JPH06501842A - 修飾リボザイム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 修飾リポザイム 一定の天然に生じるリポ核酸（ＲＮ　Ａ　Ｓ　）は、自己切断を行なう。第１に 報告された例は、補助因子としてのグアノシンを必要とする原生動物テトラヒメ ナ（Ｃｅｃｈ、＾ｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、５９　（１９９０）、５４３ −５６８参照）のリポソームＲＮＡ前駆物質の切断である。その後に、ＲＮ　Ａ 切断の多数の例がウィロイド、ウイルソイドおよびサテライトＲＮＡ中に見い出 された（　５ｈｅｌｄ。

ｎ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ ｇｙ　（１９９０）第４巻、第２２７〜２４２頁、Ｆ、　Ｅｃｋｓｔｅｉｎおよ びり。

Ｍ、　Ｊ、　Ｌｉ１ｌｅｙ４１．　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ　Ｂｅｒｌ ｉｎ　［Ｉｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；　Ｓｙｍｏｎｓ、　ＴｌＢ５１４　（１９８９ ）、　４４５−４５０）　、この切断は、５′−ヒドロキシルおよび２’、３’ 　一環式ホスホジエステル末端を生じるＭ　ｇ　２“のような二価陽イオンの存 在下にホスホジエステル結合の部位特異的切断を包含する。このような幾つかの ＲＮＡの自己切断の部位の周囲の連続的分析により、“ハンマーヘッド（ｈａ■ ｅｒｈｅａｄ）”構造と名付けられた切断にとって本質的な共通の構造特徴の一 致を導いた（　Ｈｕｔｃｈｉｎｓ他、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、 　１４　（１９８６）　３６２７−３６４０）　、この構造は、１つの特殊な位 置で切断を受け入れる三次元構造を形成する、３個の螺旋および１３個の保存ヌ クレオチド（下記の図の中で枠で囲んだ部分）から構成されている。自己触媒さ れた切断は、通常、筋肉内プロセスであり、即ち単ＲＮＡ分子は、切断に必要な 全ての機能を有する。しかし、ウーレンベック（Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ）ＣＮａｔ ｕｒｅ　３２８　（１９８７）、　５９６−６００）は、このハンマーヘッド構 造が一本鎖中に埋封されなければならないのではなく、二本鎖から構成させるこ とができることが証明された。これら２つの鎖は結合してハンマーヘッド構造を 形成し、このハンマーヘッド構造は、鎖の１つ（Ｓ鎖）中で（矢印で示されたよ うな）ホスホジエステル結合の切断を導き、これとは異なり、鎖の他方（ＡＥ鎖 ）は、老化しないままでありかつ多数の切断反応を期待することができる。この 鎖は酵素の定義に適合し、リポザイムと呼ばれる。枠で囲まれた配列（下記の図 ）は、保存されているけれども、他のものは変化可能であり、但し、一対の塩基 構造および一本鎖領域は、無傷のままである。

ｐｐｐ Ｇ Ｇ Ａ トリヌクレオチドＧＵＣ後の切断反応は、詳細に研究された（　Ｒｕｆｆｎｅｒ 他、　Ｇｅｎｅ　８２　（１９８９）、　３１−４１；　Ｆｅｄ。

ｒ　ａｎｄ　Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、　ＵＳＡ８７（１９９０）、　１６６８−１６７２）。新しい特異性を有す るリポザイムも構成され（ＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、　Ｎａｔｕ ｒｅ　３３４（１９８８）、　５８５−５９１）　、この場合には、例えば配列 ＧＵＡ１ＧＵＵ、ＣＵＣ，ＡＵＣおよびＵＵＣの後に切断が起こり得ることが指 摘されている。

更に、ＲＮＡ酵素の例は、ヘアピンＲＮ　Ａ　（ＨａＩＩｌｐｅｌ池、　Ｎｕｃ ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１ｇ　（１９９０）、　２９９−３０４）　 、ならびにタンパク質を含有するＲＮＡ１例えばテロメラーゼ（Ｇｒｅｉｄｅｒ およびＢｌａｃｋｂｕｒｎ、　Ｎａｔｕｒｅ　３３７　（１９８９）。

３３１−３３７）およびＲＮアーゼＰ　（Ｂａｅｒ他、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ １ｄｓ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　（１９８８）、第３巻 、第２３１〜２５０頁、　Ｆ、　Ｅｃｋｓｔｅｉｎおよびり、　Ｍ、　Ｊ、　Ｌ ｉｌｌｅｙ編、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ、　Ｂｅｒｌｉｎ＃Ｉｅｉｄ ｅｌｂｅｒｇ）である。

リボザイムは、治療剤としての使用に特に重要である（Ｒｏｓｓｉ　ａｎｄ　５ ａｒｖｅｒ、ＴＩＢＴＥＣＵ　８（１９９０）　、１７９−１８３、参照）。１ つの可能な方法により、例えばウィルス遺伝子および特殊な内因性遺伝子のよう な２つの異質遺伝子の表現に必要とされるＲＮＡは破壊されうる。このことは、 標的ＲＮＡと一緒にハンマーヘッド構造またはヘアピン構造を形成することがで きかつこの構造を予め定められた位置で切断することができるＲＮＡ分子の構成 を必要とする。この方法によりＨＩＶ−１ウイルスを阻害するための最初の適用 は、報告された（　５ａｒｖｅｒ池、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４７　（１９９０） 　、１２２２−１２２４）。生体内での標的ハンマーへッドリボザイムの作用の 他の例は、カンメロン（Ｃａａ＋ｍａｒｏｎ）およびジエニングス（Ｊｅｎｎｉ ｎｇｓ）によって報告されており（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ 、　ＵＳＡ　８６　（１９８６）　、９１３９−９１４３）　、かつ試験管内で の場合は、コツテン（Ｃｏｔｔｅｎ）池によって報告されている（　Ｍｏ１．　 Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　９　（１９８９）　、　４４７９−４４８７）。

更に、リポザイムの他の有用な触媒作用の性質、例えばデホスホリラーゼ活性お よびヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性は、公知である（国際公開ＷＱ８８ １０４３００、参照）。この場合には、公知のタンパク質酵素と区別される、高 い配列特異性を有するオリゴヌクレオチド基質をデホスホリル化することができ るＲＮＡ酵素が開示されている。ＲＮＡ分子は、ＲＮＡポリメラーゼとして作用 することができ、外側鋳型よりもむしろ内側鋳型を使用するようなタンパク質酵 素と区別される。従って、種々のヘテロポリマーは、変異型ＲＮ　Ａ酵素形によ って構成されうる。このことは、例えば特殊なタンパク質またはペプチドのため にメツセンジャーＲＮＡ分子を形成することができる。更に、ヘルシュラーク（ Ｈｅｒｓｃｈｌａｇ）およびチェック　（Ｃｅｃｈ）　（Ｎａｔｕｒｅ　３４４ ．　（１９９０）　、４０５−４０９）　は　、ＤＮアーゼ活性を有するＲＮＡ 酵素を記載している。

ＲＮＡ酵素は、治療剤として有用であるために、標的細胞中に導入されなければ ならない。リポザイムを標的細胞中に運搬するために主要な２つの方法が存在す る： （ａ）予め形成された合成ＲＮＡの外因性の運搬；（ｂ）プラスミド上に位置し たりポザイム解読遺伝子の内因性転写。

方法（ａ）の重大な欠点は、生存している細胞内に存在する種々のりボヌクレア ーゼ酵素による迅速な崩壊に基づく生理的条件下でのＲＮＡ分子の著しく低い安 定性にある。方法（ｂ）の欠点は、特異的および安定的にリポザイム解読遺伝子 を高級有機物の細胞中に挿入することの著しい困難さをまねく。更に、生体内で 合成されたＲＮＡ分子を用いた場合には、崩壊の問題も起こる。

従って、本発明の基礎を為す問題は、治療剤として使用することもでき、生化学 的または生物工学的方法で生物触媒として使用することもできる、触媒活性と、 化学的崩壊および酵素的崩壊に対する増大された安定性の双方を有するＲＮＡ分 子を提供することであった。

しかし、パーロールド（Ｐｅｒｒｅａｕｌｔ）他による最近の刊行物（Ｎａｔｕ ｒｃ３４４　（１９９０）　、５６５−５６７）の記載から、ＲＮＡ酵素の一定 の修飾、例えばリボザイムの少数の位置での２′−デオキシリボヌクレオチドの 取り込みにより触媒活性の著しい損傷が生じることは、知られていた。

ところで、意外なことに、一定の化学的修飾は、ＲＮＡ分子の安定性を増大させ るリポース糖の２′位でリボザイムの触媒作用の性質に殆ど影響を与えずおよび ／またはこの性質を破壊しないことが見い出された従って、本発明の目的は、リ ポース糖の２′位でのヒドロキシ基がハロゲン原子、スルフヒドリル基、アンド 基、アミノ基、モノ置換アミノ基およびジ置換アミノ基から選択された変更因子 基によって代替されているような少なくとも１つの修飾ヌクレオシドからなる触 媒活性を有するＲＮＡ分子を提供することである本発明によるＲＮＡ分子の触媒 活性は、有利にヌクレオチジルトランスフエラーゼ活性、デホスホリラーゼ活性 、デオキシリボヌクレアーゼ活性および配列特異的エンドリボヌクレアーゼ活性 からなる群の少なくとも１つを有する。有利に触媒活性は、配列特異的エンドリ ボヌクレアーゼ活性を有する。よりいっそう有利ニハ、ＲＮＡは、上記のような ハンマーへッドリポザイムである。殊に有利なのは、リボザイムが別のＲＮＡ鎖 と結合することができ、２本の鎖からなるハンマーヘッド構造を形成することで あり、この場合修飾ＲＮＡ鎖は、上記のようにＥ鎖である。

ハンマーへッドリボザイムは殊に好ましいけれども、他のＲＮＡ＃素、例えば天 然に生じる形またはその短縮された形（Ｚａｎｇ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 　２７　（１９８８）、　８９２４−８９３１）のテトラヒメナリボザイム（Ｃ ｅｃｈ、＾ｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５９　（１９９０）、　５４ ３−５６８）および殊にヘアピンＲＮ　Ａ　（Ｈａｍｐｅｌ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ 　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１ｇ　（１９９０）２９９−３０４）またはＲＮＡ含有 タンパク質、例えばＲＮアーゼ　ｐ　（Ｂａｅｒ他、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ ｄｓ　＆　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　（１９８８）、第３巻、第２ ３１〜２５０頁、Ｆ、Ｅｃｋｓｔｅｉｎおよびり、　Ｍ、　Ｊ、　Ｌｉ１ｌｅｙ 、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ　Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）　、トｏメラー ゼ（ＧｒｅｉｄｅｒおよびＢｌａｃｋｂｕｒｎ。

Ｎａｔｕｒｅ　３３７　（１９８９）、　３３１−３３７）も、本発明によッテ 包含される。

また、リボース糖の２′位での変更因子基の配合は、選択の二者択一的作業周期 （ＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４９　（１９９０）、　５ ０５−５１０：　Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎおよび５ｚｏｓｔａｒｋ、　Ｎａｔｕｒｅ 　３４６　（１９９０）、　８１Ｌ８２２）に依存する方法によって誘導された かまたは任意の他の方法によって誘導された新しい官能基を有するＲＮＡに特に 有用であると思われる。

リボース糖の２′位のヒドロキシ基の代わりの変更因子基は、ハロゲン原子、ス ルフヒドリル基、アジド基、アミノ基、モノ置換アミノ基およびジ置換アミノ基 から選択される。ハロゲン原子は、弗素原子、塩素原子、臭素原子または沃素原 子であることができ、この場合には弗素原子が好ましい。置換アミノ基の置換骨 は、有利に０１〜Ｃ３アルキル基および／またはヒドロキシアルキル基である。

最も好ましくは、変更因子基は、ハロゲン原子または非置換アミノ基である。

リボース糖の２′位での変更因子基の配合は、酵素切断に対するＲ　Ｎ　Ａ安定 性を著しく増大させる。リポザイムの特異的位置で配合された２′〜デオキシ− ２′−フルオロウリジンおよび２′−デオキシ−２′−アミノウリジンは、これ らの位置でＲＮアーゼ　Ａによって切断を阻止することが確認された（第３図お よび第４図、参照）。この酵素は、ピリミジンヌクレオシドの３′位で切断され 、かつ２′−ヒドロキシル基の存在を必要とする（　ＵｃｈｉｄａおよびＥｇａ ｍｉ　（１９７１）、　ＴｈｅＥｎｚｙＩｉｅｓ第■巻、第３編（Ｐ、　Ｄ、　 Ｂｏｙｅｒｊｍ　）　、　Ａｃａｄｅｔａｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、第２０５〜２５０ 頁）。更に、ポリヌクレオチドを用いて得られた結果は、２′−アミノ官能基の 存在により、ヘビ毒ホスホジェステラーゼのような非特異的ヌクレアーゼによる 分解が減退されることを示す（Ｈｏｂｂｓ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１２ 　（１９７３）、　５１３ｇ−５１４５）。２′−ハロゲン原子の存在は、ＤＮ アーゼ　■のようなヌクレアーゼを阻害する（　Ｈｏｂｂｓ他、　Ｂｉｏｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙ　１１　（１９７２）、　４３３６−４３４４）。また、ポリヌク レオチドを用いての結果は、ヌクレオチドの２′位でのハロゲン原子の存在によ り、ヒト血清ヌクレアーゼの作用から保護されることを示す（、Ｂ１ａｃｋ他、 Ｖｉｒｏｌａｇｙ　４ｇ　（１９７２）　５３７−５４５）。従って、修飾リボ ース糖の配合による保護は、むしろ一般的であり、かつ２′−ヒドロキシル基の 存在に依存するＲＮアーゼに制限されないリボ核酸の場合、リポース糖は、Ｎ− グリコシド結合を介してヌクレオチド塩基に結合されている。本発明のＲＮＡ分 子において修飾リボース糖に結合されているヌクレオチド塩基は、ＲＮＡ中で天 然に生じる塩基および置換塩基からなる群から選択されている。有利に修飾リポ ースは、ＲＮＡ中の天然塩基であるアデニン、グアニン、サイトシンおよび／ま たはウラシルに結合している。しかし、修飾リボースは、有利にキサンチン、ハ イポキサンチン、２．６−ジアミノプリン、２−ヒドロキシ−６−メルカプトプ リンから選択された置換塩基および硫黄により６位で置換されたプリン塩基また はハロゲン原子もしくは０１〜Ｃ５アルキル基、殊に臭素原子もしくはメチル基 により５位で置換されたピリミジン塩基に結合されていてもよい。

修飾リボースに結合された最も有利なヌクレオチド塩基はウラシルである。

ＲＮＡ分子中に配合されている修飾ヌクレオシドは、早期に記載された化合物で あるかまたは公知化合物と同様に製造することができる化合物である。リポヌク レオシドの最も好ましいフルオロ類縁物およびアミノ類縁物、例えば２′−デオ キシ−２′　−フルオロサイチジン（Ｄｏｅｒｒ　＆　Ｆａｘ、　Ｊ、　Ｏｒｇ 、　Ｃｈｅｖａ、３２　（１９６７）。

１４６２；　ｉ［ｅｎｇｅｌ　＆　Ｇｕｓｃｈｌｂａｕｅｒ、　Ａｎｇ、　Ｃｈ ｅｗ、　９０　（１９７８）、　５５７−５５８）　：　２’　−チオキシ−２ ′−フロオロアデノシン（Ｉｋｅｈａｒａ　＆　Ｍｉｋｉ、　Ｃｈｅ＋＊、　Ｐ ｈａｒｍ、　Ｂｕｌｌ、　２６　（１９７８）、２４４９−２４５３）　、２’ 　−チオキシ−２′−フロオロウリジン（Ｃｏｄｉｎｇｔｏｎ他、　Ｊ、　Ｏｒ ｇ、　Ｃｈｅｗ、　２９　（１９６４）、　５５８−５６４）　、２’　−チオ キシ−２′−アミノウリジン（ａＶｅｒｈｅｙｄｅｎ池、Ｊ、Ｏｒｇ、Ｃｈｅｗ 、３６　（１９７１）、２５０）および２′−デオキシ−２−アミノサイチジン （Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎ他、（１９７１）上掲書）は、早期に記載されたものであ る。前記化合物の幾つかの合成には、最近の合成法を使用することができる。２ ′−デオキシ−２′−フルオロサイチジンは、サンプ（Ｊ、　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅ ｍ、　４７　（１９８２）、　３６２３−３６２８）の方法により２′−デオキ シ−２′−フロオロウリジンから得ることができる。同様の方法は、２′−デオ キシ−２′−アジドサイチジンへの２′−デオキシ−２′−アジドウリジンの形 質転換に使用することができる（　Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎ他、　（１９７１）上掲 書）。この２′−デオキシ−２′−アジドサイチジンは、ムンガル（Ｍｕｎｇａ ｌｌ）他（Ｊ、　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｗ、　４０　（１９７５）、　１６５９）の 方法によって２′−デオキシ−２′−アミノサイチジンに還元することができる 。

２′−フルオロヌクレオシド　５′−トリホスフェートの合成は、ルートビッヒ （Ｌｕｄｗｉｇ）　（Ａｃｔａ　Ｂｉｏｃｈｅｔ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、＾ｃ ａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｈｕｎｇ、　１６　（１９８１）、　１３１−１３３）の方 法により実施することができるかまたはルートビッヒ（Ｌｕｄｖｉｇ）およびニ ックシュタイン（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）　（Ｊ、　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｗ、５４　（ １９８９）、　６３１−６３５）の方法により実施することができる。２′−デ オキシ−２′−アミノウリジンおよび一すイチジン　５′−トリホスフェートは 、ホップス（Ｈｏｂｂｓ）他（Ｂｉｏｃｈｅ＋＊１ｓｔｒｙ　１２　（１９７３ ）、　５１３８−５１４５）によるジホスフェートに関する記載と同様にして、 ピロホスフェートをホスフェートの代わりに使用する変法を用いて得ることがで きる。自動化オリゴヌクレオチド合成のための２′−デオキシ−２′−フルオロ ヌクレオチド　３′−ホスホルアミダイトは、シンハ（５ｉｎｈａ）他（Ｎｕｃ ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

１２　（１９８４）、　４５３９−４５５７）の方法によって得ることができる 。相応する２′−アミノ誘導体の合成に関連して、アミノ基は、イマザワ（Ｉｍ ａｚａｗａ）およびエノクンユタイン（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）　（Ｊ、　Ｏｒｇ、 　Ｃｈｅｗ、　４４　（１９７９）、　２０３９−２０４１）の記載によりトリ フルオロアセチル化（こよって保護されていてもよい。

本発明によるＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを有し、この場合リ ボースの２′位でのヒドロキシ基は、変更因子基によって代替されてＬ）る。本 発明の１つの好ましい実施態様は、残存する３個のヌクレオシドは非修飾糖を含 有するけれども、１種類の全部のヌクレオシド（即ち、アデノシンまた（まグア ノシンまたはサイチジンまたはウリジン）力く修飾筒を含有するような１つのＲ ＮＡ分子にある。よりし）ツそう好ましくは、修飾ヌクレオシドは、ビリミジン ヌクレオシド、即ちサイチジンもしくはウリジンまた（よその！換誘導体である 。最も好ましくは、修飾筒：ま、２′−フルオロリボースまたは２′−アミノリ ボースである。この実施態様の例は、フエドール（Ｆｅｄｏｒ）およびウーレン ベック（Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ）　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＬＩＳ＾８７　（１９９０）、　１６６８−１６７２）ｉこよって３ 己載されたハンマーへンドリポザイムＥ１から誘導された／１ンマルオロウリジ ンによって代替されており、Ｅ３の場合には、全てのウリジン残基は、２′−デ オキシ−２′−アミノウリノン残基によって代替されている。リボザイムＥ２お よびＥ３は、非修飾ＲＮＡ分子Ｅｌの場合と比較可能であるリボヌクレアーゼ活 性を示す。

本発明のもう１つの好ましい実施態様の場合、残存する２個のヌクレオシドは非 修飾糖を含有するけれども、２つの異なる種類の全てのヌクレオシドは、修飾筒 を含有する。よりいっそう好ましくは、全てのビリミジンヌクレオシド、即ちサ イチジンおよびウリジン（ｆｌ換ピリミジン塩基を含む）は、修飾筒を含有し、 最も好ましくは、２′−フルオロまたは２′−アミノリボース誘導体を含有する 。

更に、なお本発明による実施態様は、所謂“選択的修飾パターン”と表わされる （即ち、ヌクレオシドが修飾されており、非修飾である）修飾パターンを有する ＲＮＡ分子にある。他の特異的に選択された位置でのヌクレオシドは非修飾であ ることができるけれども、選択的修飾パターンを有するＲＮＡは、特異的に選択 された位置でのヌクレオシドが修飾されていてもよい１つの分子にある。例えば 、リボヌクレアーゼに対する高感受性部位であることが知られている（例えば、 ＲＮＡ分子の二次構造に基づく）ヌクレオシドは、修飾され、ＲＮＡ分子の延長 された生存時間を達成する。リボヌクレアーゼ高感受性部位の１つの例は、リポ ザイムＥ１の２１位で得られる。第３図で示したように、ＲＮＡ分子は、この位 置でＲＮアーゼによって著しく強力に切断される。

更に、本発明のもう１つの実施態様は、付加的に少なくとも１つの修飾インター ヌクレオチドホスホジエステル結合を有するＲＮＡ分子にある。適当な修飾ホス ホジエステル結合の例は、メチルホスホネート基またはホスホロチオエート基で あり、このホスホロチオエート基は、殊に好ましい。好ましくは、少なくともＲ ＮＡ分子の５′−末端ホスホジエステル結合および／または３′−ホスホジエス テル結合は、修飾されている。よりいっそう好ましくは、５′−末端ホスホジエ ステル結合および最後の３個の３′−末端ホスホジエステル結合は、修飾されて いる。

分解に対する増大された安定性を得るためには、修飾インターヌクレオチド結合 だけの存在では不十分であることが見い出された。しかし、２′　−修飾リボー スと、修飾インターヌクレオチド結合との合わされた存在により、付加的な安定 性を向上させる効果を示した。双方の修飾による５０倍を上層る安定性の増大に より、非修飾リポザイムと比較して切断の減少された効率は凌駕される。

修飾インターヌクレオチド結合を有するＲＮＡ分子の合成は、有利に下記したよ うな化学合成により達成される。

本発明のもう１つの目的は、ＲＮＡ鎖中に少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを 配合し、その際にリボース糖の２′位でのヒドロキシ基をハロゲン原子、スルフ ヒドリル基、アジド基、アミノ基、モノ置換アミノ基およびジ置換アミノ基から 選択された変更因子基によって代替することを特徴とする、触媒活性を有するＲ ＮＡ分子の合成法である。

有利に、変更因子基は、ハロゲン原子（即ち、弗素原子、塩素原子、臭素原子ま たは沃素原子）またはアミノ基であり、よりいっそう有利には、弗素原子または 非置換アミノ基である。また、本発明による方法が少な（とも２個の異なる変更 因子基（即ち、弗素原子およびアミン基）を有するヌクレオチドを配合するよう なＲＮＡ分子の合成からなることは、注目すべきである。

この修飾ヌクレオチドをＲＮＡ中に配合するためには、有利に２つの方法が存在 する。１つの方法は、有利にヌクレオチド前駆物質としてのそれぞれのホスホル アミダイトまたはＨ−ホスホネートを用いて固体支持体上または溶液中で実施す ることができるＲＮＡ分子の自動化化学合成によるものであり、他の方法は、２ ′−修飾ヌクレオシド５′−トリホスフェートを使用して適当な核酸、有利に核 酸ポリメラーゼを有するＤＮＡ鋳型の転写による酵素配合を包含する。自動化化 学合成を用いて、修飾インターヌクレオチド結合を有するＲＮＡ分子は、相応す る化学的に修飾されたヌクレオチド前駆物質、例えばメチルホスホネート誘導体 をＲＮＡ鎖中に配合することによって得ることができる。ホスホロチオエート結 合を配合するためには、標準ホスホルアミダイト誘導体は、ヌクレオチド前駆物 質として使用される。しかし、ＲＮＡ鎖に対する前駆物質のカップリングが起こ った後に、その後の酸化工程は、非修飾結合の場合と同様に沃素を用いて実施さ れないが、しかし硫黄または硫化剤を用いて実施され、それによってホスホロチ オエート基が得られる。

修飾ＲＮＡ分子の化学合成は、当業界で知られている、非修飾ＲＮＡまたはＤ　 Ｎ　Ａ分子の場合と同様に実施される。よりいっそう詳細には、ＲＮＡ合成は、 それぞれのヌクレオチド前駆物質の段階的添加を包含する固体支持体上での化学 合成によって実施される。望ましい長さのＲＮＡ生産物を合成した後、ＲＮＡは 、常用の方法によって固体支持体から除去され、かつ有利にゲル電気泳動法によ って精製される。また、化学的ＲＮＡ合或は、固体支持体を使用することなしに 任意の他の公知技術によって実施することもできる。即ち、ＲＮＡは、溶解可能 な形で合成させることができ、かつその後に当業界で知られた方法で精製させる ことができる。

２′−アミノ変更因子基をＲＮＡ鎖中に配合する場合には、この基は、ホスフィ チル化反応（即ち、ヌクレオチド前駆物質の製造）の前に保護されなければなら ず、かつその後の使用のためにカップリング反応で保護されなければならない。

この目的のために、ホリフルオロアセチル基は、有利に保護基として使用される 。それというのも、この基は、核酸合成剤上での合成の作業周期の間に安定であ り、かつアンモニアを用いて常用の処理をしながら除去可能である。

また、ＲＮＡ鎖の合成は、適当な核酸ポリメラーゼによる核酸鋳型からの転写に よって実施することができる。好ましくは、鋳型はＤＮＡ鋳型であり、核酸ポリ メラーゼはＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼである。

よりいっそう好ましくは、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼは、著しく進行的なバ クテリオファージＲＮＡポリメラーゼであるＴ７、Ｔ３およびＳＰ６ポリメラー ゼからなる群から選択される。これらのポリメラーゼの中で、Ｔ７ＲＮＡポリメ ラーゼが最も好ましい。修飾ＲＮＡ分子の合成のためのＤＮＡ鋳型は、本発明に よれば、有利に望ましいＲＮＡ配列を解読する合成りＮＡ断片をプラスミドの適 当な部位中に挿入することによって構成され、この場合このプラスミドは、それ ぞれのＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーターからなり、部位は、プラスミド のこのような１つの位置に位置しており、したがって合成りＮＡ断片は、プロモ ーターから転写されることができる。転写反応は、有利にランオフ転写として実 施される。また、合成りＮＡ断片は、プラスミド部分なしに転写鋳型として役立 つことができる。しかし、効果的なＲＮＡ合成を可能にする断片は、転写出発信 号を有する。

２′−チオキシ−２′−ハロゲンヌクレオチド、例えば２′−デオキシ−２′− フルオロウリジン、−オクチジン、−アデノシン、−グアノシンおよびそれぞれ のクロコ化合物の重合は、有利に補助因子としてのＭｎ２”イオンの存在下にＴ ７ポリメラーゼによって実施される。また、２′−アミノヌクレオチド、例えば ２′−チオキシ−２′−アミノウリジン、２′−チオキシ−２′−アミノサイチ ジン、２′−デオキシ−２′−アミノアデノシンおよび２′−デオキシ−２′− アミノグアノシンの重合は、有利に補助因子としてのＭ　ｇ　２　”イオンの存 在下に実施される。

次の実施例の実験データから、ハンマーへッドリポザイム中での２′−デオキシ −２′−フルオロウリジンおよび２′−デオキシ−２′−アミノウリジンの存在 により、触媒活性が破壊されないことは明らかである。このことは、基質部分で ２′−フルオロウリジンの存在に関して第３図に品質的に示されており、種々の 他の１対の酵素／基質に関して第１表に量的に示されている。実際に、全ての修 飾によりアミノ置換の最も代表的な例であるに、値が増大した。しかし、活性構 造のこの摂動は、異なる塩基組成物を用いてハンマーヘッド系について観察され るに、、変量の範囲内に十分存在する（Ｆｅｄｏｒ　＆　Ｌｌｈｌｅｎｂｅｃｋ 、上掲書）。付加的に、著しく意外なことに、単独の２′−アミノウリジン、直 接に切断部位の５′を基質中に配合することにより、Ｋｅ、は著しく増大しく第 １表）、シたがって特異的部位での２′−修飾ヌクレオシドの選択的な導入によ って向上された活性のりポザイムを生産するものと考えられる。この結果は、明 らかに、触媒活性に関してハンマーヘッド構造の酵素部分を通じての２−ヒドロ キシル基の存在は不必要であるが、しかし本発明による修飾は少な（とも一定の 位置で許容されることを示す。これとは異なり、２′−デオキシヌクレオチド１ ５％のみをハンマーへッドリボザイム中に配合することは、Ｋ、に影響を及ぼす ことはないけれども、触媒作用の効率を２程度のマグニチュードで減少させるこ とが報告されている（　Ｐｅｒｒｅａｕｌｔ他（１９９０）　、前掲書）。切断 速度は、切断部位で燐上への２′−ヒドロキシルの攻撃角度によって定められる ので、この切断速度はハンマーヘッド系の全ての構造によって著しく影響を及ぼ される。従って、速度に対する２′−修飾の観察される影響により、２′−フル オロ類縁物は、デオキシリボヌクレオタイドの場合よりも類似したりポヌクレオ タイドの構造に適合していることに注目すべきである。このことは、明らかに、 アミノ類縁物に対しても支持される。本発明による他の２′−修飾ヌクレオシド は、同様に触媒活性を示す。

更に、本発明の他の目的は、殊にウィルスもしくは他の異質遺伝的物質またはウ ィルスもしくは他の異質遺伝的物質からの転写物の特異的切断のために治療剤と してかまたは生化学的もしくは生物工学的方法における生物触媒として、少なく とも１つの修飾ヌクレオチドからなる触媒活性を有するＲＮＡ分子の使用にある 。前記目的のために、本発明のＲＮＡ分子は、非修飾の類縁物よりも適当である と思われる。それというのも、このＲＮＡ分子により、化学的切断および／また は酵素的切断に対しての安定性が増大するからである。

更に、本発明は、第１図〜第７図の組合せで次の実施例によって詳説される。し かし、これらの実施例は、本発明の範囲を狭くする意図のものではない。

第１図は、ＰＡＧＥ後のプラスミドｐＵＣＲ５のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ　ラン オフ転写物のオートラジオグラフを示す。

第２図は、ＰＡＧＥ後の２′−アミノウリジンを含有するプラスミドｐＵＣＲＥ のＴ７　ＲＮＡポリメラーゼ　ランオフ転写物のオートラジオグラフを示す。

第３図は、Ｐ、八ＧＥによって分離された５′−標識化ランオフ転写物Ｅ１およ びＥ２の部分的リボヌクレアーゼＡ切断のオートラジオグラフを示す。

第４図は、ＲＮアーゼＡＩこよるＳｌおよびＳ２の全崩壊のオートラジオグラフ を示す。

第５図は、リボザイムＥｌによる２′−フルオロウリジンおよび３２Ｐ−ＡＭＰ 含有基質Ｓ３の切断のオートラジオグラフを示す。

第６図は、Ｅ２と８１とのりボザイム反応のエディー−ホフステーのプロットを 示す。

第７図は、Ｅ３と８１とのりボザイム反応のラインウィーヴアーーバークのプロ ットを示す。

第８図は、ＨＩＶ−１配列をｐＯＴＨ３３中１：り。

−ン化した体制を示す。

第９図は、リポザイムＲＥ１１５のヌクレオチド配列を示す。

実施例 例１ オリゴリボヌクレオチドの調製 オリゴリボヌクレオチドの自動化合成：自動化オリゴリボヌクレオチド合成を、 ミリケン／バイオサーチ社（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）によって 供給される単量体リボヌクレオチドホスホルアミダイトを使用して１マイクロモ ルの規模でアプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ｓ）　３８０　Ｂ　Ｄ　Ｎ　Ａ　合成装置を用いて実施した。対照多孔質ガラス カラムにカップリングしたりポヌクレオシドを有する対照多孔質ガラスカラムは 、ミリケン／バイオサーチ社（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）または ベニンスラ社（Ｐｅｎ１ｎｓｕｌａ）の製品であった。オリゴマーをリボヌクレ オチドホスホルアミダイトの供給業者（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ ）の仕様書に応じて後処理した。保護基の除去後、オリゴリボヌクレオチドをア ミコン（Ａｍ１ｃｏｎ）フィルター膜セントリコン（ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）　ｌ 　Ｑ上でスピン透析（ｓｐｉｎ　ｄｉａｌｙｓｉｓ）によって濃縮し、エタノー ルを沈殿させた。乾燥したペレツトを水５０μｌ中に入れ、ＰＡＧＥを行なった 。バンドをＵＶ照射によって可視化し、切断し、ＲＮＡを緩衝液（酢酸アンモニ ウム０．２５モル、トリス／ＨＣ１１０ミリモル　ｐＨ８，Ｏ，ＥＤＴＡ１ミリ モル）　（Ｆｅｄｅｒ　＆　Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ、　ＰＮＡＳ　ＵＳ八へ７（１ ９９０）、　１６６８−１６７２）中で３７℃で１晩中溶離することによって単 離した。刊行物（Ｆｅｄｅｒ　＆　ｌ１ｈｌｅｎｂｅｃｋ　１９９０）に記載さ れた６　６００Ｍ−１ｃｍ−１のヌクレオチドにつき吸光係数を使用して濃度を 測定した。オリゴリボヌクレオチドの水溶液を一２０℃で貯蔵した。

ランオフ転写のための鋳型を含有するプラスミドの構成： 次のオリゴデオキシヌクレオチドをアプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅ ｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）　３８０　Ｂ　Ｄ　ＮＡ　合成装置を用いてホスホ ルアミダイト方法によってプラスミド構成のために合成した： Ｒ３２−Ｔ、５’　−ｄ　（ＧＡＴＡＴＣＣＴＧＡＣＴＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡ ＧＴＣＧＴＡＴＴＡ）−３；　Ｒ３２−Ｔ、５’　−ｄ　（ＴＡＡＴＡＣＧＡＣ ＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＴＣＡＧＧＡＴＡＴＣＴＧＣＡ）−３’　：ＲＥｌ −Ｔ、ｓ’　−ｄ　（ＧＧＡＧＴＴＴＣＧＧＣＣＴＡＡＣＧＧＣＣＴＣＡＴＣＡ ＧＡＧＧＡＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡ）−３’およびＲＥ２− Ｃ，５’　−ｄ　（ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＣＣＴＣＴＧ ＡＴＧＡＧＧＣＣＧＴＴＡＧＧＣＣＧＡＡＡＣＴＣＣＴＧＣＡ）−３゜リポザイ ムｐＵＣＲ３およびｐＵＣＲＥ　１６クローンの調製： 市場で入手できるプラスミドｐＵｃ１９を１工程反応で制限酵素ｌ５ｏ−３ａｃ ｌおよびＰｓｔＩを使用して切断した。次に、ＤＮＡを２％の寒天ゲル電気泳動 によって精製し、引続きアミコン（八ｍ１ｃｏｎ）社によって供給されるセント リコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）　３０中心溶離装＠　（ｃｅｎｔｒｏｅｌｕｔｉ ｏｎ　ａｐｐａｒａｔｕｓ）を使用して電気溶離によって精製した。１対のオリ ゴヌクレオチドプライマー、ＲＥＩ−ＴおよびＲＥ２−Ｃ（リポザイム酵素）ま たはＲ３２−ＴおよびＲ８２−Ｃ（リポザイム基質）を前記の記載のようにして ホスホリル化した（　Ｔａｙｌｏｒ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、 １３　（１９８５）、８７４９−８７６４）。これらの１対のオリゴヌクレオチ ドを、キングおよびブレイクスレー（Ｋｉｎｇ　＆　Ｂｌａｋｅｓｌｅｙ）　（ Ｆ。

ｃｕｓ　８　（１９８６）、　１−３）の方法によりｐＵＣＲＥ　１６を生じる リポザイムのＤＮＡ配列またはｐＵＣＲ５を生じるリポザイム基質と一緒にＴ７ プロモーターのクローニングに使用した。感応細胞（０１ｓｅｎ　＆　Ｅｃｋｓ ｔｅｉｎ。

ＰＮＡＳ　ＵＳ八へ７　（１９９０）、　１４５１−１４５６）の形質転換後に 、白色コロニーを、ｐＵｃＲＥ１６の場合には第２ＡｖａｌＩ部位の存在に対し てスクリーニングし、ｐＵＣＲ８に関してはユニークＥｃｏＲＶ部位の存在に対 してスクリーニングした。それぞれのクローンからの精製二本鎖ＤＮＡの配列を オルセン（０１ｓｅｎ）およびニックシュタイン（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）　（Ｎｕ ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１７（１９８９）、　９６１３−９６２０） の方法によって測定した。

Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼランオフ転写物：Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼランオフ 転写物を、ミリガン（Ｍｉｌｌｉｇａｎ）およびウーレンベック（Ｕｈｌｅｎｂ ｅｃｋ）　（Ｍｅｔｈ、　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１８０＾（１９８９） 、　５ｌ−６２）によって記載された方法に適合させることによって１５０μｍ 〜５００μｌの規模で合成させた。転写反応をトリス４０ミリモル　ｐＨ８，０ ，スペルミジン１ミリモル、ＤＴＴ５ミリモル、トリトンＸ−１０００，０１％ 、ＭｇＣｌ２２０ミリモル、ヌクレオチド２．５ミリモル、ＤＮＡ鋳型２００ｎ Ｍ、ヒト胎盤ＲＮアーゼ阻害剤０．２Ｕ／μｍおよびＴ７　ＲＮＡ１００Ｕ／μ ｍ中で実施した。２′−デオキシ−２′−フルオロヌクレオチドトリホスフェー トを使用した場合には、ＭｇＣ１２をＭｎＣｌ２２０ミリモルによって代替した 。反応を３７℃で３時間実施した。転写物を上記のようにＰＡＧＥによって精製 した。オリゴリボヌクレオチドの水溶液を一２０℃で貯蔵した。

東１図は、ＰＡＧＥ後のｐＵＣＲ３のＴ７　ＲＮＡポリメラーゼ　ランオフ転写 のオートラジオグラフを示す。Ａ：転写を１５０μｍの規模でＭｇＣｌ２２０ミ リモルおよび４つのヌクレオシドトリホスフェートそれぞれ２．５ミリモル宛の 存在下に３７℃で３時間実施した。反応混合物をアルカリホスファターゼでデホ スホリル化し、かつポリヌクレオチドキナーゼおよび［γ−３２ｐコーＡＴＰと の反応によって５’　３２ｐ標識化した。標識化された転写混合物にＰＡＧＥを 行なった。Ｂ：１５０μｌの規模でＭ　ｎ　Ｃ１２２０ミリモル、ＡＴＰｏ、５ ミリモル、［α−３２Ｐ］−ＡＴＰ２５μＣｉ、ＣＴＰおよびＣＴＰ２．５ミリ モルおよび２′−フルオロウリジントリホスフェート２．５ミリモルの存在下に ３７℃で３時間転写を実施した。転写混合物に直接ＰＡＧＥを行なった。記号ア ステリスクは、３２Ｐ−標識化されたホスフェートを示す。′Ｎ′は、鋳型ＤＮ Ａの全長に及ぶＴ７　ＲＮＡポリメラーゼによって添加された任意のヌクレオチ ドを表わす（Ｍｉｌｌｉｇａｎ　ａｎｄ　ｔｌｈｌｅｎｂｅｃｋ、　Ｍｅｔｈ、 　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１８０＾（１９８９）、　５ｌ−６２）。

第２図は、ＰＡＧＥ後の２′−アミノウリジンを含有するｐＵｃＲＥ１６のＴ７ 　ＲＮＡポリメラーゼランオフ転写物のオートラジオグラフを示す。方法１：化 学的に合成された、３４番目の遺伝標識Ｅ３を含有する２′−アミノウリジン。

方法２　：１５０μｍの規模でＭｇＣｌ２２０ミリモル、［α−３２Ｐ］−ＡＴ Ｐ６０μＣｉ、ＣＴＰおよびＧＴＰＩミリモルおよび２′−アミノウリノントリ ホスフェート１ミリモルの存在下に３７℃で３時間転写を実施した。転写混合物 に直接にＰＡＧＥを施こした。

オリゴリボヌクレオチドの調製二次のオリゴリボヌクレオチドを ａ、）ランオフ転写によって調製した（５’−１−リホスフエートなしに記載さ れる配列）： Ｅｌ、５’　−ＧＧＧＵＣＣＵＣＵＧＡＵＧＡＧＧＣＣＧＵＵＡＧＧＣＣＧＡＡ ＡＣＵＣＣ−３’　；Ｅ２．　５’　−ＧＧＧ　（２’−ＦＵ）ＣＣ（２’　− ＦＵ）Ｃ（２’−ＦＵ）ＧＡ　（２’−ＦＵ）ＧＡＧＧＣＣＧ　（２’　−ＦＵ ）　（２’−ＦＵ）ＡＧＧＣＣＧＡＡＡＣ（２’−ＦＵ）ＣＣ−３’および Ｅ３．　５’　−ＧＧＧ　（２’　−ＮＨ２Ｕ）ＣＣ（２’　−ＮＨ２Ｕ）Ｃ（ ２’　−ＮＨ２Ｕ）ＧＡ　（２’　−ＮＨ２Ｕ）ＧＡＧＧＣＣＧ　（２’　−Ｎ Ｈ２Ｕ）　（２’　−ＭＨ’　２　Ｕ）ＡＧＧＣＣＧＡＡＡＣ（２’　−ＮＨ２ Ｕ）ＣＣ−３′　： ＳＬ、５’　−ＧＧＧＡＧＵＣＡＧＧＡＵ−３’　；Ｓ３、　５’　−ＧＧＧＡ Ｇ　（２’−ＦＵ）ＣＡＧＧＡ　（２’−ＦＵ）−３′およびＳ４，５’　ＧＧ ＧＡＧＵ　（２’−ＦＣ）ＡＧＧＡＵ−３’ ｂ、）化学合成によって調製したコオリゴリボヌクレオチドＥ１、Ｅ２、Ｅ３、 Ｓｌｌよびｓ２．５′−ＧＧＧＡＣ（２’　−ＮＨ２Ｕ）ＣＡＧＧＡＵ−３’。

オリゴリボヌクレオチドの５’　３２ｐ−標識化：ランオフ転写から得られたオ リゴリボヌクレオチドを、製造業者（Ｄｉａｇｅｎ　Ｉｎｃ、　）によって記載 された記録によるキアゲンチップ（Ｑｕｉａｇｅｎ　ｔｉｐ）　２０−カラムに よって精製されかつＴ４　ポリヌクレオチドキナーゼおよびγ−３２Ｐ−ＡＴＰ で処理されたＲＮアーゼ遊離牛アルカリホスファターゼを用いての処理によって デホスホリル化した。標識化オリゴリボヌクレオチドをＰＡＧＥによって精製し た。

実施例２ ＲＮＮアーゼ−用いてのオリゴリボヌクレオチドの消化 ＲＮＮアーゼ−用いてのオリゴリボヌクレオチドの部分的消化、オリゴリボヌク レオチドＥ１およびＥ２にドニスーケラ−（Ｄｏｎｉｓ−Ｋｅｌｌｅｒ）他（Ｎ ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　４　（１９７７）、　２５２７−２５３ ８）の方法による５’　３２Ｐ標識化後にＲＮアーゼＡ消化を行ない、次に変化 させた。５’　３２ｐ−標識化ＲＮＡ約２５μモルを、尿素７モル、ＥＤＴＡ５ ０ミリモル、ブロモフェノールブルー０．０４％、キシレンシアツールＦＦ０． ０４％および水上のｔＲＮＡｏ、２５ｍｇ／ｍｌを含有する緩′ｆｆｒ液５０μ ｍに添加した。次に、ＲＮＡを５本の標識化管中に等量に分配し、５分間５０℃ に加熱し、次いで直接に氷上に置いた。リボヌクレアーゼＡ、　２μ］（２Ｘ１ ０−４単位）を第１の管に添加し、かつピペットを用いて混合した。次に、酵素 を５倍に希釈して連続的に、１つの管から次の管へのそのつどの転写の後に新し いピペットチップを使用して３本の付加的な雪中に入れた。５本目の管は対照の 試料であり、これには、酵素を添加しなかった。次に、全ての管を５０℃で５分 間恒温保持し、氷上に置き、かつＰＡＧＥによって分析した。

ＲＮＮアーゼ−よるオリゴリボヌクレオチドの全崩壊二オリゴリボヌクレオチド Ｓ１およびＳ２を次の記録による５’−３２ｐ標識化後にＲＮＮアーゼ−消化し た、オリゴマー（２０μｌの最終的容量中８．５μモル）　をＲＮ７−ｔ／Ａ１ ．２５Ｘ１０＝単位と、トリス／ＨＣｌ５０ミリモル　ｐＨ７，５およ［Ｍｇｃ １２１０ミリモルを含有する緩衝液中で３７℃で１０分間反応させた。生成物を ＰＡＧＥによって分析した。

第３図は、ＰＡＧＥによって分離された５′−標識化ランオフ転写物Ｅ１および Ｅ２の部分的リボヌクレアーゼＡ切断のオートラジオグラフを示す。条件は、前 記のものと同様である。番号付けされた方法は、１）添加された酵素なし、２） ＲＮＮアーゼＡ２Ｘ１０ル単位、３）ＲＮ７−ゼＡ３ｘｌＯ−５単位、４）ＲＮ ７−ゼＡ８ｘ　１０−４．５）ＲＮ７−ゼＡ１６Ｘ１０−７に相当する。塩基の 番号付けを、非修飾転写物のＭ　ｎ　２“仲介切断のバンドをカウントすること によって簡易化した（ＭｎＣ１２１０ミリモル中で３分間９０℃に加熱したＲＮ Ａ　１０μモル）。丸付は数字は、ＲＮＮアーゼ−敏感な切断位置から予想され るバンドを示す。矢印は、切断位置３′からウリジンを生じかつリボザイムを含 有する２′−フルオロウリジンが切断されるような方法で不在であるバンドを示 す。

第４図は、ＰＡＧＥ後のＲＮＮアーゼ−ょるｓｌおよびＳ２の全崩壊のオートラ ジオグラフを示す。この反応の詳細は、上記に記載されて入る。方法１：１２番 目のＳ２の全消化；方法２：１２番目の３１の全消化：方法３．長さ標準として ９０℃で３分間ＭｎＣｌ２２０ミリモルと反応させることによる３４番目のＥｌ の切断ラダー。Ｓ２の切断生成物は、６位で２′−アミノウリジンの存在を示す Ｓｌよりも長いヌクレオチドである。

実施例３ リボザイムによるオリゴリボヌクレオチド基質の切断切断速度の測定：切断反応 をフェーダ−（Ｆｅｄｏｒ）およびウーレンベック（Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ）　（ １９９０，上掲書）からの適した方法によって実施した。リボザイム酵素（典型 的に最終的容量２０μｌ、最終的濃度１０１００ｎ　トリス／ＨＣｌ５０ミリモ ル、ｐＨ７，５）および基ｉｔ（典型的に４０μｌ、最終的濃度２μモル）の貯 蔵溶液を別々に９０℃で１分間加熱し、２価金属イオ７（ＭＩＩＣＩ２またはＭ 　ｇ　ＣＩ　２　、最終的濃度１０ミリモル）の添加前に１５分間室温に冷却し た。この貯蔵溶液を分解反応の開始前に２５℃で１５分間別々に恒温保持した。

酵素１０ｎＭおよび基質５０〜５０００ｎＭの典型的な濃度で、酵素を基質（ト リス／ＨＣｌ５０ミリモル、ｐＨ７，５、ＭｇＣ１２、最終的容量２０μ１１最 終的濃度１０ミリモル）に添加することによって反応を開始させた。規定時間で アリコート１０μｍを尿素停止混合物１０μｌ中に移し、かつＰＡＧＥを行なっ た。オートラジオグラフをＬＫＢＵＬＴＲＯ５ＣＡＮ　ＸＬレーザー　デンシト メーター上で分析した。

研究されたハンマーへッドリボザイム系の場合には、１２番目の基質オリゴヌク レオチド（Ｓとして示した）を冒頭の構造式中で矢印で示したサイチジンー７の ３′位で３４番目の酵素オリゴヌクレオチド（Ｅとして示した）によって分解し た。この分解により、２′−３′一環式ホスフエート末端を有するヘプタマー（ 生産物１）および５′−ヒドロキシル末端を有するヘプタマー（生産物２）が発 生する（　Ｒｕｆｆｎｅｒ他、　Ｇｅｎｅ　８２　（１９８９）、　３ｌ−４１ ）。これらの型の切断生産物は、オリゴリボヌクレオチドＥ１およびｓｌを有す るだけでな（，２′−フルオロウリジン含有基質ｓ３をも有することが観察され る（第５図）。予想されたように、２′−フルオロウリジンを分解位置で含有す る基質オリゴヌクレオチドＳ４は、同一の条件下では分解されなかった。これら ２つの反応は、基質のオリゴヌクレオチド中に２′−フルオロウリジンを含有し ていた。

しかし、有利に将来の用途によりいっそう重要なことは、リボザイムの酵素部分 中でのこの修飾の存在により、このリポザイムの触媒活性が干渉されるが否かの 問題にある。従って、２′−フルオロウリジン含有リポザイムＥ２と非修飾基質 Ｓ１との反応が研究された。実際に、ゲル分析により、基質は１対のＥｌおよび Ｓｌと同じ効率をもって分解されることが指摘された。２′　−フルオロウリジ ン含有リボザイムＥ２の触媒定数は、測定され（第６図）、かつ非修飾リボザイ ムＥ１の場合と比較された。この比較により、前者の速度定数の第２次数（ｋ、 −＝／に一＝０．００２６ｎＭ−１　）は、後者（ｋ−１１／に、＝０．００２ ３ｎＭ−１）の場合よりも小さいマグニチュードの１つの次数であることは明ら かである（Ｆｅｄｅｒ　＆　Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ　（１９９０）。

上掲書）。この触媒効率の減少は、第１に切断速度の減少に基づくものであり、 これとは異なり、リボザイム双方のに、値は、はぼ同一のものである。しかし、 この減少された切断速度は、異なる塩基組成物を用いて種々のハンマーヘッド系 に関して観察される切断効率の範囲内に十分存在する（Ｆｅｄｅｒ　＆　Ｕｈｌ ｅｎｂｅｃｋ　（１９９０）、上掲書）。ハンマーへッドリボザイム反応は、金 属イオン補助因子としてのＭ　ｇ　ＣＩ　２ならびにＭ　ｎ　Ｃ１２を用いて実 施することができ、切断の半減期は、後者の補助因子の存在下にほぼ１０倍減少 さ、れる（Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ、　Ｎａｔｕｒｅ　３２８　（１９ｇ？）、　５ ９６−６０９）。また、このようにＭｇ２”からＭ　ｎ　”“へりスイッチング の下で切断条件下で基質の半減期が減少することにより、２′−フルオロウリジ ン含有酵素Ｅ２と基質Ｓ１との反応が観察された。従って、切断反応に必要とさ れる金属イオンは、２′−フルオロヌクレオチド類縁物の配合では老化されない 。

リボザイム中の２′−アミノウリジンの存在の効果は、研究された。２′−アミ ノウリジン含有リボザイムＥ３を非修飾基質Ｓ１と反応させる場合には、触媒効 率は、ｋ、、、／に、＝０．００１５ｎＭ−１のマグニチュードの程度に減少す る。ｋ　ｅａｔは殆んど非老化のままであるけれども、この効率の減少は、明ら かにより高いに、に基づ（ものである。従って、２′−アミノウリノンリボザイ ムの全効率は、２′−フルオロウリジン含有リボザイムの１つと比較可能である 。非修飾リボザイムＥ１と選択的２′−アミノウリジン修飾基１ｉ！ｔｓ２との 補足的な反応の場合には、触媒効率は、上記反応と比較されてに、、＝／に、＝ ０．００６３ｎＭ−１に増大される。この効果は、全体的にｋ　ｅａｔの増大に 基づく。この傾向は、２′−アミノウリジン含有リポザイムＥ３と８２との反応 の場合により一層顕著になり、この場合触媒効率は、ｋ、、、／に、＝０．００ １１ｎＭ−１に増大され、また主として増大されたｋ　ｃ　ｍ　＋に基づ（もの である。上記反応の全ての反応速度パラメーターは、第１表にまとめられて入る 。

第１表。

２′−変性ヌクレオチド含有リボザイムの反応速度定数。゛従って、本明細書中 に記載された反応速度のデータは、２′−フルオロ−および２′〜アミノウリジ ン修飾リポザイムの切断効率が若干減少されるけれども、なお異なる塩基組成物 のハンマーヘッド系に関して観察される範囲内にあることを示す。また、特異的 位置で選択的に２′−修飾を導入することによって触媒効率を増大させることが 可能であることも明らかになる。後者の効果は基質のオリゴリボヌクレオチドに 関して証明されたけれども、触媒の対する同様の影響を酵素の中で選択的修飾に 関して見い出すことができることが期待される。

第５図は、リボザイムＥ１による２′−フルオロウリジンおよび３２Ｐ−ＡＭＰ 含有基質Ｓ３の切断のオートラジオグラフを示す。この切断反応は、ＭｇＣ＋２ １Ｏミリモルの存在下にトリス／ＨＣＩ　５０ミリモル、ｐＨ７，５中で４０μ ｍの規模で２５℃で実施された。Ｅｌおよびｓ３の濃度は、それぞれ２．５μＭ および７．５μＭであった。他の全ての詳細は、上記に記載されている（Ｄｅｔ ｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｌｅａｖａｇｅ　Ｋｉｎｅｔｉｃｓ）。記載さ れた時間で、アリコート１０μｍをＰＡＧＥの前に水１０μｍおよび尿素停止混 合物１０μｍ中に移した。方法１：０．５分間後の反応：方法２：１５分間後の 反応：方法３：３分間後の反応。アステリスクは、３２Ｐ−標識化ホスフェート を示す。

第６図は、Ｅ２と８１とのりポザイム反応のエディー−ホフステーのプロットを 示す。この切断反応は、２０　ｕ　Ｉノｆｆｌ模ＴＭｇＣ１２１０ｍＭ＋７）存 在下ｉ：Ｅ　２の１０ｎＭの濃度ならびに５０ｎＭ、１１００ｎ、２００ｎＭ、 ４００ｎＭ、５００ｎおよび７００ｎＭのＳ１濃度を用いて実施された。７分間 後に、アリコート１０μＩをＰＡＧＥ前に水１０μｍおよび尿素停止混合物１０ μｍ中に移した。この時間ポイントは、開始速度の線状範囲内で減少することが 先に確立された。オートラジオグラフをレーザーデンシトメーター上での光学密 度の組込みによって評価した。

第７図は、Ｅ３と８１とのりボザイム反応のラインウィーヴアーーパークのプロ ットを示す。この切断反応は、２０μＩの規模テＭ　ｇ　Ｃ１２１０ｍＭノ存在 下にＥ　３　Ｌ７）　１．０　ｎ　Ｍの濃度ならびに５０ｎＭ、ｌｏｏｎＭ、２ ００ｎＭ、４００ｎＭ、５００ｎおよび７００ｎＭの５ｌｆｉ度を用いて実施さ れた。他の全ての詳細は、第６図の場合と同様である。

実施例４ リボザイムを使用してのＨＩＶ−Ｉ　ＬＴＲＲＮＡの切断 プラスミドの構成　プラスミド、ｐＯＴＨ３３、を位置−５２５〜３８６のＨＩ Ｖ−１配列（Ｒａｔｒ＋ｅｒｆ［ｌｌ！。

Ｎａｔｕｒｅ　３１３　（１９８５）、　２７７−２８４の配列番号付けによる ）を市場で入手し得るプラスミドｐ　Ｓ　Ｐ　Ｔ　１９　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ）にクローン化することによって構成させた。Ｈ１■配列は、Ｔ７プロモーター （Ｔ７）の転写制御下にある。ｐＯＴＨ３３の場合のＨＩＶ挿入の図面による提 示は、第８図に記載されている。ＨＩＶ−Ｉ　ＬＴＲ領域は、Ｕ３領域、Ｒ領域 およびＵ５領域からなる。このＨＩＶ−Ｉ　ＬＴＲ領域は、ポリブレントラクト によって５′−末位に隣接し、かつプライマー結合部位（ＰＢＳ）　、リーダー 配列およびｇａｇ遺伝子の一部によって３′−末位に隣接している。位置−５２ ５および３８６での矢印は、ｐＯＴＨ３３の構成に使用される制限部位を示す。

位置１１５の矢印は、リボザイム仲介切断のための部位を示す。

ヌクレオチド−４５３〜１８２の長い末端繰り返し配列を有する位置−５２５〜 ３８６のＨＩＶ−１のＲＮＡを、ＥｃｏＲＩ切断プラスミドｐＯＴＨ３３（ＤＮ Ａ鋳型１１００ｎ／、ｃｚｌ、ＤＴＴ　１０ｍＭ、それぞれｒＮＴＰ５００ｕＭ 、　トリス−ＣＩ　５ＱｍＭ。

ｐＨ７，５、スペルミジン２ｍＭＳＭｇＣ１２６ｍＭ、Ｃａ−３２Ｐ］　−ＡＴ Ｐ　２ｔｔＣｉ／μｌ、ＲＮ７−ゼ阻害剤５０Ｕ／μｍおよびＴ７　ＲＮＡポリ メラーゼ１５Ｕ／μｍ、４℃で２時間）をランオフ転写し、そのｉｌ：ＤＮｙ− ゼ■（ＩＵ／μＩ、３７℃で１０分Ｉ％１ｆｆ）　（ＲＮアーゼ不含）との反応 混合物を恒温保持し、かつフェノール−クロロポルム抽出することによって得た 。得られたＲＮＡは、ＬＴＲＲＮＡとして記載されている。

有用な切断部位ＧＵＣを含有するＨＩＶ−ＩＬＴＲＲＮＡの位置１１５をリボザ イム触媒切断のための標的として選択した。この部位に対する標的のハンマーへ ッドリポザイムを、化学的に合成した。非修飾ハンマーヘッド酵素ＲＥ１１５の ヌクレオチド配列は、第９図に記載されている。

ＬＴＲＲＮＡを用いての切断反応速度：ｋｃ、、／に１値を単代謝回転の条件下 で測定した。リポザイムをトリス−ＣＩ　５０ｍＭ、ｐＨ７，５の存在下に７５ ℃で１分間予め恒温保持し、引続き３７℃で５分間恒温保持することにょつて測 定した。ＭｇＣ＋２を１０ｍＭの最終濃度に添加し、この溶液を再び３７℃で５ 分間恒温保持した。ＬＴＲＲＮＡを直接に水溶液として使用した。反応混合物（ １０μｍ）は、リボザイム２０ｎＭ〜１μＭ１　トリス−ＣＩ　５０ｍＭ５ｐＨ ７，５およびＭｇＣ１２１０ｍＭを含有していた。

ＬＴＲＲＮＡを１０ｎＭの最終濃度に添加することによって反応を開始させた。

３７℃で１時間後に、停止混合物１０μｍを添加することによって反応を停止さ せ、かつＰＡＧＥ４％（長さ４Ｑｃｍ、尿素８モル）によって分析した。５０Ｗ での１時間の電気泳動および引続くオートラジオグラフィーの後に、非切断ＬＴ ＲＲＮＡの画分をレーザー走査デンシトメーター測定によって測定した。ｋｅ、 、／に、値を、次の等式：〔式中、ｋは観察される反応速度であり、ｔは１時間 の反応時間である〕により、リボザイム濃度（［ＲＥＩ）に対してＬＴＲＲＮＡ の残留断片（Ｆｒａｃ　Ｓ）をプロットすることによって得た。

２′−フルオロまたは２′−デオキシ置換基および／または末端ホスホロチオエ ート結合を含有するＲＥ１１５のリボザイムの幾つかの類縁物の触媒効率に対す る化学修飾の影響を研究するために、合成した。２′−フルオロウリジン置換基 は触媒効率に対して何らの効果も有しないけれども［第２表、ＲＥ１１５（ＦＣ ，）］、フルオロウリジン置換基は、ｋ　ｅ、、／　Ｋ、の５倍の減少を生じた ［第２表、ＲＥＩ　１５　（ＦＵ）］。３個の３′−末端ホスホロチオエート基 との組合せ物中の１つの５′−末端ホスホロチオエート基は、無視できる程度に のみ触媒効率を減少させた［第２表、ＲＥ１１５（Ｓ）］。同様のことは、２′ −フルオロウリジン置換基と一緒の末端ホスホロチオエート結合の組合せに関し て実際のことであり、この場合には、ｋｃｍ／に、の他の減少は観察されなかっ た［第２表、ＲＥ１１５　（ＦＵ）、ＳＦ。全てのピリミジンリボヌクレオチド を２′フルオロ類縁物によって置換し、かつ４個のホスホロチオエート結合を導 入することにより、非修飾リボザイムと比較して７倍だけ触媒効率は減少した［ 第２表、ＲＥ１１５　（ＦＣ，ＦＵ、Ｓ）］。これとは異なり、全てのピリミジ ンリボヌクレオチドをホスホロチオエートと結合した２′−デオキシヌクレオシ ド類縁物によって置換することにより、５０倍のｋｃ、、／に、の減少を生じた ［第２表、ＲＥ１１５（ｄＣ，ｄＵ、Ｓ）］。従って、ＲＥ１１５　（ｄＣ。

ｄＵ、Ｓ）は、ＲＥ１１５　（ＦＣ，ＦＵ、Ｓ）よりも７倍少ない効率を有する 。

第２表 ＲＥ１１５によるＬＴＲの切断に対する化学的修飾の影響リボザイム　ｋｅ、　 、／に、、　ｋ　ｅ、、／に、。

ＲＥ１１５　５００　１ ＲＥ１１５（Ｓ）　３６０　０．７２ ＲＥ１１５（ＦＣ）’　４９０　０．９８ＲＥ１１５（ＦＵ）１　８９　０．１ ８ＲＥ１１５（ＦＵ、Ｓ）１　５９　０．１２ＲＥ１１５（ＦＣ，ＦＵ、Ｓ）１ 　６９　０．１４ＲＥ１１５（ｄＣ，ｄＵ、Ｓ）２　１０　０．０２０１本発明 の実施例 ２比較例 実施例５ オリゴリボヌクレオチドの安定性 実施例４のリポザイムをヌクレアーゼ消化に対する安定性に関して試験した。

試験条件： 媒体ＲＭＰＩ　１６４０中で細胞的１０６／ｍｌの細胞濃度に成長した脱皮４ク ローン８細胞（Ｊｕｒｋｉｅｒｗｉｃｚ、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｓ　Ｐｒｉｎｍａｔ ｅｎｚｅｎｔｒｕｍ、　ＧＯｔｔｉｎｇｅｎから入手可能）の１０００ｇをヘラ オイス　ミニヒューゲ（Ｈｅｒａｅｕｓ　Ｍｉｎｉｆｕｇｅ）中で５分間遠心分 離した。５′＝３２ｐ−標識化リボザイムを９０℃で１分間予め加熱し、氷上で 冷却し、細胞上澄み液に添加して３００ｎＭの最終濃度にし、かつ３７℃で恒温 保持した。アリコートを指摘された時間ポイントで取り出し、尿素８モルを含有 する２０％のＰＡＧＥによって分析し、引続きオートラジオグラフィー処理した 。

結果・ ８０％を上形るＲＥ１１５が、ＰＡＧＥを変性することによって指摘されるよう に細胞上澄み液中での２分間の恒温保持後に分解された。しかし、１時間以内の ＲＥ１１５　（ＦＣ，ＦＵ、Ｓ）の分解は観察されなかった。非修飾リボザイム の分解速度との比較により、２′−修飾ビリミジンヌクレオシドと末端ホスホロ チオエート結合との組合せにより、Ｔ細胞上澄み液中に存在するヌクレアーゼに よる消化に対するリボザイム安定性よりも５０倍増大したものと評価される。ホ スホロチオエート基なしの２′−修飾リボザイムは、ＲＥ１１５　（ＦＣ，ＦＵ 、Ｓ）の安定性よりも約２倍低い安定性を示す。

Ｆｉｇ、６ マ／Ｓｌ／岨） 百ツ　階箋　−２１ｃ　壽ロ　ｄ＝ ＋１ｎｄｌｌｌ　Ｋｐｎｌ　Ｅｃｏ日１０ＴＨ３３ Ｆ工ｑ６８ ５”ＣＡＣＡＡＣＡＣＵＧＡＵＧＡＧＧＣＣＧＵＵＡＧＧＣＣＧ、ＡＡＡＣＧＧ ＧＣＡ３’Ｆ工９．９ １ｓ酌ｍ＋ｗａｌＡ−１ｓ　ｏｒｙｌｅｏ　（Ｈ／Ｉ’ＨＩＨＩ国際講査報告 ２ニシーー−一１１ｕｎｗ２″″′°ゝ□−−−ｗ　ｅｅｍ−ｗａ　ｔｈｌＥｗ −Ｐ−１０％ｗ　Ｅ口ＰＩＩｊ＋、２．−ｏ、１１．、、、−ユ、ヶ、２．ニー に、、−１工、□フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＴ、　ＬＵ、　ＮＬ、　ＳＥ）、０Ａ（Ｂ Ｆ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、Ｔ Ｇ）、ＡＴ、ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３，ＤＥ、　Ｄ Ｋ。

ＥＳ、ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ、ＭＣ，Ｍ Ｇ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯドイツ連邦共和国　Ｄ−３４００ゲッ チンゲン　ハインリッヒーヴアルネッケーシュトラーセ　４ （７２）発明者　オルセン、　デイヴイド　ビー。

アメリカ合衆国　ペンシルケアニア １９４８６　ウェストポイント　ダヴリュービ−４２−３００ケア　オヴ　メル ク、シン　力ロリーネンヴエーク　１５

Claims (43)

【特許請求の範囲】
1. １．少なくとも１つの修飾ヌクレオチドからなる触媒活性を有するＲＮＡ分子に おいて、リボース糖の２′−でのヒドロキシ基が、ハロゲン原子、スルフヒドリ ル基、アジド基、アミノ基、モノ置換アミノ基およびジ置換アミノ基から選択さ れた１つの修飾基によって代替されていることを特徴とする、触媒活性を有する ＲＮＡ分子。
2. ２．修飾基がハロゲン原子またはアミノ基である、請求項１記載のＲＮＡ。
3. ３．ハロゲン原子が弗素原子である、請求項１または２に記載のＲＮＡ。
4. ４．触媒活性がヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性、デホスホリラーゼ活性 、デオキシリボヌクレアーゼ活性および配列特異的エンドリボヌクレアーゼ活性 からなる群の少なくとも１つを有する、請求項１記載のＲＮＡ。
5. ５．触媒活性が配列特異的エンドリボヌクレアーゼ活性を有する、請求項４記載 のＲＮＡ。
6. ６．ハンマーヘッドリボザイムまたはヘアピンＲＮＡである、請求項５記載のＲ ＮＡ。
7. ７．修飾リボース糖に結合したヌクレオチド塩基がＲＮＡ中で天然に生じる塩基 および置換塩基からなる群から選択されたものである、請求項１から６までのい ずれか１項に記載のＲＮＡ。
8. ８．置換ヌクレオチド塩基がキサンチン、ハイポキサンチン、２，６−ジアミノ プリン、２−ヒドロキシ−６−メルカプトプリンおよび硫黄により６位で置換さ れたプリン塩基またはハロゲン原子もしくはＣ１〜Ｃ５アルキル基により５位で 置換されたピリミジン塩基から選択されている、請求項７記載のＲＮＡ。
9. ９．修飾リボース糖に結合したヌクレオチド塩基がＲＮＡ中で天然に生じる塩基 である、請求項７記載のＲＮＡ。
10. １０．修飾リボース糖に結合したヌクレオチド塩基がピリミジン塩基である、請 求項９記載のＲＮＡ。
11. １１．１つの特異的種類の全てのヌクレオチド塩基が修飾リボース糖に結合して いる、請求項１から１０までのいずれか１項に記載のＲＮＡ。
12. １２．全てのウラシルヌクレオチド塩基が修節リボース糖に結合している、請求 項１１記載のＲＮＡ。
13. １３．全てのサイトシンヌクレオチド塩基が修飾リボース糖に結合している、請 求項１１記載のＲＮＡ。
14. １４．２つの特異的種類の全てのヌクレオチド塩基が修飾リボース糖に結合して いる、請求項１から１０までのいずれか１項に記載のＲＮＡ。
15. １５．全てのサイトシンおよびウラシルヌクレオチド塩基が修飾糖に結合してい る、請求項１４記載のＲＮＡ。
16. １６．修飾リボース糖が２′−フルオロ基または２′−アミノ基を有している、 請求項１１から１５までのいずれか１項に記載のＲＮＡ。
17. １７．ヌクレオチド配列Ｅ２：５′−ＧＧＧ（２′−ＦＵ）ＣＣ（２′−ＦＵ） Ｃ（２′−ＦＵ）ＧＡ（２′−ＦＵ）ＧＡＧＧＣＣＧ（２′−ＦＵ）（２′−Ｆ Ｕ）ＡＧＧＣＣＧＡＡＡＣ（２′−ＦＵ）ＣＣ−３′からなるＲＮＡにおいて、 ２′−ＦＵが２′−デオキシ−２′−フルオロウリジンモノホスフェートを表わ すことを特徴とする、ＲＮＡ。
18. １８．ヌクレオチド配列Ｅ３：５′−ＧＧＧ（２′−ＮＨ２Ｕ）ＣＣ（２′−Ｎ Ｈ２Ｕ）Ｃ（２′−ＮＨ２Ｕ）ＧＡ（２′−ＮＨ２Ｕ）ＧＡＧＧＣＣＧ（２′− ＮＨ２Ｕ）（２′−ＮＨ２Ｕ）ＡＧＧＣＣＧＡＡＡＣ（２′−ＮＨ２Ｕ）ＣＣ− ３′からなるＲＮＡにおいて、２′−ＮＨ２Ｕが２′−デオキシ−２′−アミノ ウリジンモノホスフェートを表わすことを特徴とする、ＲＮＡ。
19. １９．分子の構造特性に基づく選択的な修飾パターンを有する、請求項１から１ ０までのいずれか１項に記載のＲＮＡ。
20. ２０．リボヌクレアーゼに対する高感受性部位でのヌクレオチドが修飾されてい る、請求項１９記載のＲＮＡ。
21. ２１．さらに少なくとも１つの修飾インターヌクレオチドホスホジエステル結合 を有する、請求項１から２０までのいずれか１項に記載のＲＮＡ。
22. ２２．修飾ホスホジエステル結合がホスホロチオエートである、請求項２１記載 のＲＮＡ。
23. ２３．少なくとも５′−末端ホスホジエステル結合が修飾されている、請求項２ １または２２に記載のＲＮＡ。
24. ２４．少なくとも３′−末端ホスホジエステル結合が修飾されている、請求項２ １から２３までのいずれか１項に記載のＲＮＡ。
25. ２５．５′−末端ホスホジエステル結合および最後の３つの３′−末端ホスホジ エステル結合が修飾されている、請求項２１から２４までのいずれか１項に記載 のＲＮＡ。
26. ２６．ＲＮＡ鎖中に少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを配合することにより、 触媒活性を有するＲＮＡ分子を合成する方法において、リボース糖の２′位での ヒドロキシ基をハロゲン原子、スルフヒドリル基、アジド基、アミノ基、モノ置 換アミノ基およびジ置換アミノ基から選択された１つの修飾基によって代替する ことを特徴とする、触媒活性を有するＲＮＡ分子の合成方法。
27. ２７．修飾基がハロゲン原子またはアミノ基である、請求項２６記載の方法。
28. ２８．ハロゲン原子が弗素原子である、請求項２６または２７に記載のに記載の 方法。
29. ２９．ＲＮＡ鎖の合成を固体支持体上でヌクレオチド前駆物質からの化学合成に よって実施し、ＲＮＡ生産物を固体支持体から除去し、かつ除去したＲＮＡ生産 物を精製する、請求項２７または２８に記載の方法。
30. ３０．ＲＮＡ鎖の合成を溶液中でヌクレオチド前駆物質からの化学合成によって 実施し、かつＲＮＡ生産物を精製する、請求項２７または２８に記載の方法。
31. ３１．それぞれホスホルアミダイトまたはＨ−ホスホネートをヌクレオチド前駆 物質として使用する、請求項２９または３０に記載の方法。
32. ３２．アミノ修飾基をトリフルオロアセチルアミド基の形でＲＮＡ鎖中に配合し 、その後にトリフルオロアセチル保護基をアンモニアとの処理によって除去する 、請求項２９から３１までのいずれか１項に記載の方法。
33. ３３．さらにＲＮＡ鎖中に少なくとも１つの修飾インターヌクレオチドホスホジ エステル結合を配合する、請求項２６から３２までのいずれか１項に記載の方法 。
34. ３４．修飾ホスホジエステル結合がホスホロチオエート基である、請求項３３記 載の方法。
35. ３５．ＲＮＡ鎖の合成を核酸ポリメラーゼを用いて核酸鋳型からの転写によって 実施する、請求項２６から２８までのいずれか１項に記載の方法。
36. ３６．核酸鋳型がＤＮＡ鋳型であり、核酸ポリメラーゼがＤＮＡ依存ＲＮＡポリ メラーゼである、請求項３５記載の方法。
37. ３７．ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼがＴ７、Ｔ３およびＳＰ６ポリメラーゼか らなる群から選択される、請求項３６記載の方法。
38. ３８．ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼがＴ７ポリメラーゼである、請求項３７記 載の方法。
39. ３９．修飾基がハロゲン原子であり、ＲＮＡ鎖の合成をＭｎ２＋イオンの存在下 に実施する、請求項３５から３８までのいずれか１項に記載の方法。
40. ４０．修飾基がアミノ基、モノ置換アミノ基またはジ置換アミノ基であり、ＲＮ Ａ鎖の合成をＭｇ２＋イオンの存在下に実施する、請求項３５から３８までのい ずれか１項に記載の方法。
41. ４１．請求項１から２５までのいずれか１項に記載のＲＮＡを使用している治療 剤または生物触媒。
42. ４２．治療剤において、作用成分としての請求項１から２５までのいずれか１項 に記載のＲＮＡを、場合によっては常用の充填剤、賦形剤、担持剤および希釈剤 と一緒に含有することを特徴とする、治療剤。
43. ４３．治療剤を製造する方法において、治療剤が作用成分としての請求項１から ２５までのいずれか１項に記載のＲＮＡを場合によっては常用の充填剤、賦形剤 、担持剤および希釈剤と一緒に含有することを特徴とする、治療剤の製造法。