PL169867B1 - Sposób otrzymywania nowych analogów somatostatyny wykazujących właściwości hamowania uwalniania hormonu wzrostu - Google Patents

Abstract

1. Sposób otrzymywania nowych analo- © gów somatostatyny, wykazujących właściwości hamowania uwalniania hormonu wzrostu o wzorze ogólnym 7, w którym Xjest resztą stanowiącą H lub NH2 lub CH2-CH2-NH2 lub CH2-CH2-OH lub C(CH2OH^CHa, a Y jest resztą podaną we wzorze 3 lub wzorze 4 lub wzorze 5 lub wzorze 6, znamienny tym, że związek o wzorze ogólnym 10 osadza się na żywicy Merrifielda, poddaje się acylowaniu zapomocą związku o wzorze 11 lub wzorze 12 lub wzorze 13 lub wzorze 14, zdejmuje się z żywicy w reakcji aminolizy za pomocą związku NH2Χ, gdzie X ma podane wyżej znaczenia, usuwa się grupy ochronne w reakcji redukcji sodem w ciekłym amoniaku i utlenia się przy pomocy 0,01 molowego wodnego roztworu żelazocyjanku potasowego lub 0,1 molowego roztworu jodu w metanolu.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania nowych analogów somatostatyny, wykazujących właściwości hamowania uwalniania hormonu wzrostu.

Somatostatyna (SS-14), znana także jako czynnik hamujący uwalnianie somatotropiny (SRIF) lub hormon hamujący uwalnianie hormonu wzrostu (GHR-IH), powstaje z prohormonu na drodze proteolizy i ma wzór strukturalny przedstawiony we wzorze 1. Aktywność somatostatyny jest wielokierunkowa, zależna od obszaru, w którym jest wydzielana. Stwierdzono, że oprócz podwzgórza wiele tkanek i organów wytwarza somatostatynę, na przykład ośrodkowy układ nerwowy, gruczoł tarczowy, łożysko, trzustka, błona śluzowa różnych odcinków przewodu pokarmego. Somatostatynę wydzielają komórki D żołądka, powstaje ona też w błonie śluzowej trzonu i części przedodźwiernikowej żołądka, dwunastnicy i dalszych odcinkach jelita cienkiego, a przede wszystkim w trzustce. Całkowita ilość samotostatyny wydzielanej w komórkach D żołądka i trzustce jest większa niż wydzielana w podwzgórzu.

Ponadto samotostatyna występuje w różnych częściach ośrodkowego układu nerwowego i innych tkankach nerwowych. Wykryto ją również w rdzeniowych zwojach nerwowych, krezkowych zwojach nerwowych, a także w rdzeniach nerwowych całego ciała oraz neuronach Auerbacha. W związku z powyższym samotostatynę określa się jako peptyd mózgowo-jelitowotrawienny, a jej sposób działania może być endokrynalny, neurokrynalny oraz egzo- i parakrynalny. Duża różnorodność działań samotostatyny w połączeniu z jej powszechnym anatomicznym rozmieszczeniem powoduje, że wpływa ona na wiele istotnych funkcji życiowych. Dlatego też podjęto szereg prób jej zastosowań jako środka terapeutycznego w licznych stanach chorobowych. Doraźne zastosowanie lecznicze znalazła samotostatyna u chorych z obfitym krwawieniem z górnego odcinka przewodu pokarmowego, ponieważ ogranicza przepływ krwi w obszarze trzewnym. Podejmowano także próby leczenia samotostatyną akromegalii, ale wyniki okazały się niezadowalające.

Istnieją dwa główne powody, które ograniczają terapeutyczną efektywność SS-14: krótki okres półtrwania (około 4 minut) oraz szerokie spektrum działania (to jest brak selektywności w stosunku do wymaganych komórek i tkanek). Dlatego też poszukiwania nowych skutecznych analogów somatostatyny koncentrują się na syntezie analogów o zawężonym spektrum działania, syntezie analogów o przedłużonym działaniu (zwiększona odporność na degradację enzymatyczną) oraz na syntezie analogów aktywnych po podaniu doustnym.

169 867

W badaniach zależności między strukturą a czynnością biologiczną stwierdzono, że istotnym dla wiązalności z receptorem jest fragment 7-10 natywnej somatostatyny o sekwencji przedstawionej we wzorze 2.

Wcześniej jeszcze ustalono, że ze zwględu na degradację enzymatyczną, a zatem przedłużenie czasu półtrwania, korzystna jest wymiana tryptofanu (Trp) w natywnej somatostatynie na Dtryptofan (D-Trp).

Nie są znane rozwiązania obejmujące sposoby otrzymywania nowych, zbudowanych z pięciu reszt aminokwasowych, analogów somatostatyny wykazujących właściwości hamowania uwalniania hormonu wzrostu.

Wynalazek rozwiązuje zagadnienie opracowania nowego sposobu otrzymywania nowych pięcioaminokwasowych analogów samotostatyny wykazujących właściwości hamowania uwalniania hormonu wzrostu.

Sposób otrzymywania nowych analogów somatostatyny, wykazujących właściwości hamowania uwalniania hormonu wzrostu o wzorze ogólnym 7, w którym X jest resztą stanowiącą H lub NH 2 lub CH 2-CH2-NH 2 lub CH2-CH2-OH lub C(CH2OH)2CH3, a Y jest resztą podaną we wzorze 3 lub wzorze 4 lub wzorze 5 lub wzorze 6, według wynalazku polega na tym, że związek o wzorze ogólnym 10, osadzony na żywicy Merrifielda poddaje się acylowaniu za pomocą związku o wzorze 11 lub wzorze 12 lub wzorze 13 lub wzorze 14, zdejmuje się z żywicy w reakcji aminolizy za pomocą związku NH2X, gdzie X ma podane wyżej znaczenia, usuwa się grupy ochronne w reakcji redukcji sodem w ciekłym amoniaku i utlenia się przy pomocy 0,01 molowego wodnego roztworu żelazocyjanku potasowego lub 0,1 molowego roztworu jodu w metanolu. Istotnym jest ponadto, że stosuje się korzystnie związek o wzorze 10 otrzymany w wyniku osadzenia Boc-Cys(Bzl) na żywicy Merrifielda i poddania tak otrzymanego substratu kolejnym acylowaniom związkami o wzorach Boc-Thr(Bzl), Boc-Lys(Tos), Boc-D-Trp i Boc-Phe, poprzedzanym usuwaniem grupy Boc z każdego kolejnego substratu acylowanego. W sposobie według wynalazku w miejsce aminokwasów 1-6(Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe) natywnej somatostatyny wprowadza się odpowiednio reszty kwasów e-mercapto-β, β-cyklopentametylenopropionowego, β-mercaptopropionowego, L-(-)-ahydroksy-e-mercaptopropionowego i β, β-dimetylo-e-mercaptopropionowego, a w pozycję 11 zamiast aminokwasów 11-14(Phe-Thr-Ser-Cys) wporwadza się cysteinę, przy czym wolną grupę karboksylową cysteiny przeprowadza się odpowiednio w amid, hydrazyd, pochodną amidu zawierającą dodatkową wolną grupę aminową i pochodne amidów zawierające dodatkowo jedną i/lub dwie wolne grupy hydroksylowe.

Sposób według wynalazku jest prostszy i tańszy w realizacji przemysłowej (w porównaniu z natywną samotostatyną mającą 14 aminokwasów, zredukowano ilość aminokwasów w nowych jej analogach do 5) i prowadzi do uzyskania produktów według wzoru ogólnego 7, wykazujących wielokrotnie silniejsze właściwości hamujące wydzielanie hormonu wzrostu i wielokrotnie wyższą odporność na degradację enzymatyczną aniżeli natywna samotostatyna.

Przykład. Związek o wzorze 10 powstaje w wyniku osadzenia Boc-Cys(Bzl) na żywicy Merrifielda i poddania tak otrzymanego substratu kolejnym acylowaniom związkami o wzorach Boc-Thr(Bzl), Boc-Lys(Tos), Boc-D-Trp i Boc-Phe poprzedzanym usuwaniem grupy Boc z każdego kolejnego substratu acylowanego. Chroniony peptyd liniowy o strukturze przedsta wionej we wzorze 8 otrzymuje się metodą syntezy na nośniku stałym. Przyłączenie reszty C-końcowej N-t-butyloksykarbonylo-S-benzylocysteiny do nośnika realizuje się w reakcji soli cezowej chronionego aminokwasu z chlorometylowaną żywicą poliestrową o stopniu osadzenia chloru 0,67 mmola/g żywicy. Grupy α-aminowe przyłączanych aminokwasów osłania się ugrupowaniem t-butyloksykarbonylowym (Boc), a aminokwasu N-końcowego ugrupowaniem benzyloksykarbonylowym (Z). Grupy funkcyjne łańcuchów bocznych treoniny i cysteiny oraz grupę tiolową kwasu β-mercaptopropiowego i jego pochodnych zabezpiecza się przez zastosowanie osłony benzylowej (Bzl). Boczną grupę aminową lizyny chroni się przez użycie reszty p-touenosulfonylowej (Tos).

Syntezę na stałym nośniku przeprowadza się w następujący sposób. Odpowiednią ilość polimeru zawierającego 0,5mmola osadzonego aminokwasu, czyli Boc-Cys(Bzl) w ilości 1,05 g przy stopniu osadzenia 0,48 mmola/g, zalewa się 15 cm³ chlorku metylenu i pozostawia się układ na 12 godzin celem spęcznienia polimeru. Po upływie tego czasu żywicę z osadzonym na niej

169 867 aminokwasem poddaje się pięciu cyklom złożonym z odblokowania, neutralizacji i sprzęgania. Każdy cykl składa się z następujących etapów. W etapie pierwszym przeprowadza się usunięcie grupy Boc poprzez użycie 40% roztworu kwasu trifluorooctowego w chlorku metylenu z dodatkiem 1% anizolu. W operacji pierwszej używa się tu 10 cm³ roztworu przez 5 minut, a w operacji drugiej 10 cm3 roztworu przez 25 minut. W etapie drugim przeprowadza się przemywanie w pięciu kolejnych operacjach, które podano niżej:

X chlorkiem metylenu w ilości 10 cm³ przez czas 3 minut;

X mieszaniną chlorek metylenu: metanol (1:1) w ilości 10 cm3 przez czas 3 minut;

X metanolem w ilości 10 cm³ (1:1) w ilości 10 cm³ przez czas 3 minut;

3Xmieszaniną chlorek metylenu: metanol (1:1) w ilości 10cm³ przez czas 3 minut;

X chlorkiem metylenu w ilości 10 cm³ przez czas 3 minut.

Po wykowaniu wszystkich opisanych wyżej operacji przemywania, realizuje się etap trzeci, polegający na zobojętnianiu trifluorooctanu peptydylożywicy 10% roztworem trietyloaminy w chlorku metylenu. W operacji pierwszej przeprowadza się zobojętnianie przy użyciu 10 cm³ roztworu przez 5 minut, a w drugiej operacji przy użyciu tej samej ilości roztworu przez czas 10 minut. Po wykonaniu zobojętniania przeprowadza się ponownie przemywanie w pięciu kolejnych operacjach opisanych wyżej dla etapu drugiego. W następującym teraz etapie czwartym przeprowadza się acylowanie. Do schłodzonego roztworu 1,5 mmola Boc-Thr(Bzl) i 1,5mmola N-hydroksybenzotriazolu w najmniejszej objętości mieszaniny chlorek metylenu: dimetyloformamid (1:1) dodaje się 1,5 mmola dicykloheksyklokarbodiimidu w chlorku metylenu, przy czym ten etap wykonuje się odrębnie, poza właściwym naczyniem reakcyjnym. Po upływie co najmniej 15 minut odsącza się wytrącony dicykloheksylomocznik, a otrzymany w ten sposób przesącz wprowadza się do naczynia reakcyjnego i wytrząsa w wytrząsarce laboratoryjnej przez okres 2 do 3 godzin.

W następnym etapie piątym, przeprowadza się ponowne przemywanie realizując w tym celu wszystkie zabiegi technologiczne, jak opisano dla etapu drugiego. W szóstym etapie cyklu technologicznego otrzymywania nowych analogów somatostatyczny, prowadzi się kontrolę stopnia acylowania. Stopień ten kontroluje się przy pomocy ninhydrynowego testu Kaisera i testu chloranilowego. W przypadku pozytywnego wyniku testu acylowanie powtarza się, natomiast uzyskanie negatywnego wyniku testu acylowania, pozwala na przejście do następnego etapu, którym jest zdejmowanie grupy Boc z chronionego peptydu. Po przyłączeniu ostatniego Nkońcowego aminokwasu i zdjęciu grupy t-butyloksykarbonylowej osadzony peptyd acyluje się kwasem ^-mercapto-β, β-cyklopentametyleno-S-benzylopropionowym analogicznie jak w czasie acylowania aminokwasem i stosuje się ten sam ciąg przemywań i ten sam sposób kontroli przebiegu reakcji acylowania. Po przyłączeniu kwasu e-mercapto-e,e-cyklopentametyleno-S-benzylopropionowego żywicę z osadzonym na niej peptydem dokładnie przemywa się w dziewięciu kolejnych operacjach: trzykrotnie chlorkiem metylenu użytego za każdym razem w ilości 10 cm³, trzykrotnie etanolem użytym za każdym razem w ilości 10 cm³ oraz ponownie trzykrotnie chlorkiem metylenu w tej samej ilości.

Otrzymany substrat suszy się w eksykatorze próżniowym nad pięciotlenkiem fosforu i wodorotlenkiem potasowym, a następnie waży. Tak otrzymany chroniony peptyd zdejmuje się z żywicy Merrifielda poprzez aminolizę etanoloaminą w następujący sposób. Do mieszaniny 0,5 mmola peptydu na żywicy i 14 cm³ metanolu dodaje się 0,05 mola etanoloaminy i całość ogrzewa się przez 5 godzin w temperaturze wrzenia metanolu. Następnie odsącza się żywicę, a do metanolowego roztworu peptydu dodaje się 200 cm³ wody. Wytrąca się biały osad, który odsącza się, przemywa wodą i krystalizuje z mieszaniny metanol: eter etylowy. Zdjęty z żywicy chroniony peptyd najpierw poddaje się deprotekcji poprzez redukcję sodem w ciekłym amoniku, a następnie cyklizacji poprzez utworzenie mostka disulfidowego na drodze utleniania grup tiolowych przy pomocy 0,01 molowego wodnego roztworu żelazocyjanku potasowego lub 0,1 molowego roztworu jodu w metanolu. Surowy cykliczny peptyd odsala się metodą chromatografu kolumnowej z wypełnieniem Sephadex G-15 eluując 50% wodnym roztworem kwasu octowego. W drugim etapie odsolony peptyd poddaje się oczyszczaniu na kolumnie jonowymiennej, stosując jako wypełnienie Sepharose. W ostatnim etapie peptyd poddaje się oczyszczaniu na kolumnie wypełnionej Sephadexem LH-20. Peptyd eluuje się 10% wodnym roztworem kwasu octowego, a połączone frakcje zawierające czysty produkt poddaje się liofilizacji. Uzyskuje się w ten sposób czysty peptyd przedstawiony wzorem 7, w którym X oznacza grupę CH 2-CH2-OH, a Y oznacza grupę o wzorze 3.

169 867 5

Związek ten charakteryzuje skręcalność [ajo²⁰ = -30,32° (c = 0,5; 10% kwas octowy), jon molekularny 880, czas retencji w wysokosprawnej chromatografu cieczowej równy RT = 7,091 (peptyd eluowano izokratycznie w układzie rozpuszczalników 48% B i 52% A, gdzie A: 0,1% kwas trifluorooctowy w wodzie a B: 80% acetonitryl w A, szybkość przepływu 1 cm3 na minutę, detekcja przy długości fali 226 nm). Skład aminokwasowy peptydu potwierdzono wykonując hydrolizę peptydu sześcionormalnym roztworem kwasu solnego w temperaturze 110°C, a następnie przeprowadzając analizę ilościową składu aminokwasowego przy pomocy automatycznego analizatora aminokwasów.

2 3 4 5 6 7 8 9 10 II 12 U 14

Aki-Gly-Cy^-LYK-AsnTlie-Phe-Trp-Lys-Tlir-Phe-Tlir-Ser-CYe

L_________________________________I

WZÓR 1

8 9 10

Plie-t rp-Lys-Tlir

WZÓR 2

WZÓR 3 ,chjX:osHO

WZÓR

J)CH-CO^SWZÓR 5 ^H^-CO- Y-PI>e-D-Trp-Lys-Thr-ęys-NH-X

H// ^XS6 WZÓR 7

C H₂ CO-riie-IJ-Trp-LystTosITlutBziyCystBzO-NH-CHfCHjOH S-Bzl

WZÓR 8

169 867 ^“^^CHjCO-Phf-O-Tni-Lys-lhr-Cye-NH-CUj-CHj-OH

WZÓR 9

PlK>]>Trp-L.ys(Tos)-ThriBzI)-Cys(Bzi)

WZÓR 10

Λ -CłŁ-COCH CX,c^	-CHjtCOOH xs-chYo)
WZÓR 11	WZÓR 12
no ^CH-COCII s-ch,M	H,Cx ^CHjCOOH HjC XS-CR,-<©>
WZÓR 13	WZÓR 1 4

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 2,00 zł

Claims (2)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób otrzymywania nowych analogów somatostatyny, wykazujących właściwości hamowania uwalniania hormonu wzrostu o wzorze ogólnym 7, w którym X jest resztą stanowiącą H lub NH2 lub CH 2-CH2-NH2 lub CH2-CH2-OH lub C(CH2OH)2CH3, a Y jest resztą podaną we wzorze 3 lub wzorze 4 lub wzorze 5 lub wzorze 6, znamienny tym, że związek o wzorze ogólnym 10 osadza się na żywicy Merrifielda, poddaje się acylowaniu za pomocą związku o wzorze 11 lub wzorze 12 lub wzorze 13 lub wzorze 14, zdejmuje się z żywicy w reakcji aminolizy za pomocą związku NH2X, gdzie X ma podane wyżej znaczenia, usuwa się grupy ochronne w reakcji redukcji sodem w ciekłym amoniaku i utlenia się przy pomocy 0,01 molowego wodnego roztworu żelazocyjanku potasowego lub 0,1 molowego roztworu jodu w metanolu.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się związek o wzorze 10 otrzymany w wyniku osadzenia Boc-Cys(Bzl) na żywicy Merrifielda i poddania tak otrzymanego substratu kolejnym acylowaniom związkami o wzorach Boc-Thr(Bzl), Boc-Lys(Tos), Boc-D-Trp i Boc-Phe, poprzedzanym usuwaniem grupy Boc z każdego kolejnego substratu acylowanego.