| US5977343A (en) | 1992-05-14 | 1999-11-02 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Synthesis, deprotection, analysis and purification of RNA and ribozymes |
| US20040127446A1 (en) * | 1992-05-14 | 2004-07-01 | Lawrence Blatt | Oligonucleotide mediated inhibition of hepatitis B virus and hepatitis C virus replication |
| US5804683A (en) * | 1992-05-14 | 1998-09-08 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Deprotection of RNA with alkylamine |
| US20040054156A1 (en) * | 1992-05-14 | 2004-03-18 | Kenneth Draper | Method and reagent for inhibiting hepatitis B viral replication |
| US6346614B1 (en) | 1992-07-23 | 2002-02-12 | Hybridon, Inc. | Hybrid oligonucleotide phosphorothioates |
| US5652355A (en) * | 1992-07-23 | 1997-07-29 | Worcester Foundation For Experimental Biology | Hybrid oligonucleotide phosphorothioates |
| TW244371B (pl) * | 1992-07-23 | 1995-04-01 | Tri Clover Inc | |
| US5646042A (en) * | 1992-08-26 | 1997-07-08 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | C-myb targeted ribozymes |
| US5891684A (en) * | 1992-10-15 | 1999-04-06 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Base-modified enzymatic nucleic acid |
| US5864028A (en) * | 1992-11-03 | 1999-01-26 | Gene Shears Pty. Limited | Degradation resistant mRNA derivatives linked to TNF-α ribozymes |
| ZA938208B (en) * | 1992-11-03 | 1995-01-03 | Gene Shears Pty Ltd | TNF-alpha ribozymes and degradation resistant mRNA derivatives linked to TNF-alpha ribozymes |
| GB9225427D0 (en) * | 1992-12-04 | 1993-01-27 | Ribonetics Gmbh | Oligonucleotides with rna cleavage activity |
| US5837542A (en) * | 1992-12-07 | 1998-11-17 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) ribozymes |
| US5658780A (en) * | 1992-12-07 | 1997-08-19 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Rel a targeted ribozymes |
| US5612215A (en) * | 1992-12-07 | 1997-03-18 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Stromelysin targeted ribozymes |
| US5616488A (en) * | 1992-12-07 | 1997-04-01 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | IL-5 targeted ribozymes |
| US5811300A (en) * | 1992-12-07 | 1998-09-22 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | TNF-α ribozymes |
| US5817635A (en) * | 1993-08-09 | 1998-10-06 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. | Modified ribozymes |
| CA2169645A1 (en) | 1993-09-02 | 1995-03-09 | Nassim Usman | Non-nucleotide containing enzymatic nucleic acid |
| AU7623194A (en) * | 1993-09-03 | 1995-03-22 | Vpi Holdings Ltd. | Oligonucleotides with rna cleavage activity |
| US5861288A (en) * | 1993-10-18 | 1999-01-19 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Catalytic DNA |
| DE69415343T2 (de) * | 1993-10-27 | 1999-08-26 | Ribozyme Pharmaceuticals | 2'-amido-und 2'-peptido-modifizierte oligonukleotide |
| CA2176035A1 (en) | 1993-11-08 | 1995-05-18 | Nassim Usman | Base-modified enzymatic nucleic acid |
| AU730347B2 (en) * | 1993-11-08 | 2001-03-08 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Base-modified enzymatic nucleic acid |
| US6897016B1 (en) | 1993-11-12 | 2005-05-24 | The Regents Of The University Of Colorado | Alteration of sequence of a target molecule |
| US5639647A (en) | 1994-03-29 | 1997-06-17 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | 2'-deoxy-2'alkylnucleotide containing nucleic acid |
| US5631359A (en) * | 1994-10-11 | 1997-05-20 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Hairpin ribozymes |
| US5693532A (en) * | 1994-11-04 | 1997-12-02 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Respiratory syncytial virus ribozymes |
| CA2183992A1 (en) * | 1994-02-23 | 1995-08-31 | Dan T. Stinchcomb | Method and reagent for inhibiting the expression of disease related genes |
| US5902880A (en) * | 1994-08-19 | 1999-05-11 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | RNA polymerase III-based expression of therapeutic RNAs |
| EP1260586A3 (en) * | 1994-02-23 | 2004-04-28 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Method and reagent for inhibiting the expression of disease related genes |
| US5627053A (en) * | 1994-03-29 | 1997-05-06 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid |
| US6103890A (en) * | 1994-05-18 | 2000-08-15 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Enzymatic nucleic acids that cleave C-fos |
| US5633133A (en) * | 1994-07-14 | 1997-05-27 | Long; David M. | Ligation with hammerhead ribozymes |
| US6146886A (en) * | 1994-08-19 | 2000-11-14 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | RNA polymerase III-based expression of therapeutic RNAs |
| US5599706A (en) * | 1994-09-23 | 1997-02-04 | Stinchcomb; Dan T. | Ribozymes targeted to apo(a) mRNA |
| US5700923A (en) * | 1994-09-29 | 1997-12-23 | Hybridon, Inc. | Finderons and methods of their preparation and use |
| US5716824A (en) * | 1995-04-20 | 1998-02-10 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | 2'-O-alkylthioalkyl and 2-C-alkylthioalkyl-containing enzymatic nucleic acids (ribozymes) |
| US5672501A (en) * | 1994-12-23 | 1997-09-30 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Base-modified enzymatic nucleic acid |
| US5545729A (en) * | 1994-12-22 | 1996-08-13 | Hybridon, Inc. | Stabilized ribozyme analogs |
| US5705388A (en) * | 1994-12-23 | 1998-01-06 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | CETP Ribozymes |
| US5804560A (en) * | 1995-01-06 | 1998-09-08 | Sibia Neurosciences, Inc. | Peptide and peptide analog protease inhibitors |
| US6017887A (en) * | 1995-01-06 | 2000-01-25 | Sibia Neurosciences, Inc. | Peptide, peptide analog and amino acid analog protease inhibitors |
| US5663064A (en) * | 1995-01-13 | 1997-09-02 | University Of Vermont | Ribozymes with RNA protein binding site |
| US5877021A (en) * | 1995-07-07 | 1999-03-02 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | B7-1 targeted ribozymes |
| US20040102389A1 (en) * | 1995-10-26 | 2004-05-27 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Nucleic acid-mediated treatment of diseases or conditions related to levels of vascular endothelial growth factor receptor (VEGF-R) |
| US20040142895A1 (en) * | 1995-10-26 | 2004-07-22 | Sirna Therapeutics, Inc. | Nucleic acid-based modulation of gene expression in the vascular endothelial growth factor pathway |
| US20040220128A1 (en) * | 1995-10-26 | 2004-11-04 | Sirna Therapeutics, Inc. | Nucleic acid based modulation of female reproductive diseases and conditions |
| US6346398B1 (en) | 1995-10-26 | 2002-02-12 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Method and reagent for the treatment of diseases or conditions related to levels of vascular endothelial growth factor receptor |
| US7034009B2 (en) * | 1995-10-26 | 2006-04-25 | Sirna Therapeutics, Inc. | Enzymatic nucleic acid-mediated treatment of ocular diseases or conditions related to levels of vascular endothelial growth factor receptor (VEGF-R) |
| EP0866865B1 (en) * | 1995-11-14 | 2002-02-06 | Vimrx Holdings, Ltd. | Chimeric oligomers having an rna-cleavage activity |
| US5998203A (en) * | 1996-04-16 | 1999-12-07 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Enzymatic nucleic acids containing 5'-and/or 3'-cap structures |
| ES2221942T3 (es) * | 1996-05-24 | 2005-01-16 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Reactivo y metodo para inhibir la expresion de n-ras. |
| US5898031A (en) * | 1996-06-06 | 1999-04-27 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligoribonucleotides for cleaving RNA |
| US7812149B2 (en) | 1996-06-06 | 2010-10-12 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 2′-Fluoro substituted oligomeric compounds and compositions for use in gene modulations |
| US20030044941A1 (en) | 1996-06-06 | 2003-03-06 | Crooke Stanley T. | Human RNase III and compositions and uses thereof |
| US9096636B2 (en) | 1996-06-06 | 2015-08-04 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation |
| US5807743A (en) * | 1996-12-03 | 1998-09-15 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Interleukin-2 receptor gamma-chain ribozymes |
| EP0948538B1 (en) * | 1996-12-13 | 2008-06-11 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Analysis and separation of platelet-derived growth factor proteins |
| CA2275541A1 (en) * | 1996-12-19 | 1998-06-25 | Yale University | Bioreactive allosteric polynucleotides |
| US6248878B1 (en) | 1996-12-24 | 2001-06-19 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Nucleoside analogs |
| US20030186909A1 (en) * | 1997-01-27 | 2003-10-02 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Nucleic acid treatment of diseases or conditions related to levels of epidermal growth factor receptors |
| US6057156A (en) | 1997-01-31 | 2000-05-02 | Robozyme Pharmaceuticals, Inc. | Enzymatic nucleic acid treatment of diseases or conditions related to levels of epidermal growth factor receptors |
| US6159951A (en) | 1997-02-13 | 2000-12-12 | Ribozyme Pharmaceuticals Inc. | 2'-O-amino-containing nucleoside analogs and polynucleotides |
| US7226730B1 (en) | 1997-02-26 | 2007-06-05 | The General Hospital Corporation | Transgenic animals and cell lines for screening drugs effective for the treatment or prevention of Alzheimer's Disease |
| NZ337445A (en) | 1997-02-26 | 2000-12-22 | Gen Hospital Corp | Transgenic animals and cell lines for screening drugs effective for the treatment or prevention of alzheimer's disease |
| US6251666B1 (en) | 1997-03-31 | 2001-06-26 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Nucleic acid catalysts comprising L-nucleotide analogs |
| US6280936B1 (en) | 1997-06-09 | 2001-08-28 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Method for screening nucleic acid catalysts |
| US6548657B1 (en) | 1997-06-09 | 2003-04-15 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Method for screening nucleic acid catalysts |
| US6183959B1 (en) | 1997-07-03 | 2001-02-06 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Method for target site selection and discovery |
| US6316612B1 (en) | 1997-08-22 | 2001-11-13 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Xylofuranosly-containing nucleoside phosphoramidites and polynucleotides |
| US6656731B1 (en) | 1997-09-22 | 2003-12-02 | Max Planck Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. | Nucleic acid catalysts with endonuclease activity |
| US6127173A (en) * | 1997-09-22 | 2000-10-03 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Nucleic acid catalysts with endonuclease activity |
| US6054576A (en) * | 1997-10-02 | 2000-04-25 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Deprotection of RNA |
| US6617438B1 (en) | 1997-11-05 | 2003-09-09 | Sirna Therapeutics, Inc. | Oligoribonucleotides with enzymatic activity |
| US6482932B1 (en) * | 1997-11-05 | 2002-11-19 | Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated | Nucleoside triphosphates and their incorporation into oligonucleotides |
| US6127535A (en) | 1997-11-05 | 2000-10-03 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Nucleoside triphosphates and their incorporation into oligonucleotides |
| US20020147143A1 (en) | 1998-03-18 | 2002-10-10 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer |
| JP2003525017A (ja) | 1998-04-20 | 2003-08-26 | リボザイム・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド | 遺伝子発現を調節しうる新規な化学組成を有する核酸分子 |
| CA2230203A1 (en) | 1998-04-29 | 1999-10-29 | Universite De Sherbrooke | Delta ribozyme for rna cleavage |
| WO2000015845A1 (en) * | 1998-08-26 | 2000-03-23 | South Alabama Medical Science Foundation | T-type calcium channel |
| US20030125269A1 (en) * | 1998-08-26 | 2003-07-03 | Ming Li | T-type calcium channel |
| US6175004B1 (en) * | 1998-09-01 | 2001-01-16 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Process for the synthesis of oligonucleotides incorporating 2-aminoadenosine |
| US6995259B1 (en) | 1998-10-23 | 2006-02-07 | Sirna Therapeutics, Inc. | Method for the chemical synthesis of oligonucleotides |
| IL126732A0 (en) * | 1998-10-23 | 1999-08-17 | Intelligene Ltd | Pro drug |
| AU4803800A (en) | 1999-04-27 | 2000-11-10 | Trustees Of The University Of Pennsylvania, The | Compositions, methods, and kits relating to LTiGTresistinLT/iGT |
| JP2002542805A (ja) | 1999-04-30 | 2002-12-17 | ユニバーシティ オブ フロリダ | アデノ随伴ウイルス送達リボザイム組成物および使用方法 |
| US6617442B1 (en) * | 1999-09-30 | 2003-09-09 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Human Rnase H1 and oligonucleotide compositions thereof |
| US6831171B2 (en) | 2000-02-08 | 2004-12-14 | Yale University | Nucleic acid catalysts with endonuclease activity |
| WO2002094185A2 (en) | 2001-05-18 | 2002-11-28 | Sirna Therapeutics, Inc. | Conjugates and compositions for cellular delivery |
| WO2002081628A2 (en) * | 2001-04-05 | 2002-10-17 | Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated | Modulation of gene expression associated with inflammation proliferation and neurite outgrowth, using nucleic acid based technologies |
| WO2003070918A2 (en) | 2002-02-20 | 2003-08-28 | Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated | Rna interference by modified short interfering nucleic acid |
| US20050032733A1 (en) * | 2001-05-18 | 2005-02-10 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (SiNA) |
| US20080039414A1 (en) * | 2002-02-20 | 2008-02-14 | Sima Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20050233329A1 (en) * | 2002-02-20 | 2005-10-20 | Sirna Therapeutics, Inc. | Inhibition of gene expression using duplex forming oligonucleotides |
| US7833992B2 (en) | 2001-05-18 | 2010-11-16 | Merck Sharpe & Dohme | Conjugates and compositions for cellular delivery |
| CA2398282A1 (en) * | 2000-02-11 | 2001-08-16 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Method and reagent for the modulation and diagnosis of cd20 and nogo gene expression |
| US7491805B2 (en) * | 2001-05-18 | 2009-02-17 | Sirna Therapeutics, Inc. | Conjugates and compositions for cellular delivery |
| US8273866B2 (en) | 2002-02-20 | 2012-09-25 | Merck Sharp & Dohme Corp. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (SINA) |
| US8202979B2 (en) * | 2002-02-20 | 2012-06-19 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid |
| US6846486B1 (en) | 2000-02-24 | 2005-01-25 | Advanced Biotherapy Concepts, Inc. | Method of treating allergy by administering an anti-histamine antibody |
| US20040002068A1 (en) | 2000-03-01 | 2004-01-01 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies |
| US20040023292A1 (en) * | 2001-10-19 | 2004-02-05 | Mcswiggen James | Method and reagent for the detection of proteins and peptides |
| US20040009510A1 (en) * | 2000-03-06 | 2004-01-15 | Scott Seiwert | Allosteric nucleic acid sensor molecules |
| US20030065155A1 (en) * | 2000-03-06 | 2003-04-03 | Nassim Usman | Nucleic acid sensor molecules |
| NZ553687A (en) | 2000-03-30 | 2010-03-26 | Whitehead Biomedical Inst | RNA sequence-specific mediators of RNA interference |
| AU2001273149A1 (en) | 2000-06-28 | 2002-01-08 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer |
| US20080032942A1 (en) * | 2000-08-30 | 2008-02-07 | Mcswiggen James | RNA interference mediated treatment of Alzheimer's disease using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20030190635A1 (en) * | 2002-02-20 | 2003-10-09 | Mcswiggen James A. | RNA interference mediated treatment of Alzheimer's disease using short interfering RNA |
| US20050209179A1 (en) * | 2000-08-30 | 2005-09-22 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated treatment of Alzheimer's disease using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US7049059B2 (en) * | 2000-12-01 | 2006-05-23 | Response Genetics, Inc. | Method of determining a chemotherapeutic regimen based on ERCC1 and TS expression |
| DE60130583T3 (de) * | 2000-12-01 | 2018-03-22 | Europäisches Laboratorium für Molekularbiologie | Kleine rns moleküle, die rns-interferenz vermitteln |
| CA2441071C (en) | 2001-03-14 | 2010-06-22 | Myriad Genetics, Inc. | Tsg101-gag interaction and use thereof |
| AU2002305123B2 (en) | 2001-03-30 | 2006-10-05 | Philadelphia Health And Education Corporation | Immunomodulation and effect on cell processes relating to serotonin family receptors |
| CA2446788A1 (en) | 2001-05-09 | 2002-11-14 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of prostate cancer |
| US20050256068A1 (en) * | 2001-05-18 | 2005-11-17 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of stearoyl-CoA desaturase (SCD) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20040209831A1 (en) * | 2002-02-20 | 2004-10-21 | Mcswiggen James | RNA interference mediated inhibition of hepatitis C virus (HCV) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US7109165B2 (en) * | 2001-05-18 | 2006-09-19 | Sirna Therapeutics, Inc. | Conjugates and compositions for cellular delivery |
| US20050164968A1 (en) * | 2001-05-18 | 2005-07-28 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of ADAM33 gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20050176666A1 (en) * | 2001-05-18 | 2005-08-11 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of GPRA and AAA1 gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20050287128A1 (en) * | 2001-05-18 | 2005-12-29 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of TGF-beta and TGF-beta receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20050196767A1 (en) * | 2001-05-18 | 2005-09-08 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of GRB2 associated binding protein (GAB2) gene expression using short interfering nucleic acis (siNA) |
| US20060241075A1 (en) * | 2001-05-18 | 2006-10-26 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of desmoglein gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20050222066A1 (en) * | 2001-05-18 | 2005-10-06 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of vascular endothelial growth factor and vascular endothelial growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20050282188A1 (en) * | 2001-05-18 | 2005-12-22 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20060211642A1 (en) * | 2001-05-18 | 2006-09-21 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA inteference mediated inhibition of hepatitis C virus (HVC) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20050182006A1 (en) * | 2001-05-18 | 2005-08-18 | Sirna Therapeutics, Inc | RNA interference mediated inhibition of protein kinase C alpha (PKC-alpha) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20050233344A1 (en) * | 2001-05-18 | 2005-10-20 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of platelet derived growth factor (PDGF) and platelet derived growth factor receptor (PDGFR) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20050054598A1 (en) * | 2002-02-20 | 2005-03-10 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition hairless (HR) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20050136436A1 (en) * | 2001-05-18 | 2005-06-23 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of G72 and D-amino acid oxidase (DAAO) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20050014172A1 (en) * | 2002-02-20 | 2005-01-20 | Ivan Richards | RNA interference mediated inhibition of muscarinic cholinergic receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20050080031A1 (en) * | 2001-05-18 | 2005-04-14 | Sirna Therapeutics, Inc. | Nucleic acid treatment of diseases or conditions related to levels of Ras, HER2 and HIV |
| US20050182009A1 (en) * | 2001-05-18 | 2005-08-18 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of NF-Kappa B / REL-A gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20050130181A1 (en) * | 2001-05-18 | 2005-06-16 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of wingless gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20050288242A1 (en) * | 2001-05-18 | 2005-12-29 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of RAS gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20050182007A1 (en) * | 2001-05-18 | 2005-08-18 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of interleukin and interleukin receptor gene expression using short interfering nucleic acid (SINA) |
| US20050148530A1 (en) * | 2002-02-20 | 2005-07-07 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of vascular endothelial growth factor and vascular endothelial growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20040019001A1 (en) * | 2002-02-20 | 2004-01-29 | Mcswiggen James A. | RNA interference mediated inhibition of protein typrosine phosphatase-1B (PTP-1B) gene expression using short interfering RNA |
| US20050119212A1 (en) * | 2001-05-18 | 2005-06-02 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of FAS and FASL gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20070270579A1 (en) * | 2001-05-18 | 2007-11-22 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20050124567A1 (en) * | 2001-05-18 | 2005-06-09 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of TRPM7 gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20050176664A1 (en) * | 2001-05-18 | 2005-08-11 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of cholinergic muscarinic receptor (CHRM3) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20050233996A1 (en) * | 2002-02-20 | 2005-10-20 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of hairless (HR) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20050203040A1 (en) * | 2001-05-18 | 2005-09-15 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of vascular cell adhesion molecule (VCAM) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20030170891A1 (en) * | 2001-06-06 | 2003-09-11 | Mcswiggen James A. | RNA interference mediated inhibition of epidermal growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20070042983A1 (en) * | 2001-05-18 | 2007-02-22 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20050124566A1 (en) * | 2001-05-18 | 2005-06-09 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of myostatin gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20050209180A1 (en) * | 2001-05-18 | 2005-09-22 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of hepatitis C virus (HCV) expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20050159376A1 (en) * | 2002-02-20 | 2005-07-21 | Slrna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition 5-alpha reductase and androgen receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US7517864B2 (en) * | 2001-05-18 | 2009-04-14 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of vascular endothelial growth factor and vascular endothelial growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20050124568A1 (en) * | 2001-05-18 | 2005-06-09 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of acetyl-CoA-carboxylase gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20050119211A1 (en) * | 2001-05-18 | 2005-06-02 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA mediated inhibition connexin gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20050233997A1 (en) * | 2001-05-18 | 2005-10-20 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of matrix metalloproteinase 13 (MMP13) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20050227935A1 (en) * | 2001-05-18 | 2005-10-13 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of TNF and TNF receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20030175950A1 (en) * | 2001-05-29 | 2003-09-18 | Mcswiggen James A. | RNA interference mediated inhibition of HIV gene expression using short interfering RNA |
| US20040198682A1 (en) * | 2001-11-30 | 2004-10-07 | Mcswiggen James | RNA interference mediated inhibition of placental growth factor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20060142226A1 (en) * | 2001-05-18 | 2006-06-29 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of cholesteryl ester transfer protein (CETP) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20050137155A1 (en) * | 2001-05-18 | 2005-06-23 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated treatment of Parkinson disease using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20050187174A1 (en) * | 2001-05-18 | 2005-08-25 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of intercellular adhesion molecule (ICAM) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20050164224A1 (en) * | 2001-05-18 | 2005-07-28 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of cyclin D1 gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20080188430A1 (en) * | 2001-05-18 | 2008-08-07 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of hypoxia inducible factor 1 (HIF1) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20050159379A1 (en) * | 2001-05-18 | 2005-07-21 | Sirna Therapeutics, Inc | RNA interference mediated inhibition of gastric inhibitory polypeptide (GIP) and gastric inhibitory polypeptide receptor (GIPR) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20050159382A1 (en) * | 2001-05-18 | 2005-07-21 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of polycomb group protein EZH2 gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20050143333A1 (en) * | 2001-05-18 | 2005-06-30 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of interleukin and interleukin receptor gene expression using short interfering nucleic acid (SINA) |
| US20050267058A1 (en) * | 2001-05-18 | 2005-12-01 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of placental growth factor gene expression using short interfering nucleic acid (sINA) |
| US20050153915A1 (en) * | 2001-05-18 | 2005-07-14 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of early growth response gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20050164966A1 (en) * | 2001-05-18 | 2005-07-28 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of type 1 insulin-like growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20050196765A1 (en) * | 2001-05-18 | 2005-09-08 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of checkpoint Kinase-1 (CHK-1) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20040006035A1 (en) * | 2001-05-29 | 2004-01-08 | Dennis Macejak | Nucleic acid mediated disruption of HIV fusogenic peptide interactions |
| US20050153914A1 (en) * | 2001-05-18 | 2005-07-14 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of MDR P-glycoprotein gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20080161256A1 (en) * | 2001-05-18 | 2008-07-03 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20060142225A1 (en) * | 2001-05-18 | 2006-06-29 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of cyclin dependent kinase-2 (CDK2) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20060019913A1 (en) * | 2001-05-18 | 2006-01-26 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibtion of protein tyrosine phosphatase-1B (PTP-1B) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20050079610A1 (en) * | 2001-05-18 | 2005-04-14 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of Fos gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20050191638A1 (en) * | 2002-02-20 | 2005-09-01 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated treatment of polyglutamine (polyQ) repeat expansion diseases using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US9994853B2 (en) | 2001-05-18 | 2018-06-12 | Sirna Therapeutics, Inc. | Chemically modified multifunctional short interfering nucleic acid molecules that mediate RNA interference |
| US20050164967A1 (en) * | 2001-05-18 | 2005-07-28 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of platelet-derived endothelial cell growth factor (ECGF1) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20050054596A1 (en) * | 2001-11-30 | 2005-03-10 | Mcswiggen James | RNA interference mediated inhibition of vascular endothelial growth factor and vascular endothelial growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| EP1390472A4 (en) * | 2001-05-29 | 2004-11-17 | Sirna Therapeutics Inc | NUCLEIC ACID TREATMENT OF DISEASES OR SIDES RELATED TO RAS, HER2 AND HIV LEVELS |
| US20030140362A1 (en) * | 2001-06-08 | 2003-07-24 | Dennis Macejak | In vivo models for screening inhibitors of hepatitis B virus |
| US7205399B1 (en) | 2001-07-06 | 2007-04-17 | Sirna Therapeutics, Inc. | Methods and reagents for oligonucleotide synthesis |
| AU2002313699A1 (en) * | 2001-07-20 | 2003-03-03 | Ribozyme Pharmacuticals, Inc. | Enzymatic nucleic acid peptide conjugates |
| US20040138163A1 (en) * | 2002-05-29 | 2004-07-15 | Mcswiggen James | RNA interference mediated inhibition of vascular edothelial growth factor and vascular edothelial growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20050075304A1 (en) * | 2001-11-30 | 2005-04-07 | Mcswiggen James | RNA interference mediated inhibition of vascular endothelial growth factor and vascular endothelial growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20070203333A1 (en) * | 2001-11-30 | 2007-08-30 | Mcswiggen James | RNA interference mediated inhibition of vascular endothelial growth factor and vascular endothelial growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| WO2003052074A2 (en) * | 2001-12-14 | 2003-06-26 | Yale University | Nucleic acid diagnostic reagents and methods for detecting nucleic acids, polynucleotides and oligonucleotides |
| DK1581119T3 (da) | 2001-12-17 | 2013-05-13 | Corixa Corp | Sammensætninger og fremgangsmåder til terapi og diagnose af inflammatoriske tarmsygdomme |
| US7071311B2 (en) * | 2002-02-13 | 2006-07-04 | Sirna Therapeutics, Inc. | Antibodies having specificity for 2′-C-allyl nucleic acids |
| US20050042632A1 (en) * | 2002-02-13 | 2005-02-24 | Sirna Therapeutics, Inc. | Antibodies having specificity for nucleic acids |
| WO2003106476A1 (en) * | 2002-02-20 | 2003-12-24 | Sirna Therapeutics, Inc | Nucleic acid mediated inhibition of enterococcus infection and cytolysin toxin activity |
| US20050137153A1 (en) * | 2002-02-20 | 2005-06-23 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of alpha-1 antitrypsin (AAT) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20050096284A1 (en) * | 2002-02-20 | 2005-05-05 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated treatment of polyglutamine (polyQ) repeat expansion diseases using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US9181551B2 (en) | 2002-02-20 | 2015-11-10 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA) |
| EP1432724A4 (en) | 2002-02-20 | 2006-02-01 | Sirna Therapeutics Inc | INTERFERENCE MEDIATION INHIBITION OF GENE RNA FROM MAP KINASE |
| US9657294B2 (en) | 2002-02-20 | 2017-05-23 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20050222064A1 (en) * | 2002-02-20 | 2005-10-06 | Sirna Therapeutics, Inc. | Polycationic compositions for cellular delivery of polynucleotides |
| US20030195164A1 (en) * | 2002-04-16 | 2003-10-16 | Veli-Matti Kahari | Novel ribozyme and its use |
| US20040018520A1 (en) * | 2002-04-22 | 2004-01-29 | James Thompson | Trans-splicing enzymatic nucleic acid mediated biopharmaceutical and protein |
| US20030224435A1 (en) * | 2002-05-16 | 2003-12-04 | Scott Seiwert | Detection of abused substances and their metabolites using nucleic acid sensor molecules |
| US7767803B2 (en) | 2002-06-18 | 2010-08-03 | Archemix Corp. | Stabilized aptamers to PSMA and their use as prostate cancer therapeutics |
| US6989442B2 (en) | 2002-07-12 | 2006-01-24 | Sirna Therapeutics, Inc. | Deprotection and purification of oligonucleotides and their derivatives |
| US7655790B2 (en) | 2002-07-12 | 2010-02-02 | Sirna Therapeutics, Inc. | Deprotection and purification of oligonucleotides and their derivatives |
| US20040110235A1 (en) * | 2002-07-25 | 2004-06-10 | David Epstein | Regulated aptamer therapeutics |
| MXPA05001355A (es) | 2002-08-05 | 2005-09-30 | Atugen Ag | Formas nuevas adicionales de moleculas de arn de interferencia. |
| US7956176B2 (en) | 2002-09-05 | 2011-06-07 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20080260744A1 (en) | 2002-09-09 | 2008-10-23 | Omeros Corporation | G protein coupled receptors and uses thereof |
| US9303262B2 (en) | 2002-09-17 | 2016-04-05 | Archemix Llc | Methods for identifying aptamer regulators |
| WO2004027030A2 (en) * | 2002-09-18 | 2004-04-01 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Efficient reduction of target rna’s by single- and double-stranded oligomeric compounds |
| ATE513843T1 (de) | 2002-09-25 | 2011-07-15 | Univ Massachusetts | Abstellen von genen in vivo durch chemischmodifizierte und stabile sirna |
| AU2003291755A1 (en) | 2002-11-05 | 2004-06-07 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligomers comprising modified bases for binding cytosine and uracil or thymine and their use |
| US8039443B2 (en) * | 2002-11-21 | 2011-10-18 | Archemix Corporation | Stabilized aptamers to platelet derived growth factor and their use as oncology therapeutics |
| US20050124565A1 (en) * | 2002-11-21 | 2005-06-09 | Diener John L. | Stabilized aptamers to platelet derived growth factor and their use as oncology therapeutics |
| US8853376B2 (en) | 2002-11-21 | 2014-10-07 | Archemix Llc | Stabilized aptamers to platelet derived growth factor and their use as oncology therapeutics |
| US10100316B2 (en) * | 2002-11-21 | 2018-10-16 | Archemix Llc | Aptamers comprising CPG motifs |
| CA2504633A1 (en) * | 2002-11-21 | 2004-06-10 | Archemix Corporation | Multivalent aptamer therapeutics with improved pharmacodynamic properties and methods of making and using the same |
| WO2004050899A2 (en) * | 2002-12-03 | 2004-06-17 | Archemix Corporation | Method for in vitro selection of 2’-substituted nucleic acids |
| US20050037394A1 (en) * | 2002-12-03 | 2005-02-17 | Keefe Anthony D. | Method for in vitro selection of 2'-substituted nucleic acids |
| US20040209353A1 (en) * | 2002-12-12 | 2004-10-21 | Chiron Corporation | Biological sample storage device and method for biological sample contamination testing |
| US20040231231A1 (en) * | 2002-12-20 | 2004-11-25 | Cataldo Dominic A. | Use of colloidal clays for sustained release of active ingredients |
| US20030232400A1 (en) * | 2002-12-20 | 2003-12-18 | Susan Radka | Methods of screening subjects for expression of soluble receptors of vascular endothelial growth factor (VEGF) for use in managing treatment and determining prognostic outcome |
| US20050085435A1 (en) * | 2003-01-02 | 2005-04-21 | Niles Edward G. | Novel inhibitors of poxvirus replication |
| ES2537514T3 (es) | 2003-04-04 | 2015-06-09 | Incyte Corporation | Composiciones, métodos y kits relacionados con la escisión de HER-2 |
| CA2522184A1 (en) * | 2003-04-17 | 2004-11-04 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Desmoglein 4 is a novel gene involved in hair growth |
| WO2004094614A2 (en) | 2003-04-21 | 2004-11-04 | Archemix Corp. | Stabilized aptamers to platelet derived growth factor and their use as oncology therapeutics |
| US20050250106A1 (en) * | 2003-04-24 | 2005-11-10 | David Epstein | Gene knock-down by intracellular expression of aptamers |
| EP3222294A1 (en) | 2003-04-30 | 2017-09-27 | Sirna Therapeutics, Inc. | Conjugates and compositions for cellular delivery |
| WO2005078848A2 (en) * | 2004-02-11 | 2005-08-25 | University Of Tennessee Research Foundation | Inhibition of tumor growth and invasion by anti-matrix metalloproteinase dnazymes |
| TR201808488T4 (tr) | 2004-02-12 | 2018-07-23 | Archemix Llc | Komplemana bağlı bozuklukların tedavisinde yararlı aptamer terapötikleri. |
| US7803931B2 (en) | 2004-02-12 | 2010-09-28 | Archemix Corp. | Aptamer therapeutics useful in the treatment of complement-related disorders |
| BRPI0508363A (pt) * | 2004-03-05 | 2007-07-24 | Archemix Corp | aptámeros para a famìlia de citocinas de il-12 humana e seus usos como terapia de doença auto-imune |
| US20060193821A1 (en) * | 2004-03-05 | 2006-08-31 | Diener John L | Aptamers to the human IL-12 cytokine family and their use as autoimmune disease therapeutics |
| US8569474B2 (en) | 2004-03-09 | 2013-10-29 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Double stranded constructs comprising one or more short strands hybridized to a longer strand |
| EP2899278A1 (en) | 2004-03-12 | 2015-07-29 | Alnylam Pharmaceuticals Inc. | iRNA agents targeting VEGF |
| US20080214489A1 (en) * | 2004-04-19 | 2008-09-04 | Anthony Dominic Keefe | Aptamer-mediated intracellular delivery of oligonucleotides |
| EP1747022A4 (en) | 2004-04-23 | 2010-03-31 | Univ Columbia | INHIBITION OF HAIRLESS PROTEIN MRNA |
| US7579450B2 (en) * | 2004-04-26 | 2009-08-25 | Archemix Corp. | Nucleic acid ligands specific to immunoglobulin E and their use as atopic disease therapeutics |
| US20060040882A1 (en) | 2004-05-04 | 2006-02-23 | Lishan Chen | Compostions and methods for enhancing delivery of nucleic acids into cells and for modifying expression of target genes in cells |
| US10508277B2 (en) | 2004-05-24 | 2019-12-17 | Sirna Therapeutics, Inc. | Chemically modified multifunctional short interfering nucleic acid molecules that mediate RNA interference |
| US8394947B2 (en) | 2004-06-03 | 2013-03-12 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Positionally modified siRNA constructs |
| WO2006112869A2 (en) | 2004-07-19 | 2006-10-26 | Baylor College Of Medicine | Modulation of cytokine signaling regulators and applications for immunotherapy |
| EP1789552A2 (en) | 2004-08-10 | 2007-05-30 | Institute for Multiple Myeloma and Bone Cancer Research | Methods of regulating differentiation and treating of multiple myeloma |
| JP2008512097A (ja) | 2004-09-07 | 2008-04-24 | アーケミックス コーポレイション | アプタマー医薬品化学 |
| US7566701B2 (en) | 2004-09-07 | 2009-07-28 | Archemix Corp. | Aptamers to von Willebrand Factor and their use as thrombotic disease therapeutics |
| KR20070101227A (ko) | 2004-09-07 | 2007-10-16 | 아케믹스 코포레이션 | 폰 빌레브란트 인자에 대한 앱타머 및 이의 혈전증치료제로서의 용도 |
| US7884086B2 (en) | 2004-09-08 | 2011-02-08 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Conjugates for use in hepatocyte free uptake assays |
| EP1807107B1 (en) | 2004-11-02 | 2011-09-07 | Archemix Corp. | Stabilized aptamers to platelet derived growth factor and their use as oncology therapeutics |
| EP1831235B1 (en) | 2004-12-16 | 2013-02-20 | The Regents of The University of California | Lung-targeted drugs |
| WO2006096754A2 (en) * | 2005-03-07 | 2006-09-14 | Archemix Corp. | Stabilized aptamers to psma and their use as prostate cancer therapeutics |
| WO2006105361A2 (en) | 2005-03-31 | 2006-10-05 | Calando Pharmaceuticals, Inc. | Inhibitors of ribonucleotide reductase subunit 2 and uses thereof |
| US20090075342A1 (en) * | 2005-04-26 | 2009-03-19 | Sharon Cload | Metabolic profile directed aptamer medicinal chemistry |
| US7868159B2 (en) | 2005-06-23 | 2011-01-11 | Baylor College Of Medicine | Modulation of negative immune regulators and applications for immunotherapy |
| WO2007002904A2 (en) | 2005-06-28 | 2007-01-04 | Medtronic, Inc. | Methods and sequences to preferentially suppress expression of mutated huntingtin |
| JP5015923B2 (ja) | 2005-06-30 | 2012-09-05 | アーケミックス コーポレイション | 完全な２’改変核酸転写物を生成するための材料および方法 |
| US8101385B2 (en) | 2005-06-30 | 2012-01-24 | Archemix Corp. | Materials and methods for the generation of transcripts comprising modified nucleotides |
| US20090176725A1 (en) * | 2005-08-17 | 2009-07-09 | Sirna Therapeutics Inc. | Chemically modified short interfering nucleic acid molecules that mediate rna interference |
| FI20055712A0 (fi) * | 2005-12-29 | 2005-12-29 | Wallac Oy | Makrosykliset oligonukleotiidien leimausreagenssit ja niistä johdetut konjugaatit |
| EP2526968A3 (en) | 2006-01-27 | 2013-05-22 | Biogen Idec MA Inc. | Nogo receptor antagonists |
| US7922000B2 (en) * | 2006-02-15 | 2011-04-12 | Miraial Co., Ltd. | Thin plate container with a stack of removable loading trays |
| RU2477137C2 (ru) | 2006-03-08 | 2013-03-10 | АРКЕМИКС Эл Эл Си | Связывающие комплемент аптамеры и средства против с5, пригодные для лечения глазных нарушений |
| WO2007115168A2 (en) | 2006-03-31 | 2007-10-11 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of eg5 gene |
| EP2010226B1 (en) | 2006-04-07 | 2014-01-15 | The Research Foundation of State University of New York | Transcobalamin receptor polypeptides, nucleic acids, and modulators thereof, and related methods of use in modulating cell growth and treating cancer and cobalamin deficiency |
| US8158782B2 (en) | 2006-05-05 | 2012-04-17 | Wallac Oy | Biomolecule labeling reactants based on azacycloalkanes and conjugates derived thereof |
| US20070275923A1 (en) * | 2006-05-25 | 2007-11-29 | Nastech Pharmaceutical Company Inc. | CATIONIC PEPTIDES FOR siRNA INTRACELLULAR DELIVERY |
| US8598333B2 (en) | 2006-05-26 | 2013-12-03 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | SiRNA silencing of genes expressed in cancer |
| JP5248494B2 (ja) | 2006-07-11 | 2013-07-31 | ユニバーシティ・オブ・メディシン・アンド・デンティストリー・オブ・ニュージャージー | タンパク質、それをコードする核酸および関連する使用方法 |
| CN101557818A (zh) | 2006-10-03 | 2009-10-14 | 新泽西医科和牙科大学 | Atap肽、编码atap肽的核酸以及相关的应用方法 |
| EP2081596A4 (en) | 2006-10-06 | 2010-07-21 | Univ Utah Res Found | METHOD FOR THE DETECTION OF EYE DISEASES AND PATHOLOGICAL CONDITIONS AND TREATMENT THEREFOR |
| WO2008052774A2 (en) | 2006-10-31 | 2008-05-08 | Noxxon Pharma Ag | Methods for detection of a single- or double-stranded nucleic acid molecule |
| US20100129358A1 (en) | 2006-12-22 | 2010-05-27 | University Of Utah Research Foundation | Method of detecting ocular diseases and pathologic conditions and treatment of same |
| EP2146691A2 (en) * | 2007-04-17 | 2010-01-27 | Baxter International Inc. | Nucleic acid microparticles for pulmonary delivery |
| EP2157982B1 (en) | 2007-05-04 | 2014-12-17 | Marina Biotech, Inc. | Amino acid lipids and uses thereof |
| AU2008257419B2 (en) | 2007-05-23 | 2013-10-24 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Targeted carriers for intracellular drug delivery |
| WO2009033027A2 (en) | 2007-09-05 | 2009-03-12 | Medtronic, Inc. | Suppression of scn9a gene expression and/or function for the treatment of pain |
| AR068542A1 (es) | 2007-09-24 | 2009-11-18 | Performance Plants Inc | Plantas que tienen biomasa aumentada |
| JP2011505144A (ja) | 2007-11-30 | 2011-02-24 | ベイラー カレッジ オブ メディシン | 樹状細胞ワクチン組成物およびその使用 |
| CA2910760C (en) | 2007-12-04 | 2019-07-09 | Muthiah Manoharan | Targeting lipids |
| EP2224912B1 (en) | 2008-01-02 | 2016-05-11 | TEKMIRA Pharmaceuticals Corporation | Improved compositions and methods for the delivery of nucleic acids |
| AU2009232355A1 (en) | 2008-04-04 | 2009-10-08 | Calando Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and use of EPAS1 inhibitors |
| PL2279254T3 (pl) | 2008-04-15 | 2017-11-30 | Protiva Biotherapeutics Inc. | Nowe preparaty lipidowe do dostarczania kwasów nukleinowych |
| WO2009137095A2 (en) | 2008-05-08 | 2009-11-12 | The Johns Hopkins University | Compositions and methods for modulating an immune response |
| CA2726187A1 (en) | 2008-05-30 | 2009-12-23 | Yale University | Targeted oligonucleotide compositions for modifying gene expression |
| EP2323679A4 (en) | 2008-07-25 | 2012-08-22 | Univ Colorado | CLIP INHIBITORS AND METHODS FOR MODULATING IMMUNE FUNCTION |
| US9249175B2 (en) * | 2008-09-05 | 2016-02-02 | The Royal Institute For The Advancement Of Learning/Mcgill University | RNA monomers containing O-acetal levulinyl ester groups and their use in RNA microarrays |
| EP2341924A4 (en) | 2008-10-02 | 2013-01-23 | David Gladstone Inst | METHOD FOR THE TREATMENT OF HEPATITIS C VIRUS INFECTIONS |
| EP2743265B1 (en) | 2008-10-09 | 2017-03-15 | Arbutus Biopharma Corporation | Improved amino lipids and methods for the delivery of nucleic acids |
| EP2349210B1 (en) | 2008-10-16 | 2015-03-18 | Marina Biotech, Inc. | Processes and compositions for liposomal and efficient delivery of gene silencing therapeutics |
| DK3199553T3 (da) | 2008-10-29 | 2019-07-22 | Circular Commitment Company | Fremgangsmåder og midler til diagnosticering og behandling af hepatocellulært carcinom |
| CA3029724A1 (en) | 2008-11-10 | 2010-05-14 | Muthiah Manoharan | Lipids and compositions for the delivery of therapeutics |
| EP2391343B1 (en) | 2009-01-29 | 2017-03-01 | Arbutus Biopharma Corporation | Improved lipid formulation for the delivery of nucleic acids |
| WO2010096813A1 (en) | 2009-02-23 | 2010-08-26 | New York Blood Center | Krüppel-like factors and fat regulation |
| EP2756845B1 (en) | 2009-04-03 | 2017-03-15 | Dicerna Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for the specific inhibition of KRAS by asymmetric double-stranded RNA |
| EP3199165B1 (en) | 2009-04-03 | 2022-06-08 | Dicerna Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for the specific inhibition of kras by asymmetric double-stranded rna |
| WO2010115993A1 (en) | 2009-04-10 | 2010-10-14 | Association Institut De Myologie | Tricyclo-dna antisense oligonucleotides, compositions, and methods for the treatment of disease |
| ES2845212T3 (es) | 2009-04-13 | 2021-07-26 | Inst Nat Sante Rech Med | Partículas de HPV y usos de las mismas |
| EP3504967A1 (en) | 2009-05-05 | 2019-07-03 | Arbutus Biopharma Corporation | Methods of delivering oligonucleotides to immune cells |
| CA3151387A1 (en) | 2009-05-05 | 2010-11-11 | Arbutus Biopharma Corporation | Lipid compositions for the delivery of therapeutic agents |
| AU2010249881B2 (en) | 2009-05-16 | 2015-01-22 | Agave Pharma, Incorporated | Compositions comprising cationic amphiphiles and colipids for delivering therapeutics molecules |
| NZ712719A (en) | 2009-06-10 | 2017-03-31 | Arbutus Biopharma Corp | Improved lipid formulation |
| WO2011000107A1 (en) | 2009-07-01 | 2011-01-06 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Novel lipid formulations for delivery of therapeutic agents to solid tumors |
| WO2011039646A2 (en) | 2009-09-30 | 2011-04-07 | Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) | Papilloma virus -like particles for targeted gene delivery |
| US8450090B2 (en) | 2009-10-06 | 2013-05-28 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Compositions and methods for promoting fatty acid production in plants |
| US20120270930A1 (en) | 2009-10-29 | 2012-10-25 | Academisch Ziekenhuis Leiden H.O.D.N. Lumc | Methods and compositions for dysferlin exon-skipping |
| EP2501414B1 (en) | 2009-11-17 | 2018-01-10 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Smndelta7 degron: novel compositions and methods of use |
| AU2010328336B2 (en) | 2009-12-07 | 2017-03-02 | Arbutus Biopharma Corporation | Compositions for nucleic acid delivery |
| EP2512449B1 (en) | 2009-12-18 | 2019-08-07 | The University of British Columbia | Methods and compositions for delivery of nucleic acids |
| AU2011214465A1 (en) | 2010-02-10 | 2012-08-30 | Novartis Ag | Methods and compounds for muscle growth |
| US9714446B2 (en) | 2010-02-11 | 2017-07-25 | Nanostring Technologies, Inc. | Compositions and methods for the detection of small RNAs |
| US9080171B2 (en) | 2010-03-24 | 2015-07-14 | RXi Parmaceuticals Corporation | Reduced size self-delivering RNAi compounds |
| JP2013529181A (ja) | 2010-03-25 | 2013-07-18 | ザ ジェイ． デヴィッド グラッドストーン インスティテューツ | 神経障害を治療するための組成物および方法 |
| WO2011120023A1 (en) | 2010-03-26 | 2011-09-29 | Marina Biotech, Inc. | Nucleic acid compounds for inhibiting survivin gene expression uses thereof |
| WO2011133584A2 (en) | 2010-04-19 | 2011-10-27 | Marina Biotech, Inc. | Nucleic acid compounds for inhibiting hras gene expression and uses thereof |
| ES2711256T3 (es) | 2010-04-23 | 2019-04-30 | Univ Florida | Composiciones de rAAV-guanilato ciclasa y métodos para tratar la amaurosis congénita de Leber 1 (LCA1) |
| WO2011139710A1 (en) | 2010-04-26 | 2011-11-10 | Marina Biotech, Inc. | Nucleic acid compounds with conformationally restricted monomers and uses thereof |
| WO2011139843A2 (en) | 2010-04-28 | 2011-11-10 | Marina Biotech, Inc. | Multi-sirna compositions for reducing gene expression |
| DK2591105T3 (en) | 2010-07-06 | 2017-07-31 | Dicerna Pharmaceuticals Inc | METHODS AND COMPOSITIONS FOR SPECIFIC INHIBITION OF BETA-CATENIN USING DOUBLE-STRENGTH RNA |
| WO2012006506A1 (en) | 2010-07-09 | 2012-01-12 | Massachusetts Institute Of Technology | Metabolic gene, enzyme, and flux targets for cancer therapy |
| WO2012016184A2 (en) | 2010-07-30 | 2012-02-02 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for delivery of active agents |
| US20130202652A1 (en) | 2010-07-30 | 2013-08-08 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for delivery of active agents |
| EP3372684B1 (en) | 2010-08-24 | 2020-10-07 | Sirna Therapeutics, Inc. | Single-stranded rnai agents containing an internal, non-nucleic acid spacer |
| SG188666A1 (en) | 2010-09-30 | 2013-05-31 | Agency Science Tech & Res | Methods and reagents for detection and treatment of esophageal metaplasia |
| WO2012058210A1 (en) | 2010-10-29 | 2012-05-03 | Merck Sharp & Dohme Corp. | RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACIDS (siNA) |
| WO2012068463A2 (en) | 2010-11-18 | 2012-05-24 | Beth Israel Deaconess Medicall Center, Inc. | Methods of treating obesity by inhibiting nicotinamide n-methyl transferase (nnmt) |
| KR20140038358A (ko) | 2011-01-11 | 2014-03-28 | 페이트 세러퓨틱스, 인코포레이티드 | 신규의 Wnt 조성물 및 이러한 조성물의 치료학적 용도 |
| JP5902197B2 (ja) | 2011-01-11 | 2016-04-13 | アルニラム・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド | Ｐｅｇ化脂質および薬剤送達のためのそれらの使用 |
| JP6261500B2 (ja) | 2011-07-22 | 2018-01-17 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | ヌクレアーゼ切断特異性の評価および改善 |
| KR20140067092A (ko) | 2011-09-07 | 2014-06-03 | 마리나 바이오테크, 인크. | 형태적으로 제한된 단량체를 갖는 핵산 화합물의 합성 및 용도 |
| JP6250543B2 (ja) | 2011-09-27 | 2017-12-20 | アルニラム・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド | ジ脂肪族置換ｐｅｇ化脂質 |
| WO2013055789A1 (en) | 2011-10-14 | 2013-04-18 | Accugenomics, Inc. | Nucleic acid amplification and use thereof |
| SI2766393T1 (sl) | 2011-10-14 | 2018-10-30 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Protitelesa Anti-HtrA1 in postopki uporabe |
| WO2013090457A2 (en) | 2011-12-12 | 2013-06-20 | Oncoimmunin Inc. | In vivo delivery of oligonucleotides |
| EP2797948B1 (en) | 2011-12-27 | 2019-02-20 | The J. David Gladstone Institutes | Compositions for use in regulating glucose metabolism |
| US9700639B2 (en) | 2012-02-07 | 2017-07-11 | Aura Biosciences, Inc. | Virion-derived nanospheres for selective delivery of therapeutic and diagnostic agents to cancer cells |
| PT2817287T (pt) | 2012-02-24 | 2018-12-28 | Arbutus Biopharma Corp | Lípidos catiónicos trialquílicos e seus métodos de utilização |
| WO2013177524A1 (en) | 2012-05-25 | 2013-11-28 | Accugenomics, Inc. | Nucleic acid amplification and use thereof |
| WO2014008474A1 (en) | 2012-07-05 | 2014-01-09 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | U1 snrnp regulates gene expression and modulates oncogenicity |
| KR101520383B1 (ko) | 2012-08-02 | 2015-05-15 | 에이비온 주식회사 | Ｈｐｖ 감염과 관련된 암의 치료용 조성물 |
| WO2014039513A2 (en) | 2012-09-04 | 2014-03-13 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Inhibition of diacylglycerol kinase to augment adoptive t cell transfer |
| EP2912182B1 (en) | 2012-10-23 | 2021-12-08 | Caris Science, Inc. | Aptamers and uses thereof |
| US10942184B2 (en) | 2012-10-23 | 2021-03-09 | Caris Science, Inc. | Aptamers and uses thereof |
| EP2935628B1 (en) | 2012-12-19 | 2018-03-21 | Caris Life Sciences Switzerland Holdings GmbH | Compositions and methods for aptamer screening |
| US10596094B2 (en) | 2013-03-08 | 2020-03-24 | Yale University | Compositions and methods for reducing skin pigmentation |
| LT2970346T (lt) | 2013-03-15 | 2018-11-26 | The Regents Of The University Of California | Acikliniai nukleozido fosfonato diesteriai |
| CN105188764B (zh) | 2013-03-21 | 2020-03-20 | 詹尼斯费尔公司 | Dna嵌入剂的细胞递送 |
| DK3444350T3 (da) | 2013-07-03 | 2022-02-07 | Dicerna Pharmaceuticals Inc | Fremgangsmåder og sammensætninger til specifik hæmning af alpha-1 antitrypsin ved dobbeltstrenget rna |
| EP4700124A2 (en) | 2013-07-11 | 2026-02-25 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotide-ligand conjugates and process for their preparation |
| US20150044192A1 (en) | 2013-08-09 | 2015-02-12 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease |
| US20160319361A1 (en) | 2013-08-28 | 2016-11-03 | Caris Life Sciences Switzerland Holdings Gmbh | Oligonucleotide probes and uses thereof |
| US9340799B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-05-17 | President And Fellows Of Harvard College | MRNA-sensing switchable gRNAs |
| US9322037B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-04-26 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof |
| EP4059521A1 (en) | 2013-09-18 | 2022-09-21 | Aura Biosciences, Inc. | Virus-like particle conjugates for diagnosis and treatment of tumors |
| ES2894333T3 (es) | 2013-09-26 | 2022-02-14 | Beth Israel Deaconess Medical Ct Inc | Inhibidores de SGK1 en el tratamiento del síndrome de QT Largo |
| CN105873902B (zh) | 2013-11-18 | 2019-03-08 | 阿克丘勒斯治疗公司 | 用于rna递送的可电离的阳离子脂质 |
| WO2015074010A2 (en) | 2013-11-18 | 2015-05-21 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Compositions and methods for cardiac regeneration |
| US9365610B2 (en) | 2013-11-18 | 2016-06-14 | Arcturus Therapeutics, Inc. | Asymmetric ionizable cationic lipid for RNA delivery |
| AR093574A1 (es) | 2013-11-21 | 2015-06-10 | Consejo Nac De Investig Cientificas Y Tecn (Conicet) | Aptameros contra la proteina basica de mielina como agentes neuroprotectores |
| WO2015084897A2 (en) | 2013-12-02 | 2015-06-11 | Mirimmune, Llc | Immunotherapy of cancer |
| US20150166985A1 (en) | 2013-12-12 | 2015-06-18 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for correcting von willebrand factor point mutations |
| WO2015095632A1 (en) | 2013-12-20 | 2015-06-25 | Acetylon Pharmaceuticals, Inc. | Histone deacetylase 6 (hdac6) biomarkers in multiple myeloma |
| DK3087184T3 (da) | 2013-12-27 | 2019-07-29 | Dicerna Pharmaceuticals Inc | Fremgangsmåder og sammensætninger til specifik inhibering af glycolatoxidase (hao1) med dobbeltstrenget rna |
| US9458464B2 (en) | 2014-06-23 | 2016-10-04 | The Johns Hopkins University | Treatment of neuropathic pain |
| ES2903029T3 (es) | 2014-07-03 | 2022-03-30 | Univ Yale | La inhibición de DICKKOPF2 (DKK2) suprime la formación de tumores |
| CA2956224A1 (en) | 2014-07-30 | 2016-02-11 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9 proteins including ligand-dependent inteins |
| CN106795188B (zh) | 2014-09-15 | 2021-02-09 | 加利福尼亚大学董事会 | 核苷酸类似物 |
| AU2015330670B2 (en) | 2014-10-10 | 2022-01-06 | Novo Nordisk Health Care Ag | Therapeutic inhibition of lactate dehydrogenase and agents therefor |
| EP3206751A4 (en) | 2014-10-14 | 2018-06-13 | The J. David Gladstone Institutes | Compositions and methods for reactivating latent immunodeficiency virus |
| WO2016081029A1 (en) | 2014-11-18 | 2016-05-26 | Arcturus Therapeutics, Inc. | Ionizable cationic lipid for rna delivery |
| WO2016081796A1 (en) | 2014-11-21 | 2016-05-26 | Yale University | Compositions and methods for modulating salm5 and hvem |
| WO2016100401A1 (en) | 2014-12-15 | 2016-06-23 | Dicerna Pharmaceuticals, Inc. | Ligand-modified double-stranded nucleic acids |
| EP3234133B1 (en) | 2014-12-18 | 2020-11-11 | Integrated DNA Technologies, Inc. | Crispr-based compositions and methods of use |
| MA41629A (fr) | 2015-03-04 | 2018-01-09 | Center For Human Reproduction | Compositions et méthodes d'utilisation de l'hormone anti-müllérienne pour le traitement de l'infertilité |
| US20180066262A1 (en) | 2015-03-09 | 2018-03-08 | Caris Science, Inc. | Oligonucleotide probes and uses thereof |
| CA2991045A1 (en) | 2015-06-29 | 2017-01-05 | Caris Science, Inc. | Therapeutic oligonucleotides binding c1q |
| WO2017019918A1 (en) | 2015-07-28 | 2017-02-02 | Caris Science, Inc. | Targeted oligonucleotides |
| EP3331536A4 (en) | 2015-08-03 | 2019-03-27 | The Regents of The University of California | COMPOSITIONS AND METHODS OF MODULATING THE ABHD2 ACTIVITY |
| IL294014B2 (en) | 2015-10-23 | 2024-07-01 | Harvard College | Nucleobase editors and uses thereof |
| KR20180095511A (ko) | 2015-10-30 | 2018-08-27 | 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카, 애즈 리프리젠티드 바이 더 세크러테리, 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비씨즈 | 표적화된 암 요법 |
| PE20181009A1 (es) | 2015-10-30 | 2018-06-26 | Genentech Inc | ANTICUERPOS ANTI-HtrA1 Y METODOS DE USO DE LOS MISMOS |
| WO2017143156A1 (en) | 2016-02-19 | 2017-08-24 | Genisphere Llc | Nucleic acid carriers and therapeutic methods of use |
| CN109715802A (zh) | 2016-03-18 | 2019-05-03 | 卡里斯科学公司 | 寡核苷酸探针及其用途 |
| WO2017173325A1 (en) | 2016-04-01 | 2017-10-05 | Avidity Biosciences Llc | Phosphatidylinositol-3-kinase nucleic acids and uses thereof |
| JP2019513371A (ja) | 2016-04-01 | 2019-05-30 | アビディティー バイオサイエンシーズ エルエルシー | 核酸ポリペプチド組成物とその使用 |
| WO2017173297A1 (en) | 2016-04-01 | 2017-10-05 | Avidity Biosciences Llc | Beta-catenin nucleic acids and uses thereof |
| MA45349A (fr) | 2016-04-01 | 2019-02-06 | Avidity Biosciences Llc | Acides nucléiques egfr et leurs utilisations |
| MA45470A (fr) | 2016-04-01 | 2019-02-06 | Avidity Biosciences Llc | Acides nucléiques kras et leurs utilisations |
| EP3436586B1 (en) | 2016-04-01 | 2021-10-13 | Avidity Biosciences, Inc. | Myc nucleic acids and uses thereof |
| EP3448369B1 (en) | 2016-04-29 | 2025-06-25 | The Regents of The University of Colorado, A Body Corporate | Inhibition or degradation of hdac11 for treating obesity, hyperlipidemia, type ii diabetes, metabolic syndrome or insulin resistance, for promoting weight loss, and/or ameliorating or preventing weight gain |
| CA3025486A1 (en) | 2016-05-25 | 2017-11-30 | Caris Science, Inc. | Oligonucleotide probes and uses thereof |
| SG11201900907YA (en) | 2016-08-03 | 2019-02-27 | Harvard College | Adenosine nucleobase editors and uses thereof |
| US11661590B2 (en) | 2016-08-09 | 2023-05-30 | President And Fellows Of Harvard College | Programmable CAS9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
| CA3034094A1 (en) | 2016-08-16 | 2018-02-22 | Bluebird Bio, Inc. | Il-10 receptor alpha homing endonuclease variants, compositions, and methods of use |
| MA46059A (fr) | 2016-08-23 | 2019-07-03 | Bluebird Bio Inc | Variants de l'endonucléase homing tim3, compositions et procédés d'utilisation |
| WO2018039438A1 (en) | 2016-08-24 | 2018-03-01 | President And Fellows Of Harvard College | Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing |
| WO2018049226A1 (en) | 2016-09-08 | 2018-03-15 | Bluebird Bio, Inc. | Pd-1 homing endonuclease variants, compositions, and methods of use |
| CA3039409A1 (en) | 2016-10-07 | 2018-04-12 | Integrated Dna Technologies, Inc. | S. pyogenes cas9 mutant genes and polypeptides encoded by same |
| US11242542B2 (en) | 2016-10-07 | 2022-02-08 | Integrated Dna Technologies, Inc. | S. pyogenes Cas9 mutant genes and polypeptides encoded by same |
| CA3039812A1 (en) | 2016-10-11 | 2018-04-19 | Bluebird Bio, Inc. | Tcr.alpha. homing endonuclease variants |
| WO2018094244A1 (en) | 2016-11-17 | 2018-05-24 | Bluebird Bio, Inc. | TGFβ SIGNAL CONVERTOR |
| CA3044101A1 (en) | 2016-11-22 | 2018-05-31 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Crispr/cpf1 systems and methods |
| WO2018111947A1 (en) | 2016-12-12 | 2018-06-21 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Genome editing enhancement |
| US10526284B2 (en) | 2016-12-21 | 2020-01-07 | Arcturus Therapeutics, Inc. | Ionizable cationic lipid for RNA delivery |
| US10383952B2 (en) | 2016-12-21 | 2019-08-20 | Arcturus Therapeutics, Inc. | Ionizable cationic lipid for RNA delivery |
| WO2018119163A1 (en) | 2016-12-21 | 2018-06-28 | Payne Joseph E | Ionizable cationic lipid for rna delivery |
| US10745677B2 (en) | 2016-12-23 | 2020-08-18 | President And Fellows Of Harvard College | Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection |
| EP4556489A3 (en) | 2017-01-06 | 2025-08-13 | Avidity Biosciences, Inc. | Nucleic acid-polypeptide compositions and methods of inducing exon skipping |
| DK3583203T5 (da) | 2017-02-15 | 2024-09-02 | 2Seventy Bio Inc | Donorreparationstemplates multiplex-genomeditering |
| CN110662556A (zh) | 2017-03-09 | 2020-01-07 | 哈佛大学的校长及成员们 | 癌症疫苗 |
| US11898179B2 (en) | 2017-03-09 | 2024-02-13 | President And Fellows Of Harvard College | Suppression of pain by gene editing |
| JP2020510439A (ja) | 2017-03-10 | 2020-04-09 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | シトシンからグアニンへの塩基編集因子 |
| WO2018191348A1 (en) | 2017-04-11 | 2018-10-18 | University Of Maryland, Baltimore | Compositions and methods for treating inflammation and cancer |
| GB201711809D0 (en) | 2017-07-21 | 2017-09-06 | Governors Of The Univ Of Alberta | Antisense oligonucleotide |
| CN111801345A (zh) | 2017-07-28 | 2020-10-20 | 哈佛大学的校长及成员们 | 使用噬菌体辅助连续进化(pace)的进化碱基编辑器的方法和组合物 |
| US11319532B2 (en) | 2017-08-30 | 2022-05-03 | President And Fellows Of Harvard College | High efficiency base editors comprising Gam |
| US11306312B2 (en) | 2017-09-01 | 2022-04-19 | Thomas Jefferson University | Compositions and methods for MYC messenger RNA inhibitors |
| CN111655268B (zh) | 2017-10-04 | 2024-03-26 | 艾维迪提生物科学公司 | 核酸-多肽组合物及其用途 |
| AU2018352592C1 (en) | 2017-10-16 | 2025-09-25 | Beam Therapeutics, Inc. | Uses of adenosine base editors |
| KR102527941B1 (ko) | 2017-12-06 | 2023-05-02 | 어비디티 바이오사이언시스 인크. | 근위축증 및 근긴장성 이영양증을 치료하는 조성물 및 방법 |
| EP3724214A4 (en) | 2017-12-15 | 2021-09-01 | The Broad Institute Inc. | SYSTEMS AND PROCEDURES FOR PREDICTING REPAIR RESULTS IN GENE ENGINEERING |
| MA51636A (fr) | 2018-01-08 | 2020-11-18 | Iovance Biotherapeutics Inc | Procédés de génération de produits de til enrichis pour des lymphocytes t spécifiques d'un antigène tumoral |
| US11713446B2 (en) | 2018-01-08 | 2023-08-01 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Processes for generating TIL products enriched for tumor antigen-specific T-cells |
| WO2019136459A1 (en) | 2018-01-08 | 2019-07-11 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Processes for generating til products enriched for tumor antigen-specific t-cells |
| CN112424352A (zh) | 2018-05-11 | 2021-02-26 | 阿尔法阿诺麦里克公司 | 包括7′-5′-α-异头双环糖核苷的寡核苷酸缀合物 |
| EP3797160A1 (en) | 2018-05-23 | 2021-03-31 | The Broad Institute Inc. | Base editors and uses thereof |
| US12522807B2 (en) | 2018-07-09 | 2026-01-13 | The Broad Institute, Inc. | RNA programmable epigenetic RNA modifiers and uses thereof |
| US20220193250A1 (en) | 2018-08-02 | 2022-06-23 | Dyne Therapeutics, Inc. | Muscle targeting complexes and uses thereof for treating facioscapulohumeral muscular dystrophy |
| WO2020092453A1 (en) | 2018-10-29 | 2020-05-07 | The Broad Institute, Inc. | Nucleobase editors comprising geocas9 and uses thereof |
| CA3122080A1 (en) | 2018-12-06 | 2020-06-11 | Arcturus Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for treating ornithine transcarbamylase deficiency |
| EP3895052A4 (en) | 2018-12-14 | 2022-10-26 | 2seventy bio, Inc. | DIMERIZING AGENT REGULATED IMMUNORECEPTOR COMPLEXES |
| WO2020154500A1 (en) | 2019-01-23 | 2020-07-30 | The Broad Institute, Inc. | Supernegatively charged proteins and uses thereof |
| US12472266B2 (en) | 2019-02-21 | 2025-11-18 | Enosi Therapeutics Corporation | Antibodies and enonomers |
| GB2601618B (en) | 2019-03-19 | 2024-11-06 | Broad Inst Inc | Methods and compositions for editing nucleotide sequences |
| US20220204975A1 (en) | 2019-04-12 | 2022-06-30 | President And Fellows Of Harvard College | System for genome editing |
| WO2020214842A1 (en) | 2019-04-17 | 2020-10-22 | The Broad Institute, Inc. | Adenine base editors with reduced off-target effects |
| AU2020263487A1 (en) | 2019-04-25 | 2021-12-16 | Avidity Biosciences, Inc. | Nucleic acid compositions and methods of multi-exon skipping |
| JP7581252B2 (ja) | 2019-06-06 | 2024-11-12 | アビディティー バイオサイエンシーズ，インク． | Ｕｎａアミダイトおよびその使用 |
| EP3980436A4 (en) | 2019-06-06 | 2023-12-20 | Avidity Biosciences, Inc. | NUCLEIC ACID POLYPEPTIDE COMPOSITIONS AND USES THEREOF |
| UA129330C2 (uk) | 2019-08-14 | 2025-03-19 | Акітас Терап'Ютікс, Інк. | Поліпшені ліпідні наночастинки для доставляння нуклеїнових кислот |
| WO2021072328A1 (en) | 2019-10-10 | 2021-04-15 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for prime editing rna |
| WO2021127650A1 (en) | 2019-12-19 | 2021-06-24 | Entrada Therapeutics, Inc. | Compositions for delivery of antisense compounds |
| US12351834B2 (en) | 2020-03-03 | 2025-07-08 | Arcturus Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for the treatment of ornithine transcarbamylase deficiency |
| EP4121018A4 (en) | 2020-03-17 | 2024-07-03 | Genevant Sciences Gmbh | CATIONIC LIPIDS FOR LIPID DNANOPARTICLE DELIVERY OF THERAPEUTICS TO HEPATIC STELLA CELLS |
| EP4121063A4 (en) | 2020-03-19 | 2024-07-03 | Avidity Biosciences, Inc. | COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING FACIO-SCAPULO-HUMERAL MUSCULAR DYSTROPHY |
| CN115697418B (zh) | 2020-03-27 | 2025-12-30 | 艾维迪提生物科学公司 | 治疗肌营养不良的组合物和方法 |
| US12070509B2 (en) | 2020-05-01 | 2024-08-27 | Arcturus Therapeutics, Inc. | Nucleic acids and methods of treatment for cystic fibrosis |
| JP2023525304A (ja) | 2020-05-08 | 2023-06-15 | ザ ブロード インスティテュート，インコーポレーテッド | 標的二本鎖ヌクレオチド配列の両鎖同時編集のための方法および組成物 |
| MX2023002928A (es) | 2020-09-13 | 2023-06-12 | Arcturus Therapeutics Inc | Encapsulacion de arn grande en nanoparticulas lipidicas. |
| US20230416750A1 (en) | 2020-11-09 | 2023-12-28 | 1E Therapeutics Ltd. | Catalytic sequence based methods of treating or preventing bacterial infections |
| JP2024500804A (ja) | 2020-12-18 | 2024-01-10 | イェダ リサーチ アンド ディベロップメント カンパニー リミテッド | Ｃｈｄ２ハプロ不全の処置における使用のための組成物及びその同定方法 |
| AU2021403156A1 (en) | 2020-12-18 | 2023-07-13 | Genevant Sciences Gmbh | Peg lipids and lipid nanoparticles |
| KR20230133859A (ko) | 2020-12-28 | 2023-09-19 | 1이 테라퓨틱스 엘티디. | p21 mRNA 표적화 DNA자임 |
| KR20230126725A (ko) | 2020-12-28 | 2023-08-30 | 1이 테라퓨틱스 엘티디. | 침묵화를 위한 P21 mRNA 표적 부위 |
| US20240299540A1 (en) | 2021-02-05 | 2024-09-12 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Adjuvant therapy for cancer |
| AU2022249318B2 (en) | 2021-03-31 | 2025-11-06 | Entrada Therapeutics, Inc. | Cyclic cell penetrating peptides |
| US20240368541A1 (en) | 2021-05-03 | 2024-11-07 | Astellas Institute For Regenerative Medicine | Methods of generating mature corneal endothelial cells |
| WO2022240721A1 (en) | 2021-05-10 | 2022-11-17 | Entrada Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for modulating interferon regulatory factor-5 (irf-5) activity |
| EP4337261A2 (en) | 2021-05-10 | 2024-03-20 | Entrada Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for modulating mrna splicing |
| CA3218805A1 (en) | 2021-05-10 | 2022-11-17 | Ziqing QIAN | Compositions and methods for intracellular therapeutics |
| JP2024521475A (ja) | 2021-06-14 | 2024-05-31 | ２セブンティ バイオ インコーポレイテッド | 一本鎖ｒｎａ精製方法 |
| IL309001A (en) | 2021-06-23 | 2024-02-01 | Entrada Therapeutics Inc | Antisense compounds and methods for targeting CUG repeats |
| WO2022271955A1 (en) | 2021-06-23 | 2022-12-29 | Musc Foundation For Research Development | Novel targeted shrna nanoparticles for cancer therapy |
| MX2024001581A (es) | 2021-08-05 | 2024-04-18 | Sanegene Bio Usa Inc | Derivados de ribosa modificados con 1'-alquilo y metodos de uso. |
| JP7742485B2 (ja) | 2021-09-16 | 2025-09-19 | アビディティー バイオサイエンシーズ，インク． | 顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーを処置する組成物および方法 |
| JP2024534502A (ja) | 2021-09-22 | 2024-09-20 | セーンジーン バイオ ユーエスエー インコーポレイティド | オリゴヌクレオチドのインビボ送達に使用するための２’－アルキル又は３’－アルキル修飾リボース誘導体 |
| JP2024542929A (ja) | 2021-10-05 | 2024-11-19 | セーンジーン バイオ ユーエスエー インコーポレイティド | ポリヒドロキシル化されたシクロペンタン誘導体及び使用方法 |
| US20250332112A1 (en) | 2022-01-31 | 2025-10-30 | Genevant Sciences Gmbh | Ionizable cationic lipids for lipid nanoparticles |
| JP2025504682A (ja) | 2022-01-31 | 2025-02-14 | ジェネバント サイエンシズ ゲーエムベーハー | ポリ（アルキルオキサゾリン）－脂質コンジュゲートおよびそれを含む脂質粒子 |
| IL314850A (en) | 2022-02-22 | 2024-10-01 | Sanegene Bio Usa Inc | Ribonucleotide derivatives substituted at the 5' position in the carboxyl group and methods of use |
| US12071621B2 (en) | 2022-04-05 | 2024-08-27 | Avidity Biosciences, Inc. | Anti-transferrin receptor antibody-PMO conjugates for inducing DMD exon 44 skipping |
| WO2023219479A1 (ko) | 2022-05-13 | 2023-11-16 | 서울대학교산학협력단 | Dicer에 의한 dsrna 가공의 서열 결정 인자 |
| AU2023307152A1 (en) | 2022-07-11 | 2025-01-09 | Sanegene Bio Usa Inc. | Optimized 2'- modified ribose derivatives and methods of use |
| IL318465A (en) | 2022-07-21 | 2025-03-01 | Antiva Biosciences Inc | Compositions and dosage forms for the treatment of HPV infection and HPV-induced neoplasia |
| WO2024026474A1 (en) | 2022-07-29 | 2024-02-01 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for transferrin receptor (tfr)-mediated delivery to the brain and muscle |
| KR20250115463A (ko) | 2022-11-04 | 2025-07-30 | 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. | 칼슘 전압 개폐 채널 보조 서브유닛 감마 1(cacng1) 결합 단백질 및 골격근으로의 cacng1-매개 전달 |
| EP4619438A2 (en) | 2022-11-14 | 2025-09-24 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for fibroblast growth factor receptor 3-mediated delivery to astrocytes |
| CN121335911A (zh) | 2023-05-03 | 2026-01-13 | 美国圣因生物股份有限公司 | 用于全身性中枢神经系统、外周神经系统和眼部递送的基于脂质的缀合物 |
| AU2024306936A1 (en) | 2023-06-27 | 2026-02-05 | Atrium Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of using prkag2-targeting antibody-oligonucleotide conjugates abstract |
| WO2025007063A1 (en) | 2023-06-30 | 2025-01-02 | Avidity Biosciences, Inc. | Compositions and methods of using pln-targeting antibody-oligonucleotide conjugates |
| US20250064939A1 (en) | 2023-07-24 | 2025-02-27 | Sanegene Bio Usa Inc. | Lipid-based enhancement agent for rna delivery and therapy |
| WO2025052278A1 (en) | 2023-09-05 | 2025-03-13 | Genevant Sciences Gmbh | Pyrrolidine based cationic lipids for lipid nanoparticle delivery of therapeutics to hepatic stellate cells |
| WO2025133951A1 (en) | 2023-12-21 | 2025-06-26 | Genevant Sciences Gmbh | Ionizable lipids suitable for lipid nanoparticles |
| WO2025153530A1 (en) | 2024-01-16 | 2025-07-24 | Novo Nordisk A/S | Albumin-targeted endonucleases, compositions, and methods of use |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4987071A (en) * | 1986-12-03 | 1991-01-22 | University Patents, Inc. | RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods |
| WO1989005852A1 (en) * | 1987-12-15 | 1989-06-29 | Macphillamy Cummins & Gibson | Ribozymes |
| DK0387775T3 (da) * | 1989-03-16 | 1996-11-04 | Boehringer Ingelheim Int | Genetisk enhed til inhibering af funktionen af RNA |
| US5149796A (en) * | 1989-08-31 | 1992-09-22 | City Of Hope | Chimeric DNA-RNA catalytic sequences |
| WO1991003162A1 (en) * | 1989-08-31 | 1991-03-21 | City Of Hope | Chimeric dna-rna catalytic sequences |
| EP0535067B1 (en) * | 1990-06-19 | 1997-03-26 | Gene Shears Pty. Ltd. | Endonucleases |
| EP0552178B1 (en) * | 1990-10-12 | 1997-01-02 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Modified ribozymes |
| DE4216134A1 (de) * | 1991-06-20 | 1992-12-24 | Europ Lab Molekularbiolog | Synthetische katalytische oligonukleotidstrukturen |
| US5817635A (en) * | 1993-08-09 | 1998-10-06 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. | Modified ribozymes |
-
1991
- 1991-09-23 EP EP91916858A patent/EP0552178B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-23 WO PCT/EP1991/001811 patent/WO1992007065A1/en not_active Ceased
- 1991-09-23 DE DE91916858T patent/DE552178T1/de active Pending
- 1991-09-23 PL PL91298867A patent/PL169576B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1991-09-23 AT AT91916858T patent/ATE147098T1/de active
- 1991-09-23 JP JP51523691A patent/JP3257675B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1991-09-23 DE DE69123979T patent/DE69123979T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-09-23 CA CA002093664A patent/CA2093664C/en not_active Expired - Fee Related
- 1991-09-23 AU AU86139/91A patent/AU649074B2/en not_active Ceased
- 1991-09-23 ES ES91916858T patent/ES2061416T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-23 US US07/965,411 patent/US5672695A/en not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-12-30 GR GR930300130T patent/GR930300130T1/el unknown
-
1995
- 1995-05-04 US US08/434,501 patent/US5698687A/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-09-24 US US08/936,657 patent/US6890908B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-07-05 JP JP2001205286A patent/JP2002101893A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE552178T1 (de) | 1994-02-03 |
| WO1992007065A1 (en) | 1992-04-30 |
| CA2093664A1 (en) | 1992-04-13 |
| ES2061416T3 (es) | 1997-03-01 |
| ES2061416T1 (es) | 1994-12-16 |
| JP2002101893A (ja) | 2002-04-09 |
| JP3257675B2 (ja) | 2002-02-18 |
| US5672695A (en) | 1997-09-30 |
| EP0552178A1 (en) | 1993-07-28 |
| US6890908B1 (en) | 2005-05-10 |
| DE69123979D1 (de) | 1997-02-13 |
| US5698687A (en) | 1997-12-16 |
| ATE147098T1 (de) | 1997-01-15 |
| AU649074B2 (en) | 1994-05-12 |
| CA2093664C (en) | 2003-07-29 |
| JPH06501842A (ja) | 1994-03-03 |
| DE69123979T2 (de) | 1997-04-30 |
| EP0552178B1 (en) | 1997-01-02 |
| AU8613991A (en) | 1992-05-20 |
| GR930300130T1 (en) | 1993-12-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL169576B1 (pl) | Sposób wytwarzania czasteczki RNA o aktywnosci katalitycznej PL PL | |
| US5817635A (en) | Modified ribozymes | |
| US20060036087A1 (en) | 2'-deoxy-2'-fluoro modified RNA | |
| US5545729A (en) | Stabilized ribozyme analogs | |
| AU706417B2 (en) | Method and reagent for inhibiting the expression of disease related genes | |
| AU751480B2 (en) | Nucleoside triphosphates and their incorporation into ribozymes | |
| US6831171B2 (en) | Nucleic acid catalysts with endonuclease activity | |
| US5627053A (en) | 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid | |
| US5639647A (en) | 2'-deoxy-2'alkylnucleotide containing nucleic acid | |
| US5714320A (en) | Rolling circle synthesis of oligonucleotides and amplification of select randomized circular oligonucleotides | |
| US5716824A (en) | 2'-O-alkylthioalkyl and 2-C-alkylthioalkyl-containing enzymatic nucleic acids (ribozymes) | |
| US6573072B1 (en) | Ribozymes having 2′-O substituted nucleotides in the flanking sequences | |
| WO1999050279A1 (en) | Antisense compositions for detecting and inhibiting telomerase reverse transcriptase | |
| WO1998043993A2 (en) | Nucleic acid catalysts | |
| JPH1052264A (ja) | Ｎ‐ｒａｓ発現阻害剤およびその方法 | |
| Slim et al. | The role of the exocyclic amino groups of conserved purines in hammerhead ribozyme cleavage | |
| US6482932B1 (en) | Nucleoside triphosphates and their incorporation into oligonucleotides | |
| JPH11513881A (ja) | テンプレートおよびプライマーに基づく酵素的に切断可能なオリゴヌクレオチドの合成 | |
| CA2106015A1 (en) | Ribozymes having 2'-0 substituted nucleotides in the flanking sequences | |
| US6656731B1 (en) | Nucleic acid catalysts with endonuclease activity | |
| EP1493818A2 (en) | Nucleoside triphosphates and their incorporation into ribozymes | |
| EP1311672A1 (en) | New sequences | |
| AU2001284570A1 (en) | New sequences | |
| Temsamani et al. | Inhibition of in vitro transcription by oligodeoxynucleotides | |
| Feldman | Bachelors in Biological Sciences, Universidade Federal do Paraná, Curitiba, Brazil, 1996 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20070923 |